Summary
Näringsämnen, bakterieflora metaboliter och läkemedel till cirkulationen tillgång styrs av gut-blod-barriären (GBB). Vi beskriver en direkt metod för att mäta den GBB permeabilitet i vivo, som, till skillnad från vanliga indirekta metoder, praktiskt taget inte påverkas av lever och njure funktioner.
Abstract
Gut-blod-barriären (GBB) kontrollerar passage av näringsämnen, bakteriell metaboliter och droger från intestinala lumen till blodomloppet. GBB integritet är störd i gastrointestinala, kardiovaskulära och metabola sjukdomar, vilket kan resultera i enklare åtkomst av biologiskt aktiva föreningar, såsom gut bakteriell metaboliter, till blodomloppet. Permeabiliteten i GBB kan således vara en markör för både tarm och extraintestinal sjukdomar. Dessutom kan ökad penetration av bakteriell metaboliter påverka hela organismen.
Vanliga metoder för att studera GBB permeabiliteten är utförs ex vivo. Riktigheten av dessa metoder är begränsad, eftersom GBB funktionssätt beror på intestinal blodflödet. Däremot, används ofta i vivo metoder kan vara partisk av lever och njure prestanda, eftersom dessa metoder bygger på utvärdering av urin eller / och perifert blodkoncentrationer av exogena markörer. Här presenterar vi en direkt mätning av GBB permeabilitet hos råttor med en in-vivo -metoden baserat på portalen blod provtagning, som bevarar intestinal blodflödet och praktiskt taget inte påverkas av funktionen lever och njure.
Polyuretan katetrar sätts i portalen ven och sämre hålvenen precis ovanför nedsatt vener sammanflödet. Blod samplas vid baseline och efter administrering av en vald markör till en önskad del av mag-tarmkanalen. Här presenterar vi flera tillämpningar av metoden inklusive (1) utvärdering av kolon permeabilitet till TMA, gut bakteriell metabolit, (2) utvärdering av lever clearance av TMA och (3) utvärdering av en gut-portal blod-lever-perifera blod väg gut bakterier-derived kortkedjade fettsyror. Dessutom kan protokollet också användas för att spåra intestinal absorption och metabolism i levern av droger eller för mätningar av portalen blodtryck.
Introduction
Gut-blod-barriären (GBB), även känd som tarmbarriären, är ett komplext skikts system som separerar gut lumen från blodomloppet för att begränsa passage av skadliga föreningar samtidigt absorptionen av näringsämnen1. Den består av tre huvudsakliga lager: slem lagret, epitel och lamina propria.
Många faktorer kan påverka den GBB integrity och funktion2. Det har visats att GBB störs i både mag och extraintestinal sjukdomar, inklusive kardiovaskulära och metabola sjukdomar3, vilket kan leda till en ökad passage av gut bakteriell metaboliter till blodomloppet4. En ökad penetration av gut bakteriell metaboliter kan påverka hela organismen. Till exempel visar nyligen genomförda studier en betydande inverkan av bakteriell metaboliter, till exempel indoler, H2S, kortkedjade fettsyror (kommittén) och trimetylamin N-oxid, på cirkulationssystemet funktioner5,6,7 ,8,9. Slutligen har det föreslagits att en ökad GBB permeabilitet kan fungera som en markör för kardiovaskulära och metabola sjukdomar som är förknippade med morfologiska och funktionella förändringar i tarmarna10. Därför kan spårning gut-portal blod-lever-systemiska blodet vägen av bakteriell metaboliter vara av intresse för både grundläggande och kliniska vetenskaper.
Ofta utnyttjad experimentella metoder för utvärdering av GBB permeabilitet är utförda i vitro med opererande intestinal segment, fragment av slemhinna eller konstgjorda membran11,12. Riktigheten av dessa metoder äventyras av att väl fungerande GBB kräver konstant intestinal blodflödet. Däremot, baseras de tillgängliga in-vivo -metoderna på utvärdering av urin eller perifert blodkoncentrationer av exogena markörer13. Men perifera blod och urin koncentration av exogena föreningar påverkas av njurfunktion, dvs glomerulär filtration och tubulär utsöndring, samt genom metabolism i levern, första passage dvs metabolism. Båda parametrarna kan skilja sig avsevärt mellan studie patienter oberoende av funktionen GBB.
