Summary
पोषक तत्वों की पहुंच, microbiota चयापचयों और दवाओं के संचलन आंत-रक्त बाधा (GBB) द्वारा नियंत्रित किया जाता है । हम vivo मेंGBB पारगम्यता को मापने के लिए एक सीधी विधि का वर्णन, जो, आमतौर पर इस्तेमाल अप्रत्यक्ष तरीकों के विपरीत, वस्तुतः जिगर और गुर्दे के कार्यों से प्रभावित नहीं है.
Abstract
आंत रक्त बाधा (GBB) पोषक तत्वों के पारित होने पर नियंत्रण, बैक्टीरियल चयापचयों और दवाओं आंतों लुमेन से खून करने के लिए. GBB अखंडता जठरांत्र में परेशान है, हृदय और चयापचय रोगों, जो इस तरह के आंत बैक्टीरियल चयापचयों के रूप में, रक्त के लिए जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों, की आसान पहुँच में परिणाम हो सकता है. इस प्रकार, GBB की पारगम्यता दोनों आंत्र और extraintestinal रोगों के एक मार्कर हो सकता है. इसके अलावा, बैक्टीरियल चयापचयों की बढ़ी हुई पैठ पूरे जीव के कामकाज को प्रभावित कर सकती है ।
GBB पारगम्यता का अध्ययन करने के लिए सामांयतः इस्तेमाल किया तरीकों vivo पूर्वप्रदर्शन कर रहे हैं । उन तरीकों की सटीकता सीमित है, क्योंकि GBB के कामकाज आंत्र रक्त प्रवाह पर निर्भर करता है । दूसरी ओर, आमतौर पर vivo तरीकों में इस्तेमाल किया जिगर और गुर्दे के प्रदर्शन से पक्षपाती हो सकता है, के रूप में उन तरीकों मूत्र या exogenous मार्करों के परिधीय रक्त सांद्रता के मूल्यांकन पर आधारित हैं । यहां, हम vivo में एक का उपयोग कर चूहों में GBB पारगम्यता का सीधा माप प्रस्तुत पोर्टल रक्त नमूना है, जो आंत्र रक्त प्रवाह को बरकरार रखता है और वस्तुतः जिगर और गुर्दे समारोह से प्रभावित नहीं है पर आधारित विधि.
टुकड़े कैथेटर पोर्टल नस और अवर वेना कावा बस यकृत नसों संगम के ऊपर में डाला जाता है । रक्त आधार रेखा पर और जठरांत्र संबंधी मार्ग के एक वांछित भाग में एक चयनित मार्कर के प्रशासन के बाद नमूना है । यहां, हम सहित विधि के कई अनुप्रयोगों के वर्तमान (1) TMA को बृहदांत्र पारगम्यता का मूल्यांकन, एक आंत बैक्टीरियल metabolite, (2) TMA के जिगर की निकासी का मूल्यांकन, और (3) एक आंत का मूल्यांकन-पोर्टल रक्त-जिगर-परिधीय रक्त मार्ग का पेट बैक्टीरिया-प्राप्त लघु श्रृंखला फैटी एसिड होता है । इसके अलावा, प्रोटोकॉल भी आंतों अवशोषण और दवाओं के जिगर चयापचय पर नज़र रखने के लिए या पोर्टल रक्तचाप की माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
आंत-रक्त बाधा (GBB), भी आंतों बाधा के रूप में जाना जाता है, एक जटिल बहुपरत प्रणाली है कि खून से आंत लुमेन अलग आदेश हानिकारक यौगिकों के पारित होने की सीमा के लिए जबकि1पोषक तत्वों के अवशोषण की अनुमति है । यह तीन मुख्य परतों के होते हैं: बलगम परत, उपकला और लेमिना propria.
कई कारकों GBB अखंडता और2समारोह को प्रभावित कर सकते हैं । यह दिखाया गया है कि GBB दोनों जठरांत्र और extraintestinal रोगों में परेशान है, हृदय और चयापचय रोगों सहित3, जो एक वृद्धि बीतने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं आंत बैक्टीरियल चयापचयों4खून करने के लिए. आंत बैक्टीरियल चयापचयों के एक वृद्धि की पैठ पूरे जीव के कामकाज को प्रभावित कर सकता है । उदाहरण के लिए, हाल के अध्ययनों से पता चलता है बैक्टीरियल चयापचयों का एक महत्वपूर्ण प्रभाव, जैसे indoles, H2S, लघु श्रृंखला फैटी एसिड (SCFA), और trimethylamine एन ऑक्साइड, संचार प्रणाली कार्यों पर5,6,7 ,8,9. अंत में, यह प्रस्तावित किया गया है कि एक वृद्धि हुई GBB पारगम्यता हृदय और चयापचय रोगों के एक मार्कर के रूप में सेवा कर सकते हैं जो आंतों में रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन के साथ जुड़े रहे हैं10. इसलिए, ट्रैकिंग आंत-पोर्टल रक्त-जिगर-प्रणालीगत बैक्टीरियल चयापचयों के रक्त मार्ग दोनों बुनियादी और नैदानिक विज्ञान के लिए ब्याज की हो सकती है ।
