Summary
ويرد هنا، سير عمل لتحليل التعبير الثقافة والجينات لخلايا بطانية إجهاد القص السوائل. وشملت ترتيب مادية للسكن ورصد الدوائر التدفق متعددة في بيئة تسيطر عليها، واستخدام الحمض النووي الريبي مرجعية خارجية ل PCR الكمي في الوقت نفسه.
Abstract
يمكننا وصف سير عمل لتحليل التعبير الجيني من خلايا بطانية رهنا بتدفق الصفحي استخدام متعددة رصد تدفق مواز-لوحة الدوائر. خلايا بطانية تشكل البطانة الخلوية الداخلية للأوعية الدموية ومزمن ويتعرض للاحتكاك قوة تدفق الدم يسمى إجهاد القص. في ظل الظروف الفسيولوجية، وظيفة خلايا بطانية حضور مختلف ظروف الإجهاد القص. وهكذا، يمكن أن توفر تطبيق شروط إجهاد القص في نماذج في المختبر مزيد من التبصر في الردود غشائي فيفو. تدفق مواز-لوحة الدائرة المنشورة سابقا بلين et al. 9 يتم تكييفها لدراسة تنظيم الجينات غشائي في وجود وغياب مطرد الاندفاق الصفحي (غير نابض). وتشمل التعديلات الرئيسية في التشكيل للتدفق الصفحي كما عرضت هنا بيئة كبيرة مخصصة للدوائر التدفق المتزامنة البيت، ورصد معدلات التدفق في الوقت الحقيقي، وإدراج إشارة خارجية الحمض النووي الريبي للتطبيع من كمية بيانات PCR الوقت الحقيقي. تقييم العلاجات/شروط متعددة مع تطبيق إجهاد القص، تستخدم دوائر تدفق ومضخات متعددة في وقت واحد داخل حاضنة دافئة وهوميديفيد نفس. يتم قياس معدل التدفق لكل دارة التدفق باستمرار في الوقت الحقيقي لتوحيد شروط الضغط القص في جميع أنحاء هذه التجارب. لأن هذه التجارب قد شروط متعددة، نستخدم أيضا مرجعية خارجية الحمض النووي الريبي التي ارتفعت في وقت استخراج الحمض النووي الريبي لتطبيع استخراج الحمض النووي الريبي وكدنا أول حبلا توليف الكفاءة. هذه الخطوات تقليل التفاوت بين العينات. هذه الاستراتيجية يعملون في خط أنابيب لدينا لتحليل التعبير الجيني مع تجارب إجهاد القص باستخدام الدائرة تدفق مواز-لوحة، لكن أجزاء من هذه الاستراتيجية، مثل الخارجية مرجع المصطلحات الخاصة في الجيش الملكي النيبالي ويمكن بسهولة وفعالية من حيث التكلفة لاستخدامها التطبيقات الأخرى.
Introduction
خلايا بطانية الأوعية الدموية تشكل البطانة الخلوية الداخلية للأوعية الدموية في نظام القلب والأوعية الدموية المغلقة الأنواع أعلى. وهي تشكل الواجهة بين الدم والأنسجة وتتميز لومينال والأسطح أبلومينال. البطانة هو نظام متنوعة ونشطة، والتكيف الذي ينظم تدفق الدم، والاتجار بالمواد الغذائية، والحصانة، ونمو الأوعية الدموية الجديدة1. في الجسم، وتوجد خلايا بطانية عادة في بيئة حيث يتعرضون للاحتكاك قوة الدورة الدموية، وإجهاد القص2. إجهاد القص منظم هام ل التعبير الجيني غشائي خلية3، وخلايا بطانية محاولة الحفاظ على إجهاد القص داخل نطاق معين2،4. إظهار خلايا بطانية الأوعية الزخرفة في غياب إجهاد القص5 التي يمكن تحسين التروية الأنسجة. الأنماط الإقليمية لتدفق الانزعاج وغيرت القص الإجهاد المرتبطة بالتعبير عن الجينات التحريضية6 وتطوير تصلب الشرايين7،8. وهكذا، النماذج التي تشمل الإجهاد القص مكوناً رئيسيا لفهم تنظيم الجينات بطانية.
يصف لنا طريقة لدراسة تنظيم الجينات في خلايا بطانية الأوعية الدموية تحت إجهاد القص. هذا النظام يستخدم التدفق غير نابض ويقلد مستويات السوائل القص إجهاد وتركيز الأكسجين أن الشروط النموذجية لخلايا بطانية الشرياني. هذا البروتوكول يتضمن تفاصيل عن أساليب لضربة قاضية الجينات باستخدام الإعداد لتطبيق إجهاد القص باستخدام جهاز تدفق مواز-لوحة، وأساليب للمصطلحات الخاصة في إشارة خارجية الحمض النووي الريبي قبل التحليل بالحمض النووي الريبي التدخل ([رني])، المنتسخة العكسية الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-قبكر). هذا الأنبوب يستخدم لدراسة تنظيم الجينات في خلايا بطانية في وجود وعدم وجود إجهاد القص الصفحي ويتضمن تعديلاً لجهاز تدفق مواز-لوحة وصف لين et al. 9-هذا التشكيل خاصة صممت لتيسير تقييم ظروف تجريبية متعددة متزامنة يتيح إجراء مقارنة مباشرة لظروف الإجهاد القص، فضلا عن التطبيع لتحليل الحمض النووي الريبي. وتستخدم وحدة ساخنة كبيرة مع الرطوبة التي تسيطر عليها للسماح لعدة دوائر منفصلة التدفق ومضخات تكون قيد التشغيل في نفس الوقت مع معدلات التدفق التي ترصد لكل تدفق قاعة الجمعية في الوقت الحقيقي. يستخدم تطبيق هذا الإعداد لضربة قاضية الجينات باستخدام [رني] في الإعداد للإجهاد الاندفاق الصفحي/القص، ولكن يمكن تطبيق جوانب من هذا البروتوكول لأي تقييم للتعبير الجيش الملكي النيبالي.
وتشمل نهج مشتركة لتطبيق إجهاد القص لخلايا بطانية موائع جزيئية نظم10ومخروط ولوحة فيسكوميتير11و تدفق مواز-لوحة دائرة12. نظم موائع جزيئية من مختلف الشركات المصنعة كانت مفيدة في دراسة ميتشانوبيولوجي وميتشانوترانسدوكتيون في خلايا متعددة وأنواع الأنسجة ومجموعة متنوعة من المنبهات الفيزيائية الأحيائية. لخلايا بطانية، فقد استخدمت لدراسة خلايا بطانية في العزلة، فضلا عن التفاعل بين خلايا بطانية والاتجار بالمناعة أو ورم الخلايا10. بيد أن هذه النظم أقل ملاءمة لاسترداد عدد كبير من الخلايا9. كل مخروط ولوحة فيسكوميتير وتدفق مواز-لوحة الدوائر السماح باسترداد عدد كبير من الخلايا في مونولاييرس المتلاقية12. هذه النظم يمكن أن تولد مجموعة من القوات وأنماط القص12. الجمعية الدائرة تدفق مواز-لوحة9 له الميزة أن التصوير في الوقت الحقيقي يمكن أن يؤديها من خلال زجاج النافذة لتقييم مورفولوجيا الخلوية في أي وقت. وعلاوة على ذلك، يمكن جمعها في بيرفوساتي تحت ظروف معقمة. لنظام المعروضة هنا، يمكن أيضا رصد التدفق في الوقت الحقيقي، وفي إنشاء قاعة متعددة، مما يسهل الحفاظ على شروط القص بين الدوائر.