Detta dokument beskriver en direkt mätning av GBB permeabiliteten hos råttor som använder portalen blodprovstagning. Denna in-vivo -metod bevarar intestinal blodflödet och praktiskt taget inte påverkas av lever-och njurfunktion. Den beskrivna metoden används ofta inte, möjligen på grund av vissa metodologiska svårigheter. Vi beskriver i detalj kateterisering av portalen ven och sämre hålvenen precis ovanför nedsatt ven sammanflödet. Blodprovstagning från portalen ven och sämre hålvenen möjliggör utvärdering av GBB permeabilitet och lever clearance och spårning av gut-portal blod-lever-systemisk blod väg av molekyler av intresse, såsom gut bakteriell metaboliter eller läkemedel. Vi presenterar också flera tillämpningar av metoden som testades i vårt laboratorium. Dessa inkluderar utvärdering av kolon permeabilitet till TMA, gut bakteriell metabolit, utvärdering av lever clearance av TMA och utvärdering av en gut-portal blod-lever-systemisk blod väg av kommittén.
Utvärdera gut-blod-barriären permeabilitet, följande protokoll bör följas, i ordning: 1 (infogning av linjen för naturliga förvaltningar), 3 (portvenen kateterisering), 4 (portvenen blod provtagning ), 6 (administrationen av en gut permeabilitet markör), 4.
För att utvärdera lever clearance och en gut-portal blod-lever-systemisk blod väg, följande protokoll bör följas, i ordning: 1 (infogning av linjen för naturliga förvaltningar), 2 (sämre vena cava kateterisering), 3 (portvenen kateterisering), 4 (portvenen blod sampling), 5 (sämre hålvenen blodprovstagning), 6 (administrationen av en gut permeabilitet markör), 4, 5, 7 ( beräkning av lever clearance).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten utfördes på Wistar Kyoto hanråttor enligt direktiv 2010/63 EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål och godkändes av den lokala bioetiska kommittén i Warszawa.
1. införande av linjen för naturliga Administration
Obs: Här föreslår vi intracolonic administrering av en markör med hjälp av en kateter. Det kan ändras av oral administrering eller sondmatning på olika nivåer av mag-tarmkanalen t.ex. magsäcken eller tolvfingertarmen. Kom ihåg att använda disponibla kirurgiska kläder, inklusive kirurgiska klänning, huva och handskar, och se till att följa säkerhetsanvisningarna relaterade till de skarpa verktyg som används vid kirurgi (nålar, etc.) under förfaranden 1-6.
- Snabb djur över natten innan förfarandet. Utför alla procedurer under narkos, dvs erhålls genom injektion av uretan 1,5 g/kg kroppsvikt i.p. bedöma korrekt anesthetization genom avsaknaden av palpebrala och korneal reflexer och tå-nypa och svans-nypa metod.
- Använda en pediatrisk Foley-kateter (10F eller 8F) som en colonic kateter. Märk katetern för att indikera den del som kommer att införas i tjocktarmen (ca 8 cm).
- Kontrollera anala regionen och avföring innehållet i ändtarmen innan du sätter katetern i tjocktarmen. Om avföringen är närvarande, tömma ändtarmen genom att massera det rektala området.
- Sätta ett smörjmedel (t.ex. glycerin eller vaselin) längs katetern. Fukta anus och dess omgivningar med smörjmedel.
- För in katetern med en guide tråd ca 8 cm genom den externa anala sfinktern. Gör långsamt framåt-bakåt och cirkulära rörelser.
Obs: Tänk på att kontrollera placeringen av katetern av Abdominell palpation medan du för in katetern.
2. sämre hålvenen kateterisering
- Raka päls i ljumsken. Växelvis desinficera huden med alkohol och povidon jod 3 gånger och täcka ljumskarna med operationsdukar.
- Försök att känna pulsen på femoralartären och skära huden längsled för längden på ca 2,0 cm på den plats där pulsen är påtaglig.
- Dissekera den fascia och muskler för att visualisera den neurovaskulära bunten.