GBB पारगम्यता के मूल्यांकन के लिए सामान्य रूप से उपयोग प्रयोगात्मक तरीकों resect आंत्र खंडों, म्यूकोसा के टुकड़े, या कृत्रिम झिल्ली11,12का उपयोग कर इन विट्रो में प्रदर्शन कर रहे हैं । उन तरीकों की सटीकता तथ्य यह है कि GBB के समुचित कार्य निरंतर आंत्र रक्त प्रवाह की आवश्यकता है द्वारा समझौता किया है । दूसरी ओर, vivo में उपलब्ध तरीकों मूत्र या परिधीय रक्त exogenous मार्करों की सांद्रता के मूल्यांकन पर आधारित हैं13. हालांकि, परिधीय रक्त और मूत्र एकाग्रता exogenous यौगिकों गुर्दे समारोह, यानी, glomerular निस्पंदन दर और ट्यूबलर उत्सर्जन, साथ ही जिगर चयापचय, यानी, पहले से गुजारें चयापचय से प्रभावित है । दोनों पैरामीटर GBB फ़ंक्शन की स्वतंत्र रूप से अध्ययन विषयों के बीच काफी अलग हो सकता है ।
इस कागज पोर्टल रक्त नमूना का उपयोग कर चूहों में GBB पारगम्यता का एक सीधा माप का वर्णन. vivo विधि में यह आंत्र रक्त प्रवाह को बरकरार रखता है और वस्तुतः जिगर और गुर्दे समारोह से प्रभावित नहीं है । वर्णित दृष्टिकोण आमतौर पर प्रयोग नहीं किया जाता है, संभवतः क्योंकि कुछ methodological कठिनाइयों का । हम विस्तार में वर्णन पोर्टल नस और अवर वेना कावा के कैथीटेराइजेशन बस यकृत नस संगम के ऊपर । पोर्टल नस और अवर वेना कावा से रक्त का नमूना GBB पारगम्यता और जिगर की निकासी के मूल्यांकन की अनुमति देता है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आंत की ट्रैकिंग-पोर्टल रक्त-जिगर-हित के अणुओं के प्रणालीगत रक्त मार्ग, आंत बैक्टीरियल चयापचयों या दवाओं के रूप में. हम भी विधि है कि हमारी प्रयोगशाला में परीक्षण किया गया के कई आवेदन पेश करते हैं । ये TMA के लिए बृहदांत्र पारगम्यता का मूल्यांकन शामिल हैं, एक आंत बैक्टीरियल metabolite, TMA के जिगर की निकासी का मूल्यांकन, और एक आंत का मूल्यांकन-पोर्टल रक्त-जिगर-SCFA के प्रणालीगत रक्त मार्ग.
आंत-रक्त बाधा पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए, निम्न प्रोटोकॉल चरणों का पालन किया जाना चाहिए, क्रम में: 1 (intraintestinal प्रशासनों के लिए लाइन की प्रविष्टि), 3 (पोर्टल नस कैथीटेराइजेशन), 4 (पोर्टल नस रक्त नमूना ), 6 (एक आंत पारगम्यता मार्कर के प्रशासन), 4.
जिगर की निकासी और एक आंत का मूल्यांकन करने के लिए-पोर्टल रक्त जिगर-प्रणालीगत रक्त मार्ग, निंनलिखित प्रोटोकॉल चरणों का पालन किया जाना चाहिए, क्रम में: 1 (intraintestinal प्रशासन के लिए लाइन के सम्मिलन), 2 (अवर वेना कावा कैथीटेराइजेशन), 3 (पोर्टल नस कैथीटेराइजेशन), 4 (पोर्टल नस रक्त नमूना), 5 (अवर वेना कावा रक्त नमूना), 6 (एक आंत पारगम्यता मार्कर के प्रशासन), 4, 5, 7 ( जिगर की निकासी की गणना)।
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Protocol
प्रयोगों पुरुष Wistar क्योटो चूहों पर प्रदर्शन के अनुसार 2010/63 वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जानवरों के संरक्षण पर यूरोपीय संघ के निर्देश पर किया गया और मैं वारसॉ में स्थानीय अनैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. Intraintestinal प्रशासन के लिए लाइन का सम्मिलन
नोट: यहाँ हम एक कैथेटर का उपयोग मार्कर के intracolonic प्रशासन का प्रस्ताव. यह मौखिक प्रशासन या पाचन तंत्र के विभिंन स्तरों पर gavage द्वारा संशोधित किया जा सकता है जैसे पेट या ग्रहणी । सर्जिकल गाउन, हुड और दस्ताने सहित डिस्पोजेबल शल्य वस्त्र, का उपयोग करने के लिए याद रखें, और प्रक्रियाओं 1-6 के दौरान सर्जरी (सुई, आदि) में इस्तेमाल तेज उपकरणों से संबंधित सुरक्षा सावधानियों का पालन करने के लिए सुनिश्चित करें ।
