Summary
De toegang van voedingsstoffen, microbiota metabolieten en medicijnen voor het verkeer wordt geregeld door de darm-bloed-barrière (GBB). Beschrijven we een directe methode voor het meten van de GBB permeabiliteit in vivo, die, in tegenstelling tot veelgebruikte indirecte methoden, wordt vrijwel niet beïnvloed door de functies van lever en nieren.
Abstract
De gut-bloed-barrière (GBB) regelt de overgang van voedingsstoffen, bacteriële metabolieten en drugs van intestinale lumen naar de bloedbaan. De GBB integriteit wordt verstoord in de gastro-intestinale, cardiovasculaire en metabole ziekten, wat leiden gemakkelijkere toegang van biologisch actieve stoffen, zoals darm bacteriële metabolieten, naar de bloedbaan tot kunnen. Dus, de doorlaatbaarheid van de GBB mogelijk een marker van zowel de extraintestinal als de intestinale ziekten. Bovendien, de toegenomen penetratie van bacteriële metabolieten invloed kan zijn op de werking van het hele organisme.
Veelgebruikte methoden voor het bestuderen van de permeabiliteit van de GBB zijn uitgevoerde ex vivo. De nauwkeurigheid van deze methoden is beperkt, omdat de werking van de GBB afhangt van intestinale bloedstroom. Aan de andere kant, gebruikte in vivo methoden kunnen worden beïnvloed door lever en nier prestaties, omdat deze methoden gebaseerd zijn op de evaluatie van urine of / en perifeer bloed concentraties van exogene markers. Hier presenteren we een directe meting van de permeabiliteit van de GBB in ratten met behulp van een in vivo methode gebaseerd op portal bloed bemonstering, die intestinale bloedstroom behoudt en wordt vrijwel niet beïnvloed door de lever en de nier functie.
Polyurethaan katheters worden ingevoegd in de ader van de portal en vena cava inferior net boven de hepatische veins samenvloeiing. Bloed is bemonsterd op basislijn en na toediening van een geselecteerde markering in een gewenste gedeelte van het maag-darmkanaal. Hier presenteren we enkele toepassingen van de methode met inbegrip van (1) evaluatie van de permeabiliteit van de dikke darm TMA, gut bacteriële metaboliet, (2) evaluatie van lever Goedkeuringvande TMA, en (3) evaluatie van een gut-portaal bloed-lever-perifere bloed weg voor gut bacteriën-afgeleide korte keten vetzuren. Bovendien kan het protocol ook worden gebruikt voor het bijhouden van de intestinale absorptie en lever metabolisme van geneesmiddelen of voor metingen van portal bloeddruk.
Introduction
De gut-bloed barrière (GBB), ook bekend als de intestinale barrière, is een complex gelaagde systeem dat het lumen van de darm uit de bloedbaan scheidt om de passage van schadelijke stoffen beperken terwijl het toestaan van de absorptie van voedingsstoffen1. Het bestaat uit de drie lagen: de slijm laag epitheel en lamina propria.
Talrijke factoren kunnen van invloed zijn op de GBB integriteit en functie2. Het is aangetoond dat de GBB in zowel de extraintestinal als de gastro-intestinale ziekten, met inbegrip van de cardiovasculaire en metabole ziekten3, hetgeen tot een verhoogde passage van bacteriële metabolieten van de darm naar de bloedbaan4 leiden kanwordt verstoord. Een toegenomen penetratie van gut bacteriële metabolieten kan gevolgen hebben voor de werking van het hele organisme. Bijvoorbeeld, tonen recente studies een significant effect van bacteriële metabolieten, zoals indolen, H2S, korte-keten vetzuren (SCFA) en trimethylamine N-oxide, op de bloedsomloop functies5,6,7 ,8,9. Er is ten slotte voorgesteld dat een verhoogde permeabiliteit van de GBB kan dienen als een marker van cardiovasculaire en metabole ziekten die verband houden met de morfologische en functionele wijzigingen in de darmen10. Het bijhouden van het traject van de darm-portaal bloed-lever-systemische bloed van bacteriële metabolieten kan dus van belang voor zowel fundamentele en klinische wetenschappen.
Algemeen gebruikte experimentele methoden voor de evaluatie van GBB permeabiliteit zijn uitgevoerd in vitro met behulp van gereseceerd intestinale segmenten, fragmenten van mucosa of kunstmatige membranen11,12. De nauwkeurigheid van deze methoden is aangetast door het feit dat de goede werking van de GBB constante intestinale bloedstroom vereist. Aan de andere kant, is het beschikbaar in vivo -methoden zijn gebaseerd op de evaluatie van urine of perifeer bloed concentraties van exogene markeringen13. Echter, perifere bloed en urine concentratie van exogene stoffen wordt beïnvloed door de nierfunctie, dat wil zeggen, glomerulaire filtratie snelheid en tubulaire uitscheiding, alsmede door lever metabolisme, dat wil zeggen, first-pass metabolisme. Beide parameters kunnen studie onderwerpen onafhankelijk van de GBB functie sterk uiteen.
