Summary
Næringsstoffer, mikrobiota metabolitter og lægemidler til cirkulation adgang styres af gut-blod barriere (GBB). Vi beskriver en direkte metode til måling af GBB permeabilitet i vivo, der i modsætning til almindeligt anvendte indirekte metoder, er stort set ikke berørt af lever og nyre funktioner.
Abstract
Gut-blod barriere (GBB) styrer passage af næringsstoffer, bakteriel metabolitter og narkotika fra tarm lumen til blodbanen. GBB integritet er forstyrret i mave, kardiovaskulære og metaboliske sygdomme, som kan resultere i lettere adgang til biologisk aktive forbindelser, såsom tarmen bakteriel metabolitter, til blodbanen. Permeabilitet af GBB kan således være en markør for både tarm og extraintestinal sygdomme. Desuden kan øget penetration af bakteriel metabolitter påvirke driften af hele organismen.
Almindeligt anvendte metoder til at studere GBB permeabilitet er udført ex vivo. Nøjagtigheden af disse metoder er begrænset, fordi GBB funktion afhænger af intestinal blodgennemstrømning. På den anden side almindeligt anvendte i vivo metoder kan være forudindtaget af lever og nyre ydeevne, da disse metoder er baseret på vurdering af urin eller / og perifert blod koncentrationer af eksogene markører. Vi præsenterer her, en direkte måling af GBB permeabilitet i rotter ved hjælp af en i vivo metode baseret på portalen blodprøvetagning, som bevarer intestinal blodgennemstrømningen og stort set ikke påvirkes af funktionen lever og nyrer.
Polyurethan katetre er indsat i Vena, og ringere vena cava lige over hepatisk vener sammenløbet. Blod er stikprøven ved baseline og efter administration af et markeret datamærke i en ønsket del af mave-tarmkanalen. Vi præsenterer her, flere anvendelser af metoden herunder (1) evaluering af kolon permeabilitet til TMA, gut bakteriel metabolit, (2) evaluering af leveren clearance af TMA og (3) vurderingen af en gut-portal blod-leveren-perifere blod pathway af gut bakterier-stammer kortkædede fedtsyrer. Protokollen kan desuden også bruges til sporing af intestinale absorption og lever metabolisme af narkotika eller målinger af portalen blodtryk.
Introduction
Gut-blod barriere (GBB), også kendt som den intestinale barriere, er et komplekst multilayer system, der adskiller tarm lumen fra blodbanen for at begrænse passage af skadelige stoffer samtidigt med at tillade optagelsen af næringsstoffer1. Det består af tre primære lag: mukuslagets, epitel og lamina propria.
Mange faktorer kan påvirke GBB integritet og funktion2. Det har vist sig at GBB er forstyrret i både mave og extraintestinal sygdomme, herunder hjerte-kar- og metaboliske sygdomme3, hvilket kan føre til en øget passage af gut bakteriel metabolitter til blodbanen4. En øget penetration af gut bakteriel metabolitter kan påvirke driften af hele organismen. Nylige undersøgelser viser f.eks bakteriel metabolitter, indoler, H2S, kortkædede fedtsyrer (SCFA) og trimethylamin N-oxid, har en betydelig indvirkning på de kredsløbssygdomme funktioner5,6,7 ,8,9. Endelig er det blevet foreslået, at en øget GBB gennemtrængelighed kan tjene som markør af kardiovaskulære og metaboliske sygdomme, som er knyttet til morfologiske og funktionelle ændringer i tarmene10. Derfor, tracking gut-portal blod-leveren-systemiske blodet pathway bakteriel metabolitter kan være af interesse for både basale og kliniske videnskaber.
Almindeligt udnyttede eksperimentelle metoder til evaluering af GBB permeabilitet er udført i vitro ved hjælp af resektion intestinal segmenter, fragmenter af slimhinde, eller kunstige membraner11,12. Nøjagtigheden af disse metoder er kompromitteret af, at et velfungerende GBB kræver konstant intestinal blodgennemstrømning. På den anden side er tilgængelig i vivo -metoder baseret på vurderingen af urin eller perifert blod koncentrationer af eksogene markører13. Men perifere blod- og urinprøver koncentration af eksogene forbindelser er påvirket af nyrefunktionen, dvs glomerulær filtrationshastighed og rørformede udskillelse, samt af lever metabolisme, dvs., first-pass metabolisme. Begge parametre kan variere betydeligt mellem undersøgelse fag uafhængigt af funktionen GBB.
