Summary
Der Zugang von Nährstoffen, Mikrobiota Metaboliten und Arzneimitteln für den Verkehr wird durch die Darm-Blut-Schranke (GBB) gesteuert. Wir beschreiben eine direkte Methode zur Messung der GBB Durchlässigkeit in Vivo, die im Gegensatz zu gängigen indirekte Methoden praktisch nicht von Leber und Niere Funktionen betroffen ist.
Abstract
Die Darm-Blut-Schranke (GBB) steuert den Übergang der Nährstoffe, bakteriellen Stoffwechselprodukte und Drogen vom Darmlumen in den Blutstrom. GBB-Integrität ist bei Magen-Darm-, Herz-Kreislauf- und Stoffwechsel-Erkrankungen, gestört, was zu leichteren Zugang von biologisch aktiven Verbindungen, z. B. Darm bakteriellen Stoffwechselprodukten, in den Blutkreislauf führen kann. So kann die Durchlässigkeit der GBB ein Marker für Darm- und intestinalem Krankheiten sein. Darüber hinaus kann die erhöhte Penetration von bakteriellen Stoffwechselprodukte beeinflussen das Funktionieren des gesamten Organismus.
Häufig verwendete Methoden zur Untersuchung der GBB Durchlässigkeit sind durchgeführten ex Vivo. Die Genauigkeit dieser Methoden ist begrenzt, da die Funktionsweise der GBB Darm Durchblutung abhängt. Auf der anderen Seite häufig verwendete in-Vivo -Methoden können voreingenommen durch Leber und Niere Leistung, da diese Methoden auf der Bewertung des Urins basieren oder / und peripherem Blutkonzentrationen von exogenen Marker. Hier präsentieren wir Ihnen eine direkte Messung der GBB Durchlässigkeit bei Ratten mit einer in-Vivo -Methode basierend auf Portal Blut Probenahme, das intestinale Blutfluss bewahrt und ist praktisch nicht von der Leber und Niere Funktion betroffen.
Polyurethan-Katheter in der Pfortader eingefügt und unteren Hohlvene oberhalb der Leber Venen Zusammenfluss. Blut wird an der Basislinie und nach der Verabreichung eines ausgewählten Marker in einen gewünschten Teil des Magen-Darm-Trakt aufgenommen. Hier präsentieren wir Ihnen mehrere Anwendungen der Methode (1) Bewertung der Doppelpunkt Durchlässigkeit für TMA, ein Darm bakterielle Stoffwechselprodukt, (2) Beurteilung der Leber Clearance von TMA und (3) Bewertung der ein Darm-Portal Blut-Leber-peripheren Blut Weg, Darm Bakterien stammenden kurzkettigen Fettsäuren. Das Protokoll kann darüber hinaus auch für die Verfolgung von intestinale Resorption und LEBERSTOFFWECHSEL von Medikamenten oder für Messungen des Blutdrucks Portal verwendet werden.
Introduction
Die Darm-Blut-Schranke (GBB), auch bekannt als die Darmbarriere, ist ein komplexes multilayer-System, das das Darm Lumen aus dem Blutkreislauf trennt, um den Durchgang von schädlichen Verbindungen zu begrenzen, wobei die Absorption von Nährstoffen1. Es besteht aus den drei Hauptschichten: die Schleimschicht, Epithel und Lamina Propria.
Zahlreiche Faktoren können die GBB Integrität und Funktion2auswirken. Es hat sich gezeigt, dass GBB gestört ist, im Magen-Darm- und intestinalem Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf-und Stoffwechselerkrankungen3, was zu einer erhöhten Passage der Darm bakteriellen Stoffwechselprodukte an die Blutbahn4führen kann. Eine erhöhte Durchdringung der Darm bakteriellen Stoffwechselprodukte beeinträchtigen die Funktion des gesamten Organismus. Zum Beispiel, zeigen neuere Studien einen signifikanten Einfluss von bakteriellen Stoffwechselprodukten wie indole, H2S, Kurzkettige Fettsäuren (SCFA) und Trimethylamin-N-oxid, auf das Herz-Kreislauf-System Funktionen5,6,7 ,8,9. Schließlich wurde es vorgeschlagen, dass ein erhöhter Durchlässigkeit der GBB als Marker für Herz-Kreislauf-und Stoffwechselerkrankungen dienen kann, die morphologische und funktionelle Veränderungen in den Darm10zugeordnet sind. Daher möglicherweise verfolgen die Darm-Portal Blut-Leber-systemische Blut weg von bakteriellen Stoffwechselprodukten von Interesse für die Grundlagenforschung und klinische Wissenschaften.
