Summary
הגישה של חומרים מזינים, microbiota מטבוליטים ותרופות אל מחזור הדם נשלטת על ידי למכשול בטן-דם (GBB). אנו מתארים שיטה ישירה למדידת ה GBB חדירות ויוו, אשר, בניגוד נפוץ שיטות עקיפות, כמעט אינה מושפעת פונקציות כבד וכליות.
Abstract
למכשול בטן-דם (GBB) שולט המעבר של חומרים מזינים, חיידקי מטבוליטים וסמים של לומן מעיים למחזור הדם. שלמות GBB מופר מחלות מערכת העיכול, לב וכלי דם, חילוף החומרים, והתוצאה עשויה להיות גישה קלה יותר של חומרים פעילים ביולוגית, כגון מטבוליטים חיידקי המעיים, למחזור הדם. לפיכך, החדירות של GBB עשויות להיות סמן של מחלות מעיים והן extraintestinal. יתר על כן, החדירה מוגברת של מטבוליטים חיידקי עלולה להשפיע על תפקודו של האורגניזם כולו.
שיטות נפוצות ללמוד את החדירות GBB הן בביצוע ex-vivo. הדיוק של שיטות אלה הוא מוגבל, כי תפקוד GBB תלוי זרימת הדם במעיים. מצד שני, השיטות הנפוצות ויוו עלול להיות מוטה על ידי הכבד וביצועים הכליה, כמו שיטות אלה מבוססות על הערכה של שתן או / וריכוזי הדם ההיקפיים של סמנים אקסוגני. כאן, אנו מציגים מדידה ישירה של חדירות GBB בחולדות באמצעות ויוו שיטה המבוססת על פורטל דם הדגימה, אשר שומר על זרימת דם במעיים, כמעט אינה מושפעת על-ידי הפונקציה כבד וכליות.
קטטרים פוליאוריתן מוכנסים לתוך וריד שער הכבד, הכלילי מעל ולשננו הוורידים הנהרות. דם נדגמים ב בסיסית ואחרי הניהול של סמן שנבחרו לתוך חלק מערכת העיכול הרצוי. כאן, אנו מציגים מספר יישומים של השיטה כולל (1) הערכה של חדירות המעי הגס TMA, מטבוליט חיידקי המעיים, (2) הערכת הכבד סיקול TMA, ו (3) הערכת שביל דם דם-הכבד-ציוד היקפי בטן-פורטל של הבטן חיידקים-derived קצר-שרשרת חומצות שומן. יתר על כן, הפרוטוקול עשוי לשמש גם עבור מעקב אחר הספיגה במעיים מטבוליזם בכבד של סמים או מדידות לחץ דם הפורטל.
Introduction
מחסום הדם-בטן (GBB), הידוע גם בשם המכשול במעיים, היא מערכת מרובת שכבות מורכבות שמפריד לומן מעיים מזרם הדם על מנת להגביל את המעבר של תרכובות מזיקות תוך מתן אפשרות ספיגת חומרים מזינים1. הוא מורכב שלושה רבדים מרכזיים: שכבת ריר, אפיתל פרופריה. מוסקולריס.
גורמים רבים עשוי להשפיע על GBB תקינות ותפקוד2. הוכח כי GBB מופר מחלות במערכת העיכול והן extraintestinal, כולל מחלות לב וכלי דם וחילוף3, דבר שעלול להוביל מעבר מוגבר של מטבוליטים חיידקי המעיים עד למחזור הדם4. חדירה מוגברת של מטבוליטים חיידקי המעיים עלול להשפיע על תפקודו של האורגניזם כולו. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו השפעה משמעותית של מטבוליטים חיידקים, כגון indoles, H2S, קצר-שרשרת חומצות שומן (SCFA) ו- trimethylamine N-תחמוצת, על מערכת הדם פונקציות5,6,7 ,8,9. בסופו של דבר, שהוא הוצע כי חדירות GBB מוגברת עשוי לשמש סמן של מחלות לב וכלי דם וחילוף אשר משויכים שינויים מורפולוגיים ופונקציונליים המעיים10. לכן, מעקב אחר מסלול בטן-פורטל דם דם-הכבד-מערכתית של מטבוליטים חיידקי יכול להיות מעניין עבור מדעי בסיסי וקליני.
בדרך כלל שימוש בשיטות אקספרימנטליות על ההערכה של חדירות GBB הן בביצוע במבחנה באמצעות מקטעים מעיים resected, שברי רירית או פקיעת קרומים מלאכותית11,12. הדיוק של שיטות אלה נפרצת על ידי העובדה כי התפקוד התקין של GBB דורש זרימת הדם במעיים מתמדת. מצד שני, השיטות הזמינות ויוו מבוססים על הערכת שתן או דם היקפיים ריכוזים של סמנים אקסוגני13. אולם, ריכוז הדם והשתן היקפיים של תרכובות אקסוגני מושפעת על ידי תפקוד הכליות, קרי, סינון glomerular קצב הפרשת צינורי, כמו גם על ידי מטבוליזם בכבד, קרי, קודם לעבור מטבוליזם. שני הפרמטרים עשוי להיות שונה באופן משמעותי בין נושאי הלימוד ללא תלות הפונקציה GBB.
