Summary
Erişimi besinler, microbiota metabolitleri ve dolaşım için ilaçlar, gut-kan bariyerini (GBB) tarafından denetlenir. Biz hangi sık kullanılan dolaylı yöntemler aksine, karaciğer ve böbrek işlevleri tarafından etkilenmez neredeyse GBB geçirgenliği vivo içindeölçmek için doğrudan bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Gut-kan bariyerini (GBB) ilaç besinler, bakteriyel metabolitleri ve oyundan pasaj intestinal lümen için kan dolaşımına denetler. GBB bütünlüğü gibi bağırsak bakteri metabolitleri, biyolojik olarak aktif bileşikler daha kolay erişim için kan neden olabilir gastrointestinal, kardiyovasküler ve metabolik hastalıklarda bozulmuştur. Böylece, GBB geçirgenliği extraintestinal ve bağırsak hastalıklarının bir işaret olabilir. Ayrıca, bakteriyel metabolitleri artan penetrasyon tüm organizmanın çalışmasını etkileyebilir.
GBB geçirgenliği türleri çalışmak için yaygın olarak kullanılan gerçekleştirilen ex vivoyöntemlerdir. GBB işleyişi bağırsak kan akımı üzerinde bağlı olduğundan bu yöntemleri doğruluğunu sınırlıdır. Bu yöntemleri üzerinde idrar değerlendirme dayalı olarak Öte yandan, yaygın olarak kullanılan in vivo Yöntemler karaciğer ve böbrek performans, önyargılı olabilir veya / ve periferik kan konsantrasyonları eksojen işaretleri. Burada, bağırsak kan akışını korur ve karaciğer ve böbrek işlev tarafından etkilenmez neredeyse GBB geçirgenliği sıçanlarda örnekleme, portal kan dayalı bir vivo içinde yöntemini kullanarak doğrudan ölçülmesi mevcut.
Poliüretan kateterler portal ven yerleştirilir ve inferior vena kava hemen üstünde hepatik izdiham damarlar. Kan temel ve seçili bir işaretleyici yönetim gastrointestinal sistem istenen bir parçası haline sonra örneklenir. Burada, yönteminin (1) iki nokta üstüste geçirgenliği TMA, gut bakteri metaboliti, TMA karaciğer Gümrükleme değerlendirmesi (2) ve (3) gut bir gut-portal kan-karaciğer-periferik kan yol değerlendirilmesi değerlendirilmesi de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar mevcut kısa zincirli yağ asitleri bakteri kaynaklı. Ayrıca, protokol bağırsak emilim ve ilaçların karaciğer metabolizması izlemek için veya portal kan basıncı ölçümleri için de kullanılabilir.
Introduction
Gut-kan bariyerini (GBB), bağırsak bariyer olarak da bilinir, besin1emilimini izin verirken zararlı bileşikler geçişini sınırlamak için kan dolaşımına bağırsak lümen ayıran karmaşık bir çok katmanlı sistemidir. Üç ana katmandan oluşur: mukus tabakası, epitel ve lamina propria.
Çok sayıda faktör GBB bütünlüğü ve fonksiyonu2etkileyebilir. GBB dahil kardiyovasküler ve metabolik hastalıklar3gut bakteri metabolitleri artan bir geçit kan dolaşımına4için yol açabilir, gastrointestinal ve extraintestinal hastalıklarında bozulmuştur gösterilmiştir. Gut bakteri metabolitleri artan bir penetrasyon tüm organizmanın çalışmasını etkileyebilir. Örneğin, son yıllarda yapılan çalışmalarda indoller, H2S, kısa zincirli yağ asitleri (SCFA) ve trimethylamine N-oksit, gibi bakteriyel metabolitleri önemli bir etkisi dolaşım sistemi işlevleri5,6,7 göster ,8,9. Son olarak, artan bir GBB geçirgenliği kardiyovasküler ve metabolik hastalıkların morfolojik ve fonksiyonel değişiklikler bağırsak10ile ilişkili olan bir işaretleyici olarak hizmet verebilir önerilmiştir. Bu nedenle, bakteriyel metabolitleri gut-portal kan karaciğer sistemik kan yol izleme için temel ve klinik Bilimleri ilgi olabilir.