- तेजी से जानवरों की प्रक्रिया से पहले रातोंरात । सामान्य संज्ञाहरण के दौरान सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन, यानी, urethane १.५ g/kg के इंजेक्शन द्वारा प्राप्त bw आईएफसआई उचित anesthetization का आकलन palpebral और corneal सजगता की कमी के द्वारा, और पैर की अंगुली-चुटकी और पूंछ-चुटकी विधि द्वारा ।
- एक बृहदांत्र कैथेटर के रूप में एक बाल चिकित्सा Foley कैथेटर (10F या 8F) का प्रयोग करें । कैथेटर (लगभग 8 सेमी) बृहदांत्र में डाला जाएगा कि भाग को इंगित करने के लिए चिह्नित करें ।
- गुदा क्षेत्र और पेट में कैथेटर डालने से पहले मलाशय में मल सामग्री की जाँच करें. यदि मल मौजूद है, मलाशय क्षेत्र की मालिश से गुदा खाली ।
- एक स्नेहक रखो (जैसे ग्लिसरीन या वेसिलीन) कैथेटर के साथ । गुदा और स्नेहक के साथ अपने आसपास गीला ।
- बाह्य गुदा लुगदी के माध्यम से लगभग 8 सेमी एक गाइड तार के साथ कैथेटर डालें । धीमी गति से आगे-पीछे और परिपत्र आंदोलनों बनाओ ।
नोट: कैथेटर डालने जबकि पेट टटोलने का कार्य द्वारा कैथेटर के स्थान की जाँच पर रखें ।
2. अवर वेना कावा कैथीटेराइजेशन
- कमर में फर दाढ़ी । वैकल्पिक रूप से शराब और povidone आयोडीन 3 बार के साथ त्वचा को संक्रमित और सर्जिकल पर्दे के साथ कमर क्षेत्र को कवर ।
- ऊरु धमनी पर नाड़ी महसूस करने की कोशिश करो और जहां नाड़ी स्पष्ट है जगह में लगभग २.० सेमी की लंबाई के लिए त्वचा longitudinally कटौती ।
- काटना प्रावरणी और मांसपेशियों neurovascular बंडल कल्पना करने के लिए ।
- neurovascular बंडल से ऊरु नस काटना: पहले नसों, फिर ऊरु धमनी, और फिर नस ।
नोट: neurovascular बंडल के विच्छेदन के दौरान सावधान रहें, के बाद से ऊरु नस की छोटी शाखाओं को आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है, रक्तस्राव का उत्पादन । - ऊरु नस पर दो लिगेचर्स रखो. गाँठें बाँध कर अभी नहीं. एक सुई धारक के साथ समीपस्थ संयुक्ताक्षर के सिरों को पकड़ो ।
- सावधानी से संयुक्ताक्षर छोर को धारक ऊपर की ओर से खींच कर नस के समीपस्थ भाग को बंद कर लें । रुको जब तक नस खून से भरा है और बाहर गाँठ टाई ।
- गाँठ और समीपस्थ संयुक्ताक्षर के बीच नस पर एक छोटा सा चीरा (सीए .1 मिमी), microsurgical कैंची का उपयोग कर. चिमटी या घुमावदार छोर के साथ सुई का उपयोग कैथेटर डालें ।
नोट: नस पंचर और कैथेटर के लिए एक गाइड के रूप में सुई के झुकने टिप का उपयोग करें । कैथेटर डालने जबकि समीपस्थ संयुक्ताक्षर ढीला । 6-7.0 सेमी के लिए कैथेटर डालें । - दो एकल शल्य समुद्री मील के साथ ऊरु नस में कैथेटर सुरक्षित । समीपस्थ संयुक्ताक्षर के रूप में अच्छी तरह से टाई ।
- एक सिरिंज के साथ रक्त आकर्षित करने का प्रयास करके कैथेटर के प्रत्यक्षता की जाँच करें । heparinized खारा (१०० इकाइयों/एमएल) के ०.३ मिलीलीटर के साथ कैथेटर कुल्ला ।
- एक टांके के दो परतों के साथ शल्य घाव बंद करो ।
3. पोर्टल नस कैथीटेराइजेशन
चित्रा 1 : पोर्टल कैथेटर । पोर्टल कैथेटर एक सुई आयुध डिपो के होते हैं: ०.९ मिमी के बारे में २५.० mm की लंबाई के साथ [एक], एक लचीला टुकड़े कैथेटर आयुध डिपो: ०.०२५ ", लंबाई के बारे में १००.० mm [B], कैथेटर आयुध डिपो के एक लचीला पॉलीथीन टिप: ०.०४०", लगभग १५.० मिमी लंबी [सी], एक प्लग [डी] , और १००.० mm [E] की लंबाई के साथ एक संयुक्ताक्षर 3/0 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
- आंकड़ा 1के अनुसार पोर्टल कैथेटर तैयार करें ।
- सुई के कट अंत (आयुध डिपो: 9 मिमी) के टुकड़े कैथेटर आयुध डिपो में डालें: ०.०२५
- सुई और कैथेटर के जंक्शन पर संयुक्ताक्षर 3/0 टाई ।