Häufig verwendete experimentelle Methoden zur Bewertung der GBB Durchlässigkeit sind durchgeführten in-vitro- mit reseziertem Darm Segmenten, Fragmente von Schleimhaut oder künstliche Membranen11,12. Die Genauigkeit dieser Methoden ist durch die Tatsache beeinträchtigt, Funktionsfähigkeit der GBB verlangt ständige Darm Blutfluss. Erhältlich in-Vivo -Methoden basieren auf der anderen Seite auf die Bewertung des Urins oder peripherem Blutkonzentrationen von exogenen Marker13. Allerdings peripheren Blut und Urin-Konzentration von exogenen Verbindungen von Nierenfunktion, d. h. die glomeruläre Filtrationsrate und tubuläre Ausscheidung sowie von LEBERSTOFFWECHSEL beeinflusst wird, d.h., first-pass Metabolismus. Beide Parameter können zwischen Probanden unabhängig von der GBB-Funktion erheblich abweichen.
Dieses Whitepaper beschreibt ein direktes Maß für die GBB Durchlässigkeit in Ratten mit Portal Blutabnahme. Diese in-Vivo -Methode schont den Darm Blutfluss und nahezu unbeeinflusst von Leber-und Nierenfunktion. Die beschriebene Vorgehensweise ist nicht, möglicherweise aufgrund methodischen Schwierigkeiten verbreitet. Wir beschreiben ausführlich die Katheterisierung der Pfortader und der unteren Hohlvene oberhalb des Zusammenflusses Lebervene. Blutentnahme aus der Pfortader und minderwertige Vena Cava ermöglicht die Bewertung der GBB Durchlässigkeit und Leber Clearance sowie Verfolgung von Darm-Portal Blut-Leber-systemische Blut weg von Molekülen von Interesse, wie Darm bakteriellen Stoffwechselprodukte oder Medikamente. Wir präsentieren auch mehrere Anwendungen der Methode, die in unserem Labor getestet wurden. Dazu gehören die Bewertung der Doppelpunkt Durchlässigkeit für TMA, ein Darm bakterielle Stoffwechselprodukt, Beurteilung der Leber Clearance von TMA und Evaluierung eines Blut-Leber-systemische Blut Darm-Portal-Pfades der SCFA.
Um Darm-Blut-Schranke Permeabilität zu bewerten, Protokoll folgendermaßen befolgt werden in der Reihenfolge: 1 (Einfügung der Linie für intraintestinal Verwaltungen), 3 (Pfortader Katheterisierung), 4 (Pfortader Blutabnahme ), 6 (Verwaltung der Darm Durchlässigkeit Marker), 4.
Zur Bewertung von Leber-Clearance und einen Darm-Portal Blut-Leber-systemische Blut Weg Protokoll folgendermaßen befolgt werden in der Reihenfolge: 1 (Einfügung der Linie für intraintestinal Verwaltungen), 2 (minderwertige Vena Cava Katheterisierung), 3 (Pfortader Katheterisierung), 4 (Pfortader Blutabnahme), 5 (minderwertige Vena Cava Blutabnahme), 6 (Verwaltung der Darm Durchlässigkeit Marker), 4, 5, 7 ( Berechnung der Leber Clearance).
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Protocol
Die Experimente wurden an männlichen Kyoto Wistar-Ratten gemäß EU-Richtlinie 2010/63 über den Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt und durch die ich bioethischen Lokalkomitees in Warschau angenommen wurden.
1. Einfügen der Zeile für die Intraintestinal Verwaltung
Hinweis: Hier schlagen wir Intracolonic Verwaltung eines Markers mit einem Katheter. Er kann durch orale Verabreichung oder Magensonde auf verschiedenen Ebenen im Verdauungstrakt z.B. Magen oder Zwölffingerdarm geändert werden. Vergessen Sie nicht, verwenden Sie Einweg-OP-Bekleidung, einschließlich op-Kittel, Haube und Handschuhe, und stellen sicher, dass die Sicherheitsvorkehrungen im Zusammenhang mit der scharfen Werkzeugen in der Chirurgie (Nadeln, etc.) verwendet, während Verfahren 1-6 folgen.
- Schnelle Tiere über Nacht vor dem Eingriff. Führen Sie alle Verfahren in Vollnarkose, z.B. durch Injektion von Urethan 1,5 g/kg bw i.p Assess richtige Anesthetization durch das Fehlen von palpebrale und Hornhaut Reflexe und durch Zehe-Prise und Heck-Prise Methode erhalten.
- Verwenden Sie einen pädiatrische Foley Katheter (10F oder 8F) als ein Kolon Katheter. Markieren Sie den Katheter um das Teil anzugeben, das in den Dickdarm (ca. 8 cm) eingefügt wird.