للتجارب التمثيلية، وتستخدم الخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيك)، التي تمثل نوع خلية بطانية ماكروفاسكولار، وظروف الإجهاد القص نستخدم (1 Pa) تعكس ظروف الشرياني (0.1-0.7 السلطة الفلسطينية). بيد أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها مع أنواع أخرى من الخلايا البطانية وظروف الإجهاد القص يمكن تعديلها وفقا لمسألة تجريبية. على سبيل المثال، يتطلب تقييم الخلايا البطانية البشرية في ظروف نموذج الدورة الدموية الوريدية مستويات أدنى من إجهاد القص (1-6 باسكال) واستخدمت الدراسات نموذج دوران microvascular مستويات الإجهاد القص من 0.4-1.2 السلطة الفلسطينية13 , 14-وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تختلف إجهاد القص حتى بين خلايا بطانية داخل الأوعية الدموية نفس6. يتم استخدام نظام واحد لرصد في التشكيل الحالي، في نفس الوقت الذي يمكن رصد أربع حلقات منفصلة التدفق. للمختبرات التي تحتاج إلى مزيد من الحلقات تدفق، هناك مساحة في بيئة مخصصة لنظام رصد إضافية.
يستخدم qPCR الرايت كوانتيتيشن المطلقة للتعبير الجيني في الإعداد لإجهاد القص. التعبير النسبي للجينات المستهدفة غالباً لمقارنة الحمض النووي الريبي التعبير عبر الشروط. يمكن بعض الأنواع رنا موجودة في كميات منخفضة جداً أو يكون غائبا، مما يعقد القياسات النسبية. على سبيل المثال، يمكن أن تمارس الكشف فضله منذ وقت طويل في خلايا بطانية تأثيرات قوية على أرقام نسخة منخفضة نسبيا لكل خلية5. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي الاختلافات في الكفاءة التمهيدي إلى تفسيراً غير دقيق من استخدام الأسلوب عتبة (Ct) دورة دلتا دلتا لتحليل البيانات. لمعالجة هذا الشاغل، نقوم كوانتيتيشن المطلقة عن طريق توليد منحنى قياسي باستخدام كمية معروفة من بلازميد الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، تكمل تركيب الدنا (كدنا) عملية غير فعالة، ويمكن حساب الفروق في كفاءة كدنا للاختلافات في الحمض النووي الريبي التعبير بين الشروط وبين العينات15. تطبيق إجهاد القص و/أو الكواشف تعداء يمكن أن تؤثر على تكاثر الخلايا والمبرمج والجدوى، أو إضافة المكونات التي قد تتداخل مع توليف الحمض النووي الريبي العزلة و/أو كدنا. لحساب احتمال التحيز من عزل الحمض النووي الريبي وتوليف كدنا، نستخدم المصطلحات خاصة في الجيش الملكي النيبالي تحكم توليفها في المختبر، وأضيف في وقت استخراج الحمض النووي الريبي وتقاس بكل كدنا التوليف عبر RT-قبكر. يسمح هذا التعديل ليس فقط التقنية الاختلافات في توليف الحمض النووي الريبي الاستخراج وكدنا ولكن أيضا يسمح حساب الكميات المطلقة كل خلية، عندما يعرف عدد الخلايا.
يستخدم هذا النظام اتخاذ خطوات إضافية للحفاظ على التشابه أو مراعاة للاختلافات التقنية بين الشروط. نؤكد هذه الخطوات لا سيما بسبب الطبيعة المعقدة لهذه التجارب، التي تنطوي على العديد من الهياكل المادية والظروف التجريبية يمكن أن تؤدي إلى تقلب التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد المراجع الخارجية الجيش الملكي النيبالي
ملاحظة: اختر إشارة خارجية الحمض النووي الريبي غير موجود في الأنواع أو نموذج للفائدة. لأنظمة الثدييات، يمكن استخدام لوسيفراس اليراع الجيش الملكي النيبالي.
-
استخطاط من مرجعية خارجية الحمض النووي الريبي بلازميد
- إعداد مرجعية خارجية الجيش الملكي النيبالي على الأقل 48 ساعة قبل استخراج الحمض النووي الريبي المتوقعة. الحصول على أو تصنيع استنساخ كدنا مرجعية خارجية المختار الجيش الملكي النيبالي، مثل استنساخ كدنا لوسيفراس اليراع في ناقل بلازميد مناسبة للنسخ في المختبر (انظر الجدول للمواد).
- أداء هضم إنزيم التقييد (RE) 1 ميكروغرام من بلازميد كامل طول (بلازميد لوسيفراس اليراع من شرطة الأمن العام-لوك + التي قد 4100 bp) كتر واحد باستخدام الطاقة المتجددة (زهوي) في 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب. اختر RE قاطع واحد (تخفيضات بلازميد x 1 فقط) في نهاية 3 'مرجعية خارجية تسلسل الحمض النووي الريبي الذي يترك من 5' عبء أو نهاية غير حادة. لإعداد نموذجي، أداء سبعة ردود استخطاط بلازميد (الخطوات 1.1.4-1-1-7) بالتوازي مع توليد كافية تركيز الحمض النووي الريبي والكمية لإكمال مجموعة واحدة من التجارب أو مشروع واحد.
- قياس تركيز بلازميد استخدام كانت أو سبيكتروفلوروميتري.
- إعداد أن خليط الطاقة المتجددة في كل أنبوبة: إضافة 4 ميليلتر من زهوي (20,000 وحدة/مل)، 8 ميليلتر من إعادة المخزن المؤقت، x µL بلازميد (1 ميكروغرام)، ويكفي ح2س للتوصل إلى حل مجموع من 80 ميليلتر.
- احتضان هذا الخليط RE ح 2 في 37 درجة مئوية. استخدام إعادة وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، كما يمكن أن يؤدي أي تعديلات في زيادة النشاط نجمة أو الانقسام غير محددة الهدف الحمض النووي. إلغاء تنشيط الحرارة رد فعل الخليط لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية.
- إنهاء هضم الطاقة المتجددة مع هطول الأمطار الإيثانول في كل أنبوبة. مباشرة إلى مزيج الطاقة المتجددة، إضافة 4 ميليلتر من 0.5 م يدتا pH 8.0، ميليلتر 8 من م 3 خلات الصوديوم pH 5.2، وميليلتر 184 من الإيثانول 100%. يخلط جيدا وتجميد المخلوط في-20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تدور أسفل الخليط عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في قوة الطرد المركزي نسبي (التعاون الإقليمي) من س 16,100 ز.
- إزالة المادة طافية مع تلميح جيد، دون لمس بيليه. أيردري بيليه لمدة 5 دقائق وريسوسبيند في 6 ميليلتر من ح2س (درجة حرارة إلى 37 درجة مئوية) قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 س-10 س.
- تأكيد استخطاط بلازميد لوسيفراس عن طريق تشغيل المنتج هضمها على 2% [اغروس] هلام يحتوي على اثيديوم بروميد (أتبر) جنبا إلى جنب مع 1 كيلو بايت + سلم وسلم سوبيركويليد، وقص وتقطيعه بلازميد. فحص الجل والمضي قدما للنسخ في المختبر إذا تبين لين بلازميد قطع عصابة واحدة في ~ 4 كيلو بايت (بلازميد تقطيعه سوف يكون ثلاثة نطاقات؛ الشكل 1).
تنبيه: أتبر المسببة للسرطان. ويعمل في غطاء الأبخرة كيميائية.