ध्यान दें: यह सुनिश्चित करें कि संयुक्ताक्षर का लंबा हिस्सा 6 सेमी से कम लंबा हो । - कैथेटर आयुध डिपो के अंत डालें: ०.०२५ "में पॉलीथीन कैथेटर आयुध डिपो: ०.०४०" ।
- एक धातु या प्लास्टिक प्लग के साथ कैथेटर बंद करें ।
- Midline laparotomy
- पेट में फर दाढ़ी, एकांतर से शराब और povidone आयोडीन 3 बार के साथ त्वचा को संक्रमित, और शल्य पर्दे के साथ क्षेत्र को कवर किया ।
- त्वचा को उरोस्थि के असिरूप से नाभि तक longitudinally काट लें ।
- सफेद रेखा के साथ पेट की दीवार की मांसपेशियों में कटौती ।
- असिरूप उपास्थि दो कटौती के बीच है ताकि Y आकृति में कटौती rostrally विस्तार करें ।
- पोर्टल नस विच्छेदन
- खारा के साथ शल्य झाड़ू गीला ।
- Exteriorize अंधान्त्र, आरोही और अनुप्रस्थ बृहदांत्र, और छोटी आंत पाश । बाईं ओर आंतों को अन्त्रपेशी की जड़ को बेनकाब करने के लिए रखो ।
नोट: सुखाने से आंतों की रक्षा के लिए एक शारीरिक खारा के साथ गीला धुंध के साथ आंतों को कवर । - पोर्टल नस बेनकाब करने के लिए, ध्यान से पक्ष या ऊपर की ओर के लिए यकृत पालियों ले जाने के लिए गीला झाड़ू के साथ डायाफ्राम ।
- अन्त्रपेशी (यकृत hilum में, के बारे में 5 मिमी लंबे) के साथ कवर नहीं किया जाता है पोर्टल नस का हिस्सा स्थानीयकृत और पोर्टल नस के अंतर्गत संयुक्ताक्षर 3/0 (15 सेमी लंबी) पास ।
नोट: संयुक्ताक्षर रखते हुए नुकसान से ऊतकों को बचाने के लिए, एक शारीरिक खारा समाधान के साथ संयुक्ताक्षर गीला । - संदंश के साथ संयुक्ताक्षर के सिरों को दबाना और इसे धीरे पोत को स्थिर करने के लिए कस ।
- कैथेटर का सम्मिलन और स्थिरीकरण
- पोर्टल की नस के नि: शुल्क भाग के अंतर्गत portal कैथेटर के संयुक्ताक्षर का लंबा भाग पास करें और इसे इतना खींचें कि कैथेटर केवल पोर्टल नस के बगल में स्थित है ।
- ऊपरी mesenteric नस और पोर्टल नस के जंक्शन के नीचे ऊपरी mesenteric नस 3 मिमी में सुई डालें । एक 30 ° कोण पर सुई पकड़ो और, नस में प्रवेश करने के बाद, कोण को कम करने और लगभग क्षैतिज सुई अग्रिम, पोर्टल नस के समानांतर में ।
नोट: लगभग 6-7 mm की लंबाई के लिए सुई डालें । स्थिर संयुक्ताक्षर धीरे पोर्टल नस कड़ा करना चाहिए, जबकि कैथेटर डालने । - जहां सुई डाला जाता है उस जगह पर टिशू गोंद की 1-2 बूँदें लागू करें । कि लीवर कवर झाड़ू निकालें ।
- आंतों को वापस उदर गुहा में डाल दें ।
- एक गर्म ऊपर खारा समाधान के साथ आंतों गीला और यह गीला बाँझ धुंध के साथ कवर ।
- कैथेटर के प्रत्यक्षता की जाँच करें और heparinized खारा (१०० इकाइयों/एमएल) के ०.३ मिलीलीटर के साथ कैथेटर कुल्ला ।
नोट: शिरापरक रक्त सहज कैथेटर में backflows ।
- सर्जरी के अंत
- 5 मिनट के बाद, आंतों और सिकुड़नेवाला आंदोलनों के रंग की जांच करें, सुनिश्चित करें कि उचित mesenteric रक्त प्रवाह बनाए रखा है ।
- पेट की दीवार की मांसपेशियों की भीतरी परत-एक सतत, अवशोषित सीवन के साथ पेट की गुहा 3 टांके के साथ बंद करें; पेट की दीवार के शेष मांसपेशियों-एक सतत, अवशोषित टांका; त्वचा और चमड़े के नीचे ऊतक-एकल, गैर अवशोषित टांके ।
नोट: Exteriorize नाभि के आसपास कैथेटर के बाहर का हिस्सा है ।
4. पोर्टल नस रक्त का नमूना
- उपयोग विशिष्ट परीक्षण प्रोटोकॉल के अनुसार समय पर नमूना पोर्टल नस रक्त; तालिका 1देखें ।
| लघु प्रोटोकॉल | लांग प्रोटोकॉल |
| टी0 – आधारभूत (intracolonic प्रशासन से पहले) | टी0 – आधारभूत (intracolonic प्रशासन से पहले) |
| टी1 -5 मिनट के बाद intracolonic प्रशासन | intracolonic प्रशासन के बाद टी1 – 30 मिनट |
| टी2 -30 मिनट के बाद intracolonic प्रशासन | टी2 -६० मिनट के बाद intracolonic प्रशासन |
तालिका 1: आंत पारगम्यता आकलन के लिए पोर्टल रक्त नमूना प्रोटोकॉल.