Yaygın olarak kullanılan deneysel GBB geçirgenliği değerlendirilmesi için gerçekleştirilen vitro rezeke bağırsak kesimleri, mukoza veya yapay membran11,12parçaları kullanarak yöntemlerdir. Bu yöntemleri doğruluğunu GBB düzgün sürekli bağırsak kan akımı gerektirir Aslında tarafından güvenilir değil. Öte yandan, mevcut vivo Yöntemler idrar değerlendirilmesi veya periferik kan konsantrasyonları eksojen işaretleri13temel alan. Ancak, periferik kan ve idrar konsantrasyon eksojen bileşiklerin böbrek fonksiyonu, Yani, glomerular filtrasyon ve borulu atılımı yanı sıra karaciğer metabolizması tarafından etkilenir, Yani, önce metabolizma geçmem. Her iki parametre GBB işlev bağımsız olarak çalışma konuları arasında önemli ölçüde farklı olabilir.
Bu kağıt GBB geçirgenliği sıçanlarda portal kan örnekleme kullanarak doğrudan ölçümü açıklar. Vivo Buyöntem bağırsak kan akışını korur ve karaciğer ve böbrek işlev tarafından etkilenir hemen hemen değil. Açıklanan yaklaşım yaygın olarak, muhtemelen bazı yöntembilimsel zorluklar nedeniyle kullanılır. Biz ayrıntılı olarak tarif kateterizasyon portal ven ve inferior vena kava hepatik ven kesiştiği yerde hemen üstünde. Kan örnekleme portal ven ve inferior vena kava GBB geçirgenliği ve karaciğer Temizleme değerlendirilmesi yanı sıra ilgi gut bakteri metabolitleri veya ilaç gibi moleküllerin gut-portal kan karaciğer sistemik kan yolu izleme sağlar. Biz de bizim laboratuvar test edildi birkaç uygulama Yöntem mevcut. Bu iki nokta üstüste geçirgenliği TMA, gut bakteri metaboliti, TMA karaciğer Gümrükleme değerlendirilmesi ve SCFA bir gut-portal kan karaciğer sistemik kan yol değerlendirilmesi için değerlendirilmesi içerir.
Gut-kan bariyerini geçirgenliği değerlendirmek için protokolü aşağıdakileri, sırayla takip edilmelidir: 1 (intraintestinal idareler için satır ekleme), 3 (portal ven kateterizasyonu), 4 (portal ven kan örnekleme ), 6 (bağırsak geçirgenliği marker yönetim), 4.
Karaciğer temizlik ve gut-portal kan karaciğer sistemik kan yolu değerlendirmek için protokolü aşağıdakileri, sırayla takip edilmelidir: 1 (intraintestinal idareler için satır ekleme), 2 (inferior vena kava kateterizasyon), 3 (portal ven kateterizasyonu), 4 (portal ven kan örnekleme), 5 (inferior vena kava kan örnekleme), 6 (bağırsak geçirgenliği marker yönetim), 4, 5, 7 () karaciğer Temizleme hesaplanması).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneyler bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması yönergesi 2010/63 AB göre erkek Wistar Kyoto fareler üzerinde gerçekleştirilen ve ben Varşova yerel Biyoetik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. Intraintestinal yönetim için satır ekleme
Not: Burada bir kateter kullanarak bir işaretleyici İdaresi intracolonic teklif ediyorum. Sözlü yönetim veya sonda ile besleme sindirim sistemi Örneğin mide ve oniki parmak bağırsağı çeşitli düzeylerde tarafından değiştirilebilir. Cerrahi Önlük, başlık ve eldiven gibi tek kullanımlık cerrahi giyim kullanmak (iğne, vb) 1-6 işlemler sırasında kullanılan keskin aletler ile ilgili güvenlik önlemleri takip etmek emin olun unutmayın.
- Gecede daha önce yordamı hızlı hayvanlar. Üretan 1.5 g/kg bw ı.p. değerlendirin uygun anesthetization enjeksiyonu ile palpebral ve kornea refleksleri eksikliği ve ayak-çimdik ve Kuyruk tutam yöntemi tarafından elde edilen yani genel anestezi sırasında tüm yordamları gerçekleştirin.
- Pediatrik Foley kateter (10F veya 8F) kolon kateter kullanın. Kateter kolon (yaklaşık 8 cm) eklenecek bölümü göstermek için işaretleyin.
- Anal bölge ve rektum dışkı içeriğinde kateter kolon eklemeden önce kontrol edin. Dışkı varsa, rektal alan masaj rektum boş.
- Bir yağ (Örneğin gliserin veya petrolatum) kateter boyunca koymak. Anüs ve çevresini yağ ile nemlendirin.
- Bir kılavuz tel yaklaşık 8 cm dış anal sfinkter aracılığıyla sondayla yerleştirin. Yavaş ileri geri ve dairesel hareketler yapmak.
Not: kateter konumunu kateter ekleme sırasında abdominal palpasyonla tarafından kontrol tutmak.
2. inferior Vena kava kateterizasyon
- Kasık kürk tıraş. Alternatif olarak alkol ve povidone iyot ile cilt 3 kez dezenfekte ve kasık bölgesinde cerrahi perdeler ile kaplayın.