Dette papir beskriver en direkte måling af GBB permeabilitet i rotter ved hjælp af portalen blod prøveudtagning. Denne i vivo metode bevarer den intestinale blodgennemstrømningen og stort set ikke er påvirket af lever og nyre funktion. Den beskrevne fremgangsmåde er ikke almindeligt anvendt, muligvis på grund af nogle metodologiske vanskeligheder. Vi beskriver i detaljer kateterisation af portalen vene og ringere vena cava lige over leverens vene sammenløbet. Udtagning af blodprøve fra portalen vene og ringere vena cava tillader evaluering af GBB permeabilitet og leveren clearance og sporing af gut-portal blod-leveren-systemiske blodet pathway af molekyler af interesse, såsom tarmen bakteriel metabolitter eller medicin. Vi præsenterer også flere anvendelser af metoden, der blev testet i vores laboratorium. Disse omfatter vurdering af kolon permeabilitet til TMA, en gut bakteriel metabolit, evaluering af leveren clearance af TMA og evaluering af en gut-portal blod-leveren-systemiske blodet pathway af SCFA.
For at evaluere gut-blod barriere permeabilitet, følgende protokol trin bør følges i rækkefølge: 1 (indsættelse af linjen for intraintestinal forvaltninger), 3 (Vena kateterisation), 4 (Vena blod prøvetagning ), 6 (administration af en gut permeabilitet markør), 4.
For at evaluere lever clearance og en gut-portal blod-leveren-systemiske blodet pathway, følgende protokol trin bør følges i rækkefølge: 1 (indsættelse af linjen for intraintestinal forvaltninger), 2 (ringere vena cava kateterisation), 3 (Vena kateterisation), 4 (Vena blod prøveudtagning), 5 (ringere vena cava blod prøveudtagning), 6 (administration af en gut permeabilitet markør), 4, 5, 7 ( beregning af leveren clearance).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgene blev udført på mandlige Kyoto Wistar-rotter efter direktiv 2010/63 EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål og blev godkendt af de lokale bioetiske udvalg i Warszawa.
1. indsættelse af linjen til Intraintestinal Administration
Bemærk: Her foreslår vi intracolonic administration af markør ved hjælp af et kateter. Det kan ændres ved oral administration eller sonde på forskellige niveauer af fordøjelseskanalen f.eks. maven eller tolvfingertarmen. Husk at bruge engangs kirurgiske tøj, herunder kirurgisk kjole, hætte og handsker, og sørge for at følge de sikkerhedsforanstaltninger, der er relateret til de skarpe værktøjer, der anvendes i kirurgi (nåle, osv.) under procedurer 1-6.
- Hurtige dyr natten før proceduren. Udføre alle procedurer under generel anæstesi, dvs, fremstillet ved injektion af urethan 1,5 g/kg bw i.p. vurdere korrekt anesthetization ved manglen på hornhindens og øjenlågenes reflekser og tå-knivspids og hale-knivspids metode.
- Bruge en pediatric Foley kateter (10F eller 8F) som en Colon kateter. Markere kateter for at angive den del, der vil blive indsat i tyktarmen (ca 8 cm).
- Tjek den anale region og afføring indhold i endetarmen før du indsætter kateteret i tyktarmen. Hvis afføringen er til stede, skal du tømme endetarmen ved at massere området rektal.
- Sætte et smøremiddel (fx glycerin eller petrolatum) langs kateteret. Fugte anus og omegn med smøremidlet.
- Indsæt kateter med en guide wire ca 8 cm gennem den eksterne anal sphincter. Gøre langsom fremad-baglæns og cirkulære bevægelser.
Bemærk: Hold på kontrollere placeringen af kateteret ved abdominal palpation samtidigt med at indlagde kateteret.
2. ringere Vena Cava kateterisation
- Barbere pels i lysken. Skiftevis desinficere huden med alkohol og povidon-jod 3 gange og dække lysken med kirurgisk gardiner.
- Prøv at føle pulsen på arteria femoralis og skære i huden langs for længde på ca. 2,0 cm i det sted, hvor pulsen er håndgribelig.