מאמר זה מתאר מדידה ישירה של החדירות GBB בחולדות באמצעות לקיחת דמים הפורטל. בשיטה זו אין ויוו משמרת את זרימת הדם במעיים של כמעט לא מושפע על ידי תפקוד כבד וכליות. הגישה המתוארת לא נפוץ, ואולי בגלל קשיים מתודולוגיים. נתאר בפירוט את צנתור של וריד שער הכבד, הכלילי מעל המפגש וריד הכבד. לקיחת דמים וריד שער הכבד, הכלילי מאפשרת הערכה של סיקול חדירות והכבד GBB וכן מעקב של דם דם-הכבד-מערכתית בטן-פורטל מסלול של מולקולות של עניין, כגון מטבוליטים חיידקי המעיים או תרופות. אנו מציגים גם מספר יישומים של השיטה שנבדקו במעבדה שלנו. אלה כוללים הערכת חדירות המעי הגס כדי TMA, מטבוליט חיידקי המעיים, הערכה של הכבד סיקול TMA וכן הערכה של שביל דם דם-הכבד-מערכתית של פורטל הבטן של SCFA.
כדי להעריך את מחסום הדם-בטן חדירות, בשלבים הבאים פרוטוקול צריכה להיות מלווה, סדר: 1 (ההכנסה של הקו עבור מינהל intraintestinal), 3 (צנתור וריד שער), 4 (וריד שער לקיחת דמים ), 6 (מינהלה של סמן חדירות מעיים), 4.
כדי להעריך את סיווג בכבד, שביל דם דם-הכבד-מערכתית בטן-פורטל, בשלבים הבאים פרוטוקול צריכה להיות מלווה, סדר: 1 (ההכנסה של הקו עבור מינהל intraintestinal), 2 (הכלילי צנתור), 3 (צנתור וריד שער), 4 (לקיחת דמים וריד שער), 5 (דיגום הדם הכלילי), 6 (מינהלה של סמן חדירות מעיים), 4, 5, 7 ( החישוב של סיווג בכבד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים נערכו על עכברים קיוטו Wistar זכר על פי הוראה 2010/63 האיחוד האירופי בנושא ההגנה על בעלי חיים משמשים למטרות מדעיות ואושרו על-ידי ועד מקומי Bioethical בוורשה I.
1. ההכנסה של הקו עבור ניהול Intraintestinal
הערה: כאן אנו מציעים ניהול intracolonic של סמן באמצעות קטטר. ניתן לשנות אותה על-ידי המינהל אוראלי או gavage ברמות שונות של מערכת העיכול כגון בקיבה או בתריסריון. זכור להשתמש בגדים כירורגי חד פעמיות, כולל שמלת כירורגי, מכסה המנוע, כפפות, ולהבטיח לעקוב את אמצעי זהירות הקשורות בכלים חדים המשמש בניתוח (מחטים, וכו ') במהלך הליכי 1-6.
- חיות מהירות בין לילה לפני ההליך. לבצע את כל ההליכים במהלך הרדמה כללית, קרי, מתקבל על ידי הזרקה של urethane 1.5 g/kg bw i.p. להעריך נכונה ההרדמה היעדרה של רפלקסים palpebral של הקרנית, ועל ידי שיטה הבוהן-קורט, זנב-קמצוץ.
- להשתמש צנתר פולי רפואת ילדים (10F או 8F) צנתר שטיפה. סמן את הצנתר כדי לציין את החלק שיתווספו לתוך המעי הגס (כ- 8 ס"מ).
- בדוק את אזור פי הטבעת לבין תוכן צואה בחלחולת לפני החדרת הקטטר לתוך המעי הגס. אם הצואה, רוקן החלחולת על ידי מעסה את אזור פי הטבעת.
- לשים סיכה (למשל גליצרין או וזלין) לאורך הצנתר. להרטיב את פי הטבעת וסביבתו עם הסיכה.
- הכנס את הקטטר עם ס מ חוט כ 8 מדריך דרך הסוגר האנלי חיצוניים. להפוך קדימה-אחורה איטי ותנועות מעגליות.
הערה: לשמור על בדיקת המיקום של הצנתר על ידי מישוש הבטן תוך כדי החדרת הקטטר.
2. הכלילי צנתור
- לגלח פרווה במפשעה. לסירוגין לחטא את העור עם אלכוהול, povidone יוד 3 פעמים, לכסות את האזור המפשעה וילונות כירורגי.
- נסה להרגיש את הדופק על עורק הירך לחתוך את העור longitudinally לאורך של 2.0 ס מ במקום איפה הדופק מוחשי.