Dit witboek beschrijft een rechtstreekse meting van de permeabiliteit van de GBB in ratten met behulp van de portal bloedmonsters. Deze methode in vivo behoudt de intestinale doorbloeding en wordt vrijwel niet beïnvloed door de leverfunctie en nierfunctie. De beschreven aanpak wordt niet vaak gebruikt, mogelijk vanwege bepaalde methodologische problemen. We beschrijven in detail de catheterisatie van de ader van de portal en de vena cava inferior net boven de samenvloeiing van de hepatische ader. Bloedmonsters van de ader van de portal en de vena cava inferior kunt evaluatie van de GBB permeabiliteit en lever goedkeuring en opvolging van gut-portaal bloed-lever-systemische bloed traject van moleculen van belang, zoals de darm bacteriële metabolieten of medicijnen. Ook presenteren we verschillende toepassingen van de methode die werden getest in ons laboratorium. Het gaat hierbij om de evaluatie van de permeabiliteit van de dikke darm TMA, een gut bacteriële metaboliet, evaluatie van lever Goedkeuringvande TMA en evaluatie van een gut-portaal bloed-lever-systemische bloed weg van SCFA.
Om te beoordelen gut-bloed barrière permeabiliteit, volgt protocol moeten worden gevolgd, in volgorde: 1 (invoeging van de lijn voor intraintestinal overheden), 3 (portal vein catheterisatie), 4 (portal veneuze bloedmonsters ), 6 (administratie van een gut permeabiliteit marker), 4.
Om te beoordelen lever goedkeuring en een darm-portaal bloed-lever-systemische bloed weg, volgt protocol moeten worden gevolgd, in volgorde: 1 (invoeging van de lijn voor intraintestinal overheden), 2 (vena cava inferior catheterisatie), 3 (portal vein catheterisatie), 4 (portal veneuze bloedmonsters), 5 (vena cava inferior bloedmonsters), 6 (administratie van een gut permeabiliteit marker), 4, 5, 7 () berekening van de lever clearance).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimenten werden uitgevoerd op mannelijke Wistar Kyoto ratten volgens richtlijn 2010/63 EU betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt en goedgekeurd door de I lokale bio-ethisch comité in Warschau.
1. opneming van de lijn voor Intraintestinal administratie
Opmerking: Hier stellen wij voor het beheer van de intracolonic van een markering met behulp van een katheter. Het kan worden gewijzigd door orale toediening of maagsonde op verschillende niveaus van het spijsverteringskanaal bijvoorbeeld maag of de twaalfvingerige darm. Vergeet niet om gebruik van wegwerp chirurgische kleding, met inbegrip van de chirurgenjas, kap en handschoenen, en zorgen om te volgen de veiligheidsmaatregelen aan de scherpe instrumenten gebruikt in de chirurgie (naalden, enz.) tijdens procedures 1-6 gerelateerde.
- Snelle dieren 's nachts voordat de procedure. Voer alle procedures tijdens de narcose, dat wil zeggen, verkregen door injectie van urethaan 1,5 g/kg bw i.p. Assess juiste afstomping, door het gebrek aan ooglidreflex en hoornvlies reflexen en teen-knijp- en staart-snuifje methode.
- Gebruik een pediatrische Foley katheter (10F of 8F) als een Colon katheter. Mark de katheter om aan te geven van het deel dat wordt ingevoegd in de dikke darm (ca. 8 cm).
- Controleer de anale regio en de inhoud van de stoelgang in de endeldarm videoband de katheter in de dikke darm. Als ontlasting aanwezig is, leeg de endeldarm door het masseren van het rectale gebied.
- Zet een smeermiddel (bijvoorbeeld glycerine of petrolatum) langs de katheter. Bevochtig de anus en omstreken met het glijmiddel.
- Plaats de katheter met een gids draad ongeveer 8 cm via de externe anale sluitspier. Langzaam vooruit-achteruit en cirkelvormige bewegingen maken.
Opmerking: Houd bij het controleren van de locatie van de katheter door abdominale palpatie terwijl het opnemen van de katheter.
2. inferior Vena Cava catheterisatie
- Scheren bont in de lies. Afwisselend desinfecteren van de huid met alcohol en Povidon jodium 3 keer en de liesstreek met afdeklakens dekken.