-
في النسخ المختبر من مرجعية خارجية الحمض النووي الريبي بلازميد
- لكل أنبوبة من منتجات بلازميد هضمها، إجراء النسخ في المختبر باستخدام أسلوب نسخ في المختبر (انظر الجدول للمواد). اتبع إرشادات الشركة المصنعة واستخدام بالعاثية المناسبة بوليميريز الحمض النووي الريبي. إذا كان أسلوب التوليف كدنا يتطلب ذيل poly(A)، أو تطبيقات أخرى تتطلب ذيل poly(A)، اختر طريقة النسخ في المختبر الذي يشمل بالإضافة إلى ذيل poly(A) (انظر الجدول للمواد).
- الجمع بين كل في المختبر نسخها المنتجات في أنبوب البولي بروبلين 1.5 مل واحد قبل تنقية.
-
بوريف إيكاتيون من الجيش الملكي النيبالي من رد فعل النسخ في المختبر
- تنقية في المختبر نسخها من المنتجات مع عملية في المختبر نسخ تنظيف كيت (انظر الجدول للمواد). يرجى اتباع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- تقييم تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق قياس امتصاص في 260 nm استخدام كانت.
ملاحظة: يحسب تركيز الجيش الملكي النيبالي باستخدام قانون بير لامبرت. هذا ويذكر أن امتصاص الأحماض النووية (التي تمتص الضوء بشدة على 260 nm) يتناسب مع التركيز. امتصاص 1.0 يساوي 40 ميكروغرام/مل من الحمض النووي الريبي المفرد-الذين تقطعت بهم السبل.
-
اليقوتينج رصيد الجيش الملكي النيبالي في PCR أنابيب للاستخدام التجريبي
- التأكد من تركيز الحمض النووي الريبي 1 ميكروغرام/ميليلتر.
- إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي > 1 ميكروغرام/ميليلتر، تضعف الأسهم إلى 1 ميكروغرام/ميليلتر. الكوة 1 ميليلتر في PCR أنابيب وتخزينها في-80 درجة مئوية.
- إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي < 1 ميكروغرام/ميليلتر، يمكن أن يؤديها هطول الأمطار إضافية استخدام خلات الأمونيوم م 5 (المتوفرة في مجموعة) وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. إذا كان لا يزال تركيز الحمض النووي الريبي < 1 ميكروغرام/ميليلتر، المضي قدما في اليقوتينج 1 ميليلتر في أنابيب PCR.
- التأكد من تركيز الحمض النووي الريبي 1 ميكروغرام/ميليلتر.
2-الشريحة طلاء
ملاحظة: يجب أن تكون الخطوات 2.1-2.10 المنجز ح 24-48 قبل البذر الخلية المتوقعة.
- يسخن الفرن إلى 250 درجة مئوية.
- استخدام القفازات المعقمة، التفاف كل شريحة زجاجية 2 x مع رقائق الألومنيوم. تجنب لمس سطح الشريحة مباشرة.
- خبز الشرائح في الفرن ح 1 في 250 درجة مئوية، والسماح للشرائح لتبرد بدرجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لتدمير أي تلويث الذيفان. - بينما يتم تبريد الشرائح، جعل حل أسهم فيبرونيكتين 1 ملغ/مل بالماء المقطر واحتضان ذلك مدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية حل. جعل مختبرين 100 ميليلتر. جانبا مختبرين للاستخدام الفوري وتجميد مختبرين المتبقية للاستخدام في المستقبل.
- بسط الغطاء الخارجي من رقائق الألومنيوم قبل وضع الشريحة الزجاجية في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. تنفيذ خطوات 2.6-2.7 و 2.9 في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
- ضع الشريحة الزجاجية في طبق ثقافة عقيمة خلية 4-بئر مستطيلة.
- تمييع فيبرونيكتين حل الأوراق المالية 1: 100 مع الماء المقطر. معطف كل شريحة مع 1 مل من المخفف فيبرونيكتين، قطره قطره، استخدام ماصة. تأكد من أن يتم تغطية الشريحة كله.
- احتضان الشرائح الموجودة في العرض حاضنة استنبات الأنسجة في 37 درجة مئوية ح 24-48.
- بعد الاحتضان، نضح في فيبرونيكتين عن إمالة الطبق ثقافة الخلية 4-جيدا. تجنب لمس الشريحة مباشرة مع المضخة.
3-خلية البذر على الزجاج الشرائح
- عد الخلايا البطانية البشرية في سن مبكرة (مرور 2-5) والبذور ~1.0 × 106 خلايا على كل شريحة الزجاج فيبرونيكتين المغلفة مع 1 مل من وسائل الإعلام (1.0 × 106 خلايا/مل الإعلام). بذور الخلايا 24 ساعة قبل تطبيق الاندفاق الصفحي المتوقعة إذا كان لا معاملة أخرى يتعين القيام بها.
ملاحظة: تستخدم هذه الأرقام كدليل للتجارب مع ح 24 من التدفق.- ضبط كثافة البذر لتحقيق أحادي الطبقة المتلاقية من الخلايا في وقت الحصاد الخلية واستخراج الحمض النووي الريبي.
- السماح للخلايا التقيد بالشريحة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- أضف 3 مل من وسائل الإعلام في كل بئر للطبق ثقافة الخلية لتغطية الشريحة، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية ل 24 ساعة مع شركة 5%2.
4-الصغيرة التدخل من الحمض النووي الريبي (siRNA) تعداء
-
إعداد الخلايا على الشرائح الزجاجية لتجارب siRNA تعداء وتدفق
- يتبع البروتوكول في الخطوتين 2 (طلاء الشرائح) و 3 (خلية البذر على الشرائح الزجاجية) لإعداد الشرائح الزجاجية والطلاء لتجارب التدفق.
- بذور الخلايا 24 ساعة قبل المعالجة siRNA (48 ساعة قبل تطبيق الاندفاق الصفحي).
- بذور الخلايا البطانية البشرية في وسائل الإعلام خالية من المضادات الحيوية في 750,000 إلى 1 × 106 خلايا كل شريحة لتحقيق التقاء 85%-95% في اليوم التالي.
ملاحظة: يتم استخدام هوفيك في هذا البروتوكول.
-
إعداد مجمعات كاشف تعداء siRNA-المستندة إلى المادة الدهنية (كل شريحة)
- تصميم مخصص سيرناس أو ترتيب premade سيرناس للجين المطلوب من الاهتمام.
ملاحظة: الخطوات التالية في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. - إضافة 6 ميليلتر من siRNA (20 ميكرومتر الأسهم) في ميليلتر 414 من المصل انخفاض المتوسط (انظر الجدول للمواد) وتخلط بلطف بيبيتينج.
- تمييع 49.5 ميليلتر من كاشف تعداء مختلطة بلطف على أساس المادة الدهنية (انظر الجدول للمواد) في 130.5 ميليلتر من المصل انخفاض المتوسط.
- المزيج بلطف واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- الجمع بين سيرناس المخفف وكاشف تعداء على أساس المادة الدهنية وتخلط بلطف واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. المزيج برفق لتجنب تعطيل لمجمعات كاشف تعداء على أساس المادة الدهنية.
ملاحظة: قد يظهر الحل غائم كنموذج المجمعات. - في حين يتم تشكيل المجمعات، إزالة المتوسطة النمو وتغسل الخلايا 1 x مع انخفاض مصل المتوسطة.
- إضافة 2.4 مل من المصل انخفاض المتوسط لكل شريحة.
- إضافة 600 ميليلتر من مجمعات كاشف تعداء siRNA-المستندة إلى المادة الدهنية المختلطة بلطف إلى كل لوحة، والصخور لوحة ذهابا وإيابا المزيج. ضمان تركيز siRNA النهائي هو 40 نانومتر. ضمان أن تغطي الشريحة تماما.