- Dissekere fascia og muskler til at visualisere den neurovaskulære bundt.
- Dissekere den femorale vene fra neurovaskulære bundt: første nerver, så arteria femoralis, og derefter i venen.
Bemærk: Vær forsigtig under dissektion af det neurovaskulære bundt, da små grene af den femoralis vene kan nemt blive beskadiget, producere blødning. - Sætte to ligaturer på femoral venen. Ikke binde knuderne endnu. Fange enderne af den proksimale ligatur med en nål holder.
- Træk forsigtigt ligatur ender med indehaveren opad for at lukke den proksimale del af venen. Vent indtil venen er fyldt med blod og binde den distale knude.
- Gør et lille snit (ca. 1 mm) på retning mellem knude og proksimale ligatur, ved hjælp af microsurgical saks. Indsæt kateteret med pincet eller nålen med den buede ende.
Bemærk: Punktere venen og bruge bøjet spidsen af nålen som en guide til kateteret. Løsn den proksimale ligatur samtidigt med at indlagde kateteret. Indsæt kateter for 6-7,0 cm. - Sikre kateter i femoral venen med to enkelt kirurgisk knob. Binde den proksimale ligatur så godt.
- Kontrollere passage af kateteret ved at forsøge at trække blod med en sprøjte. Skyl kateter med 0,3 mL af heparinized saltvand (100 enheder/mL).
- Luk den kirurgiske sår med to lag af enkelt Sting.
3. portåren kateterisation
Figur 1 : Portal kateter. Portalen kateteret består af en nål OD: 0,9 mm med en længde på omkring 25,0 mm [A], en fleksibelt polyurethan kateter OD: 0,025", længde ca 100,0 mm [B], en fleksibelt polyethylen spidsen af kateteret OD: 0.040", ca 15,0 mm lang [C], et stik [D]. , og en ligatur 3/0 med en længde på 100,0 mm [E]. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Forberede portal kateteret efter figur 1.
- Indsæt den afskårne ende af nålen (OD: 9 mm) i polyurethan kateteret OD: 0,025".
- Binde ligatur 3/0 ved krydset af nål og kateter.
Bemærk: Sikre, at den længere del af ligature mindst 6 cm lang. - Sæt enden af kateteret OD: 0,025" i polyethylen kateter OD: 0.040".
- Luk kateter med en metal eller plastic plug.
- Midterlinjen laparotomi
- Barbere pels i maven, skiftevis desinficere huden med alkohol og povidon-jod 3 gange, og dække området med kirurgisk gardiner.
- Skær huden langs fra formet som et sværd af brystbenet til navlen.
- Skære musklerne i bugvæggen langs den hvide linje.
- Udvid cut rostrally i figuren Y, så den xiphoid brusk er mellem to nedskæringer.
- Portalen vene dissektion
- Fugte kirurgisk podninger med saltvand.
- Exteriorize af coecum, stigende og tværgående kolon og tyndtarmen loop. Sætte tarmene på venstre side for at afsløre roden af mesenterium.
Bemærk: Dæk tarmene med gaze fugtet med en fysiologisk kogsaltopløsning at beskytte tarmene fra tørring. - For at udsætte Vena, flytte omhyggeligt de hepatiske lapper til siderne eller opad mod mellemgulvet med de fugtede svaberprøver.
- Lokalisere del af portalen vene, der ikke er dækket med mesenterium (i den hepatiske hilum, omkring 5 mm lang) og passere ligatur 3/0 (15 cm lang) under portalen vene.
Bemærk: For at beskytte væv fra skader samtidig med at placere ligatur, fugte ligatur med en fysiologisk saltvand løsning. - Klemme enderne af ligatur med pincet og spænd det forsigtigt for at stabilisere fartøjet.
- Isætning og stabilisering af kateteret
- Passere den længere del af portalen kateteret ligatur under den frie del af portalen vene og trække det, således at kateteret ligger lige ved siden af portalen vene.
- Indsætte nålen ind i den øverste mesenteriallymfeknuderne vene 3 mm under krydset af øvre mesenteriallymfeknuderne vene og portal vene. Hold nålen i en vinkel på 30° og efter indtastning ind i venen, reducere vinklen og fremme nålen næsten vandret, parallel til Vena.