नोट: लगातार रक्त नमूने के बीच का समय परीक्षण किया पदार्थ और प्रशासन की साइट (बृहदांत्र, पेट, आदि) की जैव उपलब्धता पर मुख्य रूप से निर्भर करता है ।
- पोर्टल कैथेटर प्लग खोलें और रक्त प्रवाह स्वतंत्र रूप से करते हैं ।
- सिरिंज का उपयोग करें (vol .2 एमएल) और कुंद सुई आयुध डिपो: ०.९ मिमी. कोई अधिक से अधिक ०.७ मिलीलीटर ले लीजिए ।
- heparinized खारा (१०० इकाइयों/एमएल) के ०.३ मिलीलीटर के साथ कैथेटर कुल्ला और कैथेटर प्लग बंद करो ।
5. अवर वेना कावा रक्त का नमूना
- नमूना अवर वेना विशेष परीक्षण प्रोटोकॉल के अनुसार समय पर कावा रक्त का इस्तेमाल किया; तालिका 2देखें ।
| पोर्टल नस | अवर वेना कावा |
| टी0 – आधारभूत (intracolonic प्रशासन से पहले) | टी0 – आधारभूत (intracolonic प्रशासन से पहले) |
| intracolonic प्रशासन के बाद टी1 – 30 मिनट | intracolonic प्रशासन के बाद टी1 – 30 मिनट |
तालिका 2: जिगर की मंजूरी माप के लिए रक्त नमूना के प्रोटोकॉल और आंत-पोर्टल रक्त जिगर-प्रणालीगत रक्त मार्ग पर नज़र रखने ।
- अवर वेना कावा कैथेटर प्लग खोलें और रक्त प्रवाह स्वतंत्र रूप से करते हैं ।
- (vol .2 एमएल) सिरिंज और टूटी हुई सुई आयुध डिपो: 0.9 मिमी का उपयोग कर रक्त की अधिक से अधिक ०.७ मिलीलीटर ले लीजिए ।
- heparinized खारा (१०० इकाइयों/एमएल) के 0.2-0.3 मिलीलीटर के साथ कैथेटर कुल्ला और कैथेटर प्लग बंद करो ।
6. एक आंत पारगम्यता मार्कर के प्रशासन
- गाइड वायर निकालें और कालोनी कैथेटर गुब्बारा फुलाना, बाँझ पानी की पर्याप्त मात्रा का उपयोग कर (आमतौर पर 1 मिलीलीटर लेकिन वास्तविक गुब्बारा आकार की जांच करने से पहले प्रविष्टि) ।
नोट: गुब्बारा व्यास 1 सेमी से अधिक नहीं होना चाहिए । - जगह चूहा सिर नीचे (झुकाव के बारे में 15%) बृहदांत्र से प्रशासित समाधान के बहिर्वाह के जोखिम को कम करने के लिए ।
- धीरे परीक्षण पदार्थ प्रशासन (जैसे trimethylamine, १०० मिलीग्राम/bw) बृहदांत्र कैथेटर में एक ड्रेनेज बंदरगाह का उपयोग कर ।
नोट: प्रशासित समाधान के ०.७५ मिलीलीटर की मात्रा से अधिक नहीं है और गुदा से प्रशासित समाधान के बहिर्वाह को रोकने के लिए ०.५ मिलीलीटर/मिनट की खिला गति । - 10 मिनट के बाद कैथेटर गुब्बारा खंडन करना ।
- नमूना रक्त अवर वेना कावा से और पोर्टल नस विशिष्ट परीक्षण प्रोटोकॉल के अनुसार इस्तेमाल किया; तालिका 1 और तालिका 2देखें ।
- अनुमोदित विधि के जरिए Euthanize पशु.
7. जिगर की निकासी की गणना
- एक्सप्रेस जिगर की मंजूरी, यकृत निष्कर्षण के रूप में समझा, पोर्टल रक्त एकाग्रता और अवर वेना कावा रक्त एकाग्रता के बीच अंतर से या अवर वेना कावा के अनुपात से पोर्टल रक्त एकाग्रता के लिए, (1-(अवर वेना कावा एकाग्रता /portal शिरा एकाग्रता)).
8. परीक्षण पदार्थ एकाग्रता n रक्त के नमूनों का मूल्यांकन
- परीक्षण पदार्थ और परीक्षण पद्धति पर निर्भर करता है, उपयुक्त प्रयोगशाला प्रक्रियाओं (केंद्रापसारक, आदि) के लिए नमूना विषय । प्रस्तावित प्रोटोकॉल में, हम ट्रिपल-quadrupole मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके TMA/TMAO और SCFA एकाग्रता का मूल्यांकन करते हैं । कृपया पूरक सामग्री में विधि का विस्तृत विवरण प्राप्त करें ।
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Representative Results
हम सफलतापूर्वक चूहों में TMA के GBB पारगम्यता और जिगर की मंजूरी मापा है. हमने दिखा दिया है कि ग्रस्त चूहों normotensive चूहों की तुलना में TMA करने के लिए एक वृद्धि की बृहदांत्र पारगम्यता है (चित्रा 2)4. एक अन्य अध्ययन में हमने पाया है कि उच्च नमक का सेवन TMA के GBB पारगम्यता और जिगर की निकासी को प्रभावित नहीं करता है (चित्रा 3)14.