- Probeer te voelen van de pols op de femorale slagader en snijd de huid lengterichting voor de lengte van ongeveer 2,0 cm op de plaats waar de pols voelbaar.
- Ontleden de fascia en de spieren te visualiseren de neurovasculaire bundel.
- Ontleden van de femorale ader van de neurovasculaire bundel: eerste zenuwen, dan de femorale slagader, waarna de ader.
Opmerking: Wees voorzichtig tijdens de dissectie van de neurovasculaire bundel, aangezien kleine takken van de femorale ader kunnen gemakkelijk worden beschadigd, produceren bloeden. - Twee ligaturen zetten de femorale ader. Geen bindt de knopen nog. De uiteinden van de proximale ligatuur met een naald houder te vangen.
- Trek voorzichtig de ligatuur eindigt met de houder naar boven om te sluiten van het proximale deel van de ader. Wacht totdat de ader is gevuld met bloed en binden de distale knoop.
- Maken van een kleine incisie (ca. 1 mm) op de ader tussen de knoop en de proximale ligatuur, met behulp van microchirurgische schaar. Plaats de katheter met pincet of de naald met het gebogen uiteinde.
Opmerking: Het doorprikken van de ader en het gebogen uiteinde van de naald gebruiken als een gids voor de katheter. Los de ligatuur proximale terwijl het opnemen van de katheter. Plaats de katheter voor 6-7.0 cm. - Beveilig de katheter in de femorale ader met twee één chirurgische knopen. De proximale ligatuur evenals binden.
- Controleer de bij van de katheter door te proberen te trekken bloed met een spuit. Spoel de katheter met 0.3 mL van de heparinized zout (100 eenheden/mL).
- Sluit de chirurgische wond met twee lagen van enkele steken.
3. Portal Vein catheterisatie
Figuur 1 : Portaal katheter. De portal katheter bestaat uit een naald OD: 0,9 mm met een lengte van ongeveer 25.0 mm [A], een flexibel polyurethaan katheter OD: 0,025", lengte ongeveer 100.0 mm [B], een flexibele polyethyleen-tip van de katheter OD: 0.040", circa 15,0 mm lange [C], een stekker [D]. , en een ligatuur 3/0 met een lengte van 100.0 mm [E]. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Bereiden de portal katheter volgens Figuur 1.
- Stop gesneden van de naald (OD: 9 mm) in de polyurethaan katheter OD: 0,025".
- Bind de ligatuur 3/0 op de kruising van de naald en de katheter.
Opmerking: Zorg ervoor dat het langer deel van de ligatuur ten minste 6 cm lang is. - Steek het uiteinde van de katheter OD: 0,025" in de polyethyleen katheter OD: 0.040".
- Sluit de katheter met een stekker metaal of plastic.
- Middellijn laparotomie
- Scheren van de vacht in de buik, afwisselend desinfecteren van de huid met alcohol en Povidon jodium 3 keer en bestrijken het gebied met afdeklakens.
- Snijd de huid lengterichting van de xiphoid van het borstbeen hard aan de navel.
- Snijd de spieren van de buikwand langs de witte lijn.
- Vouw de cut rostrally in de Y-vorm zodat de xiphoid kraakbeen tussen twee sneden.
- Portal vein dissectie
- Bevochtig de chirurgische swabs met zoutoplossing.
- Exteriorize van de blindedarm, oplopend en transverse colon en dunne darm lus. Zet de darmen aan de linkerkant de hoofdmap van het mesenterium bloot te stellen.
Opmerking: Bedek de darmen met gaas bevochtigd met een fysiologische zoutoplossing om de darmen uitdroogt. - Aan de portal vein bloot, zorgvuldig de hepatische lobben aan de zijkanten of verplaatsen naar boven naar de diafragma met de bevochtigde swabs.
- Het deel van de portal-ader die niet is bedekt met het mesenterium (in de hepatische Hilus, ongeveer 5 mm lang.) lokaliseren en doorgeven van de ligatuur 3/0 (15 cm lang) onder de portal ader.
Opmerking: Om de weefsels te beschermen tegen schade terwijl het plaatsen van de ligatuur, Bevochtig de ligatuur met een fysiologische zoutoplossing oplossing. - De uiteinden van de ligatuur klem met pincet en draai voorzichtig om te stabiliseren van het vaartuig.
- Inbrengen en stabilisatie van de katheter
- Doorgeven van het langere gedeelte van de portal katheter ligatuur onder het vrije gedeelte van de portal-ader en trek het zodat de katheter net naast de portal ader ligt.