Bemærk: Indsætte nålen til en længde på ca 6-7 mm. Den stabiliserende ligatur bør forsigtigt stramme Vena samtidigt med at indlagde kateteret. - Påfør 1-2 dråber af væv lim på det sted, hvor nålen er indsat. Fjerne podninger, der dækker leveren.
- Sætte tarmene tilbage ind i bughulen.
- Fugte tarmene med en varmet op saltopløsning og dække det med fugtede steril gaze.
- Kontrollere passage af kateteret og skyl kateter med 0,3 mL af heparinized saltvand (100 enheder/mL).
Bemærk: Venøse blod spontant backflows i kateteret.
- Afslutning af operationen
- Efter 5 minutter, tjekke farven tarme og peristaltiske bevægelser, Sørg for at korrekt mesenteriallymfeknuderne blodgennemstrømningen er opretholdt.
- Luk bughulen med 3 sting: væg bughinden med det inderste lag af bugvæggen muskler - en kontinuerlig, resorberbare sutur; resterende muskler i bugvæggen - en kontinuerlig, resorberbare sutur; hud og subkutane væv - enkelt, ikke-resorberbare suturer.
Bemærk: Exteriorize den distale del af kateter omkring navlen.
4. portåren blod prøveudtagning
- Sample portal vene blod til tider efter specifikke test protokol brugt; Se tabel 1.
| Kort protokol | Lang protokol |
| t0 – oprindelig (før intracolonic administration) | t0 – oprindelig (før intracolonic administration) |
| t1 -5 min efter intracolonic administration | t1 – 30 min efter intracolonic administration |
| t2 -30 min efter intracolonic administration | t2 -60 min. efter intracolonic administration |
Tabel 1: Portal blodet prøveudtagning protokoller for gut permeabilitet vurdering.
NOTE: Tid mellem på hinanden følgende blod prøveudtagning afhænger hovedsageligt af biotilgængeligheden af de testede stoffer og site administration (tyktarmen, maven, osv.).
- Åbne portalen kateter stikket og lader blodet flyde frit.
- Brug sprøjten (vol. 2 mL) og stumpe nål OD: 0,9 mm. indsamle mere end 0,7 mL blod.
- Skyl kateter med 0,3 mL af heparinized saltvand (100 enheder/mL) og lukke kateter plug.
5. ringere Vena Cava blod prøveudtagning
- Prøven ringere vena cava blod til tider efter specifikke test protokol brugt; Se tabel 2.
| Portalen vene | Ringere vena cava |
| t0 – oprindelig (før intracolonic administration) | t0 – oprindelig (før intracolonic administration) |
| t1 – 30 min efter intracolonic administration | t1 – 30 min efter intracolonic administration |
Tabel 2: Protokol af blod prøveudtagning til leveren clearance måling og sporing af gut-portal blod-leveren-systemiske blodet pathway.
- Åbn den ringere vena cava kateter plug og lader blodet flyde frit.
- Indsamle mere end 0,7 mL blod ved hjælp af sprøjte (vol. 2 mL) og brudt nål OD: 0,9 mm.
- Skyl kateter med 0,2-0,3 mL af heparinized saltvand (100 enheder/mL) og lukke kateter plug.
6. administration af en Gut permeabilitet markør
- Fjerne guidewire og puste Colon kateter ballonen, ved hjælp af passende volumen af sterilt vand (normalt 1 mL men check faktiske ballon størrelse før indsættelse).
Bemærk: Ballon diameter må ikke overstige 1 cm. - Placere det rotte hovedet ned (hældning ca. 15%) for at minimere risikoen for udstrømning af den administrerede løsning fra tyktarmen.
- Langsomt administrere det testede stofs (f.eks. trimethylamin, 100 mg/kg bw) ved hjælp af en dræning port i Colon kateter.
Bemærk: Ikke overstige mængden af 0,75 mL af den administrerede løsning og fodring hastighed på 0,5 mL/min. at forhindre udstrømning af den administrerede løsning fra anus. - Efter 10 min deflatere kateter ballon.
- Prøven blod fra den ringere vena cava og Vena efter specifikke test protokol brugt; Se tabel 1 og tabel 2.
- Aflive dyr via godkendte metode.
7. beregning af leveren Clearance
- Express lever clearance, forstået som hepatisk udvinding af forskellen mellem portal blodkoncentration og ringere vena cava blodkoncentration eller forholdet mellem ringere vena cava til portalen blodkoncentration, (1 - (ringere vena cava koncentration / Vena koncentration)).