- Femoral arter darbe hissediyorum ve boyuna 2,0 cm darbe aşikar yerde uzunluğu için deriyi kesme deneyin.
- Fasya ve nörovasküler demet görselleştirmek için kas incelemek.
- Nörovasküler demet üzerinden femoral ven teşrih: ilk sinirler, sonra femoral arter ve ven.
Not: femoral ven küçük dalları kolayca kanama üreten hasarlı, beri nörovasküler demet diseksiyon sırasında dikkatli olun. - İki bitişik harfler üzerinde femoral ven koymak. Henüz knot kravat mı. İğne bağı ile proksimal ip uçları yakalamak.
- Dikkatle ip uçları yukarı doğru damarı proksimal kısmı kapatmak için sahibi ile çek. Damar kan ile dolu kadar bekleyin ve distal düğüm kravat.
- Küçük bir kesi yapmak (ca. 1 mm) üzerinde ven düğümü atacağız ve proksimal bağ arasında mikrocerrahi makas kullanarak. Cımbız veya iğne ile eğri sonuna kullanarak kateter takın.
Not: damar ponksiyon ve iğne kıvrık ucu kateter için bir kılavuz olarak kullanın. Proksimal bağ kateter eklerken gevşetin. 6-7,0 cm için kateter takın. - İki tek cerrahi knot ile femoral ven kateteri güvenli. Proksimal bağ de bağla.
- Kateterin a_ılabilinirse şırıngayla kan girişiminde bulunarak denetleyin. Sonda heparinized serum (100 adet/mL) 0.3 mL ile yıkayın.
- Tek dikiş iki kat ile cerrahi yara kapatın.
3. Portal ven kateterizasyonu
Resim 1 : Portal kateter. Portal kateter bir iğne OD oluşur: 0.9 mm uzunluğu yaklaşık 25.0 mm [A], Esnek poliüretan kateter OD: 0,025", uzunluğu yaklaşık 100,0 mm [B], kateter OD esnek polietilen ucu: 0.040", yaklaşık 15.0 mm uzun [C], bir eklenti [D]. ve bir bağ 3/0 100,0 mm [E] uzunluğunda. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Şekil 1göre portal kateter hazırla.
- İğne kesim ucunu bağlayın (OD: 9 mm) içine poliüretan kateter OD: 0,025".
- İğne ve kateter, bağ 3/0 bağla.
Not: bağ daha uzun bir parçası en az 6 cm uzunluğunda olduğundan emin olun. - Kateter OD sonuna yerleştirin: 0,025" içine polietilen kateter OD: 0.040".
- Bir metal veya plastik fiş sondayla kapatın.
- Orta hat laparotomi
- Kürk karın tıraş, dönüşümlü olarak alkol ve povidone iyot ile cilt 3 kez dezenfekte ve cerrahi perdeler ile alanı kapsamaktadır.
- Deriden boyuna göğüs kemiği xiphoid göbek için kesti.
- Beyaz hattı boyunca karın duvarı kaslarının kesti.
- Böylece xiphoid kıkırdak iki kesim arasında kesme Y şeklinde rostrally genişletin.
- Portal ven diseksiyon
- Serum fizyolojik ile cerrahi temizleme bezi nemlendirin.
- Çekum, artan ve enine kolon ve ince bağırsak döngü exteriorize. Bağırsak bıçaklanmasından kökünü göstermek için sol tarafa koy.
Not: bağırsak bağırsak kurumasını korumak için bir fizyolojik serum ile ıslatılmış gazlı bezle kapak. - Portal ven göstermek için dikkatli bir şekilde karaciğer lobları taraf veya yukarı doğru diyafram nemlendirilmiş temizleme bezi ile doğru taşıyın.
- Bıçaklanmasından (içinde karaciğer Hilus, 5 mm uzun) ile kapsanmayan portal ven parçası yerelleştirilmesine ve portal ven altında bağ 3/0 (15 cm uzunluğunda) geçirin.
Not: bir fizyolojik serum fizyolojik solüsyonu ile bağ dokuları bağ yerleştirerek süre zararlardan korumak için kadar ıslat! - Forseps ile ip uçları kelepçe ve yavaşça gemi stabilize etmek sıkın.
- Ekleme ve stabilization kateterin
- Portal kateter'ın bağ portal ven ücretsiz parçası altında daha uzun bir parçası geçmek ve böylece kateter sadece portal ven yanında bulunan çekin.
- Üst mezenterik ven üst mezenterik ven ve portal ven altında 3 mm iğne takın. 30 ° açıyla ve damar içine girdikten sonra iğne tutun, açı azaltmak ve iğne neredeyse yatay olarak, portal ven paralel ilerlemek.