- Überprüfen der Analbereich und der Hocker Inhalt im Enddarm vor dem Einführen des Katheters in den Darm. Wenn Hocker vorhanden ist, Entleeren Sie den Enddarm durch das Massieren der rektalen Bereich.
- Setzen Sie ein Gleitmittel (z.B. Glycerin oder Vaseline) entlang des Katheters. Befeuchten Sie den Anus und seine Umgebung mit dem Schmiermittel.
- Legen Sie den Katheter mit einem Reiseführer Draht ca. 8 cm über den externen analen Schließmuskel. Machen Sie langsamere vorwärts-rückwärts und kreisförmige Bewegungen.
Hinweis: Halten Sie sich auf die Lage des Katheters durch abdominale Palpation beim Einführen des Katheters überprüfen.
(2) minderwertige Vena Cava Katheterisierung
- Fell in der Leistengegend zu rasieren. Abwechselnd 3 Mal die Haut mit Alkohol und Povidon-Jod zu desinfizieren und die Leistengegend mit op-Tüchern abdecken.
- Versuchen Sie, fühlen Sie den Puls auf die Femoral Arterie und schneiden Sie die Haut längs für die Dauer von ca. 2,0 cm an der Stelle, wo der Puls fühlbar ist.
- Sezieren der Faszien und Muskeln, das Neurovaskuläre Bündel zu visualisieren.
- Sezieren die femorale Ader aus dem neurovaskulären Bündel: erste Nerven, dann die Femoral Arterie und der Vene.
Hinweis: Achten Sie während der Präparation des neurovaskulären Bündels, da kleine Zweige der femoral Ader leicht beschädigt werden können, produzieren, Blutungen. - Legen Sie zwei Ligaturen auf der femoral Ader. Binden Sie der Knoten noch nicht. Fangen Sie die Enden der proximalen Ligatur mit einem Nadelhalter.
- Ziehen Sie vorsichtig die Ligatur enden mit dem Halter nach oben um den proximalen Teil der Vene zu schließen. Warten Sie, bis die Vene mit Blut gefüllt ist und Leben Sie den distalen Bund fürs.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1 mm) auf die Vene zwischen dem Knoten und dem proximalen Ligatur mit einer mikrochirurgischen Schere. Legen Sie den Katheter mit Pinzette oder Nadel mit dem gebogenen Ende.
Hinweis: Punktion der Vene und die gebogene Spitze der Nadel als Leitfaden für den Katheter verwenden. Lösen Sie die proximalen Ligatur beim Einführen des Katheters. Legen Sie den Katheter für 6-7,0 cm. - Sichern Sie den Katheter in die femoral Ader mit zwei einzelnen chirurgischen Knoten. Die proximalen Ligatur sowie zu binden.
- Überprüfen Sie die Durchgängigkeit des Katheters durch den Versuch, mit einer Spritze Blutabnahme. Spülen Sie den Katheter mit 0,3 mL heparinisierten Kochsalzlösung (100 Einheiten/mL).
- Schließen Sie die Operationswunde mit zwei Schichten von einzelnen Stichen.
(3) Pfortader Katheterisierung
Abbildung 1 : Portal Katheter. Der Portal Katheter besteht aus einer Nadel OD: 0,9 mm mit einer Länge von ca. 25,0 mm [A], eine flexible Polyurethan-Katheter OD: 0,025", Länge ca. 100,0 mm [B], eine flexible Polyethylen-Spitze des Katheters OD: 0,040", ca. 15,0 mm lang [C], einen Stecker [D]. , und eine Ligatur 3/0 mit einer Länge von 100,0 mm [E]. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Bereiten Sie den Portal Katheter nach Abbildung 1.
- Legen Sie das abgeschnittene Ende der Nadel (OD: 9 mm) in der Polyurethan-Katheter OD: 0,025".
- Binden Sie die Ligatur 3/0 an der Kreuzung der Nadel und Katheter.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der längere Teil der Ligatur mindestens 6 cm lang ist. - Stecken Sie das Ende des Katheters OD: 0,025" in der Polyethylen-Katheter OD: 0,040".
- Schließen Sie den Katheter mit einem Metall- oder Kunststoff-Stecker.
- Mittellinie Laparotomie
- Fell in den Bauch rasieren, abwechselnd Desinfizieren der Haut mit Alkohol und Povidon-Jod 3 Mal und decken den Bereich mit op-Tüchern.
- Schneiden Sie die Haut längs aus dem Xiphoid des Brustbeins bis zum Nabel.
- Schneiden Sie die Muskeln der Bauchwand entlang der weißen Linie.
