Summary
Здесь представлен рабочий процесс для анализа выражения культуры и гена эндотелиальных клеток под жидкости касательное напряжение. Входит физическое расположение одновременно жилья и мониторинга несколько камер потока в контролируемой среде и использования внешних ссылок РНК для количественного PCR.
Abstract
Мы описываем процесс для анализа экспрессии генов из эндотелиальных клеток при условии устойчивого ламинарного потока, с помощью нескольких камер контроль потока параллельно плита. Эндотелиальные клетки формируют внутренней клеточной оболочки кровеносных сосудов и хронически подвергаются воздействию силы трения потока крови, называется касательное напряжение. В физиологических условиях, функции эндотелиальных клеток в присутствии различных условий касательное напряжение. Таким образом применение условий касательное напряжение в модели в пробирке может обеспечить большую проницательность в эндотелиальных ответы в естественных условиях. Ранее опубликованные Лейн et al. палата параллель плита потока 9 адаптированы для изучения эндотелиальной гена регулирование в наличие и отсутствие устойчивого ламинарного потока (не ударные). Основные приспособления в настройке для ламинарного потока как здесь представлены включают в себя большой, посвященный окружающей среде дом параллельных потока цепей, мониторинг скорости потока в режиме реального времени и включение ведения экзогенных РНК для нормализации количественные данные ПЦР в реальном времени. Для оценки нескольких лечения/условий с применением касательное напряжение, несколько схем потока и насосы используются одновременно в рамках же инкубатор с подогревом и увлажненной. Скорость потока каждого потока цепи измеряется постоянно в режиме реального времени для стандартизации условий касательное напряжение во всем экспериментов. Потому что эти эксперименты имеют несколько условий, мы также используем РНК внешних ссылок, с шипами в во время извлечения РНК для нормализации РНК добыча и эффективность синтеза cDNA перв стренги. Эти шаги минимизировать изменчивость между выборками. Эта стратегия работает в нашем трубопровода для анализа выражения гена с касательное напряжение эксперименты с использованием потока параллельной пластине камеры, но частей этой стратегии, такие как экзогенные ссылку Спайк в РНК, можно легко и экономически эффективно использоваться для другие приложения.
Introduction
Сосудистые эндотелиальные клетки формируют сотовой мотопомпам кровеносных сосудов в закрытые сердечно-сосудистой системы высших видов. Они формируют интерфейс между кровью и тканями и характеризуются Люминал и abluminal поверхностей. Эндотелий-это разнообразные, активных и адаптивной системы, которая регулирует поток крови, питательных людьми, иммунитета и роста новых кровеносных сосудов1. В организме эндотелиальные клетки обычно существуют в среде, где они подвергаются воздействию силы трения обращения, касательное напряжение2. Касательное напряжение является важным регулятором эндотелиальных клеток ген выражение3, и эндотелиальных клеток пытаются поддерживать касательное напряжение в пределах заданного диапазона2,4. Эндотелиальные клетки демонстрируют ангиогенных кучность при отсутствии касательное напряжение5 , которая может улучшить перфузии тканей. Региональные модели нарушается потока и изменены касательное напряжение связано с выражением воспалительные гены6 и развитие атеросклероза7,8. Таким образом модели, которые включают касательное напряжение являются основным компонентом понимания эндотелиальной гена регулирования.
Мы описываем метод для изучения гена регулирование в сосудистой эндотелиальных клетках под напряжение сдвига. Эта система использует не пульсирующего потока и имитирует уровни жидкости касательное напряжение и концентрация кислорода что модель условия для артериальной эндотелиальных клеток. Этот протокол включает в себя детали методов нокдаун гена, с помощью РНК-интерференции (RNAi), настройки для приложения с помощью потока параллельной пластине аппарата и методы для всплеска в экзогенных ссылки на РНК до анализа, при сдвиге обратной транскриптазы количественных полимеразной цепной реакции (RT-ПЦР). Этот трубопровод используется для изучения гена регулирование в эндотелиальных клетках в присутствии и отсутствии ламинарные касательное напряжение и включает Адаптация потока параллельной пластине аппарата описал Лейн et al. 9. этой конкретной установки был разработан для облегчения одновременного оценки нескольких экспериментальных условий, который позволяет прямое сравнение условий касательное напряжение, а также нормализации РНК анализа. Большой подогреваемый блок с контролируемой влажностью используется, чтобы разрешить несколько отдельных потока камер и насосы для быть запущена одновременно с скорости потока, контролируется для каждого потока палата Ассамблеи в режиме реального времени. Применение этой настройки используется для нокдаун гена с помощью РНК-интерференции в параметре ламинарного потока/касательное напряжение, но аспекты настоящего Протокола может быть применен к любой оценке выражения РНК.