Not: bir süre boyunca yaklaşık 6-7 mm iğne yerleştirin. Teskin bağ-hafifçe sıkın portal ven kateteri eklerken. - 1-2 damla doku yapıştırıcısı iğne yerleştirildiği yerde geçerlidir. Karaciğer kapak bezlerden kaldırın.
- Bağırsak karın boşluğuna koy.
- Bağırsak kadar ısıtılmış serum fizyolojik solüsyonu ile nemlendirin ve nemli steril gazlı bez ile kaplayın.
- Kateterin a_ılabilinirse kontrol ve heparinized tuz (100 adet/mL) 0.3 mL sondayla durulayın.
Not: Venöz kan kateter içinde kendiliğinden backflows.
- Ameliyat sonu
- 5 dakika sonra bağırsak ve peristaltik hareketleri rengini kontrol, uygun mezenterik kan akımı korunur emin olun.
- 3 dikiş ile karın boşluğu kapatmak: periton karın duvarı kasları - sürekli, absorbe dikiş; iç tabakası ile duvar kalan kasları karın duvarı - sürekli, absorbe dikiş; deri ve subkutan doku - tek, absorbe olmayan dikiş.
Not: göbek çevresinde kateterin distal bölümü Exteriorize.
4. Portal ven kan örnekleme
- Örnek portal ven kan zaman zaman kullanılan belirli test protokolüne göre; bkz. Tablo 1.
| Kısa protokol | Uzun protokol |
| t0 – temel (önce intracolonic yönetim) | t0 – temel (önce intracolonic yönetim) |
| t1 – 5 dk sonra intracolonic yönetim | t1 – 30 dk sonra intracolonic yönetim |
| t2 -30 dk sonra intracolonic yönetim | t2 -60 dk sonra intracolonic yönetim |
Tablo 1: Portal kan örnekleme protokolleri bağırsak geçirgenliği değerlendirmesi için.
Not: Üst üste kan örnekleme arasındaki süre esas olarak test edilmiş maddelerin bioavailability ve site yönetim (kolon, mide, vb) bağlıdır.
- Portal kateter tak aç ve kan akımı serbestçe izin ver.
- Kullanım şırınga (vol. 2 mL) ve iğne OD künt: 0.9 mm. den fazla 0.7 mL kan toplamak.
- Sonda heparinized serum (100 adet/mL) 0.3 mL ile durulayın ve kateter tak kapatın.
5. inferior Vena kava kan örnekleme
- Örnek inferior vena kava kan zaman zaman kullanılan belirli test protokolüne göre; Tablo 2' ye bakın.
| Portal ven | İnferior vena kava |
| t0 – temel (önce intracolonic yönetim) | t0 – temel (önce intracolonic yönetim) |
| t1 – 30 dk sonra intracolonic yönetim | t1 – 30 dk sonra intracolonic yönetim |
Tablo 2: Protokolü karaciğer Temizleme ölçüm için örnekleme ve gut-portal kan karaciğer sistemik kan yolu izleme kan.
- İnferior vena kava kateter tak aç ve kan akımı serbestçe izin ver.
- Fazla 0.7 mL şırınga kullanarak kan toplamak (vol. 2 mL) ve iğne OD kırık: 0.9mm.
- Sonda 0.2-0.3 ile durulayın mL heparinized serum fizyolojik (100 adet/mL) ve kateter tak kapatın.
6. Yönetim bir bağırsak geçirgenliği Marker
- Kılavuzu kaldır ve steril su (genellikle 1 mL ama onay gerçek balon boyutu ekleme önce) yeterli hacim kullanarak kolon kateter balon şişirmek.
Not: Balon çapı 1 cm aşmaması gerekir. - Sıçan baş aşağı (iki nokta üst üste yönetilen çözümden çıkış riskini en aza indirmek için eğim yaklaşık % 15) yerleştirin.
- Yavaş yavaş test madde yönetmek (Örneğin trimethylamine, 100 mg/kg bw) kolon kateter drenaj limanda kullanarak.
Not: hacmi yönetilen çözümün 0.75 mL ve anüs yönetilen çözümden çıkış önlemek için 0.5 mL/dk besleme hızı fazla olamaz. - 10 dakika sonra kateter balonu deflate.
- Örnek kan inferior vena kava ve portal ven kullanılan belirli test protokolüne göre; bkz: Tablo 1 ve tablo 2.
- Hayvan onaylı yöntemi ile ötenazi.