- Dissekera femoral ven från den neurovaskulära bunten: första nerver, sedan femoralartären, och venen.
Var försiktig under dissektion av den neurovaskulära bunten, eftersom små grenar av den femorala venen kan lätt skadas, producerar blödning. - Pålagda femoral ven två ligaturer. Inte knyta knutar ännu. Fånga ändarna av proximala ligatur med en nålförare.
- Dra försiktigt ligatur ändarna med innehavaren av uppåt för att stänga den proximala delen av venen. Vänta tills venen fylls med blod och distala vigas.
- Göra ett litet snitt (ca. 1 mm) på venen mellan Knut och proximala ligatur, med hjälp av mikrokirurgiska saxar. För in katetern med pincett eller nålen med den böjda änden.
Obs: Punktera venen och använda böjda spetsen på nålen som en guide för katetern. Lossa den proximala ligaturen medan du för in katetern. För in katetern för 6-7,0 cm. - Säkra katetern i femoral ven med två enda kirurgiska knutar. Knyt den proximala ligaturen samt.
- Kontrollera patency av katetern genom att försöka dra blod med en spruta. Spola katetern med 0,3 mL av den hepariniserad saltlösning (100 enheter/mL).
- Nära kirurgiska såret med två lager av enstaka stygn.
3. portvenen kateterisering
Figur 1 : Portal kateter. Portalen katetern består av en nål OD: 0.9 mm med en längd av ca 25,0 mm [A], en flexibel polyuretan katetern OD: 0,025 ”, längd ca 100,0 mm [B], en flexibel polyeten spets av katetern OD: 0,040”, cirka 15,0 mm lång [C], en plug [D]. , och en ligatur 3/0 med en längd av 100,0 mm [E]. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Förbereda portal katetern enligt figur 1.
- Infoga den avskurna änden av nålen (OD: 9 mm) in i polyuretan katetern OD: 0,025 ”.
- Knyt ligaturen 3/0 vid korsningen av nålen och kateter.
Anmärkning: Se till att den längsta delen av ligatur är minst 6 cm lång. - Anslut änden av katetern OD: 0,025 ”i polyeten katetern OD: 0,040”.
- Stäng katetern med en metall eller plast plugg.
- Mittlinjen laparotomi
- Raka päls i buken, växelvis desinficera huden med alkohol och povidon jod 3 gånger och täcka området med operationsdukar.
- Skära huden längdriktningen från xiphoid av bröstbenet till naveln.
- Skär musklerna i den buk-väggen längs den vita linjen.
- Expandera snittet rostrally i formen Y så att xiphoid brosk är mellan två snitten.
- Portalen ven dissektion
- Fukta de kirurgiska kompresser med saltlösning.
- Exteriorize blindtarmen, stigande och tvärgående tjocktarmen och tunntarmen slingan. Sätta tarmarna på vänster sida för att exponera roten av krös.
Anmärkning: Täck tarmarna med kompress fuktad med en fysiologisk koksaltlösning att skydda tarmen från torkning. - För att exponera portalen ven, försiktigt flytta nedsatt loberna åt sidorna eller uppåt mot mellangärdet med de fuktade kompresser.
- Lokalisera del av portalen ven som inte är täckt med krös (i nedsatt hilum, ca 5 mm lång) och passera ligatur 3/0 (15 cm långa) under portalen ven.
Obs: För att skydda vävnader från skador medan placera ligatur, fukta ligatur med en fysiologisk koksaltlösning lösning. - Klämma i ändarna av ligatur med pincett och dra den försiktigt för att stabilisera fartyget.
- Införande och stabilisering av katetern
- Passera den längsta delen av portalen kateterns ligatur under den fria delen av portalen ven och dra så att katetern ligger precis intill portalen ven.
- Stick in nålen i den övre mesenteriska ven 3 mm nedanför korsningen övre mesenteriska ven och portalen ven. Håll nålen i 30° vinkel och, efter inresan i venen, minska vinkeln och avancera nålen nästan horisontellt, parallellt med portalen ven.
Obs: Stick in nålen för en längd av cirka 6-7 mm. Stabiliserande ligatur bör försiktigt dra åt portalen ven medan du för in katetern. - Applicera 1-2 droppar av vävnad lim på den plats där nålen sätts. Ta bort de kompresser som täcker levern.