Общие подходы к применению касательное напряжение для эндотелиальных клеток включают microfluidic систем10, конус и пластины вискозиметра11и параллельно плита потока камеры12. Microfluidic систем от различных производителей были полезны в изучении mechanobiology и mechanotransduction в несколько ячеек и типы тканей и различных биофизических раздражителей. Для эндотелиальных клеток они были использованы для изучения эндотелиальных клеток в изоляции, а также взаимодействие эндотелиальных клеток и торговлей иммунной или опухолевых клеток10. Однако эти системы являются менее пригодны для восстановления большого числа клеток9. Вискозиметр конуса и пластины и параллельно плита потока камеры позволяют восстановления большого числа клеток в вырожденная монослои12. Эти системы можно создавать широкий спектр сдвига силы и шаблоны12. Параллель плита потока палата Ассамблеи9 имеет то преимущество, что в реальном времени изображений может быть выполнена через стекло окна проверяемый клеточной морфологии в любой момент времени. Кроме того perfusate может быть собрана в стерильных условиях. Для системы, представленные здесь поток может также контролироваться в реальном времени и многокамерные ловушка, которая облегчает поддержание условий сдвига между камерами.
Для представителя экспериментов, эндотелиальные клетки человека пупочную вену (HUVEC), которые представляют тип эндотелиальных клеток macrovascular, используются, и напряжение сдвига условия мы используем (1 ПА) отражают артериальной условия (0,1 - 0,7 ПА). Однако этот протокол может использоваться с другими типами эндотелиальных клеток, и условия касательное напряжение можно отрегулировать согласно экспериментальной вопрос. Например, оценка эндотелиальных клеток человека в условиях, которые моделируют венозное кровообращение потребует более низких уровней напряжения сдвига (1-6 Па) и исследования, которые моделируют микрососудистой циркуляции использовали уровни касательное напряжение 0,4 - 1,2 Па13 , 14. Кроме того, касательное напряжение может меняться даже между эндотелиальных клеток в пределах же кровеносный сосуд6. В текущей настройке, используется единой системы мониторинга, можно одновременно отслеживать четыре отдельных потока петли. Для лабораторий, которые нужно больше потока петли есть места в специальной среде для дополнительной системы мониторинга.
RT-ПЦР используется для абсолютной количественный экспрессии генов в параметре касательное напряжение. Относительное выражение генов-мишеней часто используется для сравнения РНК выражение условия. Некоторые виды РНК может существовать на очень низком количестве или отсутствуют, что затрудняет относительных измерений. К примеру длиной некодирующих РНК в эндотелиальных клетках могут оказывать мощным эффекты на относительно низкой копирования цифры в ячейки5. Кроме того различия в эффективности грунт может привести к неточной интерпретации от использования порогового значения (Ct) метод дельта дельта цикла для анализа данных. Для решения этой проблемы, мы выполняем абсолютной количественный, создавая калибровочной кривой с помощью известное количество плазмидной ДНК. Кроме того дополнительные синтеза ДНК — (cDNA кДНК) является неэффективным процессом, и различия в эффективности cDNA можно объяснить различия в РНК выражение между условиями и образцы15. Приложение касательное напряжение и/или трансфекции реагентов может повлиять на пролиферацию клеток, апоптоз и жизнеспособности, или добавить компоненты, которые могут помешать в изоляции и/или cDNA синтез РНК. Чтобы учесть возможность смещения от изоляции РНК и синтез cDNA, мы используем шип в РНК управления синтезируется в лаборатории, добавил в то время извлечение RNA и измеряется с каждым cDNA синтеза через RT-ПЦР. Это позволяет не только технические различия в добыче и cDNA синтез РНК, но также позволяет расчет абсолютного количества в клетку, когда известно число ячеек.