7. karaciğer Temizleme hesaplanması
- Karaciğer Temizleme, hepatik çıkarma portal kan konsantrasyonu ve inferior vena kava kan konsantrasyonu arasındaki fark veya inferior vena kava portal kan konsantrasyonu, (1 - (inferior vena kava toplama oranı tarafından anlaşılmış hızlı / portal ven konsantrasyon)).
8. Test madde konsantrasyonu n kan örnekleri değerlendirilmesi
- Test madde ve test metodoloji bağlı olarak örnek uygun Laboratuvar yordamları (Santrifüjü, vb) tabi. Önerilen Protokoller'de TMA/TMAO ve sıvı kromatografi triple quadrupole kütle spektrometresi ile birleştiğinde kullanarak SCFA konsantrasyon değerlendirin. Lütfen ek malzeme yöntemi ayrıntılı bir açıklamasını bulabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarıyla GBB geçirgenliği ve karaciğer Temizleme TMA sıçanlarda ölçülen var. Hipertansif fareler bir artan kolon geçirgenliği TMA için normotansif fareler (Şekil 2)4ile karşılaştırıldığında var göstermiştir. Başka bir çalışmada bulduk o yüksek Tuz tüketiminizi TMA (Şekil 3)14GBB geçirgenliği ve karaciğer geçiş izni etkilemez.
SCFA konsantrasyon dışkı, portal kan ve kan periferik ölçme, bağırsak üzerinden molekülleri periferik kan yolunu bulduk. Bu deneyler için örnek sonuçları Tablo 3' te sunulmuştur.
Resim 2 : Hipertansiyon ilişkili değişiklikler gut-kan bariyerini geçirgenliği. TMA, Intracolonic yönetimi üretilen portal kan TMA her grup içinde önemli bir artış (n = 12 her grup için). Portal kan TMA hipertansif (SHR) grubunda artış anlamlı (WKY) normotansif grubunda daha yüksek oldu. Biz 30 dk ve 60 dk sonra TMA Yönetim (IC TMA) örnekleme kan oluşan uzun protokolü kullanılır. Değerler şunlardır: anlamına gelir + SE, *p < 0,05 vs temel, #p 0.05 < WKY vs SHR. Bu rakam Jaworska ve ark. değiştirildi 4 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Gut-kan bariyer geçirgenliği ve karaciğer temizleme sonra yüksek Tuz tüketiminizi. (A) TMA Intracolonic yönetimi portal kan TMA önemli bir artış üretti. Artış boyutunu gruplar arasında benzer (n = 7 her grup için). Biz basitleştirilmiş bir protokol, kan örnekleri temel (0) ve 15 dk alarak TMA (IC TMA) yönetim sonra kullanılır. (B) TMA karaciğer Temizleme TMA intracolonic yönetim sonra temel, grupları ve 15 dk arasında benzer. Değerler şunlardır: anlamına gelir, + SE. *p < 0,05 vs temel. Bu rakam Bielinska ve ark. değiştirildi 14 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| SCFA | Dışkı toplama (µM) | Portal kan konsantrasyonu (µM) | Periferik kan konsantrasyonu (µM) |
| AA - asetik asit (C2) | 15998.40 ± 4317.58 | 564.22 ± 155.34 | 149.89 ± 31.74 |
| IPA - propiyonik asit (C3) | 5390.70 ± 1016.19 | 138.25 ± 55.50 | 5,36 ± 3,25 |
| IBA-İzobutirik asit (C4) | 191.20 ± 123.87 | 4,51 ± 1,60 | 1.14 ± 1.16 |
| BA - bütirik asit (C4) | 4159.80 ± 3141.68 | 143.14 ± 68.42 | 6,43 ± 4,18 |
| 2MeB-2 methylbutyric asit (C5) | 80,90 ± 59.86 | 2.02 ± 0,88 | 1.14 ± 1,42 |
| IVA-isovaleric asit (C5) | 109.10 ± 56.05 | 2,59 ± 1.07 | 0.90 ± 1,22 |
| VA - valeric asit (C5) | 281,9 ± 158.20 | 8,55 ± 3,56 | 0,72 ± 1,02 |
| ICA-isocaproic asit / 4-methylvaleric asit (C6) | 5.9 ± 2,95 | 0,61 ± 0,15 | 1.76 ± 0,87 |
| CA - kaproik asit (C6) | 287.00 ± 309.68 | 11,19 ± 4,94 | 1.12 ± 0.93 |
Tablo 3: Dışkı, portal kan ve kan periferik SCFA konsantrasyon (n = 7).
| Test madde | Olası uygulama |
| Bakteriyel metabolitleri: trimethylamine (TMA), kısa zincirli yağ asitleri (SCFA), hidrojen sülfür, vb. |
GBB geçirgenliği çalışmaları Bir gut-portal kan karaciğer sistemik kan yol izleme Karaciğer temizleme çalışmaları |
| Klasik geçirgenliği işaretleri: FITC-dextran, polisakkaritler, PEG, vb. |
GBB geçirgenliği çalışmaları |
| Uyuşturucu | emme ve hepatik temizleme çalışmaları |
Tablo 4: Örnek test maddeler olası uygulamaları ile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan doğrudan, in vivo, GBB geçirgenliği ölçüm yöntemi closetophysiological koşulları (bağırsak kan akışını korur) gastrointestinal sistemde korur ve karaciğer ve böbrek işlev tarafından etkilenir hemen hemen değil.