- Erweitern Sie den Schnitt Rostral in Y-Form, so dass die xiphoid Knorpel zwischen zwei Schnitten ist.
- Pfortader Dissektion
- Befeuchten Sie die chirurgische Tupfer mit Kochsalzlösung.
- Exteriorize der Blinddarm, aufsteigend und Colon transversum und Dünndarm Schleife. Setzen Sie den Darm auf der linken Seite um die Wurzel des das Mesenterium verfügbar zu machen.
Hinweis: Bedecken Sie den Darm mit Gaze angefeuchtet mit einer physiologischen Kochsalzlösung, den Darm vor dem Austrocknen zu schützen. - Um die Pfortader offen zu legen, bewegen Sie vorsichtig die hepatischen Lappen an den Seiten oder oben auf die Membran mit dem angefeuchteten Tupfer.
- Lokalisieren Sie den Teil der Pfortader, die nicht mit dem Mesenterium (in den hepatischen Hilum, ca. 5 mm lang) bedeckt ist und übergeben Sie die Ligatur 3/0 (15 cm lang) unter die Pfortader.
Hinweis: Um Gewebe vor Schäden zu schützen während des Einsetzens der Ligatur, Befeuchten Sie die Ligatur mit physiologischer Kochsalzlösung. - Klemmen Sie die Enden der Ligatur mit Zange und ziehen Sie es vorsichtig, um das Schiff zu stabilisieren.
- Einfügung und Stabilisierung des Katheters
- Übergeben Sie den längeren Teil der Portal Katheter Ligatur unter den freien Teil der Pfortader und ziehen Sie ihn so, dass der Katheter direkt neben der Pfortader liegt.
- Stechen Sie die Nadel in die oberen mesenterialen Vene 3 mm unterhalb der Kreuzung der oberen mesenterialen Vene und die Pfortader. Halten Sie die Nadel in einem Winkel von 30° und nach der Eingabe in die Vene, reduzieren Sie den Winkel und die Nadel fast horizontal, parallel zu der Pfortader.
Hinweis: Setzen Sie die Nadel auf einer Länge von ca. 6-7 mm. Die stabilisierende Ligatur sollte sanft die Pfortader anziehen, beim Einführen des Katheters. - Geben Sie 1-2 Tropfen Gewebekleber an der Stelle wo die Nadel eingeführt wird. Entfernen Sie die Tupfer, die Leber zu decken.
- Setzen Sie den Darm wieder in die Bauchhöhle.
- Der Darm mit einer aufgewärmten Kochsalzlösung anfeuchten und mit angefeuchteten steriler Gaze abdecken.
- Überprüfen Sie die Durchgängigkeit des Katheters und spülen Sie den Katheter mit 0,3 mL heparinisierten Kochsalzlösung (100 Einheiten/mL).
Hinweis: Venöses Blut spontan Rückflüsse in den Katheter.
- Ende der Operation
- Überprüfen Sie nach 5 Minuten die Farbe der Darm und der peristaltischen Bewegungen, stellen Sie sicher, dass die mesenterialen Blutfluss aufrechterhalten wird.
- Schließen Sie die Bauchhöhle mit 3 Maschen: Wand-Peritoneum mit der inneren Schicht der Bauchwand Muskeln - eine kontinuierliche, resorbierbaren Naht; übrigen Muskeln der Bauchwand - eine kontinuierliche, resorbierbaren Naht; Haut und Unterhaut - einzelne, nicht resorbierbaren Fäden.
Hinweis: Exteriorize den distalen Teil des Katheters um den Nabel herum.
(4) Pfortader Blood Sampling
- Probe Pfortader Blut zeitweise nach dem spezifischen Test-Protokoll verwendet; siehe Tabelle 1.
| Kurzes Protokoll | Langen Protokoll |
| t0 -Basislinie (vor Intracolonic) | t0 -Basislinie (vor Intracolonic) |
| t1 – 5 Minuten nach der Verabreichung von intracolonic | t1 – 30 min nach Intracolonic Verwaltung |
| t2 – 30 min. nach der Verabreichung von intracolonic | t2 – 60 min nach der Verabreichung von intracolonic |
Tabelle 1: Portal Blut Probenahme Protokolle für Darm Durchlässigkeit Bewertung.
Hinweis: Die Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Blutabnahme richtet sich vor allem auf die Bioverfügbarkeit der untersuchten Substanzen und der Ort der Verwaltung (Darm, Magen usw.).
- Öffnen Sie den Portal Katheter-Stecker und lassen Sie den Blutfluss frei.
- Verwendung Spritze (Vol. 2 mL) und stumpfe Nadel OD: 0,9 mm. Max. 0,7 mL Blut sammeln.