Эта система использует дополнительные шаги для поддержания подобия или учитывать технические различия между условиями. Мы особенно подчеркиваем эти шаги ввиду сложного характера этих экспериментов, которые включают несколько физических установок и экспериментальных условиях, которые могут привести к экспериментальной изменчивости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. подготовка внешних ссылок РНК
Примечание: Выберите ссылку экзогенных РНК, которая не существует в модели интереса или видов. Для млекопитающих систем Светлячок Люцифераза РНК могут быть использованы.
-
Линеаризация внешних ссылок РНК плазмиды
- Подготовьте экзогенных ссылка РНК по крайней мере 48 часов до предполагаемого извлечение RNA. Получить или изготовление клона cDNA выбранной экзогенных ссылки на РНК, например клона cDNA Люцифераза светлячков в вектор плазмиды, подходящие для в vitro транскрипция (см. Таблицу материалы).
- Выполнять Пищеварение энзима ограничения (RE) 1 мкг полнометражных плазмида (Светлячок Люцифераза плазмида является pSP-люк +, которая имеет 4100 bp) с использованием одного резак RE (XhoI) в 1,5 мл отцентрифугировать трубы. Выберите ре, это один резак (режет плазмида только 1 x) в конце 3' экзогенных ссылка последовательности РНК, которая оставляет 5' навеса или тупой конец. Для типичных приготовления выполните семь плазмида Линеаризация реакций (шаги 1.1.4 - 1.1.7) параллельно для создания достаточной концентрации РНК и количество завершить один набор экспериментов или одного проекта.
- Измерьте концентрацию плазмида с помощью спектрофотометрии или spectrofluorometry.
- Подготовка смеси RE в каждой тюбике: 4 мкл XhoI (20 000 единиц/мл), 8 мкл буфера, x µL плазмиды (1 мкг), и достаточно H2O для достижения общего решения 80 мкл.
- Инкубировать RE смесь для 2 ч при 37 ° C. Используйте RE согласно протоколу производителя, как любые изменения могут привести к повышенной активности звезды или неспецифических расщепление ДНАО цели. Тепла инактивирует реакционную смесь для 20 мин на 65 ° C.
- Прекратить RE дайджест с этанолом осадков в каждой тюбике. RE-микс непосредственно мкл 4 0.5 М ЭДТА рН 8,0, 8 мкл 3 M натрия ацетата рН 5.2 и 184 µL 100% этанола. Хорошо перемешайте и заморозить смесь при-20 ° C за 30 мин.
- Спин вниз смеси на 4 ° C на 20 мин в относительная центробежная (РРС) 16,100 x g.
- Удалите супернатант с тонкой кончиком, не касаясь гранулы. Просушите Пелле за 5 мин и Ресуспензируйте в 6 мкл H2O (разогрет до 37 ° C), закупорить вверх и вниз 5 x - 10 x.
- Подтвердите Линеаризация Люцифераза плазмида, запустив переваривается продукта на 2% агарозном геле, содержащие бромид ethidium (бромистый этидий) наряду с 1 КБ + лестница, supercoiled лестница и вырезать и неподрезанные плазмиды. Осмотрите гель и перейти к в vitro транскрипция если полосу для резки плазмида показывает одной полосы в ~ 4 КБ (режиссерский плазмиды будет иметь три полосы; Рисунок 1).
Предупреждение: Бромистый этидий канцерогенами. Работа в химической зонта.
-
В in vitro транскрипция внешних ссылок РНК плазмиды
- Для каждой трубы переваривается плазмида продуктов, выполняют в vitro транскрипция с использованием метода в vitro транскрипция (см. Таблицу материалы). Следуйте инструкциям производителя и использовать соответствующие Фаговые РНК-полимеразы. Если метод синтеза cDNA требует poly(A) хвост, или другие приложения требуют poly(A) хвост, выбрать метод в vitro транскрипция, который включает в себя добавление хвост poly(A) (см. Таблицу материалы).