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية ح 4.
- أضف 1 مل وسائط النمو الخلية خالية من المضادات الحيوية غشائي التي تحتوي على 3 × تركيز المصل البقري الجنين (FBS) العادي دون إزالة الخليط تعداء.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
- تصميم مخصص سيرناس أو ترتيب premade سيرناس للجين المطلوب من الاهتمام.
5-حساب معدل تدفق استناداً إلى إجهاد القص المطلوب9
- حساب معدل تدفق استناداً إلى تشدد على القص المطلوب وفقا للمعادلة التالية:
هنا،
Q هو معدل التدفق في مل/دقيقة؛
Τ هو إجهاد القص المطلوب في دينيس/سم2 (1 Pa = دينيس 10/سم2)؛
w هو عرض الدائرة تدفق لوحة التوازي في سم؛
h هو ارتفاع تدفق مواز-لوحة الدائرة سم؛
μ هو اللزوجة من وسائط الإعلام في حزب المحافظين (g/cm·s).
ملاحظة: تجري تجارب نموذجية إجهاد القص الصفحي (غير-نابض) في سير العمل هذا في τ = 1 السلطة الفلسطينية (دينيس 10/سم2). يمكن أن تقاس باستخدام فيسكوميتير مثل فيسكوميتير مخروط ولوحة μ ويمكن أن تختلف تبعاً لمحتويات الوسائط بما في ذلك المصل وديكستران إضافية9. - ولتحقيق محددة τ (إجهاد القص)، ضبط معدل التدفق و/أو اللزوجة. معدلات تدفق أعلى، قد فصل خلايا ملتصقة من الشريحة. معدلات التدفق عينة مع الدوائر تدفق نموذجية ترد في الجدول 1.
6-إنشاء بيئة مخصصة لرصد النظام ومتعددة تدفق مواز-لوحة الدوائر (الشكل 2)
- استخدام وحدة ساخنة كبيرة/حاضنة متعددة الرفوف ووصول الكهرباء الداخلية والأبواب الزجاجية-يشار إلى الشاطئ (البيئة المضمنة مع قابل للتعديل CO2 ) والحرارة – البيت الدوائر التدفق متعددة في وقت واحد للتجارب التي وتتطلب كل من إجهاد القص والمقارنة المباشرة بين اثنين أو أكثر من العلاجات أو النواتج (أي، الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتين).
ملاحظة: الشاطئ يسمح للرصد المتكرر للدائرة التدفق، بما في ذلك معدل التدفق، دون انقطاع متكرر للبيئة. - ضمان كافية CO2 متاح للتجربة وأن CO2 جهاز العرض بشكل صحيح. ضمان مناسب يتم ملء علبة المياه، حيث لا تكون هناك هوميديفيد الجوية.
7-إنشاء جهاز تدفق مواز-لوحة
ملاحظة: لتصنيع لوحات متوازية، الرجاء راجع لين et al. 9.
- اﻷوتوكﻻف التدفق الدائرة لوحات والخزان ويستمتع، وأنابيب، ولويرس لكل إنشاء الدائرة تدفق لوحة التوازي كما هو مبين في الجدول 2.
-
إنشاء الجمعية حلقة التدفق (الشكل 3).
- وضع المناشف المعقمة في السلامة البيولوجية مجلس الوزراء. تجميع النظام حلقة التدفق، أولاً دون تدفق مواز-لوحة الدائرة، في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
- تواصل الجمعية الأنابيب بالخزان:
- إدراج أنبوب الصلب #14 في حفرة واحدة واثنين #14 أنابيب لينة في الثقوب الأخرى اثنين في عملية النداء الموحد لخزان تدفق. التأكد من أن أحد أنابيب لينة يلامس الجزء السفلي من الخزان كأنابيب تدفق .
- ضع 1/16 "اللوير الذكور في نهاية 14 # الصلب أنبوب وإرفاق عامل تصفية عقيمة كتنفيس هواء.
- ضع 1/16 "اللوير الإناث في نهاية #14 الناعمة تدفق أنبوب، القادمة من الخزان، ونعلق محبس الحنفية 4-الطريق.
ملاحظة: لتحليل التعبير الجيني أو دراسات أخرى حيث تحتاج perfusates لم يتم جمعها، ستوبكوكس 2-طريقة يمكن استخدامها بدلاً من ستوبكوكس 4-الطريق في هذا البروتوكول. - ضع 1/16 "اللوير الذكور في نهاية أنبوب تدفق #14 الناعمة، القادمة من الخزان.
- توصيل أنابيب تدفق الخزان بأنابيب ضخ: ضع 1/16 "اللوير الإناث في نهاية كل من أنبوب الصلب #13 (مضخة الأنابيب). الاتصال أنبوب تدفق لينة #14 من الخزان إلى أنبوب الصلب #13 بربط 1/16 "لارس الذكور والإناث معا.
- توصيل أنابيب ضخ مع الأنابيب 'يستمتع جسر': وضع 1/8 "اللوير الذكور و 1/8" اللوير الإناث في نهاية كل من أنبوب لينة #16. الاتصال 1/16 "اللوير الإناث أنبوب الصلب #13 (في نهاية الأنبوب مضخة التدفق) مع 1/8" اللوير الذكور من أنبوب لينة #16.
- تجميع أنابيب ليستمتع تدفق: ضع 3/16 "اللوير الذكور في واحدة من نهاية الأنبوب #25 لينة وكرر هذه العملية للجانب الآخر من يستمتع التدفق. إرفاق نهايات أنابيب لينة #25 مجاناً لكل جانب من يستمتع التدفق.
- توصيل أنابيب 'جسر يستمتع' مع أنابيب ليستمتع تدفق: توصيل أنبوب لينة #25 من يستمتع التدفق مع أنبوب لينة #16 'جسر يستمتع' باستخدام 1/8 "اللوير الإناث من جانب #16' يستمتع جسر '3/16 الموضوعة مسبقاً" واللوير الذكور من جانب أنبوب يستمتع لينة #25.
- تجميع الأنابيب 'دائرة الجسر':
- ضع 1/8 "اللوير الإناث و 1/8" اللوير الذكور في نهاية كل من أنبوب لينة #16 (الأنابيب 'الدائرة جسر').
- الاتصال 1/8 "اللوير الإناث' جسر الدائرة 'مع 3/16" اللوير الذكور في أنبوب لينة #25 من نهاية يستمتع التدفق الحر.
- في 1/8 "مكان اللوير الذكور (نهاية الحرة) الأنابيب' دائرة الجسر '، محبس الحنفية 4-الطريق.
- قم بتوصيل محبس الحنفية 4-الطريق من نهاية الحرة 'دائرة الجسر' محبس الحنفية 4-الطريق من خزان تدفق الأنابيب الناعمة (من الخطوة 7.2.2.3). قم بإغلاق في ستوبكوكس.
- إضافة الوسائط إلى الخزان ويستمتع. ل 48-ح التعرض لإجهاد القص، إضافة 35 مل من وسائل الإعلام إلى الخزان ومل 25 إلى يستمتع. ضبط حجم الصوت لوسائل الإعلام استناداً إلى مدة التجربة تدفق وعدد الخلايا في المصنف.
- جعل النظام حلقة تدفق المجتمعون إلى المضخة في الشاطئ. وضع أنبوب الصلب #13 (مضخة الأنابيب) في رأس المضخة وتأمينه. فتح في ستوبكوكس.
- قم بتشغيل المضخة وزيادة سرعة المضخة ببطء. السماح لوسائل الإعلام تعمم عن طريق نظام حلقة. التحقق من وجود أي تسرب أو انسداد (مثلاً، تراكم الضغط). التأكد من أن وسائل الإعلام هي تتدفق مرة أخرى إلى الخزان.