दस्त, पोर्टल रक्त, और परिधीय रक्त में SCFA की एकाग्रता को मापने, हम आंत से परिधीय रक्त अणुओं के रास्ते का पता लगाया. उन प्रयोगों के लिए अनुकरणीय परिणाम तालिका 3में प्रस्तुत कर रहे हैं ।
चित्रा 2 : उच्च रक्तचाप-आंत में परिवर्तन जुड़े-रक्त बाधा पारगम्यता । TMA के Intracolonic प्रशासन प्रत्येक समूह (n = 12 प्रत्येक समूह के लिए) में पोर्टल रक्त TMA में एक महत्वपूर्ण वृद्धि का उत्पादन किया । ग्रस्त (SHR) समूह में पोर्टल रक्त TMA में वृद्धि normotensive (WKY) समूह की तुलना में काफी अधिक थी । हम लंबे TMA प्रशासन (आईसी TMA) के बाद खून का नमूना 30 मिनट और ६० मिनट से मिलकर प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया । मान का अर्थ है, + SE, *p < ०.०५ बनाम आधारभूत, #p < ०.०५ WKY vs SHR. यह आंकड़ा Jaworska एट अल से संशोधित किया गया है । 4 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : आंत-रक्त बाधा पारगम्यता और उच्च नमक के सेवन के बाद जिगर की निकासी. (क) Intracolonic प्रशासन TMA पोर्टल रक्त TMA में उल्लेखनीय वृद्धि का उत्पादन किया । वृद्धि का आकार समूहों (n = 7 प्रत्येक समूह के लिए) के बीच समान था । हम एक सरलीकृत प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया, आधार रेखा (0) और TMA के प्रशासन के बाद 15 मिनट में रक्त के नमूने लेने (आईसी TMA) । (ख) TMA जिगर निकासी बेसलाइन पर समूहों के बीच समान था, और 15 मिनट TMA के intracolonic प्रशासन के बाद । मान का अर्थ है, + SE. *p < ०.०५ बनाम आधारभूत । यह आंकड़ा Bielinska एट अल से संशोधित किया गया है । 14 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| SCFA | मल एकाग्रता (µ m) | पोर्टल रक्त एकाग्रता (µ m) | परिधीय रक्त एकाग्रता (µ m) |
| ए. ए.-एसिटिक एसिड (C2) | १५९९८.४० ± ४३१७.५८ | ५६४.२२ ± १५५.३४ | १४९.८९ ± ३१.७४ |
| आइपीएल-propionic एसिड (C3) | ५३९०.७० ± १०१६.१९ | १३८.२५ ± ५५.५० | ५.३६ ± ३.२५ |
| आईबीए-isobutyric एसिड (C4) | १९१.२० ± १२३.८७ | ४.५१ ± १.६० | १.१४ ± १.१६ |
| बीए-butyric एसिड (C4) | ४१५९.८० ± ३१४१.६८ | १४३.१४ ± ६८.४२ | ६.४३ ± ४.१८ |
| 2MeB-2 methylbutyric एसिड (C5) | ८०.९० ± ५९.८६ | २.०२ ± ०.८८ | १.१४ ± १.४२ |
| IVA-isovaleric अम्ल (C5) | १०९.१० ± ५६.०५ | २.५९ ± १.०७ | ०.९० ± १.२२ |
| VA-valeric एसिड (C5) | २८१.९ ± १५८.२० | ८.५५ ± ३.५६ | ०.७२ ± १.०२ |
| ICA-isocaproic एसिड/4-methylvaleric एसिड (सी 6) | ५.९ ± २.९५ | ०.६१ ± ०.१५ | १.७६ ± ०.८७ |
| सीए-caproic एसिड (सी 6) | २८७.०० ± ३०९.६८ | ११.१९ ± ४.९४ | १.१२ ± ०.९३ |
तालिका 3: मल में SCFA एकाग्रता, पोर्टल रक्त, और परिधीय रक्त (n = 7).
| परीक्षण पदार्थ | संभव आवेदन |
| बैक्टीरियल चयापचयों: trimethylamine (TMA), शॉर्ट चेन फैटी एसिड (SCFA), हाइड्रोजन सल्फाइड, आदि । |
GBB पारगम्यता अध्ययन ट्रैकिंग एक आंत-पोर्टल रक्त जिगर-प्रणालीगत रक्त मार्ग यकृत मंजूरी अध्ययन |
| क्लासिक पारगम्यता मार्कर: FITC-dextran, polysaccharides, खूंटी आदि । |
GBB पारगम्यता अध्ययन |
| दवाओं | अवशोषण और यकृत मंजूरी अध्ययन |
तालिका 4: संभव अनुप्रयोगों के साथ अनुकरणीय परीक्षण पदार्थों.
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Discussion
vivo मेंवर्णित प्रत्यक्ष, GBB पारगम्यता को मापने की विधि जठरांत्र प्रणाली में closetophysiological शर्तों का कहना है (आंत्र रक्त प्रवाह को बरकरार रखता है), और वस्तुतः जिगर और गुर्दे समारोह से प्रभावित नहीं है.