8. evaluering af Test stof koncentrationen n blodprøver
- Afhængigt af test-kemikaliet og prøvningsmetode, er underlagt prøven laboratorieprocedurer (centrifugering, osv.). I de foreslåede protokoller evaluerer vi TMA/TMAO og SCFA koncentration ved hjælp af væskekromatografi kombineret med triple-Quadrupol massespektrometri. Du kan finde en detaljeret beskrivelse af metoden i supplerende materiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har med succes målt GBB permeabilitet og leveren clearance af TMA i rotter. Vi har demonstreret, at hypertensive rotter har en øget kolon permeabilitet til TMA i forhold til normotensive rotter (figur 2)4. I en anden undersøgelse fandt vi, at høj saltindtag ikke påvirker GBB permeabilitet og leveren clearance af TMA (figur 3)14.
Måling af koncentrationen af SCFA i afføring, portal blodet og perifert blod, spore vi vej af molekyler fra tarmen til at den perifert blod. De eksemplariske resultater for disse eksperimenter er præsenteret i tabel 3.
Figur 2 : Hypertension-associerede ændringer i gut-blod barriere permeabilitet. Intracolonic administration af TMA produceret en betydelig stigning i portal blodet TMA i hver gruppe (n = 12 for hver gruppe). Stigningen i portal blodet TMA i gruppen hypertensive (SHR) var betydeligt højere end i normotensive (WKY) gruppe. Vi brugte den lange protokol bestående af blodprøvetagning 30 min og 60 min. efter TMA administration (IC TMA). Værdierne er middel + SE, *p < 0,05 vs baseline, #p < 0,05 WKY vs SHR. Dette tal er blevet ændret fra Jaworska et al. 4 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Gut-blod barriere permeabilitet og leveren clearance efter høj saltindtag. (A) Intracolonic administration af TMA produceret en betydelig stigning i portal blodet TMA. Størrelsen af stigningen var ens mellem grupperne (n = 7 for hver gruppe). Vi brugte en forenklet protokol, tager blodprøver på baseline (0) og 15 min efter administration af TMA (IC TMA). B TMA lever clearance var ens mellem grupper ved baseline og 15 min. efter intracolonic administration af TMA. Værdierne er middel, + SE. *p < 0,05 vs baseline. Dette tal er blevet ændret fra Bielinska et al. 14 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| SCFA | Taburet koncentration (µM) | Portalen blodkoncentration (µM) | Perifert blodkoncentration (µM) |
| AA - eddikesyre (C2) | 15998.40 ± 4317.58 | 564.22 ± 155.34 | 149.89 ± 31.74 |
| IPA - propionsyre (C3) | 5390.70 ± 1016.19 | 138.25 ± 55,50 | 5,36 ± 3.25 |
| IBA-isobutyric syre (C4) | 191.20 ± 123.87 | 4.51 ± 1,60 | 1.14 ± 1.16 |
| BA - smørsyre (C4) | 4159.80 ± 3141.68 | 143.14 ± 68.42 | 6.43 ± 4.18 |
| 2MeB-2 methylbutyric syre (C5) | 80.90 ± 59.86 | 2.02 ± 0,88 | 1.14 ± 1.42 |
| IVA-isovaleric syre (C5) | 109.10 ± 56.05 | 2,59 ± 1.07 | 0,90 ± 1,22 |
| VA - valeric syre (C5) | 281.9 ± 158.20 | 8,55 ± 3,56 | 0,72 ± 1,02 |
| ICA-isocaproic syre / 4-methylvaleric syre (C6) | 5.9 ± 2,95 | 0,61 ± 0,15 | 1.76 ± 0.87 |
| CA - capronsyre (C6) | 287.00 ± 309.68 | 11.19 ± 4.94 | 1.12 ± 0,93 |
Tabel 3: SCFA koncentration i afføringen, portal blodet og perifert blod (n = 7).
| Test-kemikaliet | Eventuel anvendelse |
| Bakteriel metabolitter: trimethylamin (TMA), kortkædede fedtsyrer (SCFA), hydrogensulfid, osv. |
GBB permeabilitet undersøgelser Sporing af en gut-portal blod-leveren-systemisk blod vej Nedsat clearance undersøgelser |
| Klassiske permeabilitet markører: FITC-dextran, polysaccharider, PIND, osv. |
GBB permeabilitet undersøgelser |
| Narkotika | absorption og hepatisk clearance undersøgelser |
Tabel 4: Eksemplarisk prøvestoffer med mulige applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrives direkte, i vivo, metode til måling af GBB permeabilitet fastholder closetophysiological betingelser i mave-tarmsystemet (bevarer den intestinale blodgennemstrømning), og stort set ikke er påvirket af lever og nyre funktion.