-
إنشاء تدفق قاعة الجمعية العامة
- ضع 1/8 "اللوير الإناث في نهاية واحدة 16 # لينة أنبوب ونعلق محبس الحنفية 4-الطريق. إرفاق الطرف الحر للأنبوب على الجانب الأيمن من الصفيحة العلوية (تدفق الجانب).
- ضع 1/8 "اللوير الذكور في نهاية واحدة 16 # لينة أنبوب ونعلق محبس الحنفية 4-الطريق. إرفاق الطرف الحر للأنبوب على الجانب الأيسر من اللوحة العلوية (الجانبإلى الخارج ).
- ضع 1/8 "اللوير الذكور و 1/8" اللوير الإناث في نهاية كل من أنبوب لينة #16 (فقاعة أنابيب فخ). إرفاق الأنابيب فقاعة فخ عن طريق 1/8 "اللوير الذكور. إرفاق محبس الحنفية 4-الطريق إلى الجانب الآخر من الأنابيب عبر 1/8 "اللوير الإناث.
- استخدام ملاقط معقمة، نقل الشريحة الزجاجية المصنف الخلية من طبق ثقافة الخلية 4-جيدا للعطلة في أسفل لوحة. ضمان هو مواجهة الجهة المصنفة الخلية من الشريحة الزجاجية.
- باستخدام حقنه 10 مل، إضافة 10 مل من وسائل الإعلام الحارة إلى أسفل لوحة داخل الخط الأحمر طوقا حول اللوحة. السماح لوسائل الإعلام للتدفق من خلال الشريحة وتغطية الخلايا. تجنب إضافة الوسائط مباشرة على الشريحة.
- بلطف ضع الصفيحة العلوية إلى أسفل لوحة، محاذاة من جانب واحد إلى آخر. تجنب إدخال فقاعات الهواء. برغي اللوحات معا محكم.
- إزالة فقاعات الهواء من فخ فقاعة بفتح في محبس الحنفية على الجانب الأيمن من اللوحة (تدفق) والتنظيف بلطف 20 مل الحارة الوسائط باستخدام المحاقن 30 مل. تأكد من مغلق في محبس الحنفية على الجانب الأيسر من اللوحة (التدفق) وأن تتدفق وسائل الإعلام من خلال محبس الحنفية فخ فقاعة (فتح). تجاهل وسائل الإعلام متدفق.
- أغلق في محبس الحنفية في فخ فقاعة وفتح في محبس الحنفية على الجانب الأيسر للدائرة (تدفق). رفع الجانب الأيسر (تدفق) من الدائرة بزاوية 45 درجة، وتدفق بلطف 20 مل الحارة الوسائط باستخدام المحاقن 30 مل من الجانب الأيمن (تدفق) من الدائرة لإزالة فقاعات الهواء من الدائرة. يمكن تصور فقاعات من خلال النافذة. تجاهل وسائل الإعلام متدفق.
- إغلاق ستوبكوكس على كلا الجانبين للدائرة وكاب. فحص الخلايا بالفحص المجهري.
- نقل الدائرة إلى الشاطئ مع نظام حلقة تجميعها مسبقاً.
- ببطء تقلل من سرعة المضخة وتوقف المضخة. إغلاق ستوبكوكس على نظام حلقة التدفق لمنع التسرب.
- الاتصال الدائرة وحلقة النظام معا عن طريق ستوبكوكس. فتح جميع ستوبكوكس.
- بطء زيادة سرعة ضخ وبحث الإعداد لأي تسرب أو انسداد. ضمان وسائط الإعلام يدور في اتجاه واحد، ويعود إلى الخزان.
- مكان استشعار التدفق في الأنابيب 'الدائرة جسر' الموجود على الجانب تدفق من الدائرة. تأكد من أن أجهزة الاستشعار هو التوجه بشكل صحيح في اتجاه التدفق.
- ضبط سرعة مضخة للحصول على معدل التدفق التي تم حسابها مسبقاً، استناداً إلى إجهاد القص المطلوب.
ملاحظة: قد تختلف معدل التدفق في الارتفاع والعرض لكل دائرة، وكذلك اللزوجة من وسائط الإعلام. - قم بتشغيل الدبابة2 CO لتحقيق 5% CO2 ووضع علبة مياه داخل الشاطئ.
8-حصاد الخلايا واستخراج الحمض النووي الريبي من الدائرة تدفق
- بمجرد اكتمال الفترة الزمنية المطلوبة للتدفق، ببطء تشغيل أسفل سرعة مضخة تمعجية إلى 0 وإيقاف تشغيل الطاقة. بسرعة إغلاق جميع ستوبكوكس مفتوحة وإزالة الدائرة وأنابيب المرفقة مع محبس الحنفية في نهاية كل.
- تتخذ الدائرة إلى benchtop نظيفة وفك جميع البراغي لإزالة اللوحة العلوية بلطف. استخدام الملقط إبرة الآنف، إزالة الشريحة الزجاجية من أسفل لوحة ووضعه في طبق استنبات الأنسجة قطر 100 ملم.
- تغسل الشريحة مع 10 مل من المحلول الملحي الباردة مخزنة الفوسفات (PBS)-/-وفحص الخلايا تحت مجهر لتأكيد تمسك الخلية والمحاذاة في اتجاه التدفق.
- نضح برنامج تلفزيوني من اللوحة ونقل الشريحة إلى طبق قطره نظيفة 100 مم. إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل من استخراج الحمض النووي الريبي كيت (انظر الجدول للمواد)، الذي يحتوي على 1/100 من بيتا-ميركابتوثانول، إلى الشريحة.
تنبيه: إضافة ميركابتوثانول بيتا في غطاء الأبخرة كيميائية. - تتخلص من الخلايا خارج الشريحة باستخدام مكشطة خلية البولي إثيلين البيضاء. إمالة، طبق استنبات الأنسجة، تمكن السائل إلى تجمع في الجزء السفلي، وإزالة الشريحة الزجاجية بالملقط. "الماصة؛" الخلية في أنبوب 1.5 مل وإبقائه على الجليد.
- تضعف إشارة خارجية الأسهم الحمض النووي الريبي (لوسيفراس الرنا) إلى 0.0025 نانوغرام/ميليلتر من خلال تمييع المسلسل قبل إضافته إلى النموذج. على سبيل المثال، إذا كان تركيز المخزون 1 ميكروغرام/ميليلتر، إضعاف 1/000 400 من اللازم لتحقيق 0.0025 نانوغرام/ميليلتر. إضافة 10 ميليلتر من إضعاف الجيش الملكي النيبالي لوسيفراس لكل عينة من خلية لعزل الحمض النووي الريبي المتلقين للمعلومات والتحليل.
- المضي قدما في البروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، أو تجميد في-80 درجة مئوية حتى تتمكن من المضي قدما في الاستخراج.
9-حساب كفاءة "استخراج الحمض النووي الريبي" وكدنا التوليف
ملاحظة: حساب كفاءة لوسيفراس بعد الرايت قبكر بمقارنة العائد النظرية والتجريبية العائد.
- تحديد العائد النظري لوسيفراس الجيش الملكي النيبالي.
- تحديد المبلغ الإجمالي لنسخ لوسيفراس أضيف كل عينة. (إضافة 0.025 نانوغرام/عينة = 2.73 × 107 نسخ من لوسيفراس الجيش الملكي النيبالي كل عينة قبل استخراج الحمض النووي الريبي.)