- Lägg tarmarna tillbaka i bukhålan.
- Fukta tarmarna med en värmde upp saltlösning och täck med fuktade steril gasbinda.
- Kontrollera patency av katetern och Spola katetern med 0,3 mL av den hepariniserad saltlösning (100 enheter/mL).
Obs: Venöst blod spontant backflows i katetern.
- Slut av kirurgi
- Efter 5 minuter, kontrollera färgen på tarmen och peristaltiska rörelser, se till att korrekt mesenterica blodflödet upprätthålls.
- Stäng bukhålan med 3 stygn: vägg peritoneum med det inre skiktet av bukväggen musklerna - en kontinuerlig, resorberbar sutur; återstående musklerna i den buk-väggen - en kontinuerlig, resorberbar sutur; hud och subkutan vävnad - enda, icke-resorberbara suturer.
Obs: Exteriorize den distala delen av katetern runt naveln.
4. portvenen blod provtagning
- Prov portvenen blod ibland enligt det specifika testa protokoll som används; Se tabell 1.
| Kort protokoll | Långa protokollet |
| t0 – baslinje (före intracolonic) | t0 – baslinje (före intracolonic) |
| t1 – 5 min efter intracolonic administration | t1 – 30 min efter intracolonic administration |
| t2 – 30 min efter intracolonic administration | t2 – 60 min efter intracolonic administration |
Tabell 1: Portal blod provtagning protokoll för gut permeabilitet bedömning.
Obs: Tiden mellan på varandra följande blodprovstagning beror främst på biotillgängligheten av de testa ämnena och administreringsstället (kolon, mage, etc.).
- Öppna portalen katetern kontakten och låt blodflödet fritt.
- Använd spruta (vol. 2 mL) och trubbig nål OD: 0.9 mm. samla mer än 0,7 mL blod.
- Spola katetern med 0,3 mL hepariniserad saltlösning (100 enheter/mL) och Stäng katetern kontakten.
5. sämre Vena Cava blodprovstagning
- Prov sämre hålvenen blod ibland enligt det specifika testa protokoll som används; Se tabell 2.
| Portådern | Sämre vena cava |
| t0 – baslinje (före intracolonic) | t0 – baslinje (före intracolonic) |
| t1 – 30 min efter intracolonic administration | t1 – 30 min efter intracolonic administration |
Tabell 2: Protokoll av blod provtagning för lever clearance mätning och spårning gut-portal blod-lever-systemiska blodet vägen.
- Öppna den sämre vena cava kateter kontakten och låt blodflödet fritt.
- Samla mer än 0,7 mL blod med hjälp av spruta (vol. 2 mL) och bruten nål OD: 0,9 mm.
- Spola katetern med 0,2-0,3 mL hepariniserad saltlösning (100 enheter/mL) och Stäng katetern kontakten.
6. förvaltning av en Gut permeabilitet markör
- Ta bort ledaren och blåsa upp ballongen colonic kateter, med tillräcklig volym sterilt vatten (vanligtvis 1 mL men kontrollera faktiska ballong storlek före insättning).
Obs: Ballong diametern bör inte överstiga 1 cm. - Placera råtta huvudet ner (lutning ca 15%) för att minimera risken för utflödet av administrerade lösningen från tjocktarmen.
- Långsamt administrera det testa ämnet (t.ex. trimetylamin, 100 mg/kg bw) använder en dränering port i kolon katetern.
Obs: Inte överstiger volymen 0,75 mL administrerade lösningen och matningshastigheten på 0,5 mL/min till förhindra utflödet av administrerade lösningen från anus. - Efter 10 min tömma kateter ballongen.
- Prov blod från den sämre vena cava och portalen ven enligt specifika test protokoll används; Se tabell 1 och tabell 2.
- Avliva djuret via godkänd metod.
7. beräkning av lever Clearance
- Express lever clearance, förstås nedsatt utvinning, av skillnaden mellan portalen blodkoncentration och sämre hålvenen blodkoncentration eller förhållandet mellan sämre vena cava till portalen blodkoncentration, (1 - (sämre hålvenen koncentration / portalen ven koncentration)).