- Steek de naald in de bovenste mesenterische ader 3 mm onder de kruising van de bovenste mesenterische ader en de portal vein. Houd de naald onder een hoek van 30° en, na het aangaan van de ader, verminderen de hoek en vooraf de naald bijna horizontaal, parallel aan de portal-ader.
Opmerking: Plaats de naald voor een lengte van ongeveer 6-7 mm. De stabiliserende ligatuur moet voorzichtig de portal vein draai terwijl het opnemen van de katheter. - Toepassing van 1-2 druppels weefsel lijm op de plaats waar de naald is ingebracht. Verwijder de swabs die betrekking hebben op de lever.
- Zet de darmen terug in de buikholte.
- Bevochtig de darmen met een verwarmde omhoog zoutoplossing en bedek het met bevochtigd steriel gaas.
- Controleer de bij van de katheter en spoel de katheter met 0.3 mL van de heparinized zout (100 eenheden/mL).
Opmerking: Veneuze bloed spontaan backflows in de katheter.
- Beëindiging van de operatie
- Na 5 minuten, Controleer de kleur van de darmen en de peristaltische bewegingen, ervoor te zorgen dat de juiste mesenterische bloedstroom wordt gehandhaafd.
- Sluit de buikholte met 3 steken: muur buikvlies met de binnenste laag van de spieren van de buikwand - een continu, absorbeerbare Sutuur (geologie); resterende spieren van de buikwand - een continu, absorbeerbare Sutuur (geologie); huid en onderhuids weefsel - één, niet-absorbeerbare draadjes.
Opmerking: Exteriorize het distale deel van de katheter rond de navel.
4. Portal Vein bemonstering bloed
- Monster portal vein bloed soms volgens de specifieke testen protocol gebruikt; Zie tabel 1.
| Korte protocol | Lange protocol |
| t0 – basislijn (vóór intracolonic de administratie) | t0 – basislijn (vóór intracolonic de administratie) |
| t1 – 5 min na toediening van de intracolonic | t1 – 30 min na intracolonic toediening |
| t2 – 30 min na intracolonic toediening | t2 – 60 min na toediening van de intracolonic |
Tabel 1: Portal bloed bemonstering protocollen voor gut permeabiliteit beoordeling.
Opmerking: De tijd tussen opeenvolgende bloedmonsters hangt voornamelijk de biodisponibiliteit van de geteste stoffen en de plaats van toediening (dikke darm, maag, enz.).
- De portal katheter stekker open en laat de bloedstroom vrij.
- Gebruik spuit (vol. 2 mL) en botte naald OD: 0.9 mm. het verzamelen van niet meer dan 0,7 mL bloed.
- Spoel de katheter met 0.3 mL EDTA zoutoplossing (100 eenheden/mL) en sluit de stekker van de katheter.
5. inferior Vena Cava bloedmonsters
- Monster vena cava inferior bloed soms volgens de specifieke testen protocol gebruikt; Zie tabel 2.
| Portal vein | Vena cava inferior |
| t0 – basislijn (vóór intracolonic de administratie) | t0 – basislijn (vóór intracolonic de administratie) |
| t1 – 30 min na intracolonic toediening | t1 – 30 min na intracolonic toediening |
Tabel 2: Protocol van bloed bemonstering voor lever klaring meten en bijhouden van de darm-portaal bloed-lever-systemische bloed weg.
- Open de stekker van de vena cava inferior-katheter en de bloedstroom vrij laat.
- Verzamelen van niet meer dan 0,7 mL bloed met behulp van spuit (vol. 2 mL) en gebroken naald OD: 0.9mm.
- Spoel de katheter met 0,2-0,3 mL EDTA saline (100 eenheden/mL) en sluit de stekker van de katheter.
6. de administratie van een Gut permeabiliteit markering
- Verwijder de begeleidingskabel en opblazen van de ballon van de Colon katheter, met behulp van adequate hoeveelheid steriel water (meestal 1 mL maar check de ballon van de werkelijke grootte voor de insertdatum).
Opmerking: De diameter van de ballon mag niet hoger zijn dan 1 cm. - Plaats de kop van de rat naar beneden (hellingsgradiënt ongeveer 15%) tot een minimum beperken van het risico van de uitstroom van de door de overheid gereguleerde oplossing van de dikke darm.
- Langzaam het beheren van de geteste stof (bijvoorbeeld trimethylamine, 100 mg/kg bw) via een poort van de afwatering in Colon katheter.
Let op: Overschrijd niet de hoeveelheid van de door de overheid gereguleerde 0,75 mL en de voeding snelheid van 0,5 mL/min om te voorkomen dat de uitstroom van de door de overheid gereguleerde oplossing van de anus. - Na 10 min leeglopen van de ballon van de katheter.