Den kritiske trin af denne teknik er indsættelsen af portalen kateteret. Dette skal gøres forsigtigt og beslutsomt på samme tid. En mild, korte blødning kan forekomme fra det korrekt udførte punktering af Vena; men det stopper når nålen er indsat i fartøjet. Vedvarende blødning viser at portalen vene er perforeret. For at lette kateter indsættelse, bør Vena være godt eksponeret. Efter exteriorizing tarmene, når mesenteriallymfeknuderne roden er godt eksponeret, den øverste mesenteriallymfeknuderne vene bør også være synlig (mesenteriallymfeknuderne vene træder cranially i portal vene). Portalen vene er normalt dækket af de hepatiske fliger, som skal flyttes til siderne. Også, en ordentlig stabilisering af portalen kateteret er afgørende for en vellykket procedure, da den kateter bevægelse kan producere portåren brud og blødning, især i længere eksperimenter. Yderligere stabilisering af kateteret kan opnås ved at knytte kateteret til mesenterium af stikning det til en mesenterium med væv lim eller ved at anvende to enkelt sting (tråd 6/0). Efter lukketid i bughulen for at sikre placeringen af kateteret, kan en pung-streng sutur anvendes på kateteret.
Der er adskillige mindre problemer, der kan opstå under eksperimentet. Efter kateterisation af den femorale vene, hvis den venøse blod ikke ikke tilbagestrømning i kateteret, Prøv følgende løsninger: Skyl kateter med heparinized saltvand, forsigtigt trække kateteret 1-2 mm fra venen, fjerne de kirurgiske knuder og binde en ny one, pull kateteret ud og genindsætte eller erstatte med et nyt kateter. Husk at bekræfte den korrekt placering af kateteret efter forsøget. Kateteret skal indsættes for 6-7 cm, afhængigt af størrelsen på dyret, placere den proksimale spidsen af kateteret i den ringere vena cava lige over leverens vene sammenløbet. Når det kommer til colon kateterisation, hvis du har problemer med fremrykkende kateteret du kan injicere 0,3-0,5 mL saltvand eller orlov kateter i tyktarmen for 5-10 minutter, og prøv igen. Brug ikke kraft mens du indsætter et kateter for at undgå perforation af tarmen.
I vores undersøgelser brugte vi en tarm bakterier-stammer molekyle, trimethylamin (TMA), som markør for kolon GBB permeabilitet, som TMA er produceret for det meste af Colon bakterier. Dog, mange andre stoffer, herunder klassiske permeabilitet markører som FITC-dextran eller sukker, kan bruges som godt (Se tabel 4). Når du forbereder en opløsning af prøvestof, tage hensyn til den irriterende effekt på tarmslimhinden og passende vælge koncentrationen af stoffet. Yderligere laboratorieprocedurer af blodprøverne skal justeres til den valgte markør.
Vi foreslår i vores protokol, intracolonic administration af en markør; Det kan dog ændres ved oral administration eller sonde på forskellige niveauer af fordøjelseskanalen. Variabel hastighed peristaltikken og mulige interaktioner med enzymer og mavesyre bør tages i betragtning samtidig administration af en markør i øverste dele af mave-tarmkanalen f.eks. maven eller tolvfingertarmen. Tidspunkt for udtagning af blodprøve efter indgift af en markør skal derfor justeres.