- Spülen Sie den Katheter mit 0,3 mL heparinisierten Kochsalzlösung (100 Einheiten/mL) und schließen Sie den Katheter-Stecker.
(5) minderwertige Vena Cava Blutabnahme
- Probe minderwertige Vena Cava Blut zeitweise nach dem spezifischen Test-Protokoll verwendet; siehe Tabelle 2.
| Pfortader | Minderwertige Vena cava |
| t0 -Basislinie (vor Intracolonic) | t0 -Basislinie (vor Intracolonic) |
| t1 – 30 min nach Intracolonic Verwaltung | t1 – 30 min nach Intracolonic Verwaltung |
Tabelle 2: Protokoll des Blutes Probenahme für Leber Freimessung und Verfolgung des Darm-Portal Blut-Leber-systemische Blut Weges.
- Öffnen des minderwertigen Vena Cava-Katheter-Steckers und den Blutfluss frei lassen.
- Sammeln Sie nicht mehr als 0,7 mL Blut mit Spritze (Vol. 2 mL) und gebrochene Nadel OD: 0,9 mm.
- Spülen Sie den Katheter mit 0,2-0,3 mL heparinisierten Kochsalzlösung (100 Einheiten/mL) und schließen Sie den Katheter-Stecker.
6. Verwaltung der Darm Durchlässigkeit Marker
- Entfernen Sie den Führungsdraht und Pumpen Sie den Kolon Katheter Ballon, mit ausreichend Volumen von sterilem Wasser (in der Regel 1 mL aber tatsächliche ballongröße Check vor dem einsetzen).
Hinweis: Der ballondurchmesser sollte 1 cm nicht überschreiten. - Legen Sie die Ratte-Kopf nach unten (etwa 15 % Neigung) zur Minimierung des Risikos des Abflusses der verabreichten Lösung aus dem Dickdarm.
- Die getestete Substanz langsam zu verwalten (z. B. Trimethylamin, 100 mg/kg bw) mit einem Abfluss Anschluss im Kolon Katheter.
Hinweis: Überschreiten Sie nicht die Lautstärke von 0,75 mL der Lösung verabreicht und die Zuführgeschwindigkeit von 0,5 mL/min, den Abfluss der verabreichten Lösung aus dem Anus zu verhindern. - Nach 10 min entlüften des Katheter Ballons.
- Probe des Blutes von der minderwertigen Vena Cava und die Pfortader nach dem spezifischen Test-Protokoll verwendet; siehe Tabelle 1 und Tabelle 2.
- Einschläfern Sie Tier über anerkannte Methode.
7. Berechnung der Leber Clearance
- Leber-Clearance, verstanden als hepatische Extraktion durch die Differenz zwischen Portal Blut-Konzentration und minderwertige Vena Cava Konzentration im Blut oder durch das Verhältnis der unteren Hohlvene Portal Blut Konzentration, (1 - (minderwertige Vena Cava Konzentration Express / Pfortader Konzentration)).
8. Bewertung der Substanz Konzentration n Blut Prüflinge
- Abhängig von der Prüfsubstanz und Testmethodik vorbehaltlich der Probenmaterials entsprechenden Laborverfahren (Zentrifugation, etc.). In der vorgeschlagenen Protokolle bewerten wir TMA/TMAO und SCFA Konzentration mit Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie. Finden Sie eine ausführliche Beschreibung der Methode im Zusatzmaterial.
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Representative Results
Wir haben erfolgreich die GBB Durchlässigkeit und Leber Clearance von TMA bei Ratten gemessen. Wir haben gezeigt, dass Hypertensive Ratten ein erhöhtes Doppelpunkt Durchlässigkeit für TMA im Vergleich zu normotonen Ratten (Abbildung 2)4. In einer anderen Studie fanden wir, dass hohe salzeinlaß die GBB Durchlässigkeit und Leber Clearance von TMA (Abbildung 3)14nicht beeinflusst.
Messung der Konzentration der SCFA in Hocker, Portal Blut und peripherem Blut, verfolgen wir den Weg der Moleküle aus dem Darm in das periphere Blut. Die beispielhafte Ergebnisse für solche Experimente sind in Tabelle 3dargestellt.