8. utvärdering av testet ämne koncentration n blodproverna
- Beroende på testämnet och testmetodik, omfattas av provet lämpligt laboratorium förfaranden (centrifugering, etc.). I de föreslagna protokoll utvärderar vi TMA/TMAO och kommittén koncentration med hjälp av vätskekromatografi tillsammans med triple-quadrupole masspektrometri. Vänligen hitta en detaljerad beskrivning av metoden i kompletterande Material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har framgångsrikt mätte GBB permeabilitet och lever clearance av TMA hos råttor. Vi har visat att hypertensiva råttor har en ökad kolon genomtränglighet TMA i jämförelse med normotensiva råttor (figur 2)4. I en annan studie fann vi att höga saltintag inte påverkar GBB permeabilitet och lever clearance av TMA (figur 3)14.
Mätning av koncentrationen av kommittén i avföring, portal blod och perifert blod, spåras vi sökvägen till molekylerna från tarmen till perifert blod. Exemplarisk resultaten för dessa experiment presenteras i tabell 3.
Figur 2 : Hypertoni-associerade ändringar i gut-blod-barriären permeabilitet. Intracolonic administration av TMA gav en signifikant ökning i portalen blod TMA i varje grupp (n = 12 för varje grupp). Portalen blod TMA i gruppen hypertensiva (SHR) ökade betydligt högre än i normotensiva (WKY) grupp. Vi använde långa protokollet bestående av blod provtagning 30 min och 60 min efter TMA administrering (IC TMA). Värden är medel, + SE, *p < 0,05 vs baslinjen, #p < 0,05 WKY vs SHR. Denna siffra har ändrats från Jaworska o.a. 4 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Gut-blod barriär permeabilitet och lever clearance efter höga saltintag. (A) Intracolonic administration av TMA gav en signifikant ökning i portalen blod TMA. Storleken på ökningen var liknande mellan grupperna (n = 7 för varje grupp). Vi använde ett förenklat protokoll, att ta blodprov vid behandlingsstart (0) och 15 min efter administrering av TMA (IC TMA). (B) TMA lever clearance var liknande mellan grupperna vid baslinjen, och 15 min efter intracolonic administrering av TMA. Värden är medel, + SE. *p < 0,05 vs baslinjen. Denna siffra har ändrats från Bielinska et al. 14 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| KOMMITTÉN | Pall koncentration (µM) | Portalen blodkoncentration (µM) | Perifert blodkoncentration (µM) |
| AA - ättiksyra (C2) | 15998.40 ± 4317.58 | 564.22 ± 155,34 | 149.89 ± 31,74 |
| IPA - propionsyra (C3) | 5390.70 ± 1016.19 | 138.25 ± 55.50 | 5,36 ± 3,25 |
| IBA-isobutyric syra (C4) | 191.20 ± 123.87 | 4,51 ± 1,60 | 1.14 ± 1.16 |
| BA - smörsyra (C4) | 4159.80 ± 3141.68 | 143.14 ± 68.42 | 6.43 ± 4.18 |
| 2MeB-2 methylbutyric syra (C5) | 80.90 ± 59,86 | 2.02 ± 0,88 | 1.14 ± 1,42 |
| IVA-isovaleriansyra (C5) | 109.10 ± 56.05 | 2.59 ± 1,07 | 0.90 ± 1,22 |
| VA - Valerian syra (C5) | 281,9 ± 158.20 | 8.55 ± 3.56 | 0,72 ± 1,02 |
| ICA-isocaproic syra / 4-methylvaleric syra (C6) | 5,9 ± 2,95 | 0,61 ± 0,15 | 1.76 ± 0,87 |
| CA - kapronsyra (C6) | 287.00 ± 309.68 | 11.19 ± 4,94 | 1.12 ± 0,93 |
Tabell 3: Kommittén koncentration i pall, portal blod och perifert blod (n = 7).
| Testsubstansen | Eventuell tillämpning |
| Bakteriella metaboliter: trimetylamin (TMA), korta fettsyror (kommittén), svavelväte, etc. |
GBB permeabilitet studier Spåra en gut-portal blod-lever-systemisk blod väg Hepatiskt clearance studier |
| Klassiska permeabilitet markörer: FITC-dextran, polysackarider, PEG, etc. |
GBB permeabilitet studier |
| Droger | absorption och nedsatt clearance studier |
Tabell 4: Exemplariskt testsubstanser med möjliga tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrivna direkt, i vivo, metod för att mäta GBB permeabilitet underhåller closetophysiological villkor i magtarmkanalen (bevarar intestinal blodflödet), och praktiskt taget inte påverkas av lever-och njurfunktion.