इस तकनीक के महत्वपूर्ण कदम पोर्टल कैथेटर की प्रविष्टि है । यह धीरे और निर्णायक एक ही समय में किया जाना चाहिए । एक हल्के, छोटे खून बह रहा है पोर्टल नस की सही ढंग से प्रदर्शन पंचर से हो सकता है; हालांकि, यह सुई जहाज में डाला जाता है जब बंद हो जाता है । लगातार रक्तस्राव इंगित करता है कि पोर्टल नस छिद्रित है । कैथेटर प्रविष्टि की सुविधा के लिए, पोर्टल नस अच्छी तरह से उजागर किया जाना चाहिए । आंतों exteriorizing के बाद, जब mesenteric जड़ अच्छी तरह से उजागर किया जाता है, ऊपरी mesenteric नस भी दिखाई जानी चाहिए (mesenteric नस पोर्टल नस में कपाल में प्रवेश करती है) । पोर्टल नस आमतौर पर यकृत पालियों, जो पक्षों के लिए ले जाया जाना है द्वारा कवर किया जाता है । इसके अलावा, पोर्टल कैथेटर का उचित स्थिरीकरण एक सफल प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि कैथेटर आंदोलन पोर्टल नस टूटना और खून बह रहा उत्पादन कर सकते हैं, विशेष रूप से अब प्रयोगों में । कैथेटर के अतिरिक्त स्थिरीकरण कैथेटर अन्त्रपेशी करने के लिए यह ऊतक गोंद के साथ एक अन्त्रपेशी करने के लिए चिपके द्वारा या दो एकल टांके (धागा 6/0) लागू करने से प्राप्त किया जा सकता है । कैथेटर के स्थान को सुरक्षित करने के लिए उदर गुहा बंद करने के बाद, एक पर्स-स्ट्रिंग टांका कैथेटर पर लागू किया जा सकता है ।
वहां कई मामूली कठिनाइयों है कि प्रयोग के दौरान हो सकता है । शिरापरक रक्त कैथेटर में backflow नहीं करता है, तो ऊरु नस के कैथीटेराइजेशन के बाद, निम्न समाधान का प्रयास करें: heparinized खारा के साथ कैथेटर फ्लश, धीरे, नस से कैथेटर 1-2 mm खींचने, सर्जिकल समुद्री मील को हटाने, और एक नया एक टाई, पुल कैथेटर बाहर और फिर से डालें, या एक नया कैथेटर के साथ बदलें । प्रयोग के बाद कैथेटर की उचित स्थान की पुष्टि करने के लिए याद रखें । कैथेटर 6-7 सेमी, पशु के आकार पर निर्भर करता है के लिए डाला जाना चाहिए, बस यकृत नस संगम के ऊपर अवर वेना कावा में कैथेटर के समीपस्थ टिप जगह है । जब यह बृहदांत्र कैथीटेराइजेशन की बात आती है, यदि आप कैथेटर को आगे बढ़ाने के साथ समस्या है आप खारा के 0.3-0.5 मिलीलीटर इंजेक्शन या 5-10 मिनट के लिए बृहदांत्र में कैथेटर छोड़ सकते हैं, और फिर से प्रयास करें। बल का उपयोग करते हुए आंत के वेध से बचने के लिए एक कैथेटर डालने मत करो ।
हमारे अध्ययन में, हम एक आंत जीवाणु-व्युत्पंन अणु, trimethylamine (TMA), बृहदांत्र GBB पारगम्यता के एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया, के रूप में TMA ज्यादातर बृहदांत्र बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित है । हालांकि, FITC-dextran या शर्करा जैसे क्लासिक पारगम्यता मार्करों सहित कई अन्य पदार्थों, के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है ( तालिका 4देखें). जब परीक्षण पदार्थ का एक समाधान की तैयारी, खाते में आंतों की श्लेष्मा झिल्ली पर अपनी परेशान प्रभाव ले और उचित पदार्थ की एकाग्रता का चयन करें । आगे रक्त के नमूनों की प्रयोगशाला प्रक्रियाओं चयनित मार्कर को समायोजित किया जाना चाहिए.
हमारे प्रोटोकॉल में, हम एक मार्कर के intracolonic प्रशासन का प्रस्ताव; तथापि, यह मौखिक प्रशासन द्वारा संशोधित किया जा सकता है या पाचन तंत्र के विभिंन स्तरों पर gavage । क्रमाकुंचन और एंजाइमों और गैस्ट्रिक एसिड के साथ संभव बातचीत के चर गति को ध्यान में रखा जाना चाहिए, जबकि जठरांत्र संबंधी मार्ग के ऊपरी भागों में एक मार्कर प्रशासन जैसे पेट या ग्रहणी । तदनुसार, एक मार्कर के प्रशासन के बाद रक्त नमूने के समय के लिए समायोजित किया जाना चाहिए ।
वहां प्रस्तुत विधि की कई सीमाएं हैं, संज्ञाहरण के प्रतिकूल प्रभाव और रात भर उपवास सहित, कि दोनों GBB समारोह को प्रभावित कर सकते हैं । यह ध्यान में रखा जाना चाहिए के रूप में प्रक्रिया टर्मिनल है और नहीं पूरी तरह से शारीरिक स्थितियों के दौरान रक्त नमूना शामिल है । हालांकि, जैसा कि पहले उल्लेख किया है, यह अभी भी अंय प्रयोगात्मक GBB पारगम्यता का आकलन तरीकों पर कई फायदे हैं, विशेष रूप से इन विट्रो मेंप्रदर्शन किया11. उदाहरण के लिए, एक Ussing चैंबर आंत्र उपकला कोशिकाओं के माध्यम से कंडक्टर और कण प्रवाह के उपाय । इस तकनीक की मुख्य कमजोरी इसके अत्यधिक सरलीकरण में निहित है । यह आंत्र म्यूकोसा के जटिल शारीरिक प्रणाली का वर्णन करने के लिए मुश्किल है अकेले उपकला कोशिका परत पर माप की एक छोटी संख्या का उपयोग. कुछ शोधकर्ताओं Ussing चैंबर अध्ययन के लिए पूरे मोटाई आंत का उपयोग करें, लेकिन इस प्रक्रिया में कई methodological जटिलताओं के साथ है15. इसके अलावा, विधि की सटीकता जीव से पृथक ऊतकों की एक सीमित व्यवहार्यता से समझौता किया है । इन विट्रो तरीकों में कुछ pharmacokinetic अध्ययन में इस्तेमाल किया आंत्र बाधा12का एक मॉडल के रूप में कृत्रिम झिल्ली का उपयोग करें । हालांकि, उन तरीकों, Ussing चैंबर के लिए इसी तरह, GBB संरचना और कार्यों की जटिलता को प्रतिबिंबित नहीं करते ।