- Monster bloed van de vena cava inferior en de portal vein volgens de specifieke testen protocol gebruikt; Zie tabel 1 en tabel 2.
- Euthanaseren dier via erkende methode.
7. berekening van de lever Clearance
- Lever van mijnen, opgevat als hepatische extractie, door het verschil tussen portal bloed concentratie en vena cava inferior bloed concentratie of door de verhouding tussen de vena cava inferior portal bloed concentratie, (1 - (vena cava inferior concentratie Express / portal vein concentratie)).
8. evaluatie van de analysemonsters stof concentratie n bloed
- Afhankelijk van de teststof en de methodologie van de test, wordt het monster onverminderd door aangewezen laboratorium procedures (centrifugeren, enz.). In de voorgestelde protocollen evalueren we TMA/TMAO en SCFA concentratie met behulp van vloeibare chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie triple-vierpolige. Vindt u een gedetailleerde beschrijving van de methode van aanvullend materiaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben met succes de GBB permeabiliteit en lever Goedkeuringvande TMA bij ratten gemeten. We hebben aangetoond dat hypertensieve ratten een verhoogde dubbelpunt doorlatend zijn voor TMA in vergelijking met normotensive ratten (Figuur 2)4 hebben. In een andere studie vonden we dat hoog zout inname heeft geen invloed op de GBB permeabiliteit en lever Goedkeuringvande TMA (Figuur 3),14.
Het meten van de concentratie van SCFA in ontlasting, portal bloed en perifeer bloed, we het pad van de moleculen van de darm naar het perifere bloed opgespoord. De voorbeeldige resultaten voor die experimenten worden gepresenteerd in tabel 3.
Figuur 2 : Hypertensie-geassocieerde veranderingen in de darm-bloed barrière permeabiliteit. Intracolonic beheer van TMA geproduceerd een aanzienlijke toename van de portal bloed TMA in elke groep (n = 12 voor elke groep). De toename van de portal bloed TMA in de groep hypertensieve (SHR) was beduidend hoger dan in de groep normotensive (WKY). We gebruikten het lange protocol bestaande uit bloed bemonstering van 30 min en 60 min na toediening van de TMA (IC TMA). Waarden zijn middelen, + SE, *p < 0.05 vs basislijn, #p < 0.05 WKY versus SHR. Dit cijfer is gewijzigd van Jaworska et al. 4 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Gut-bloed barrière permeabiliteit en lever goedkeuring na de hoge inname van zout. (A) Intracolonic beheer van TMA geproduceerd een aanzienlijke toename van de portal bloed TMA. De grootte van de verhoging tussen de groepen gelijkaardig was (n = 7 voor elke groep). We gebruikten een vereenvoudigde protocol, nemen van bloedmonsters bij basislijn (0) en 15 minuten na toediening van TMA (IC TMA). (B) TMA lever goedkeuring was vergelijkbaar tussen de groepen op de basislijn, en 15 min na de toediening van de intracolonic van de TMA. Waarden zijn middelen, + SE. *p < 0.05 vs basislijn. Dit cijfer is gewijzigd van Bielinska et al. 14 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| SCFA | Kruk concentratie (µM) | Portal bloed concentratie (µM) | Perifeer bloed concentratie (µM) |
| AA - azijnzuur (C2) | 15998.40 ± 4317.58 | 564.22 ± 155.34 | 149.89 ± 31.74 |
| IPA - propionzuur (C3) | 5390.70 ± 1016.19 | 138.25 ± 55.50 | 5,36 ± 3,25 |
| IBA-isobutyric acid (C4) | 191.20 ± 123.87 | 4.51 ± 1.60 | 1.14 ± 1.16 |
| BA - boterzuur (C4) | 4159.80 ± 3141.68 | 143.14 ± 68.42 | 6.43 ± 4.18 |
| 2MeB-2 methylbutyric zuur (C5) | 80.90 ± 59.86 | 2.02 ± 0.88 | 1.14 ± 1.42 |
| IVA-isovaleric zuur (C5) | 109.10 ± 56.05 | 2,59 ± 1.07 | 0,90 ± 1.22 |
| VA - valeriaanzuur (C5) | 281.9 ± 158.20 | 8.55 ± 3.56 | 0,72 ± 1.02 |
| ICA-isocaproic acid / 4-methylvaleric zuur (C6) | 5.9 ± 2.95 | 0.61 ± 0,15 | 1.76 ± 0,87 |
| CA - capronzuur acid (C6) | 287.00 ± 309.68 | 11.19 ± 4,94 | 1.12 ± 0.93 |
Tabel 3: SCFA concentratie in ontlasting, portal bloed en perifeer bloed (n = 7).