Det kritiska steget i denna teknik är införandet av portalen katetern. Detta måste göras försiktigt och beslutsamt på samma gång. En mild, kort blödning kan uppstå från korrekt utfört punkteringen av portalen ven; men slutar det när nålen sätts in i fartyget. Ihållande blödning indikerar att portalen ven är perforerad. För att underlätta katetrar, bör portalen ven exponeras väl. Efter exteriorizing tarmarna, när mesenterica roten är väl exponerade, den övre mesenteriska ven ska också vara synliga (mesenteriska ven träder cranially i portalen ven). Portalen ven täcks oftast av nedsatt loberna, som måste flyttas till sidorna. Ordentlig stabiliseringen av portalen katetern är också avgörande för en framgångsrik förfarande, eftersom kateterns rörelse kan producera portalen ven bristning och blödning, särskilt i längre experiment. Ytterligare stabilisering av katetern kan uppnås genom att koppla katetern till tarmkäx av stickning det till en tarmkäx med vävnad lim eller genom att tillämpa två enda stygn (6/0 tråd). Efter stängning bukhålan för att säkra placering av katetern, kan en handväska-sträng suturen tillämpas på katetern.
I området i närheten finns det flera mindre svårigheter som kan uppstå under experimentet. Efter kateterisering av femoral ven, om venöst blod gör inte återflödet i katetern, prova följande lösningar: Spola katetern med hepariniserad saltlösning, försiktigt dra katetern 1-2 mm från venen, ta bort kirurgiska knutar och knyt en ny en, dra katetern ut och sätt tillbaka, eller ersätta med en ny kateter. Kom ihåg att bekräfta korrekt placering av katetern efter experimentet. Katetern bör införas för 6-7 cm, beroende på storleken på djuret, att placera katetern proximala spets i den sämre vena cava precis ovanför nedsatt ven sammanflödet. När det kommer till tjocktarmen kateterisering, om du har problem med stigande katetern du kan injicera 0,3-0,5 mL koksaltlösning eller ledighet katetern i kolon för 5-10 minuter och försök igen. Använd inte kraft medan du för in en kateter för att undvika perforation av tarmen.
I våra studier har använt vi en gut bakterier-derived molekyl, trimetylamin (TMA), som markör för kolon GBB permeabilitet, som TMA är producerad mestadels av kolon bakterier. Men många andra ämnen, inklusive klassiska permeabilitet markörer som FITC-dextran eller socker kan användas samt (se tabell 4). När du förbereder en lösning av testämnet, beakta dess irriterande effekt på tarmslemhinnan och på lämpligt sätt välja koncentrationen av ämnet. Ytterligare laboratorierutiner av blodproverna måste anpassas till den valda markören.
I våra protokoll föreslår vi intracolonic administrering av en markör; Det kan dock ändras av oral administrering eller sondmatning på olika nivåer i mag-tarmkanalen. Variabel hastighet peristaltiken och möjliga interaktioner med enzymer och magsyra bör beaktas när du administrerar en markör i övre delar av magtarmkanalen t.ex. magsäcken eller tolvfingertarmen. Följaktligen behöver tid för blodprovstagning efter administrering av en markör justeras.