- حساب الكتلة الجزيئية من لوسيفراس الجيش الملكي النيبالي باستخدام متوسط كتلة جزيئية كل النوكليوتيدات من 330 غ/مول، وضرب من قبل طول لوسيفراس اليراع الجيش الملكي النيبالي، النيوكليوتيدات 1652.
- تقسيم مبلغ لوسيفراس الجيش الملكي النيبالي وأضاف (0.025 نغ) لكل عينة قبل استخراج الحمض النووي الريبي بالكتلة الجزيئية تسفر عن كمية المولى. ثم، أن تتضاعف بعدد أفوجادرو أن تسفر عن النسخ إضافة كل عينة.
- حساب العائد النظري لنسخ لوسيفراس لكل رد فعل RT-قبكر باستخدام المعادلة:
- حساب العائد التجريبية لنسخ لوسيفراس لكل رد فعل RT-قبكر باستخدام بلازميد لوسيفراس لإنشاء منحنى قياسي ل RT-قبكر.
- حساب كفاءة لوسيفراس (%) باستخدام المعادلة:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأكد استخطاط ناجحة من بلازميد لوسيفراس استخدام إنزيمات تقييد تشغيل منتجات الهضم على [اغروس] هلام (الشكل 1). وأكد حجم المنتج خطية باستخدام الحمض النووي سلالم والمقارنة مع بلازميد تقطيعه.
ونحن قد تكيفت إنشاء الدائرة تدفق مواز-لوحة من لين et al. 9 للتجارب التي تتطلب ظروف/علاجات متعددة مع إجهاد القص أو ظروف الإجهاد القص متعددة. نحن نستخدم بيئة مكرسة، الشاطئ، والتي يمكن أن تؤوي متعددة، الدوائر تدفق مجمع بشكل كامل أن الجميع قد رصد معدلات التدفق (الشكل 2). ويتم رصد معدل تدفق المنبع فقط للجمعية لوحة التوازي (الشكل 3). يمكن رصد تدفق الدوائر وأسعار مباشرة من خلال الأبواب الزجاجية دون التسبب في التقلبات في درجة الحرارة أو الرطوبة، أو محتوى الغاز داخل الشاطئ.
عمليات التصنيع يمكن أن تؤدي إلى اختلافات صغيرة في دائرة الارتفاع. وبالتالي، يجب احتساب معدلات التدفق لكل دائرة لتحقيق نفس القص الإجهاد (الجدول 1). من الناحية النظرية، يمكن استخدام معدلات تدفق متطابقة لتحقيق إجهاد القص نفس الدوائر مع ارتفاعات مماثلة ويمكن استخدامها في سلسلة. استخدام التجارب النموذجية مع خلايا بطانية إجهاد القص 0-إجهاد القص "الصفحي بنسلفانيا" 1.5 1 استخدمت السلطة الفلسطينية في سير العمل هذا لإجهاد القص غشائي الشرياني النموذجي. كما يمكن الاختلافات بين إعدادات رأس المضخة وداخلها مضخة رؤساء مع مرور الوقت مع الاستخدام. استخدام مقياس التدفق يمكن أن تمثل هذه الاختلافات.
تجارب باستخدام تطبيق إجهاد القص وكثيراً ما تنطوي على عدة ظروف الإجهاد القص وظروف العلاج والنقاط الزمنية. حيثما كان ذلك ممكناً، ونحن استخدام مرجع ذاتية الحمض النووي الريبي لحساب لأي التقلبات في التشكيل التجريبية. لبعض التجارب، والعثور الحمض النووي الريبي مرجعية ذاتية مع استقرار الكمية ليست مجدية16. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يعزى استقرار الكمية أو عدم استقرار الجينات المرجعية الذاتية بين العينات أما الآثار تعتمد على التحفيز على مستويات التعبير الخلوية أو الاختلافات في الكفاءة لاستخراج الحمض النووي الريبي أو النسخ العكسي. حصر لأوجه القصور هذه، وفي الإعداد حيث جينات مرجعية ذاتية ليست مستقرة نوعا، نستخدم جين سبايك في مرجعية خارجية. لإجراء التجارب على إدماج الصفحي إجهاد القص في خلايا الثدييات بطانية، نستخدم لوسيفراس اليراع الحمض النووي الريبي خارجية الحمض النووي الريبي سبايك (الشكل 4 أ).
ويبين الشكل 4 تحليل البيانات التجريبية RT-قبكر من تجارب القص إجهاد تقييم عامل مثل كربل 2 (KLF2) خسارة للدالة باستخدام siRNA. KLF2 أوبريجولاتيد عامل نسخ الاندفاق الصفحي في خلايا بطانية ووسيط رئيسي النسخي للتعبير الجيني غشائي في الإعداد لتدفق رقائقي2.
ويبين الشكل 4A الكفاءة لوسيفراس لثلاث تجارب منفصلة، كل دائرتين التدفق باستخدام. لوسيفراس الكفاءة يمكن مماثلة بين عينات تجربة (التجربة 1) أو إظهار بعض التغير (تجارب 2 و 3) (الشكل 4 أ). هذه النتائج ذات قيمة خاصة في النظم التجريبية حيث تعتبر التغييرات الصغيرة المطلقة فقط. قد يكون استخدام الجينات المرجعية الخارجية أهمية خاصة في التجارب حيث العلاجات التجريبية يمكن أن تتداخل مع كفاءة النسخ العكسي أو بكر17. النتائج هو مبين في الشكل 4A نموذجية. كفاءة لوسيفراس 5% يشير إلى الكشف عن أن 5% من لوسيفراس الحمض النووي الريبي (أيمبلغ بداية أولية للحمض النووي الريبي) إضافة إلى العينة قبل استخراج الحمض النووي الريبي بواسطة RT-قبكر. بين العينات أو الأوضاع داخل تجربة واحدة، لوسيفراس الكفاءة هي عادة ± 50%. يجب تفسير النتائج بحذر إذا كان تغير كفاءات لوسيفراس > 50% وينبغي أن تتضمن استعراضاً للإجراءات التجريبية والشروط.
يظهر الشكل 4B النتائج التجريبية النموذجية من الرايت قبكر من التجارب المتكررة القص الإجهاد، وكل استخدام متعددة تدفق مواز-لوحة الدوائر. داخل كل تجربة، هو تطبيع التعبير مرناً KLF2 بثلاث طرق. يستخدم تطبيع الأولى الجيش الملكي النيبالي مرجعية ذاتية، سيكلوفيلين A (سيكا). تطبيع الثاني يستخدم مرجعية خارجية الجيش الملكي النيبالي، لوسيفراس اليراع (لوك). تطبيع الثالث يستخدم على حد سواء الداخلية والخارجية الإشارة الجيش الملكي النيبالي. داخل كل تجربة هو موضح في الشكل 4 باء، غلة كل أساليب التطبيع ثلاثة (تطبيع للجين المرجعية الذاتية والجينات مرجعية خارجية، وكلا الجينات المرجعية الداخلية والخارجية معا) نتائج مشابهة. إذا تم تغيير أسلوب التطبيع إلى حد كبير النتائج (مثلاً، يؤدي إلى اختلاف > 50%)، ينبغي تفسير النتائج بحذر. عندما يكون هناك تباين كبير بين أساليب التطبيع، ينبغي استعراض gene(s) المرجعية الذاتية، كما قد يكون متغير تابع في النظام التجريبي. وبالمثل، ينبغي استعراض الإجراءات التجريبية والشروط. في الشكل 4 باء، غلة ضربة قاضية KLF2 استخدام siRNA الكفاءة ضربة قاضية مماثلة بين ثلاث تجارب منفصلة (التجربة 1 و 2 و 3). كنا ثلاث عينات بيولوجية مميزة لهذه التجارب، واستخدام دائرتي تدفق قيد التشغيل في نفس الوقت مع إجهاد القص في 1 السلطة الفلسطينية لكل تجربة.