Abbildung 2 : Hypertonie-assoziierten Veränderungen im Darm-Blut-Schranke Permeabilität. Intracolonic Verwaltung von TMA produziert eine deutliche Steigerung im Portal Blut TMA in jeder Gruppe (n = 12 für jede Gruppe). Die Zunahme der Portal Blut TMA im Gruppenrahmen Hypertensive (SHR) war deutlich höher als bei normotonen (WKY) Gruppe. Wir nutzten das lange Protokoll, bestehend aus Blut, die Probenahme von 30 min und 60 min nach der TMA Verabreichung (IC TMA). Werte sind Mittel + SE, *p < 0,05 Vs Grundlinie, #p < 0,05 WKY Vs SHR Diese Zahl wurde von aller Et Al. modifiziert 4 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Darm-Blut-Schranke Permeabilität und Leber Clearance nach hoher salzeinlaß. (A) Intracolonic Verwaltung von TMA produziert eine deutliche Steigerung im Portal Blut TMA. Die Größe des Anstiegs war ähnlich zwischen den Gruppen (n = 7 für jede Gruppe). Wir verwendeten ein vereinfachtes Protokoll Blutentnahme bei Baseline (0) und 15 min nach der Verabreichung von TMA (IC TMA). (B) TMA Leber Abstand ähnelte zwischen den Fraktionen zu Studienbeginn und 15 min nach der Intracolonic Verwaltung der TMA. Werte sind Mittel + SE. *p < 0,05 Vs Grundlinie. Diese Zahl wurde von Bielinska Et Al. modifiziert 14 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| SCFA | Hocker-Konzentration (µM) | Konzentration im Portal Blut (µM) | Konzentration im peripheren Blut (µM) |
| AA - Essigsäure (C2) | 15998.40 ± 4317.58 | 564.22 ± 155.34 | 149.89 ± 31,74 |
| IPA - Propionsäure (C3) | 5390.70 ± 1016.19 | 138.25 ± 55.50 | 5.36 ± 3,25 |
| IBA-Isobutyric Säure (C4) | 191.20 ± 123.87 | 4.51 ± 1,60 | 1.14 ± 1.16 |
| BA - Buttersäure (C4) | 4159.80 ± 3141.68 | 143.14 ± 68.42 | 6,43 ± 4.18 |
| 2MeB-2-Methylbutyric Säure (C5) | 80.90 ± 59.86 | 2,02 ± 0.88 | 1.14 ± 1,42 |
| IVA-Isovaleric Säure (C5) | 109.10 ± 56,05 | 2.59 ± 1,07 | 0,90 ± 1.22 |
| VA - Valeric Säure (C5) | 281.9 ± 158.20 | 8.55 ± 3.56 | 0,72 ± 1.02 |
| ICA-Isocaproic Säure / 4-Methylvaleric Säure (C6) | 5.9 ± 2,95 | 0,61 ± 0.15 | 1,76 ± 0,87 |
| CA - Caproic Säure (C6) | 287.00 ± 309.68 | 11.19 ± 4,94 | 1.12 ± 0.93 |
Tabelle 3: SCFA-Konzentration im Stuhl, Portal Blut und peripherem Blut (n = 7).
| Prüfsubstanz | Mögliche Anwendung |
| Bakteriellen Stoffwechselprodukte: Trimethylamin (TMA), kurzkettigen Fettsäuren (SCFA), Schwefelwasserstoff, etc.. |
GBB Durchlässigkeit Studien Verfolgung eines Darm-Portal Blut-Leber-systemische Blut Weges Hepatische Clearance Studien |
| Klassische Durchlässigkeit Marker: FITC-Dextran, Polysaccharide, PEG, etc.. |
GBB Durchlässigkeit Studien |
| Medikamente | Absorption und hepatische Clearance-Studien |
Tabelle 4: Beispielhafte Testsubstanzen mit möglichen Anwendungen.
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Discussion
Die beschriebenen direkten, in Vivo, Methode zur Messung der GBB Durchlässigkeit unterhält Closetophysiological Bedingungen im Magen-Darm-System (schützt den Darm Blutfluss), und ist nahezu unbeeinflusst von Leber-und Nierenfunktion.
Der entscheidende Schritt dieser Technik ist die Einfügung des Portals Katheters. Dies muss sanft und entschlossen zur gleichen Zeit erfolgen. Eine leichte, kurze Blutungen auftreten von der korrekt durchgeführte Punktion der portalader; jedoch stoppt es, wenn die Nadel in das Gefäß eingeführt wird. Anhaltende Blutungen zeigt, dass die Pfortader perforiert ist. Um das Einführen des Katheters zu erleichtern, sollten die Pfortader auch ausgesetzt werden. Nach exteriorizing den Darm, wenn die mesenterialen Wurzel gut ausgesetzt ist, die oberen mesenterialen Vene sollte auch sichtbar sein (mesenterialen Vene tritt cranially in die Pfortader). Die Pfortader ist in der Regel durch die hepatischen Lappen bedeckt, an den Seiten verschoben werden. Die richtige Stabilisierung des Portals Katheters ist entscheidend für ein erfolgreiches Verfahren, da der Katheter Bewegung Pfortader Bruch und Blutungen, vor allem bei längeren Experimente produzieren kann. Zusätzliche Stabilisierung des Katheters kann erreicht werden, indem Sie den Katheter an Mesenterium anhängen, kleben Sie es ein Mesenterium mit Gewebekleber oder zwei einzelne Stiche (Gewinde 6/0). Nach dem Schließen der Bauchhöhle um die Platzierung des Katheters zu sichern, kann eine tabaksbeutelnaht am Katheter angewendet werden.