- לנתח את fascia ואת השרירים כדי להמחיש את הצרור נוירו-וסקולריים.
- לנתח את וריד הירך מ הצרור נוירו-וסקולריים: העצבים הראשון, ולאחר מכן עורק הירך, ולאחר מכן את הווריד.
הערה: להיות זהירים בזמן של הקיבוץ נוירו-וסקולריים, מאז זעירים ענפי וריד הירך בקלות פגום, בהפקת דימום. - לשים שני ליגטורות על הווריד של הירך. לא לקשור את הקשרים עדיין. לתפוס את קצוות קשירה צינתור עם בעל מחט.
- משוך בזהירות את הקצוות קשירה עם המחזיק כלפי מעלה כדי לסגור חלק הווריד הפרוקסימלית. המתן עד הווריד מלאה דם, אותה יקדש דיסטלי.
- עושים חתך קטן (ca. 1 מ מ) על הווריד של בין קשר קשירה צינתור, באמצעות מספריים השתלה. הכנס את הצנתר באמצעות פינצטה או את המחט עם הסוף מעוקל.
הערה: לנקב את הווריד ולהשתמש קצה המחט גהר כמדריך עבור הצנתר. שחרר את הקשירה proximal תוך החדרת הקטטר. הכנס את הצנתר עבור 6-7.0 ס מ. - אבטח את הקטטר. את תקחי את הירך עם שני קשרים כירורגי יחיד. לקשור את הקשירה מקורב גם כן.
- בדוק patency של הצנתר על ידי ניסיון להוציא דם עם מזרק. יש לשטוף את הקטטר עם mL 0.3 של מלוחים heparinized (100 יחידות/mL).
- לסגור את הפצע כירורגית עם שתי שכבות של תפרים יחיד.
3. וריד שער צנתור
איור 1 : פורטל קטטר. הקטטר פורטל מורכב מחט OD: 0.9 מ מ באורך של 25.0 מ"מ [A], OD קטטר פוליאוריתן גמיש: 0.025", אורך כ- 100.0 מ מ [B], טיפ פוליאתילן גמיש של הקטטר OD: 0.040 ", כ 15.0 מ מ ארוך [C], פקק [D]. , ואת קשירה 3/0 עם אורך של 100.0 מ"מ [E]. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
- הכינו את הצנתר הפורטל על פי איור 1.
- להוסיף בסוף לחתוך המחט (OD: 9 מ מ) לתוך הצנתר פוליאוריתן OD: 0.025".
- לקשור את קשירה 3/0 בצומת של המחט, קטטר.
הערה: ודא כי החלק הארוך יותר של קשירה לפחות באורך 6 ס מ. - להוסיף בסוף הצנתר OD: 0.025" לתוך הצנתר פוליאתילן OD: 0.040".
- סגור את הקטטר עם פקק מתכת או פלסטיק.
- קו האמצע פתיחת בטן
- לגלח פרווה בבטן לסירוגין לחטא את העור עם אלכוהול, povidone יוד 3 פעמים, לכסות את האזור עם וילונות כירורגי.
- חותכים את העור longitudinally מן מצאתי של עצם החזה על הטבור.
- חותכים את שרירי לקיר הבטן לאורך הקו הלבן.
- להרחיב את החתך rostrally בצורת Y כך הסחוס xiphoid היא בין שני חתכים.
- וריד שער הכבד לנתיחה
- להרטיב הושארו כירורגית עם תמיסת מלח.
- Exteriorize את לולאת המעי האטום, בסדר עולה של המעי הגס, והמעי הדק. לשים את המעיים בצד שמאל כדי לחשוף את שורש מצע המעי.
הערה: לכסות את המעיים עם גזה סוידיש של תמיסת מלח פיזיולוגית על המעיים מפני התייבשות. - לחשוף את וריד שער הכבד, בזהירות להזיז את אונות הכבד לצדדים או כלפי מעלה כלפי הסרעפת עם הושארו בטעימת.
- להתאים את החלק של וריד שער הכבד שאינה מכוסה עם מצע המעי (ב hilum הכבד, ארוכה כ- 5 מ"מ) ולהעביר את קשירה 3/0 (אורכו 15 ס מ) תחת וריד שער הכבד.
הערה: כדי להגן על רקמות מפני נזק תוך הצבת את הקשירה, להרטיב את הקשירה עם פתרון תמיסת מלח פיזיולוגית. - הצמד את קצות קשירה עם מלקחיים והדק את זה בעדינות כדי לייצב את כלי הקיבול.
- הכניסה וייצוב של הקטטר
- להעביר את החלק הארוך יותר של הקשירה של הקטטר פורטל תחת החלק חינם של וריד שער הכבד, ומשוך אותו כך הקטטר הינו ממוקם ממש ליד וריד שער הכבד.