رقم 1: [اغروس] هلام صورة استخطاط بلازميد خارجية لوسيفراس. سلالم الحمض النووي سوبيركويليد و 1 كيلو بايت + تستخدم كعلامات لتحديد كل تقطيعه وقطع لوسيفراس أحجام بلازميد في كيلوبس (kb). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: نظرة عامة التخطيطي لتدفق حلبة تجميعات متعددة داخل بيئة مخصصة (على الشاطئ)- ويتم رصد معدلات التدفق في كل الدوائر التدفق بسهولة في الوقت الحقيقي، ودون الإخلال بالبيئة، وكل الدوائر يمكن تشغيلها في وقت واحد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: نظرة عامة التخطيطي جمعية دارة تدفق واحد. وترد أحجام أنابيب ولارس المستخدمة في هذا الشكل. تأكد مقياس تدفق في اتجاه التدفق وهو وضع المنبع الدائرة تدفق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الممثل ناتجة عن تجارب فقدان لوظيفة KLF2 في الخلايا البطانية البشرية تتعرض لإجهاد القص (1 السلطة الفلسطينية) ل 24 h. (أ) هذا الفريق يظهر التحديد الكمي للخارجية لوسيفراس الجيش الملكي النيبالي في ثلاث تجارب تدفق منفصلة. يمكن لوسيفراس كفاءات مماثلة بين عينات تجربة (التجربة 1) أو إظهار بعض التغير (تجارب 2 و 3). لوسيفراس (نسخ المطلق) هو عدد نسخ لوسيفراس الحمض النووي الريبي اكتشفتها كوانتيتيشن المطلق باستخدام منحنى قياسي بعكس المنتسخة PCR الكمي (RT-قبكر). لوسيفراس الكفاءة هي النسخ التجريبية لوسيفراس مقسوماً على نسخ لوسيفراس النظرية لكل عينة مضروباً في 100 (راجع الخطوة 8 من البروتوكول). لوسيفراس النسبية أن الكفاءة هي كفاءة لوسيفراس لكل عينة مقسوماً على حالة مرجعية (تدفق + كتلسي) داخل كل تجربة. (ب) تبين هذه الألواح تطبيع التعبير الجيني في مجموعة من إجهاد القص عينة تجارب باستخدام الجينات المرجعية الداخلية والخارجية على حد سواء. النتائج من PCR الكمي المنتسخة العكسية (RT-قبكر). ويرد ضربة قاضية للتعبير مرناً KLF2 حضور الاندفاق الصفحي مع إجهاد القص 1 السلطة الفلسطينية ل 24 h. FC = حظيرة التغيير؛ سيكا = A سيكلوفيلين، يستخدم كمرجع ذاتية رنا؛ لوك = لوسيفراس، يستخدم كمرجع خارجية الجيش الملكي النيبالي. البيانات مقتبس من رجل et al. 5- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| ارتفاع الغرفة (ميكرون؛ ميكرومتر) |
قاعة العرض (سنتيمتر؛ سم) |
تدفق معدل (مل/دقيقة) لإجهاد القص السلطة الفلسطينية 1 | اللزوجة (سينتيبويسي؛ cP) |
| 303.80 | 1.90 | 19.48 | 0.90 |
| 326.10 | 1.90 | 22.45 | 0.90 |
| 344.84 | 1.90 | 25.10 | 0.90 |
| 319.06 | 1.90 | 21.49 | 0.90 |
الجدول 1: الدائرة مرتفعات وأمثلة على معدلات التدفق لمختلف الدوائر تدفق تحقيقا لإجهاد القص 1 بنسلفانيا
| أقمشة ي |
| ملاقط |
| زجاجة الخزان والغطاء |
| يستمتع وكاب |
| حلقة تدفق |
| 1/16 "الذكور اللوير x 3 |
| 1/16 "الإناث اللوير x 3 |
| 1/8 "الذكور اللوير x 2 |
| 1/8 "الإناث اللوير x 4 |
| 3/16 "الذكور محول x 2 |
| 14 "أنبوب الصلب" L/S (2 بوصة) x 1 |
| 14 "أنبوب لينة" L/S (5 بوصة) x 2 |
| 16 "أنبوب لينة" L/S (3 بوصة) x 2 |
| 25 "أنبوب لينة" L/S (3 بوصة) x 2 |
| 13 "أنبوب الصلب" L/S (10 بوصات) x 1 |
| الدائرة تدفق |
| 1/8 "الذكور اللوير x 2 |
| 1/8 "الإناث اللوير x 2 |
| 16 "أنبوب لينة" L/S (3 بوصة) x 3 |
| أعلى وأسفل لوحات |
| مسامير |
الجدول 2: أجزاء أن يعقم في الخطوة 6، 2 من البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إجهاد القص هو شرط الفسيولوجية التي ينظم وظيفة بطانية، جزئيا، بالتأثير على الجينات الحالة المستقرة التعبير2،5. نماذج لتنظيم الجينات في مختلف ظروف الإجهاد القص سوف يسهم في مزيد من فهم لوظيفة غشائي. يقوم سير العمل هذا عملي يتضمن دارة تدفق باستخدام دائرة التوازي-لوحة تدفق مقتبس من لين et al. 9 ويمثل التدفق الصفحي، غير نابض. أن البنية العامة صممت لتيسير التجارب التي تتطلب عدة تدفق الدوائر والحد من تقلب التجريبية في هذا الإعداد.
الجمعية حلبة تدفق هو مكون رئيسي لسير العمل هذا، وهو مقتبس من لين et al. 9-وقدمت عدة تعديلات لهذه الجمعية وبروتوكول لتعكس الاختلافات في النظم التجريبية. وحدة حامية كبيرة، الشاطئ، وهو تكيف التي تسهل عملية متزامنة ورصد عدة دوائر التدفق داخل نفس البيئة. وقد استخدمت هذا النظام بنجاح لتطبيق إجهاد القص إلى خلايا بطانية لفترات زمنية مختلفة، من ح 1 إلى 7 أيام، وعلى عدة مستويات من إجهاد القص (مثلاً، 1.0 و 1.5 و 2.0 السلطة الفلسطينية). وكان يستخدم هذا النظام أيضا لدراسات الجينات ضربة قاضية لتقييم وظيفة الجينات غشائي المراعية للتدفق في الإعداد لإجهاد القص (الشكل 4)5. وهناك تباين كبير بين المضخات ورؤساء مضخة، التي قد تتغير بمرور الوقت بسبب البلى العادي أيضا. لحساب هذه الاختلافات، يمكننا استخدام جهاز استشعار تدفق يقع الدانية إلى الدائرة التدفق باستمرار رصد معدلات التدفق. يتم استخدام أحجام مختلفة من الأنابيب ولارس لضمان تناسب ضيق لكل مكون من مكونات ومنع أي تسرب خلال التجارب. نحن عد الخلايا وتبذر تقريبا 1,000,000 الخلايا كل شريحة الزجاج، دروبويسي، وثم ترك الخلايا احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لزيادة كفاءة الالتزام. ونحن السلف غشائي الخلايا، الذي يمكن أن يكون المصنف لفترة قصيرة قبل تطبيق إجهاد القص9، بالمقارنة مع البذور البشرية خلايا بطانية لمالا يقل عن 24 ساعة قبل تطبيق إجهاد القص. مدد أقصر يمكن أن تؤدي إلى إزاحة الخلايا أثناء التدفق، أو طبقة متقطع من خلايا بطانية، حتى مع كثافة البذر المناسبة. ونشدد على التفتيش على الشرائح لأحادي الطبقة المتلاقية لخلايا بطانية قبل وبعد تطبيق إجهاد القص. ونجد أن الشرائح المغلفة مع فيبرونيكتين، عنصر مصفوفة خارج الخلية طبيعية18، تحتفظ بطانية أحادي الطبقة أكثر مقارنة مع استمرار الجانبين مغطاة بطبقة الجيلاتين (التشويه والتحريف فيبريلار النوع الأول من الكولاجين). وأخيراً، dampeners التدفق في هذا البروتوكول هي الأمثل لاستخدام 30 مل من وسائط الإعلام، مقارنة 190 مل من وسائط الإعلام لغيرها من الشركات المصنعة.