Der er flere begrænsninger i metoden præsenteres, herunder bivirkninger af anæstesi og fastende natten over, at kan både påvirke GBB funktion. Det bør tages i betragtning som proceduren er terminal og indebærer udtagning af blodprøve under ikke fuldt fysiologiske tilstande. Men som nævnt før, det har stadig mange fordele i forhold til andre eksperimentelle metoder vurdere GBB permeabilitet, især udføres in vitro-11. For eksempel, måler en Ussing-kammer den ledningsevne og partiklen flux gennem de intestinale epitel celler. Den væsentligste svaghed ved denne teknik ligger i dens overdrevne forenkling. Det er svært at beskrive den komplekse fysiologiske system af tarmslimhinden ved hjælp af et lille antal målinger på epitelcelle lag alene. Nogle forskere bruger hele-tykkelse tarmen til Ussing kammer undersøgelser, men denne fremgangsmåde er ledsaget af flere metodologiske komplikationer15. Derudover er metodens nøjagtighed kompromitteret af en begrænset levedygtighed af væv isoleret fra organismen. Nogle in vitro- metoder, der anvendes i Farmakokinetiske undersøgelser bruge kunstige membraner som en model af intestinal barriere12. Men disse metoder, ligeledes til Ussing-kammer, ikke afspejler kompleksiteten af GBB struktur og funktioner.
Der er også i vivo permeabilitet assays til rådighed i eksperimentelle og kliniske undersøgelser. De er for det meste baseret på urin eller perifert blod prøveudtagning efter mundtlig eller Colon administration af forskellige markører13. Den udbredte sukker test indebærer oral indtagelse af mono- og oligosaccharider, som ikke metaboliseres i pattedyr organisme, fx mannitol og Lose. Metoden er non-invasiv og kan anvendes i både eksperimentel og klinisk brug16,17; men resultaterne er påvirket af first-pass lever metabolisme og nyre funktion, som kan variere betydeligt mellem undersøgelse emner. I modsætning til de ovenfor nævnte indirekte metoder tillader at indsamle blod fra Vena direkte vurdering af GBB permeabilitet12. Denne metode er ikke afhængige af lever og nyre funktion og stort set bevarer fysiologiske tilstande i tarmen, hvilket er en vigtig fordel over ex vivo eller in vitro- metoder.
De teknikker, der er beskrevet i denne hvidbog også give mulighed for en forholdsvis nøjagtig lever clearance evaluering, som blodet er indsamlet fra portalen vene og ringere vena cava lige over leverens vene sammenløbet. De repræsentative resultater for hepatisk udvinding er præsenteret i figur 3 (for TMA) og tabel 3 (for SCFA). Vores data tyder på, at tre vigtigste SCFA, acetat, propionat og butyrat, er karakteriseret ved forskellige hepatiske clearance, som støttes af tidligere undersøgelser, hvor Bloemen et al. vist at tarm frigivelse af butyrat og propionat, men ikke acetat, er næsten tangerede af hepatisk optagelse18. Derfor er præsenteres protokollen velegnet til sporing af intestinale absorption og lever metabolisme af stoffer, som kan bruges i Farmakokinetiske undersøgelser.
Teknikkerne kan også tilpasses andre eksperimentelle formål. Kateterisation af Vena kan bruges til at måle portalen blodtryk eller administration af medicin direkte til portalen vene, for at studere hepatisk omsætning. For eksempel, i vores tidligere arbejde administreres vi hydrogensulfid donorer til Vena at vurdere dens indflydelse på hepatisk omsætning og portal pres19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Arbejdet er støttet af Ministeriet for videnskab og videregående Republikken Polen, Diamond give nr: DI2017 009247.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needle OD: 9 mm | Becton Dickinson S.A. | 301300 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-40 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-25 | |
| C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD | Cole-Parmer Instrument Co. | 06424-59 | |
| Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F) | Sigmed | 0000 80305 | |
| Surgical ligatures 3/0 | Yavo Sp. Z o.o. | P48JE | |
| Absorbable surgical sutures - Polyglactine 910 4/0 | KRUUSE Polska Sp. Zo.o. | 152336 | |
| Tissue glue - Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive | Loctite | 1370127 | |
| Povidone iodine | EGIS Pharmaceuticals PLC | 4449 11 | |
| Heparin - Heparinium WZF | WZF Polfa S.A. | 02BK0417 | Dilute 10 times with physiological saline |
| Glycerin 86% | Laboratorium Farmaceutyczne Avena | 5.90999E+12 | Serves as a lubricant in colon catheterization |
| Xylocaine 2% | AstraZenca | 9941342 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich (Merck) | U2500-500G | |
| Trimethylamine solution 45% | Sigma-Aldrich (Merck) | 92262-1L | |
| Syringes 2 mL | B.Braun Melsungen AG | 4606027V | |
| Saline 250 mL | Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o. | 15LL707WL | |
| Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends | Braun | NS-010-115-PKM | |
| Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 " | Braun | KN-008-140-ZMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7x0.55 | Braun | PO-001-007-ZMK | |
| Micro Scissors type Vannas, straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm | Braun | NO-010-085-PMK | |
| Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8" | Braun | HO-128-130-PMK | |
| Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2 | Braun | IM-927-150-PZMK | |
| Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp | Braun | NO-052-110-PMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp | Braun | PO-022-001-PMK |
References
- Camilleri, M., Madsen, K., Spiller, R., Greenwood-Van Meerveld, B., Verne, G. N. Intestinal barrier function in health and gastrointestinal disease. Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 24 (6), 503-512 (2012).