Kritik bu tekniği portal Kateter yerleştirilmesi adımdır. Bu aynı zamanda yavaşça ve kararlı yapılmalıdır. Bir hafif, kısa kanama portal ven doğru gerçekleştirilen bir delik ortaya çıkabilir; Ancak, iğne damar eklenir durur. Sürekli kanama portal ven delikli gösterir. Kateter ekleme kolaylaştırmak için portal ven de maruz. Mezenterik kök de maruz kaldığında, bağırsak exteriorizing sonra üst mezenterik ven da görünür olmalıdır (mezenterik ven girer cranially portal ven). Portal ven genellikle taraf için taşınacak var hepatik loblar kaplıdır. Kateter'ın hareketi portal ven yırtılması ve kanama, özellikle daha uzun deneylerde neden olabilir bu yana da, portal kateterin uygun sabitleme başarılı bir yordam için çok önemlidir. Kateterin ek istikrar kateter bıçaklanmasından için bir bıçaklanmasından doku yapıştırıcı ile yapışmasını veya iki tek dikiş (6/0 numaralı iş parçacığı) uygulayarak ekleyerek elde edilebilir. Kateter yerleştirme güvenliğini sağlamak için karın boşluğu kapattıktan sonra çanta-dize dikiş kateter üzerinde uygulanabilir.
Deneme sırasında oluşabilecek birkaç küçük zorluklar vardır. Venöz kan değil geri tepme kateter içinde yaparsa, femoral ven kateterizasyonu sonra aşağıdaki çözümleri deneyin: sonda heparinized serum fizyolojik ile flush, yavaşça 1-2 mm damardan kateter çekin, cerrahi knot kaldırmak ve yeni bir 1, çekil kravat kateter dışarı ve eski mevkiini geri vermek ya da yeni bir kateter ile değiştirin. Kateterin uygun yerleştirme deneyden sonra onaylamak hatırlıyorum. Kateter kateter proksimal ucu inferior vena kava hepatik ven kesiştiği yerde hemen üstünde yerleştirmek için hayvan, boyutuna bağlı olarak 6-7 cm için takılmalıdır. Kateter ilerleyen ile ilgili sorunlar varsa iki nokta üst üste kateterizasyon için geldiğinde 0,3-0,5 enjekte mL serum fizyolojik veya bırak kateter. kolon 5-10 dakika ve yeniden deneyin Güç kullanmayın bağırsak perforasyonu önlemek için bir kateter ekleme sırasında.
TMA çoğunlukla kolon bakteriler tarafından üretilen gibi çalışmalarımız, biz bir gut bakteri kaynaklı molekül, trimethylamine (TMA), iki nokta üst üste GBB geçirgenliği bir işaretleyici olarak kullanılır. Ancak, FITC dextran veya şekerler, gibi klasik geçirgenliği işaretleri de dahil olmak üzere birçok başka maddeler de kullanılabilir (bkz. Tablo 4). Bir çözüm test madde hazırlanırken, bağırsak mukoza üzerindeki rahatsız edici etkisi dikkate almalı ve uygun şekilde madde konsantrasyonu seçin. Daha fazla laboratuvar yordamlar kan örneklerinin seçili işaretçisi için ayarlanması gerekir.
Bizim iletişim kuralında, intracolonic yönetim bir işaretleyici teklif; Ancak, sözlü yönetim veya sonda ile besleme sindirim sistemi çeşitli düzeylerde tarafından değiştirilebilir. Değişken hız peristaltizm ve olası etkileşimleri enzim ve gastrik asit ile gastrointestinal sistem Örneğin mide ve oniki parmak bağırsağı üst bölümlerinin bir işaretleyici yönetme süre dikkate alınmalıdır. Buna göre kan örnekleme yönetim bir işaretleyici sonra zamanının ayarlanması gerekiyor.