| Teststof | Mogelijke toepassing |
| Bacteriële metabolieten: Trimethylamine (TMA), korte keten vetzuren (SCFA), waterstofsulfide, enz. |
GBB permeabiliteit studies Het bijhouden van een gut-portaal bloed-lever-systemische bloed weg Hepatische klaring studies |
| Klassieke permeabiliteit Markeringen: FITC-dextran, polysacchariden, PEG, enz. |
GBB permeabiliteit studies |
| Drugs | absorptie en hepatische klaring studies |
Tabel 4: Voorbeeldige teststoffen met mogelijke toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven direct, in vivo, methode voor het meten van de permeabiliteit van de GBB onderhoudt closetophysiological voorwaarden in de gastro-intestinale systeem (behoudt de intestinale doorbloeding), en wordt vrijwel niet beïnvloed door de leverfunctie en nierfunctie.
De kritische stap van deze techniek is het inbrengen van de katheter in de portal. Dit moet gebeuren zachtjes en besluitvaardig op hetzelfde moment. Een milde en korte bloeden kan optreden van de correct uitgevoerde aanprikken van de portal-ader; echter, het stopt wanneer de naald in het vaartuig wordt ingevoegd. Aanhoudende bloedingen geeft aan dat de ader portal is geperforeerd. Ter vergemakkelijking van het inbrengen van de katheter, dienen de portal ader goed worden blootgesteld. Na het exteriorizing van de darmen, wanneer de mesenterische wortel goed belicht is, de bovenste mesenterische ader ook zichtbaar moet zijn (mesenterische ader treedt cranially in de ader portal). De portal-ader is meestal gedekt door de hepatische lobben, die moet worden verplaatst naar de zijkanten. Ook is de goede stabilisatie van de portal katheter cruciaal voor een succesvolle procedure, aangezien de beweging van de katheter produceren kan portal vein breuk en bloeden, vooral in langere experimenten. Extra stabilisering van de katheter kan worden bereikt door de katheter aan mesenterium verbonden door het vasthouden aan een mesenterium met weefsel lijm of door twee enkele steken (draad 6/0) toe te passen. Na het sluiten van de buikholte om de plaatsing van de katheter, kan een portemonnee-snarige hechtdraad worden toegepast op de katheter.
Er zijn verschillende kleine problemen die tijdens het experiment optreden kunnen. Na catheterisatie van de femorale ader, het veneuze bloed doet niet terugvoer in de katheter, probeer de volgende oplossingen: de katheter met EDTA zoutoplossing spoelen, zachtjes trekken de katheter 1-2 mm van de ader, verwijderen van de chirurgische knopen en binden van een nieuwe één, pull de katheter out en opnieuw, of vervangen door een nieuwe katheter. Vergeet niet om de juiste plaatsing van de katheter bevestigen na het experiment. De katheter moet worden ingevoegd voor 6-7 cm, afhankelijk van de grootte van het dier, het proximale puntje van de katheter in de vena cava inferior net boven de samenvloeiing van de hepatische ader plaatsen. Als het gaat om dikke darm catheterisatie, als je problemen hebt met het bevorderen van de katheter u kan injecteren 0.3-0,5 mL zoutoplossing of verlof de katheter in de dikke darm voor 5-10 minuten en probeer het opnieuw. Gebruik geen kracht bij het invoegen van een katheter Voorkom perforatie van de darm.
In onze studies gebruikten we een gut bacteriën afkomstige molecuul, trimethylamine (TMA), als een marker van de dikke darm GBB permeabiliteit, zoals TMA meestal door Colon bacteriën ontstaat. Echter, evenals veel andere stoffen, met inbegrip van klassieke permeabiliteit markeringen zoals FITC-dextran of suikers, mogen worden gebruikt (Zie tabel 4). Bij de voorbereiding van een oplossing van de teststof, rekening houden met het irriterend effect daarvan op de intestinale mucosa en de concentratie van de stof op de juiste manier te kiezen. Verdere procedures voor het laboratorium van de bloedmonsters moeten worden aangepast aan de geselecteerde markering.
In ons protocol, stellen wij voor intracolonic beheer van een marker; echter kan het worden gewijzigd door orale toediening of maagsonde op verschillende niveaus van het spijsverteringskanaal. De variabele snelheid van peristaltiek en mogelijke interacties met enzymen en maagzuur moet rekening worden gehouden terwijl het beheer van een markering in de bovenste delen van het maag-darmkanaal bijvoorbeeld maag of de twaalfvingerige darm. Tijd van bloedmonsters na toediening van een markering moet dienovereenkomstig worden aangepast.