- הכנס את המחט לתוך וריד מצע המעי העליון העליון 3 מ מ מתחת לצומת של וריד מצע המעי העליון העליון, וריד שער הכבד. . תחזיקי את המחט בזווית של 30 מעלות, לאחר הזנת לווריד, להקטין את הזווית ולקדם את המחט כמעט אופקית, במקביל וריד שער הכבד.
הערה: את המחט על אורך של 6-7 מ מ. קשירה המייצבת צריך בעדינות להדק את וריד שער הכבד תוך החדרת הקטטר. - 1-2 טיפות של רקמות דבק במקום איפה המחט מוחדרת להחיל. הסר הושארו שמכסים את הכבד.
- לשים את המעיים בחזרה לתוך חלל הבטן.
- להרטיב את המעיים עם תמיסת ומחוממת למעלה ומכסים אותו עם בטעימת גזה סטרילית.
- בדוק patency של הקטטר ולשטוף את הקטטר עם mL 0.3 של מלוחים heparinized (100 יחידות/mL).
הערה: דם ורידי באופן ספונטני backflows הקטטר.
- הסוף של הניתוח
- לאחר 5 דקות, לבדוק את הצבע של תנועות ממברנות והמעיים, ודא זרימת הדם מצע המעי העליון הנכונה תישמר.
- לסגור את חלל הבטן עם תפרים 3: קיר צפק עם השכבה הפנימית של שרירי דופן הבטן - בתפר מתמשך, שנספג; שרירי הנותרים לקיר הבטן - בתפר מתמשך, שנספג; לעור ולרקמה התת-עורית - יחיד, נספגים התפרים.
הערה: Exteriorize החלק הדיסטלי של הקטטר סביב הטבור.
4. וריד שער דם הדגימה
- דגימת דם וריד שער בזמנים לפי הפרוטוקול בדיקות ספציפיות להשתמש; ראה טבלה 1.
| פרוטוקול קצר | פרוטוקול ארוך |
| t0 – בסיסית (לפני intracolonic מינהלה) | t0 – בסיסית (לפני intracolonic מינהלה) |
| t1 – 5 דקות לאחר intracolonic ניהול | t1 – 30 דקות לאחר intracolonic ניהול |
| t2 – 30 דקות לאחר intracolonic ניהול | t2 – 60 דקות לאחר intracolonic ניהול |
טבלה 1: פורטל דם הדגימה פרוטוקולים להערכת חדירות מעיים.
הערה: הזמן בין לקיחת דמים רציפים תלויה בעיקר הביולוגית של החומרים שנבדקו, באתר של המינהל (המעי הגס, קיבה, וכו ').
- פתח את הפקק קטטר פורטל, תנו לדמם לזרום בחופשיות.
- שימוש במזרק (כרך 2 מ"ל), להקהות את המחט OD: 0.9 מ"מ. לאסוף יותר מ 0.7 מ של דם.
- לשטוף את הצנתר 0.3 מ ל תמיסת heparinized (100 יחידות/mL) וסגור את התקע קטטר.
5. נחות Vena Cava דם הדגימה
- דגימת הדם הכלילי בזמנים לפי הפרוטוקול בדיקות ספציפיות להשתמש; עיין בטבלה 2.
| וריד שער | הכלילי |
| t0 – בסיסית (לפני intracolonic מינהלה) | t0 – בסיסית (לפני intracolonic מינהלה) |
| t1 – 30 דקות לאחר intracolonic ניהול | t1 – 30 דקות לאחר intracolonic ניהול |
טבלה 2: פרוטוקול של דם הדגימה למדידה סיווג כבד ומעקב אחר השביל בטן-פורטל דם דם-הכבד-מערכתית.
- פתח את הפקק קטטר הכלילי, תנו לדמם לזרום בחופשיות.
- לאסוף יותר מ 0.7 מ של דם באמצעות מזרק (כרך 2 מ"ל) ושבר המחט OD: מ מ.
- לשטוף את הקטטר עם 0.2-0.3 מ ל heparinized מלוחים (100 יחידות/mL) ולסגור את הפקק קטטר.
6. ניהול של סמן חדירות מעיים
- הסר את החוט, לנפח את הבלון צנתר שטיפה, באמצעות אחסון נאותים של מים סטריליים (בדרך כלל 1 מ"ל, אך בדיקת גודל בלון בפועל לפני ההוספה).
הערה: הקוטר בלון לא יעלה על 1 ס מ. - מניחים את ראש עכברוש (הנטייה כ 15%) כדי למזער את הסיכון של זרימה יוצאת של הפתרון המנוהל של המעי הגס.
- לאט לאט לנהל את החומר שנבדקו (למשל trimethylamine, 100 מ"ג/ק"ג bw) באמצעות יציאת ניקוז ב צנתר שטיפה.