Anestezi yan etkileri de dahil olmak üzere ve gecede, her ikisi de GBB işlevini etkileyebilir oruç sunulan yönteminin bazı sınırlamaları vardır. Yordamı terminal ve kan örnekleme sırasında tamamen fizyolojik koşullar içerir olarak dikkate alınmalıdır. Ancak, diğer deneysel yöntemler GBB geçirgenliği değerlendirilmesi üzerinde hala pek çok avantajı vardır daha önce belirtildiği gibi özellikle vitro11gerçekleştirilen. Örneğin, bir Ussing odası Bağırsak epitel hücreleri aracılığıyla gürültülerinden ve parçacık akı ölçer. Bu teknik ana zayıflığını onun aşırı basitleştirme yatıyor. Bağırsak mukoza epitel hücre katmanda yalnız az sayıdaki ölçümleri kullanarak karmaşık fizyolojik sistemi tarif etmek zordur. Bazı araştırmacılar bütün kalınlığı bağırsak Ussing odası çalışmaları için kullanılır, ancak bu yordamı birkaç metodolojik komplikasyonlar15tarafından eşlik ediyor. Ayrıca, yönteminin doğruluğunu organizma izole dokuların sınırlı bir canlılık tarafından güvenilir değil. Farmakokinetik çalışmalarda kullanılan bazı vitro yöntemleri Yapay membran bağırsak bariyer12bir model olarak kullanın. Ancak, benzer şekilde Ussing odası için bu yöntemleri GBB yapısı ve fonksiyonları karmaşıklığı yansıtmıyor.
Ayrıca vivo içinde permeabilite deneyleri deneysel ve klinik çalışmalarda bulunmaktadır. Onlar çoğunlukla idrar veya periferik kan örnekleme sözlü veya kolon yönetim çeşitli işaretleri13sonra temel alır. Yaygın olarak kullanılan şeker testi mono - ve memeli organizma, Örneğin mannitol ve laktuloz metabolize değil oligosakkaritler oral alımı içerir. Bu yöntem non-invaziv ve her iki deneysel ve klinik kullanım16,17' istihdam edilebilir; Ancak, sonuçları önemli ölçüde çalışma konuları arasında farklı olabilir ilk geçiş karaciğer metabolizması ve böbrek fonksiyonu, etkilenir. Yukarıda belirtilen dolaylı yöntemler aksine, portal ven kan toplama GBB geçirgenliği12doğrudan değerlendirme sağlar. Bu yöntem karaciğer ve böbrek işlev üzerinde bağımlı değildir ve neredeyse fizyolojik şartlarda ex vivo veya vitro yöntemleri üzerinde önemli bir avantaj olan bağırsak korur.
Portal ven ve inferior vena kava hepatik ven kesiştiği yerde hemen üstünde kan toplanır gibi bu yazıda açıklanan teknikleri de nispeten doğru karaciğer Temizleme değerlendirme için izin. Hepatik çıkarılması için temsilcisi sonuçları Şekil 3 (TMA) ve Tablo 3 (SCFA) sunulmuştur. Bizim veri üç ana SCFA, asetat, propiyonat ve bütrat, önceki çalışmaları tarafından desteklenmeyen farklı hepatik izni tarafından karakterize öneririz nerede bu bağırsak ve serbest bırakılması bütrat propiyonat, gösterilen ama Bloemen vd. asetat, hepatik alımı18tarafından neredeyse eşit. Bu nedenle, sunulan Protokolü bağırsak emilim ve farmakokinetik çalışmalarda kullanılan ilaçların karaciğer metabolizması izlemek için uygundur.
Teknikleri de deneysel başka amaçlar için ayarlanabilir. Portal ven kateterizasyonu yönetimi doğrudan portala ilaçların damar veya portal kan basıncı ölçmek için hepatik dolaşımı çalışma için kullanılabilir. Örneğin, önceki çalışmalarda, biz hepatik dolaşımı ve portal basınç19üzerindeki etkisini değerlendirmek için portal ven için hidrojen sülfit bağış yönetilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
İş Bilim Bakanlığı ve Yükseköğretim RP tarafından desteklenmektedir, elmas vermek no: DI2017 009247.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needle OD: 9 mm | Becton Dickinson S.A. | 301300 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-40 | |
| Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025" | Scientific Commodities, Inc. | #BB520-25 | |
| C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD | Cole-Parmer Instrument Co. | 06424-59 | |
| Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F) | Sigmed | 0000 80305 | |
| Surgical ligatures 3/0 | Yavo Sp. Z o.o. | P48JE | |
| Absorbable surgical sutures - Polyglactine 910 4/0 | KRUUSE Polska Sp. Zo.o. | 152336 | |
| Tissue glue - Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive | Loctite | 1370127 | |
| Povidone iodine | EGIS Pharmaceuticals PLC | 4449 11 | |
| Heparin - Heparinium WZF | WZF Polfa S.A. | 02BK0417 | Dilute 10 times with physiological saline |
| Glycerin 86% | Laboratorium Farmaceutyczne Avena | 5.90999E+12 | Serves as a lubricant in colon catheterization |
| Xylocaine 2% | AstraZenca | 9941342 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich (Merck) | U2500-500G | |
| Trimethylamine solution 45% | Sigma-Aldrich (Merck) | 92262-1L | |
| Syringes 2 mL | B.Braun Melsungen AG | 4606027V | |
| Saline 250 mL | Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o. | 15LL707WL | |
| Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends | Braun | NS-010-115-PKM | |
| Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 " | Braun | KN-008-140-ZMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7x0.55 | Braun | PO-001-007-ZMK | |
| Micro Scissors type Vannas, straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm | Braun | NO-010-085-PMK | |
| Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8" | Braun | HO-128-130-PMK | |
| Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2 | Braun | IM-927-150-PZMK | |
| Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp | Braun | NO-052-110-PMK | |
| Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp | Braun | PO-022-001-PMK |
References
- Camilleri, M., Madsen, K., Spiller, R., Greenwood-Van Meerveld, B., Verne, G. N. Intestinal barrier function in health and gastrointestinal disease. Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 24 (6), 503-512 (2012).