Er zijn verschillende beperkingen van de onderhavige methode, met inbegrip van de negatieve effecten van de narcose en vasten 's nachts, dat kunnen zowel invloed GBB functie. Het moet rekening worden gehouden, zoals de procedure terminal is en bloedmonsters tijdens niet volledig fysiologische omstandigheden. Echter zoals eerder vermeld, het heeft nog steeds veel voordelen ten opzichte van andere experimentele methoden beoordelen GBB permeabiliteit, vooral uitgevoerd in vitro11. Bijvoorbeeld, meet een Ussing kamer de flux van het geleidingsvermogen en deeltjes door de intestinale epitheliale cellen. De belangrijkste zwakte van deze techniek ligt in haar overdreven vereenvoudiging. Het is moeilijk om te beschrijven de complex fysiologische systeem van de intestinale mucosa met behulp van een klein aantal metingen op epitheliale cellaag alleen. Sommige onderzoekers gebruiken geheel-dikte darm voor Ussing kamer studies, maar deze procedure gaat gepaard met verschillende methodologische complicaties15. Bovendien, de nauwkeurigheid van de methode is aangetast door een beperkte levensvatbaarheid van weefsels geïsoleerd van het organisme. Kunstmatige membranen sommige in vitro methoden gebruikt in farmacokinetisch onderzoek gebruiken als een model van de intestinale barrière-12. Deze methoden, ook in de vergaderzaal van Ussing, komen echter niet overeen met de complexiteit van de GBB structuur en functies.
Er zijn ook in vivo permeabiliteit assays beschikbaar in experimentele en klinische studies. Ze zijn meestal gebaseerd op urine of perifeer bloed bemonstering na mondelinge of Colon toediening van verschillende markeringen13. De test gebruikte suiker gaat om orale inname van mono- en oligosachariden, die niet worden gemetaboliseerd in zoogdieren organisme, zoals mannitol en lactulose. De methode is niet-invasief en kan worden gebruikt in zowel experimentele en klinische gebruik16,17; echter worden de resultaten beïnvloed door de first-pass metabolisme en nier leverfunctie, die aanzienlijk tussen de onderwerpen van de studie verschillen kan. In tegenstelling tot de hierboven genoemde indirecte methoden kunt het verzamelen van bloed uit de ader portal directe beoordeling van de GBB permeabiliteit12. Deze methode is niet afhankelijk van de leverfunctie en nierfunctie en vrijwel behoudt fysiologische omstandigheden in de darmen die is een belangrijk voordeel ten opzichte van ex vivo of in vitro methoden.
De technieken beschreven in dit document ook toestaan voor de evaluatie van een betrekkelijk nauwkeurige lever klaring, naarmate het bloed worden verzameld uit de ader van de portal en de vena cava inferior net boven de samenvloeiing van de hepatische ader. De representatieve resultaten voor de hepatische extractie worden gepresenteerd in Figuur 3 (voor TMA) en tabel 3 (voor SCFA). Onze gegevens blijkt dat de drie belangrijkste SCFA, acetaat, propionaat en butyraat, worden gekenmerkt door verschillende hepatische klaring, die wordt ondersteund door eerdere studies, waar Bloemen et al. aangetoond dat intestinale vrijlating van butyraat en propionaat, maar niet acetaat, is bijna geëvenaard door hepatische opname18. Het gepresenteerde protocol is daarom geschikt voor het bijhouden van de intestinale absorptie en lever metabolisme van geneesmiddelen, die kan worden gebruikt in farmacokinetisch onderzoek.
De technieken kunnen ook worden aangepast aan andere experimentele doeleinden. Catheterisatie van de ader van de portal kan worden gebruikt voor beheer van drugs direct naar de portal vein te portal bloeddruk meten, te bestuderen van hepatische circulatie. Bijvoorbeeld, in onze vorige werk toegediend we waterstofsulfide donoren aan de portal ader te beoordelen van de invloed daarvan op hepatische circulatie en portal druk19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk wordt ondersteund door het ministerie van Wetenschappen en hogeronderwijs Republiek Polen, Diamond verlenen neen: DI2017 009247.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needle OD: 9 mm | Becton Dickinson S.A. | 301300 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-40 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-25 | |
| C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD | Cole-Parmer Instrument Co. | 06424-59 | |
| Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F) | Sigmed | 0000 80305 | |
| Surgical ligatures 3/0 | Yavo Sp. Z o.o. | P48JE | |
| Absorbable surgical sutures - Polyglactine 910 4/0 | KRUUSE Polska Sp. Zo.o. | 152336 | |
| Tissue glue - Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive | Loctite | 1370127 | |
| Povidone iodine | EGIS Pharmaceuticals PLC | 4449 11 | |
| Heparin - Heparinium WZF | WZF Polfa S.A. | 02BK0417 | Dilute 10 times with physiological saline |
| Glycerin 86% | Laboratorium Farmaceutyczne Avena | 5.90999E+12 | Serves as a lubricant in colon catheterization |
| Xylocaine 2% | AstraZenca | 9941342 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich (Merck) | U2500-500G | |
| Trimethylamine solution 45% | Sigma-Aldrich (Merck) | 92262-1L | |
| Syringes 2 mL | B.Braun Melsungen AG | 4606027V | |
| Saline 250 mL | Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o. | 15LL707WL | |
| Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends | Braun | NS-010-115-PKM | |
| Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 " | Braun | KN-008-140-ZMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7x0.55 | Braun | PO-001-007-ZMK | |
| Micro Scissors type Vannas, straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm | Braun | NO-010-085-PMK | |
| Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8" | Braun | HO-128-130-PMK | |
| Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2 | Braun | IM-927-150-PZMK | |
| Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp | Braun | NO-052-110-PMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp | Braun | PO-022-001-PMK |
References
- Camilleri, M., Madsen, K., Spiller, R., Greenwood-Van Meerveld, B., Verne, G. N. Intestinal barrier function in health and gastrointestinal disease. Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 24 (6), 503-512 (2012).