- Keita, A. V., Soderholm, J. D. The intestinal barrier and its regulation by neuroimmune factors. Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 22 (7), 718-733 (2010).
- Farhadi, A., Banan, A., Fields, J., Keshavarzian, A. Intestinal barrier: an interface between health and disease. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (5), 479-497 (2003).
- Jaworska, K., et al. Hypertension in rats is associated with an increased permeability of the colon to TMA, a gut bacteria metabolite. PloS one. 12 (12), e0189310 (2017).
- Fujii, H., Nakai, K., Fukagawa, M. Role of oxidative stress and indoxyl sulfate in progression of cardiovascular disease in chronic kidney disease. Therapeutic Apheresis and Dialysis: Official Peer-Reviewed Journal of the International Society for Apheresis, the Japanese Society for Apheresis, the Japanese Society for Dialysis Therapy. 15 (2), 125-128 (2011).
- Tomasova, L., et al. Intracolonic hydrogen sulfide lowers blood pressure in rats. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 60, 50-58 (2016).
- Brahe, L. K., Astrup, A., Larsen, L. H. Is butyrate the link between diet, intestinal microbiota and obesity-related metabolic diseases? Obesity Reviews: An Official Journal of the International Association for the Study of Obesity. 14 (12), 950-959 (2013).
- Ufnal, M., et al. Trimethylamine-N-oxide: a carnitine-derived metabolite that prolongs the hypertensive effect of angiotensin II in rats. The Canadian Journal of Cardiology. 30 (12), 1700-1705 (2014).
- Huc, T., Nowinski, A., Drapala, A., Konopelski, P., Ufnal, M. Indole and indoxyl sulfate, gut bacteria metabolites of tryptophan, change arterial blood pressure via peripheral and central mechanisms in rats. Pharmacological Research. 130, 172-179 (2018).
- Ufnal, M., Pham, K. The gut-blood barrier permeability - A new marker in cardiovascular and metabolic diseases? Medical Hypotheses. 98, 35-37 (2017).
- Le Ferrec, E., et al. In vitro models of the intestinal barrier. The report and recommendations of ECVAM Workshop 46. European Centre for the Validation of Alternative methods. Alternatives to Laboratory Animals: ATLA. 29 (6), 649-668 (2001).
- Bohets, H., et al. Strategies for absorption screening in drug discovery and development. Current Topics in Medicinal Chemistry. 1 (5), 367-383 (2001).
- Grootjans, J., et al. Non-invasive assessment of barrier integrity and function of the human gut. World Journal of Gastrointestinal Surgery. 2 (3), 61-69 (2010).
- Bielinska, K., et al. High salt intake increases plasma trimethylamine N-oxide (TMAO) concentration and produces gut dysbiosis in rats. Nutrition. 54, 33-39 (2018).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Denno, D. M., et al. Use of the lactulose to mannitol ratio to evaluate childhood environmental enteric dysfunction: a systematic review. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 Suppl 4, S213-S219 (2014).
- Lugea, A., Salas, A., Casalot, J., Guarner, F., Malagelada, J. R. Surface hydrophobicity of the rat colonic mucosa is a defensive barrier against macromolecules and toxins. Gut. 46 (4), 515-521 (2000).
- Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clinical Nutrition. 28 (6), 657-661 (2009).
- Huc, T., et al. Colonic hydrogen sulfide produces portal hypertension and systemic hypotension in rats. Experimental Biology and Medicine. 243 (1), 96-106 (2018).