تتطلب العديد من الخطوات في الجمعية حلبة تدفق الرعاية الإضافية. وينبغي أحادي الطبقة حتى من خلايا بطانية قبل تطبيق إجهاد القص. من المهم أن خلايا البذور على شريحة الزجاج دروبويسي لزيادة عدد الخلايا التي تلتزم بالشريحة، ومن ثم شريحة التغطية الشاملة. وقت الانتظار بين الخلية البذر وإضافة وسائط إضافية للشريحة عموما يحسن كفاءة البذر حيث أنه يوفر وقتاً كافياً للخلايا للانضمام إلى الشريحة بدلاً من أن تكون جرفت في علبة شرائح متعددة. فحص خلايا بصريا قبل وأثناء وبعد تطبيق إجهاد القص. يمكن وضع مجهر في الشاطئ لهذا الغرض. يجب إرفاق جهاز استشعار التدفق في الاتجاه الصحيح وينبغي التحقق من معدل تدفق المستهدفة لكل دائرة تدفق الفردية. وينبغي أن perfused النظام حلقة التدفق دون الدائرة لضمان عدم تسرب وسائل الإعلام أو غيرها من المشاكل، مثل تراكم الضغط، لتجنب زعزعة الخلايا أثناء التجارب الفعلية. معاينة والقضاء على فقاعات في النظام. بينما تقوم باختبار النظام حلقة التدفق، ضمان ستوبكوكس كلها مفتوحة قبل تشغيل مضخة تمعجية للسماح بالتدفق دون انقطاع، أحادي الاتجاه. ضمان أن ستوبكوكس جميع مغلقة قبل إرفاق الدائرة تدفق إلى الحلقة وفتحها بالكامل قبل إعادة تشغيل المضخة.
أننا نجد أن إضافة الجينات مرجعية خارجية مفيدة في مجموعة متنوعة من سيناريوهات. وسائط غشائي خلية يحتوي غالباً على الهيبارين، الذي مثبط بكر17. بينما بعض البروتوكولات استخراج الحمض النووي الريبي تتضمن خطوات لإزالة الهيبارين، يمكن أن يسبب كميات نزرة الاختلافات في الكفاءة بكر بين العينات. قد يمنع علاجات فعالة أيضا التعرف الجينات المرجعية الذاتية استقرارا كمياً. أوجد لدينا مختبر بروتوكولا تتسم بكفاءة لتوليف الحمض النووي الريبي لوسيفراس 5 '--توج وبولي-A-الذيل لاستخدامها بوصفها الحمض النووي الريبي مرجعية خارجية. هذه الاستراتيجية قد ثبت أن اتباع نهج فعال من حيث التكلفة مقارنة بشراء الحمض النووي الريبي متاحة تجارياً. أثناء إعداد إشارة خارجية الجيش الملكي النيبالي، من المهم أن الجيش الملكي النيبالي الكوة إلى مختبرين تستخدم مرة واحدة لتجنب دورات تجميد أذاب متعددة. خلط شامل ودقيق بيبيتينج أمر حاسم للحفاظ على الاتساق بين الكوة. تجارب نموذجية تظهر كفاءة لوسيفراس في حدود ± 5% 2.5% ولكن يمكن أن تتراوح بين 1-10%. فإنه من الحكمة لتصحيح نتائج RT-qPCR لكفاءة مرجعية خارجية الجيش الملكي النيبالي وجين مرجعية ذاتية (التدبير المنزلي).
وتستخدم متواليات لوسيفراس اليراع للتجارب التي ندير بها، مرجعاً غير الثدييات سبايك في الجيش الملكي النيبالي في نماذج الثدييات. في التجارب حيث يتم التعبير عن لوسيفراس اليراع في الخلايا، هذا لا يكون جينات إشارة مناسبة. يمكن استخدام جينات أخرى مرجع إبلاغها، بما في ذلك ايليجانس كاينورهابديتيس ميرنا cel-مير-3919 و ribulose bisphosphate carboxylase نبات الحمض النووي الريبي20.
ونماذج هذه الدارة تدفق أحادي الطبقة 2-د غشائي الخلايا المزروعة في زراعة الأنسجة من البلاستيك أو الزجاج، وشديدة جداً. تصلب مصفوفة يمكن أن تؤثر في استجابة بطانية للسوائل القص إجهاد21. يستخدم هذا النظام النموذجي تركيز أكسجين مرتفعة نسبيا أكثر مماثلة إلى الشرياني من تركيزات الأوكسجين الوريدي. هذا النموذج يشبه مقاطع مستقيمة السفن الأكبر حجماً في نظام القلب والأوعية الدموية مغلقة عن كثب، ويوفر بيئة متجانسة نسبيا لخلايا بطانية على الشريحة. لا يتم تمثيل الشروط الأخرى المحددة في هياكل ثلاثية الأبعاد، مثل بيفوركيشنز أو تقوسات للسفن، مع هذا النموذج. أنظمة أخرى يمكن نموذج أنماط التدفقات الأخرى، بما في ذلك تلك الموجودة في المناطق المنحنية من المفرج، لكن تسفر عن خلايا أقل من النظام المذكور في هذا البروتوكول. وبالمثل، قد يكون من الأنسب التجميعات الأخرى إذا كانت مطلوبة > 1 × 106 خلايا، أو إذا كان مطلوباً إجراء تحليل خلية واحدة. لدينا التطبيق الحالي نماذج الاندفاق الصفحي غير نابض. حتى الآن، يمكن استخدام هذا النموذج لتوليد الطول الموجي الأخرى، بما في ذلك الطول الموجي نابض أو متذبذبة، بالاتساق، كما أن معدلات التدفق وتراقب باستمرار.
عموما، يقوم سير العمل هذا عملي يوفر نظام للتطبيق المتزامن لإجهاد القص إلى الدوائر التدفق متعددة مع معدلات تدفق المرصودة. مواد وإجراءات طوال سير العمل هذا مصممة للحد من تقلب التجريبية بين العينات وشروط. وقد استخدمت بنجاح لتجارب [رني] في تحديد تدفق رقائقي سير العمل هذا، ويمكن أن تستخدم أيضا لأي تجارب تتطلب شروط متعددة مع الصفحي إجهاد القص، أو مقادير الصفحي القص إجهاد متعددة و/أو النقاط الزمنية، بما في ذلك الطول الموجي البديلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها استوفوا باتاكا 142307 إلى P.A.M. H.S.J.M. مستلم الكندية المعاهد من صحة البحث برنامج التدريب في "زمالة الطب التجديدي". H.S.J.M.، A.N.S.، K.H.K.، M.K.D.، وهي المتلقية "الملكة إليزابيث الثانية الدراسات العليا المنح الدراسية" في مجال العلم والتكنولوجيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
- Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
- Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
- Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
- Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
- Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
- Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
- Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
- Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