- Keita, A. V., Soderholm, J. D. The intestinal barrier and its regulation by neuroimmune factors. Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 22 (7), 718-733 (2010).
- Farhadi, A., Banan, A., Fields, J., Keshavarzian, A. Intestinal barrier: an interface between health and disease. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (5), 479-497 (2003).
- Jaworska, K., et al. Hypertension in rats is associated with an increased permeability of the colon to TMA, a gut bacteria metabolite. PloS one. 12 (12), e0189310 (2017).
- Fujii, H., Nakai, K., Fukagawa, M. Role of oxidative stress and indoxyl sulfate in progression of cardiovascular disease in chronic kidney disease. Therapeutic Apheresis and Dialysis: Official Peer-Reviewed Journal of the International Society for Apheresis, the Japanese Society for Apheresis, the Japanese Society for Dialysis Therapy. 15 (2), 125-128 (2011).
- Tomasova, L., et al. Intracolonic hydrogen sulfide lowers blood pressure in rats. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 60, 50-58 (2016).
- Brahe, L. K., Astrup, A., Larsen, L. H. Is butyrate the link between diet, intestinal microbiota and obesity-related metabolic diseases? Obesity Reviews: An Official Journal of the International Association for the Study of Obesity. 14 (12), 950-959 (2013).
- Ufnal, M., et al. Trimethylamine-N-oxide: a carnitine-derived metabolite that prolongs the hypertensive effect of angiotensin II in rats. The Canadian Journal of Cardiology. 30 (12), 1700-1705 (2014).
- Huc, T., Nowinski, A., Drapala, A., Konopelski, P., Ufnal, M. Indole and indoxyl sulfate, gut bacteria metabolites of tryptophan, change arterial blood pressure via peripheral and central mechanisms in rats. Pharmacological Research. 130, 172-179 (2018).
- Ufnal, M., Pham, K. The gut-blood barrier permeability - A new marker in cardiovascular and metabolic diseases? Medical Hypotheses. 98, 35-37 (2017).
- Le Ferrec, E., et al. In vitro models of the intestinal barrier. The report and recommendations of ECVAM Workshop 46. European Centre for the Validation of Alternative methods. Alternatives to Laboratory Animals: ATLA. 29 (6), 649-668 (2001).
- Bohets, H., et al. Strategies for absorption screening in drug discovery and development. Current Topics in Medicinal Chemistry. 1 (5), 367-383 (2001).
- Grootjans, J., et al. Non-invasive assessment of barrier integrity and function of the human gut. World Journal of Gastrointestinal Surgery. 2 (3), 61-69 (2010).
- Bielinska, K., et al. High salt intake increases plasma trimethylamine N-oxide (TMAO) concentration and produces gut dysbiosis in rats. Nutrition. 54, 33-39 (2018).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Denno, D. M., et al. Use of the lactulose to mannitol ratio to evaluate childhood environmental enteric dysfunction: a systematic review. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 Suppl 4, S213-S219 (2014).
- Lugea, A., Salas, A., Casalot, J., Guarner, F., Malagelada, J. R. Surface hydrophobicity of the rat colonic mucosa is a defensive barrier against macromolecules and toxins. Gut. 46 (4), 515-521 (2000).
- Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clinical Nutrition. 28 (6), 657-661 (2009).
- Huc, T., et al. Colonic hydrogen sulfide produces portal hypertension and systemic hypotension in rats. Experimental Biology and Medicine. 243 (1), 96-106 (2018).