Es gibt mehrere kleinere Schwierigkeiten, die während des Tests auftreten können. Nach Katheterisierung der femoral Ader, wenn das venöse Blut nicht Rückfluss in den Katheter tut, versuchen Sie folgenden Lösungen: Spülen Sie den Katheter mit heparinisierten Kochsalzlösung, sanft ziehen Sie den Katheter ca. 1-2 mm aus der Vene der chirurgischen Knoten zu entfernen und binden Sie eine neue ein, ziehen der Katheter raus und wieder einfügen oder ersetzen Sie durch einen neuen Katheter. Denken Sie daran, die richtige Platzierung des Katheters nach dem Experiment bestätigen. Der Katheter sollte für ca. 6-7 cm, abhängig von der Größe des Tieres, die proximale Spitze des Katheters in der minderwertigen Vena Cava oberhalb des Zusammenflusses Lebervene platzieren eingefügt werden. In Sachen Doppelpunkt Katheterisierung, haben Sie Probleme mit den Katheter zunehmendem injizieren Sie 0,3-0,5 mL Kochsalzlösung oder lassen Sie den Katheter in den Dickdarm für 5-10 Minuten, und versuchen Sie es erneut. Keine Gewalt anwenden während ein Katheter zur Perforation des Darms zu vermeiden.
In unseren Studien haben wir ein Darm Bakterien-derived Molekül, Trimethylamin (TMA), als Marker der Doppelpunkt GBB Durchlässigkeit, wie TMA meist durch Kolon Bakterien produziert wird. Jedoch viele andere Stoffe, darunter klassische Durchlässigkeit Marker wie FITC-Dextran oder Zucker, können auch verwendet werden (siehe Tabelle 4). Wenn Sie eine Lösung der Prüfsubstanz vorbereiten, berücksichtigen Sie die irritierende Wirkung auf die Darmschleimhaut und wählen Sie entsprechend der Konzentration des Stoffes. Weitere Laborverfahren der Blutproben müssen auf den ausgewählten Marker angepasst werden.
In unserem Protokoll schlagen wir Intracolonic Verwaltung eines Markers; Allerdings kann es durch orale Verabreichung oder Magensonde auf verschiedenen Ebenen des Verdauungstraktes geändert werden. Die Variable Geschwindigkeit der Peristaltik und mögliche Wechselwirkungen mit Enzymen und Magensäure sollte berücksichtigt werden, während der Verabreichung eines Markers in oberen Teile des Magen-Darm-Trakt z.B. Magen oder Zwölffingerdarm. Zeitpunkt der Blutentnahme nach der Verabreichung eines Markers muss dementsprechend angepasst werden.
Es gibt mehrere Einschränkungen der vorgestellten Methode, einschließlich der negativen Auswirkungen der Narkose und Fasten über Nacht, dass beide GBB Funktion beeinflussen können. Es sollte berücksichtigt werden, da das Verfahren terminal ist und Blutabnahme während nicht vollständig physiologischen Bedingungen beinhaltet. Wie bereits erwähnt, hat es immer noch viele Vorteile gegenüber anderen experimentellen Methoden bewerten GBB Durchlässigkeit, durchgeführt jedoch vor allem in-vitro-11. Beispielsweise misst eine h-Kammer die Leitfähigkeit und Partikel Fluss durch die intestinalen Epithelzellen. Die größte Schwäche dieses Verfahrens liegt in seiner übermäßige Vereinfachung. Es ist schwierig, die komplexen physiologischen Systems der Darmschleimhaut mit einer kleinen Anzahl von Messungen auf epitheliale Zellschicht allein zu beschreiben. Einige Forscher verwenden ganz dicke Darm für h-Kammer-Studien, aber dieses Verfahren wird von mehreren methodischen Komplikationen15begleitet. Darüber hinaus ist die Genauigkeit der Methode durch eine begrenzte Lebensfähigkeit der Gewebe isoliert aus dem Organismus gefährdet. Einige in-vitro- Methoden der pharmakokinetischen Studien verwenden Künstliche Membranen als Modell der Darmbarriere12. Diese Methoden, ähnlich wie bei der h-Kammer, spiegeln jedoch nicht die Komplexität der GBB Struktur und Funktionen.