הערה: לא יעלה על היקף 0.75 מ של הפתרון המנוהל ומהירות האכלה של 0.5 mL/min כדי למנוע זרימה יוצאת של הפתרון המנוהל מפי-הטבעת. - לאחר 10 דקות השטחת קצה הבלון קטטר.
- דגימת הדם הכלילי התחתון, וריד שער הכבד לפי הפרוטוקול בדיקות ספציפיות להשתמש; ראה טבלה 1 בטבלה 2.
- המתת חסד חיה באמצעות שיטת שאושרו.
7. חישוב של סיווג כבד
- אקספרס אישור בכבד, להבנה כמו חילוץ הכבד, ההבדל בין ריכוז הדם פורטל ריכוז הדם הכלילי או על ידי היחס של הכלילי כדי ריכוז הדם הפורטל, (1 - (ריכוז הכלילי / ריכוז וריד שער)).
8. הערכה של הדגימות דם n מבחן ריכוז חומר
- בהתאם לחומר הבחינה מתודולוגיית הבדיקה, נושא את הדגימה נהלי המעבדה המתאימה (צנטריפוגה, וכו '). ב הפרוטוקולים המוצע, נוכל להעריך TMA/TMAO וריכוז SCFA באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם טריפל-פאול ספקטרומטר מסה. בבקשה למצוא תיאור מפורט של השיטה בחומר משלימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהצלחה מדדנו את GBB חדירות והכבד הסיווג של TMA בחולדות. הראו שיש חולדות עם יתר לחץ דם חדירות המעי הגס מוגברת כדי TMA בהשוואה חולדות normotensive (איור 2)4. במחקר אחר מצאנו את צריכת המלח גבוהה אינה משפיעה על סיווג חדירות ולכבד את GBB TMA (איור 3)14.
מדידת הריכוז של SCFA, שרפרפים, מדם פורטל דם היקפיים, איתרנו את הנתיב של מולקולות מהמעי אל הדם ההיקפיים. התוצאות למופת לניסויים אלה מוצגים בטבלה3.
איור 2 : יתר לחץ דם-הקשורים לשינויים חדירות מחסום המעיים-דם- Intracolonic מינהל TMA המיוצר עלייה משמעותית בדם פורטל TMA בכל קבוצה (n = 12 לכל קבוצה). העלייה בדם פורטל TMA בקבוצה עם יתר לחץ דם (על זה) היה גבוה באופן משמעותי בקבוצה normotensive (WKY). השתמשנו פרוטוקול ארוך המורכב דם הדגימה 30 min ו- 60 דקות לאחר TMA המינהל (IC TMA). ערכים הם אמצעי +, SE, *p < 0.05 vs בסיסית, #p < 0.05 WKY לעומת SHR. דמות זו שונתה מ. Jaworska et al. 4 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : בטן-דם מכשול סיווג חדירות ואת הכבד לאחר צריכת המלח גבוהה. (א) Intracolonic מינהל TMA הפיק עלייה משמעותית בדם פורטל TMA. גודל הגידול היה דומה בין הקבוצות (n = 7 עבור כל קבוצה). השתמשנו פרוטוקול מפושטת, לקחת דגימות דם-בסיסית (0) ו- 15 דקות לאחר מתן של TMA (IC TMA). (ב) TMA הכבד סיווג היה דומה בין הקבוצות בנקודת ההתחלה, 15 דקות לאחר מתן של intracolonic של TMA. ערכים הם אמצעים, + -SE. *p < 0.05 vs בסיסית. דמות זו שונתה מ. Bielinska et al. 14 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| SCFA | ריכוז צואה (מיקרומטר) | ריכוז הדם פורטל (מיקרומטר) | ריכוז הדם ההיקפיים (מיקרומטר) |
| AA - חומצה אצטית (C2) | 15998.40 ± 4317.58 | 564.22 ± 155.34 | 149.89 ± 31.74 |
| IPA - חומצה propionic (C3) | 5390.70 ± 1016.19 | 138.25 ± 55.50 | 5.36 ± 3.25 |
| רשות השידור-isobutyric חומצה (C4) | 191.20 ± 123.87 | 4.51 ± 1.60 | 1.14 ± 1.16 |
| BA - חומצה בוטירית (C4) | 4159.80 ± 3141.68 | 143.14 ± 68.42 | 6.43 ± 4.18 |
| 2MeB-2 methylbutyric חומצה (C5) | 80.90 ± 59.86 | 2.02 ± 0.88 | 1.14 ± 1.42 |
| IVA-isovaleric חומצה (C5) | 109.10 ± 56.05 | התחלתי של 2.59 ± 1.07 | 0.90 ± 1.22 |
| VA - חומצה valeric (C5) | 281.9 ± 158.20 | ±: 8.55 3.56 | 0.72 ± 1.02 |
| חומצה ICA-isocaproic / 4-methylvaleric חומצה (C6) | 5.9 ± 2.95 | 0.61 ± 0.15 | 1.76 ± 0.87 |
| CA - חומצה caproic (C6) | 287.00 ± 309.68 | 11.19 ± 4.94 | 1.12 ± 0.93 |
טבלה 3: SCFA ריכוז צואה, פורטל דם, דם היקפיים (n = 7).