वहां भी vivo पारगम्यता प्रयोगात्मक और नैदानिक अध्ययन में उपलब्ध परख में हैं । वे ज्यादातर मूत्र या परिधीय विभिंन मार्करों के मौखिक या बृहदांत्र प्रशासन के बाद रक्त नमूने के आधार पर कर रहे है13। व्यापक रूप से इस्तेमाल किया शर्करा परीक्षण मोनो के मौखिक सेवन शामिल है-और oligosaccharides, जो स्तनधारी जीव में metabolized नहीं कर रहे हैं, जैसे mannitol और lactulose. विधि गैर इनवेसिव है और दोनों प्रयोगात्मक और नैदानिक उपयोग16,17में नियोजित किया जा सकता है; हालांकि, परिणाम पहले से गुजारें जिगर चयापचय और गुर्दे समारोह है, जो काफी अध्ययन विषयों के बीच अलग हो सकता है प्रभावित कर रहे हैं । उपर्युक्त अप्रत्यक्ष तरीकों के विपरीत, पोर्टल नस से रक्त संग्रह GBB पारगम्यता12के प्रत्यक्ष मूल्यांकन की अनुमति देता है । इस विधि जिगर और गुर्दे समारोह पर निर्भर नहीं है और वस्तुतः आंतों जो पूर्व vivo या इन विट्रो तरीकों में एक महत्वपूर्ण लाभ है में शारीरिक स्थितियों को बरकरार रखता है ।
इस पत्र में वर्णित तकनीक भी एक अपेक्षाकृत सटीक जिगर की मंजूरी मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं, के रूप में रक्त पोर्टल नस और अवर वेना कावा बस यकृत नस संगम से ऊपर से एकत्र की है । यकृत निष्कर्षण के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 (TMA के लिए) और तालिका 3 (SCFA के लिए) में प्रस्तुत कर रहे हैं । हमारे डेटा का सुझाव है कि तीन मुख्य SCFA, एसीटेट, propionate, और butyrate, अलग यकृत निकासी, जो पिछले अध्ययनों द्वारा समर्थित है द्वारा विशेषता है, जहां Bloemen एट अल । butyrate और propionate की है कि आंतों जारी दिखाया, लेकिन नहीं एसीटेट, लगभग यकृत के बाद18से बराबर है । इसलिए, प्रस्तुत प्रोटोकॉल आंत्र अवशोषण और दवाओं के जिगर चयापचय, जो pharmacokinetic अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है पर नज़र रखने के लिए उपयुक्त है ।
तकनीक भी अंय प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए समायोजित किया जा सकता है । पोर्टल नस के कैथीटेराइजेशन के लिए पोर्टल रक्तचाप या दवाओं के प्रशासन के लिए सीधे पोर्टल नस को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ताकि यकृत संचलन का अध्ययन करने के लिए । उदाहरण के लिए, हमारे पिछले काम में, हम पोर्टल नस के लिए हाइड्रोजन सल्फाइड दाताओं प्रशासित करने के लिए यकृत परिसंचरण और पोर्टल दबाव19पर अपने प्रभाव का आकलन करें ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
काम विज्ञान और पोलैंड के उच्च शिक्षा गणराज्य के मंत्रालय द्वारा समर्थित है, हीरा अनुदान नहीं: DI2017 ००९२४७ ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needle OD: 9 mm | Becton Dickinson S.A. | 301300 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-40 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-25 | |
| C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD | Cole-Parmer Instrument Co. | 06424-59 | |
| Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F) | Sigmed | 0000 80305 | |
| Surgical ligatures 3/0 | Yavo Sp. Z o.o. | P48JE | |
| Absorbable surgical sutures - Polyglactine 910 4/0 | KRUUSE Polska Sp. Zo.o. | 152336 | |
| Tissue glue - Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive | Loctite | 1370127 | |
| Povidone iodine | EGIS Pharmaceuticals PLC | 4449 11 | |
| Heparin - Heparinium WZF | WZF Polfa S.A. | 02BK0417 | Dilute 10 times with physiological saline |
| Glycerin 86% | Laboratorium Farmaceutyczne Avena | 5.90999E+12 | Serves as a lubricant in colon catheterization |
| Xylocaine 2% | AstraZenca | 9941342 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich (Merck) | U2500-500G | |
| Trimethylamine solution 45% | Sigma-Aldrich (Merck) | 92262-1L | |
| Syringes 2 mL | B.Braun Melsungen AG | 4606027V | |
| Saline 250 mL | Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o. | 15LL707WL | |
| Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends | Braun | NS-010-115-PKM | |
| Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 " | Braun | KN-008-140-ZMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7x0.55 | Braun | PO-001-007-ZMK | |
| Micro Scissors type Vannas, straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm | Braun | NO-010-085-PMK | |
| Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8" | Braun | HO-128-130-PMK | |
| Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2 | Braun | IM-927-150-PZMK | |
| Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp | Braun | NO-052-110-PMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp | Braun | PO-022-001-PMK |
References
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