- Keita, A. V., Soderholm, J. D. The intestinal barrier and its regulation by neuroimmune factors. Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 22 (7), 718-733 (2010).
- Farhadi, A., Banan, A., Fields, J., Keshavarzian, A. Intestinal barrier: an interface between health and disease. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (5), 479-497 (2003).
- Jaworska, K., et al. Hypertension in rats is associated with an increased permeability of the colon to TMA, a gut bacteria metabolite. PloS one. 12 (12), e0189310 (2017).
- Fujii, H., Nakai, K., Fukagawa, M. Role of oxidative stress and indoxyl sulfate in progression of cardiovascular disease in chronic kidney disease. Therapeutic Apheresis and Dialysis: Official Peer-Reviewed Journal of the International Society for Apheresis, the Japanese Society for Apheresis, the Japanese Society for Dialysis Therapy. 15 (2), 125-128 (2011).
- Tomasova, L., et al. Intracolonic hydrogen sulfide lowers blood pressure in rats. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 60, 50-58 (2016).
- Brahe, L. K., Astrup, A., Larsen, L. H. Is butyrate the link between diet, intestinal microbiota and obesity-related metabolic diseases? Obesity Reviews: An Official Journal of the International Association for the Study of Obesity. 14 (12), 950-959 (2013).
- Ufnal, M., et al. Trimethylamine-N-oxide: a carnitine-derived metabolite that prolongs the hypertensive effect of angiotensin II in rats. The Canadian Journal of Cardiology. 30 (12), 1700-1705 (2014).
- Huc, T., Nowinski, A., Drapala, A., Konopelski, P., Ufnal, M. Indole and indoxyl sulfate, gut bacteria metabolites of tryptophan, change arterial blood pressure via peripheral and central mechanisms in rats. Pharmacological Research. 130, 172-179 (2018).
- Ufnal, M., Pham, K. The gut-blood barrier permeability - A new marker in cardiovascular and metabolic diseases? Medical Hypotheses. 98, 35-37 (2017).
- Le Ferrec, E., et al. In vitro models of the intestinal barrier. The report and recommendations of ECVAM Workshop 46. European Centre for the Validation of Alternative methods. Alternatives to Laboratory Animals: ATLA. 29 (6), 649-668 (2001).
- Bohets, H., et al. Strategies for absorption screening in drug discovery and development. Current Topics in Medicinal Chemistry. 1 (5), 367-383 (2001).
- Grootjans, J., et al. Non-invasive assessment of barrier integrity and function of the human gut. World Journal of Gastrointestinal Surgery. 2 (3), 61-69 (2010).
- Bielinska, K., et al. High salt intake increases plasma trimethylamine N-oxide (TMAO) concentration and produces gut dysbiosis in rats. Nutrition. 54, 33-39 (2018).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Denno, D. M., et al. Use of the lactulose to mannitol ratio to evaluate childhood environmental enteric dysfunction: a systematic review. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 Suppl 4, S213-S219 (2014).
- Lugea, A., Salas, A., Casalot, J., Guarner, F., Malagelada, J. R. Surface hydrophobicity of the rat colonic mucosa is a defensive barrier against macromolecules and toxins. Gut. 46 (4), 515-521 (2000).
- Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clinical Nutrition. 28 (6), 657-661 (2009).
- Huc, T., et al. Colonic hydrogen sulfide produces portal hypertension and systemic hypotension in rats. Experimental Biology and Medicine. 243 (1), 96-106 (2018).