| בדיקת חומר | יישום אפשרי |
| חיידקי מטבוליטים: trimethylamine (TMA), חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFA), מימן גופרתי, וכו '. |
מחקרים חדירות GBB מעקב אחר נתיב דם דם-הכבד-מערכתית בטן-פורטל לימודי סיווג הכבד |
| סמני חדירות קלאסי: FITC-לתוספי, פוליסכרידים, פג, ועוד. |
מחקרים חדירות GBB |
| סמים | הקליטה ולשננו סיווג מחקרים |
טבלה 4: בדיקת למופת חומרים עם היישומים האפשריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ה תיאר ישירה, ויוו, שיטת מדידה את החדירות GBB שומרת closetophysiological תנאים במערכת העיכול (משמר את זרימת הדם מעיים), ואני כמעט לא מושפע על ידי תפקוד כבד וכליות.
השלב הקריטי של טכניקה זו היא החדרת הקטטר הפורטל. זה חייב להעשות בעדינות ובהחלטיות באותו זמן. קל, קצר הדימום עלול להתרחש מ הניקוב כראוי בביצוע של וריד שער הכבד; עם זאת, הוא עוצר כאשר המחט מוחדרת לתוך הכלי. דימום מתמשך מציין כי וריד שער הכבד הוא מחורר. כדי להקל על הכניסה קטטר, וריד שער הכבד צריך להיות טוב חשופות. לאחר exteriorizing את המעיים, כאשר השורש מצע המעי העליון חשוף. ובכן, וריד מצע המעי העליון העליון צריך גם להיות גלוי (וריד מצע המעי העליון נכנס cranially לתוך וריד שער הכבד). וריד שער הכבד מכוסה בדרך כלל על ידי האונות הכבד, אשר תועבר לצדדים. גם, ייצוב נאותה של הקטטר הפורטל הוא קריטי עבור הליך מוצלח, כיוון התנועה של הקטטר עשויה לייצר מדמם, במיוחד בניסויים ארוכים ולמסמנים וריד שער הכבד. ייצוב נוסף של הצנתר יכול להיעשות על ידי הצמדת הקטטר מצע המעי על ידי פ מצע המעי עם דבק רקמות או על-ידי החלת בשני תפרים יחיד (חוט 6/0). לאחר סגירת חלל הבטן כדי לאבטח את המיקום של הקטטר, בתפר הארנק-מחרוזת ניתן להחיל על הצנתר.
ישנם מספר קשיים קלים שעלולות להתרחש במהלך הניסוי. לאחר צנתור של הווריד של הירך, אם דם ורידי עושה לא זרם אחורי הקטטר, נסה את הפתרונות הבאים: לשטוף את הקטטר עם מלוחים heparinized תמשכו את הצנתר 1-2 מ מ הווריד, להסיר את הקשרים כירורגי ובעדינות לקשור משיכה אחת, חדש הקטטר, הכנס מחדש או להחליף קטטר חדש. זכור לאשר את המיקום הנכון של הקטטר לאחר הניסוי. צריך להיות מוכנס הצנתר עבור 6-7 ס מ, בהתאם לגודל של החיה, כדי למקם את קצה הקטטר proximal הכלילי התחתון מעל המפגש וריד הכבד. כשמדובר על המעי הגס צנתור, אם יש לך בעיות עם קידום הצנתר יכול להזריק 0.3-0.5 מ של תמיסת מלח או להשאיר הצנתר במעי הגס 5-10 דקות, נסה שוב. ואל תשתמש בכוח תוך החדרת צנתר להימנע לחירור של המעי.
במחקרים שלנו, השתמשנו בטן חיידקים-derived מולקולה, trimethylamine (TMA), כסמן של חדירות GBB המעי הגס, כפי TMA המיוצר בעיקר על ידי חיידקים חוקן. עם זאת, חומרים רבים אחרים, כולל סמני חדירות קלאסי כמו FITC-לתוספי או סוכרים, יכול לשמש גם כן (ראה טבלה 4). בעת הכנת פתרון של החומר במבחן, לקחת בחשבון את השפעתה מעצבן על רירית המעי ובחרו כראוי את הריכוז של החומר. תהליכי מעבדה נוספות של דגימות הדם התוקף שתישמר עד לסימון הנבחרים.
בפרוטוקול שלנו, אנו מציעים intracolonic הניהול של סמן; עם זאת, אותו ניתן לשנות על ידי המינהל אוראלי או gavage ברמות שונות של מערכת העיכול. המהירות המשתנה של תנועה פריסטלטית, האינטראקציות האפשריות עם אנזימים, חומצת קיבה צריך להילקח בחשבון תוך מתן סמן לחלקים העליונים של מערכת העיכול כגון הקיבה או התריסריון. בהתאם לכך, שעת לקיחת דמים לאחר ניהול של סמן צריך להיות מותאם.