I området i närheten finns det flera begränsningar av den presenterade metoden, inklusive biverkningar av anestesi och fasta över natten, att påverka både GBB funktion. Det bör beaktas eftersom förfarandet är terminal och innebär blodprovstagning under inte fullt fysiologiska förhållanden. Dock som tidigare nämnts, det har fortfarande många fördelar över andra experimentella metoder att bedöma GBB permeabilitet, utförs särskilt in vitro-11. Exempelvis mäter en Ussing kammare konduktans och particle flux genom tarmens epitelceller. Denna teknik största svaghet ligger i dess överdriven förenkling. Det är svårt att beskriva det komplexa fysiologiska systemet av tarmslemhinnan med ett litet antal mätningar på epitelceller lager ensam. Vissa forskare använder hela-tjocklek tarmen för Ussing kammare studier, men proceduren åtföljs av flera metodologiska komplikationer15. Dessutom äventyras riktigheten av metoden av en begränsad bärkraft vävnader isolerade från organismen. Vissa in vitro- metoder som använts i farmakokinetiska studier använda konstgjorda membran som en modell av tarmbarriären12. Dessa metoder, likaså till avdelningen i Ussing återspeglar dock inte komplexiteten i GBB struktur och funktioner.
Det finns också i vivo permeabilitet analyser i experimentella och kliniska studier. De är mestadels baserade på urin eller perifert blod provtagning efter oral eller kolon tillförsel av olika markörer13. Allmänt använda socker testet innebär oralt intag av mono- och oligosackarider, som inte metaboliseras i däggdjur organismen, e.g. mannitol och Laktulos. Metoden är icke-invasiv och kan användas i både experimentell och klinisk användning16,17; Resultaten påverkas dock av första passage metabolism och njure leverfunktion, vilket kan skilja sig avsevärt mellan ämnena som studien. I motsats till de ovan nämnda indirekta metoderna tillåter samla in blod från portalen ven direkt utvärdering av GBB permeabilitet12. Denna metod är inte beroende av lever-och njurfunktion och praktiskt taget bevarar fysiologiska förhållanden i tarmen vilket är en viktig fördel jämfört med ex vivo eller in vitro- metoder.
Metoder som beskrivs i detta dokument också möjliggöra en relativt träffsäkra lever clearance utvärdering, som blodet samlas från portalen ven och sämre hålvenen precis ovanför nedsatt ven sammanflödet. De representativa resultat för nedsatt utvinning presenteras i figur 3 (för TMA) och tabell 3 (för kommittén). Våra data tyder på att tre huvudsakliga kommittén, acetat, propionat och butyrate, kännetecknas av olika hepatiskt clearance, vilket stöds av tidigare studier, där Bloemen et al. visat att intestinal släppa butyrate och propionat, men inte acetat, är nästan motsvaras av nedsatt upptag18. Därför är presenteras protokollet lämplig för att spåra intestinal absorption och metabolism i levern av droger, som kan användas i farmakokinetiska studier.
Teknikerna kan också anpassas till andra experimentella syften. Kateterisering av portalen ven kan användas att mäta portalen blodtryck eller för tillförsel av läkemedel direkt till portalen ven, för att studera nedsatt cirkulation. Exempelvis i vårt tidigare arbete administreras vi vätesulfid givare till portalen ven att bedöma dess påverkan på nedsatt cirkulation och portal tryck19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet stöds av ministeriet för vetenskap och högre utbildning i Polen, Diamond bevilja nr: DI2017 009247.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needle OD: 9 mm | Becton Dickinson S.A. | 301300 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-40 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-25 | |
| C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD | Cole-Parmer Instrument Co. | 06424-59 | |
| Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F) | Sigmed | 0000 80305 | |
| Surgical ligatures 3/0 | Yavo Sp. Z o.o. | P48JE | |
| Absorbable surgical sutures - Polyglactine 910 4/0 | KRUUSE Polska Sp. Zo.o. | 152336 | |
| Tissue glue - Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive | Loctite | 1370127 | |
| Povidone iodine | EGIS Pharmaceuticals PLC | 4449 11 | |
| Heparin - Heparinium WZF | WZF Polfa S.A. | 02BK0417 | Dilute 10 times with physiological saline |
| Glycerin 86% | Laboratorium Farmaceutyczne Avena | 5.90999E+12 | Serves as a lubricant in colon catheterization |
| Xylocaine 2% | AstraZenca | 9941342 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich (Merck) | U2500-500G | |
| Trimethylamine solution 45% | Sigma-Aldrich (Merck) | 92262-1L | |
| Syringes 2 mL | B.Braun Melsungen AG | 4606027V | |
| Saline 250 mL | Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o. | 15LL707WL | |
| Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends | Braun | NS-010-115-PKM | |
| Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 " | Braun | KN-008-140-ZMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7x0.55 | Braun | PO-001-007-ZMK | |
| Micro Scissors type Vannas, straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm | Braun | NO-010-085-PMK | |
| Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8" | Braun | HO-128-130-PMK | |
| Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2 | Braun | IM-927-150-PZMK | |
| Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp | Braun | NO-052-110-PMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp | Braun | PO-022-001-PMK |
References
- Camilleri, M., Madsen, K., Spiller, R., Greenwood-Van Meerveld, B., Verne, G. N. Intestinal barrier function in health and gastrointestinal disease. Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 24 (6), 503-512 (2012).