In experimentellen und klinischen Studien gibt es auch in Vivo Durchlässigkeit Assays. Sie basieren meist auf Urin oder peripheren Blutentnahmen nach oraler oder Kolon Verabreichung von verschiedenen Markern13. Der weit verbreitete Zuckertest beinhaltet oralen Einnahme von Mono- und Oligosaccharide, die in Säugetier-Organismus, z. B. Mannit und Lactulose nicht verstoffwechselt werden. Die Methode ist nicht invasiv und kann in beiden experimentellen und klinischen Einsatz16,17eingesetzt werden; jedoch sind die Ergebnisse von First-Pass-Stoffwechsel und die Niere Leberfunktion, betroffen die Versuchspersonen deutlich unterscheiden können. Im Gegensatz zu den oben genannten indirekten Methoden ermöglicht das Sammeln von Blut aus der Pfortader direkte Auswertung der GBB Durchlässigkeit12. Diese Methode ist nicht abhängig von Leber-und Nierenfunktion und physiologische Bedingungen in den Darm, die einen wichtigen Vorteil gegenüber ex Vivo oder in Vitro Methoden ist nahezu bewahrt.
In diesem Artikel beschriebenen Techniken ermöglichen auch eine relativ genaue Leber Abstand Auswertung, wie das Blut aus der Pfortader und unteren Hohlvene oberhalb des Zusammenflusses Lebervene gesammelt werden. Die repräsentativen Ergebnisse für die hepatische Extraktion sind in Abbildung 3 (TMA) und Tabelle 3 (für SCFA) präsentiert. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die drei wichtigsten SCFA, Acetat, propionat und Butyrat, durch verschiedene hepatische Clearance, auszeichnen, die bei früheren Studien unterstützt wird, wo Bloemen Et Al. gezeigt, dass Darm Freisetzung von Butyrat und propionat, aber nicht Acetat, ist fast erreicht, durch hepatische Aufnahme18. Daher eignet sich die vorgestellte Protokoll für tracking-intestinale Resorption und LEBERSTOFFWECHSEL von Drogen, die in den pharmakokinetischen Studien verwendet werden kann.
Die Techniken können auch für andere experimentelle Zwecke angepasst werden. Katheterisierung der Pfortader kann verwendet werden, Portal Blutdruck messen oder Vene für die Verabreichung von Medikamenten direkt in das Portal, um die hepatische Zirkulation zu studieren. Zum Beispiel in unserer bisherigen Arbeit verabreicht wir Schwefelwasserstoff Geber die Pfortader, seinen Einfluss auf hepatische Kreislauf und Portal Druck19abzuschätzen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Arbeit wird unterstützt durch das Ministerium für Wissenschaft und Hochschulwesen Republik Polen, Diamond gewähren keine: DI2017 009247.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needle OD: 9 mm | Becton Dickinson S.A. | 301300 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-40 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-25 | |
| C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD | Cole-Parmer Instrument Co. | 06424-59 | |
| Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F) | Sigmed | 0000 80305 | |
| Surgical ligatures 3/0 | Yavo Sp. Z o.o. | P48JE | |
| Absorbable surgical sutures - Polyglactine 910 4/0 | KRUUSE Polska Sp. Zo.o. | 152336 | |
| Tissue glue - Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive | Loctite | 1370127 | |
| Povidone iodine | EGIS Pharmaceuticals PLC | 4449 11 | |
| Heparin - Heparinium WZF | WZF Polfa S.A. | 02BK0417 | Dilute 10 times with physiological saline |
| Glycerin 86% | Laboratorium Farmaceutyczne Avena | 5.90999E+12 | Serves as a lubricant in colon catheterization |
| Xylocaine 2% | AstraZenca | 9941342 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich (Merck) | U2500-500G | |
| Trimethylamine solution 45% | Sigma-Aldrich (Merck) | 92262-1L | |
| Syringes 2 mL | B.Braun Melsungen AG | 4606027V | |
| Saline 250 mL | Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o. | 15LL707WL | |
| Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends | Braun | NS-010-115-PKM | |
| Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 " | Braun | KN-008-140-ZMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7x0.55 | Braun | PO-001-007-ZMK | |
| Micro Scissors type Vannas, straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm | Braun | NO-010-085-PMK | |
| Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8" | Braun | HO-128-130-PMK | |
| Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2 | Braun | IM-927-150-PZMK | |
| Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp | Braun | NO-052-110-PMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp | Braun | PO-022-001-PMK |
References
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