קיימות מספר מגבלות השיטה שהוצגו, לרבות תופעות לוואי של הרדמה, צום בן לילה, כי ייתכן שניהם להשפיע GBB פונקציה. יש לקחת בחשבון כמו ההליך הוא מסוף כרוך דגימה דם במהלך התנאים לא מלא פיזיולוגיים. עם זאת, כפי שהוזכר מקודם, יש לו עדיין הרבה יתרונות על פני שיטות אחרות ניסיוני הערכת GBB פרמאביליות, במיוחד מבוצע במבחנה11. לדוגמה, תא Ussing מודד את שטף מוליכות וחלקיק דרך בתאי אפיתל המעי. החולשה העיקרית של טכניקה זו טמון פישוט יתר שלו. קשה לתאר את מערכת פיזיולוגית מורכבת של רירית המעי באמצעות מספר קטן של מדידות על שכבת תאים אפיתל לבד. יש חוקרים משתמשים המעי שלם-עובי ללימודי תא Ussing, אך הליך זה מלווה סיבוכים מתודולוגי מספר15. יתר על כן, הדיוק של שיטת נפרצת על ידי הכדאיות מוגבלת של רקמות מבודד מן האורגניזם. כמה במבחנה שיטות שימוש במחקרים פרמוקוקינטיים להשתמש ממברנות מלאכותיות כמודל מכשול המעי12. עם זאת, בשיטות אלה, באופן דומה לתא Ussing, אינן משקפות את המורכבות של המבנה GBB, פונקציות.
יש גם ויוו מבחני חדירות הזמינות במחקרים ניסויים קליניים. הם מבוססים בעיקר על שתן או דגימת דם היקפיים לאחר ניהול אוראלי או חוקן של סמנים שונים13. הבדיקה סוכר נפוץ כרוכה צריכת אוראלי של מונו - ו oligosaccharides, אשר הם לא מטבוליזם בתרבית של האורגניזם, למשל מניטול, לקטולוז. השיטה אינה פולשנית, עשוי להיות מועסק בשני16,לשימוש ניסיוני הקליני17; עם זאת, התוצאות מושפעים ראשון-עוברים מטבוליזם וכליות תפקוד הכבד, אשר יכול להיות שונה באופן משמעותי בין הנבדקים במחקר. בניגוד עקיף השיטות שהוזכרו לעיל, איסוף דם מווריד שער מאפשר הערכה ישירה של חדירות GBB12. שיטה זו אינה תלויה על תפקוד כבד וכליות ושומר כמעט מצבים פיזיולוגיים במעיים וזה יתרון חשוב על פני שיטות שמחוץ או במבחנה .
השיטות המתוארות במאמר זה לאפשר גם הערכה מדויקת יחסית סיווג הכבד, כמו הדם נאסף וריד שער הכבד, הכלילי מעל המפגש וריד הכבד. התוצאות נציג להפקת הכבד מוצגים באיור 3 (עבור TMA) ו לטבלה 3 (עבור SCFA). הנתונים שלנו מראים כי שלוש SCFA הראשי, אצטט, propionate ו butyrate, מאופיינים על ידי סיווג הכבד שונים, אשר נתמך על ידי מחקרים קודמים, איפה Bloemen et al. . הראו את שחרור מעיים של butyrate ושל propionate, אבל לא אצטט, הוא כמעט שווה על ידי ספיגת הכבד18. לכן, פרוטוקול הציג מתאימה למעקב אחר הספיגה במעיים מטבוליזם בכבד של תרופות, אשר יכול לשמש במחקרים פרמוקוקינטיים.