- Keita, A. V., Soderholm, J. D. The intestinal barrier and its regulation by neuroimmune factors. Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 22 (7), 718-733 (2010).
- Farhadi, A., Banan, A., Fields, J., Keshavarzian, A. Intestinal barrier: an interface between health and disease. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (5), 479-497 (2003).
- Jaworska, K., et al. Hypertension in rats is associated with an increased permeability of the colon to TMA, a gut bacteria metabolite. PloS one. 12 (12), e0189310 (2017).
- Fujii, H., Nakai, K., Fukagawa, M. Role of oxidative stress and indoxyl sulfate in progression of cardiovascular disease in chronic kidney disease. Therapeutic Apheresis and Dialysis: Official Peer-Reviewed Journal of the International Society for Apheresis, the Japanese Society for Apheresis, the Japanese Society for Dialysis Therapy. 15 (2), 125-128 (2011).
- Tomasova, L., et al. Intracolonic hydrogen sulfide lowers blood pressure in rats. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 60, 50-58 (2016).
- Brahe, L. K., Astrup, A., Larsen, L. H. Is butyrate the link between diet, intestinal microbiota and obesity-related metabolic diseases? Obesity Reviews: An Official Journal of the International Association for the Study of Obesity. 14 (12), 950-959 (2013).
- Ufnal, M., et al. Trimethylamine-N-oxide: a carnitine-derived metabolite that prolongs the hypertensive effect of angiotensin II in rats. The Canadian Journal of Cardiology. 30 (12), 1700-1705 (2014).
- Huc, T., Nowinski, A., Drapala, A., Konopelski, P., Ufnal, M. Indole and indoxyl sulfate, gut bacteria metabolites of tryptophan, change arterial blood pressure via peripheral and central mechanisms in rats. Pharmacological Research. 130, 172-179 (2018).
- Ufnal, M., Pham, K. The gut-blood barrier permeability - A new marker in cardiovascular and metabolic diseases? Medical Hypotheses. 98, 35-37 (2017).
- Le Ferrec, E., et al. In vitro models of the intestinal barrier. The report and recommendations of ECVAM Workshop 46. European Centre for the Validation of Alternative methods. Alternatives to Laboratory Animals: ATLA. 29 (6), 649-668 (2001).
- Bohets, H., et al. Strategies for absorption screening in drug discovery and development. Current Topics in Medicinal Chemistry. 1 (5), 367-383 (2001).
- Grootjans, J., et al. Non-invasive assessment of barrier integrity and function of the human gut. World Journal of Gastrointestinal Surgery. 2 (3), 61-69 (2010).
- Bielinska, K., et al. High salt intake increases plasma trimethylamine N-oxide (TMAO) concentration and produces gut dysbiosis in rats. Nutrition. 54, 33-39 (2018).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Denno, D. M., et al. Use of the lactulose to mannitol ratio to evaluate childhood environmental enteric dysfunction: a systematic review. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 Suppl 4, S213-S219 (2014).
- Lugea, A., Salas, A., Casalot, J., Guarner, F., Malagelada, J. R. Surface hydrophobicity of the rat colonic mucosa is a defensive barrier against macromolecules and toxins. Gut. 46 (4), 515-521 (2000).
- Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clinical Nutrition. 28 (6), 657-661 (2009).
- Huc, T., et al. Colonic hydrogen sulfide produces portal hypertension and systemic hypotension in rats. Experimental Biology and Medicine. 243 (1), 96-106 (2018).