הטכניקות עשוי גם להיות מותאם למטרות ניסויים אחרים. צנתור של וריד שער הכבד עשוי לשמש כדי למדוד לחץ דם הפורטל או עבור ניהול של סמים ישירות לפורטל הווריד, ללימוד מחזור הכבד. למשל, בעבודה הקודמת שלנו, אנחנו ערכנו מימן גופרתי תורמים וריד שער הכבד כדי להעריך את השפעתה על לחץ פורטל19והשאלה הכבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
העבודה נתמך על ידי משרד המדע להשכלה גבוהה של פולין, יהלום הענק לא: DI2017 009247.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needle OD: 9 mm | Becton Dickinson S.A. | 301300 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-40 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-25 | |
| C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD | Cole-Parmer Instrument Co. | 06424-59 | |
| Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F) | Sigmed | 0000 80305 | |
| Surgical ligatures 3/0 | Yavo Sp. Z o.o. | P48JE | |
| Absorbable surgical sutures - Polyglactine 910 4/0 | KRUUSE Polska Sp. Zo.o. | 152336 | |
| Tissue glue - Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive | Loctite | 1370127 | |
| Povidone iodine | EGIS Pharmaceuticals PLC | 4449 11 | |
| Heparin - Heparinium WZF | WZF Polfa S.A. | 02BK0417 | Dilute 10 times with physiological saline |
| Glycerin 86% | Laboratorium Farmaceutyczne Avena | 5.90999E+12 | Serves as a lubricant in colon catheterization |
| Xylocaine 2% | AstraZenca | 9941342 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich (Merck) | U2500-500G | |
| Trimethylamine solution 45% | Sigma-Aldrich (Merck) | 92262-1L | |
| Syringes 2 mL | B.Braun Melsungen AG | 4606027V | |
| Saline 250 mL | Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o. | 15LL707WL | |
| Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends | Braun | NS-010-115-PKM | |
| Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 " | Braun | KN-008-140-ZMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7x0.55 | Braun | PO-001-007-ZMK | |
| Micro Scissors type Vannas, straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm | Braun | NO-010-085-PMK | |
| Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8" | Braun | HO-128-130-PMK | |
| Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2 | Braun | IM-927-150-PZMK | |
| Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp | Braun | NO-052-110-PMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp | Braun | PO-022-001-PMK |
References
- Camilleri, M., Madsen, K., Spiller, R., Greenwood-Van Meerveld, B., Verne, G. N. Intestinal barrier function in health and gastrointestinal disease. Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 24 (6), 503-512 (2012).
- Keita, A. V., Soderholm, J. D. The intestinal barrier and its regulation by neuroimmune factors. Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 22 (7), 718-733 (2010).
- Farhadi, A., Banan, A., Fields, J., Keshavarzian, A. Intestinal barrier: an interface between health and disease. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (5), 479-497 (2003).
- Jaworska, K., et al. Hypertension in rats is associated with an increased permeability of the colon to TMA, a gut bacteria metabolite. PloS one. 12 (12), e0189310 (2017).
- Fujii, H., Nakai, K., Fukagawa, M. Role of oxidative stress and indoxyl sulfate in progression of cardiovascular disease in chronic kidney disease. Therapeutic Apheresis and Dialysis: Official Peer-Reviewed Journal of the International Society for Apheresis, the Japanese Society for Apheresis, the Japanese Society for Dialysis Therapy. 15 (2), 125-128 (2011).
- Tomasova, L., et al. Intracolonic hydrogen sulfide lowers blood pressure in rats. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 60, 50-58 (2016).
- Brahe, L. K., Astrup, A., Larsen, L. H. Is butyrate the link between diet, intestinal microbiota and obesity-related metabolic diseases? Obesity Reviews: An Official Journal of the International Association for the Study of Obesity. 14 (12), 950-959 (2013).
- Ufnal, M., et al. Trimethylamine-N-oxide: a carnitine-derived metabolite that prolongs the hypertensive effect of angiotensin II in rats. The Canadian Journal of Cardiology. 30 (12), 1700-1705 (2014).
- Huc, T., Nowinski, A., Drapala, A., Konopelski, P., Ufnal, M. Indole and indoxyl sulfate, gut bacteria metabolites of tryptophan, change arterial blood pressure via peripheral and central mechanisms in rats. Pharmacological Research. 130, 172-179 (2018).
- Ufnal, M., Pham, K. The gut-blood barrier permeability - A new marker in cardiovascular and metabolic diseases? Medical Hypotheses. 98, 35-37 (2017).
- Le Ferrec, E., et al. In vitro models of the intestinal barrier. The report and recommendations of ECVAM Workshop 46. European Centre for the Validation of Alternative methods. Alternatives to Laboratory Animals: ATLA. 29 (6), 649-668 (2001).
- Bohets, H., et al. Strategies for absorption screening in drug discovery and development. Current Topics in Medicinal Chemistry. 1 (5), 367-383 (2001).
- Grootjans, J., et al. Non-invasive assessment of barrier integrity and function of the human gut. World Journal of Gastrointestinal Surgery. 2 (3), 61-69 (2010).
- Bielinska, K., et al. High salt intake increases plasma trimethylamine N-oxide (TMAO) concentration and produces gut dysbiosis in rats. Nutrition. 54, 33-39 (2018).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Denno, D. M., et al. Use of the lactulose to mannitol ratio to evaluate childhood environmental enteric dysfunction: a systematic review. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 Suppl 4, S213-S219 (2014).
- Lugea, A., Salas, A., Casalot, J., Guarner, F., Malagelada, J. R. Surface hydrophobicity of the rat colonic mucosa is a defensive barrier against macromolecules and toxins. Gut. 46 (4), 515-521 (2000).
- Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clinical Nutrition. 28 (6), 657-661 (2009).
- Huc, T., et al. Colonic hydrogen sulfide produces portal hypertension and systemic hypotension in rats. Experimental Biology and Medicine. 243 (1), 96-106 (2018).