- Объединить все в vitro расшифрованный продуктов в один 1,5 мл полипропиленовые трубы до очистки.
-
Purif мышсы РНК в vitro транскрипция реакции
- Очищение в vitro расшифрованный продуктов с в vitro транскрипция очистки комплект (см. Таблицу материалы). Пожалуйста, следуйте производителя протокол.
- Оценка концентрации РНК путем измерения оптической плотности на 260 Нм, с помощью спектрофотометрии.
Примечание: Концентрация РНК рассчитывается с использованием Закон Бугера-Ламберта — Бера. Это утверждает, что поглощение нуклеиновых кислот (которые поглощают свет сильно на 260 Нм) пропорциональна к концентрации. Абсорбция 1.0 равен 40 мкг/мл одноцепочечной РНК.
-
Aliquoting запас РНК в ПЦР пробирок для экспериментального использования
- Убедитесь, что концентрация РНК-1 мкг/мкл.
- Если концентрация РНК > 1 мкг/мкл, разбавленных запас 1 мкг / мкл. аликвота 1 мкл в ПЦР пробирок и хранить их в-80 ° C.
- Если концентрация РНК < 1 мкг/мкл, дополнительных осадков с использованием ацетата аммония 5 M (поставляется в комплекте) может выполняться в соответствии с протоколом производителя. Если концентрация РНК до сих пор < 1 мкг/мкл, продолжите aliquoting 1 мкл в пробирки ПЦР.
- Убедитесь, что концентрация РНК-1 мкг/мкл.
2. Сдвиньте покрытие
Примечание: Шаги 2.1-2.10 должна быть осуществляется 24-48 ч до посева предполагаемых клеток.
- Разогреть духовку до 250 ° C.
- С помощью стерильных перчаток, обернуть каждый стекла слайд 2 x с алюминиевой фольгой. Не прикасайтесь к поверхности слайда непосредственно.
- Выпекать слайды в духовке в течение 1 ч при 250 ° C и позволяют слайды остыть до комнатной температуры.
Примечание: Этот шаг имеет важное значение для уничтожения любых загрязняющих эндотоксин. - В то время как охлаждение слайды, сделать фибронектин Стоковый раствор 1 мг/мл дистиллированной водой и Инкубируйте 30 минут при 37 ° C распустить. Сделайте 100 мкл аликвоты. Отложите аликвоты для немедленного использования и заморозить остальные аликвоты для использования в будущем.
- Берем внешнее покрытие алюминиевой фольги перед вводом стеклянное скольжение в биобезопасности кабинета. Выполните шаги 2,6-2,7 и 2,9 в кабинет биобезопасности.
- Поместите слайд стекла в стерильных Прямоугольные ячейки 4-ну культуры блюдо.
- Разбавьте фибронектин Стоковый раствор 1: 100 с дистиллированной водой. Покройте каждый слайд с 1 мл разбавленной фибронектин, по капле, с помощью пипетки. Убедитесь, что охватывает весь слайд.
- Инкубируйте слайды в инкубатор культуры ткани при 37 ° C за 24-48 ч.
- После инкубации аспирационная фибронектин, наклоняя 4-ну клетки культуры блюдо. Не прикасайтесь слайд непосредственно с аспиратором.
3. клетки, посев на стекло слайды
- Граф человека эндотелиальных клеток в начале прохода (проход 2-5) и семян ~1.0 х 106 клеток на каждый слайд фибронектин покрытием стекла с 1 мл раствора СМИ (1.0 х 106 клеток/мл СМИ). Семя клетки 24 ч до предполагаемого применения ламинарного потока, если не лечение должны быть выполнены.
Примечание: Эти цифры используются в качестве руководства для экспериментов с 24 h потока.- Регулировка посева плотности для достижения вырожденная монослоя клеток во время уборки клеток и извлечение RNA.
- Пусть клетки придерживаться слайд 15 мин при температуре 37 ° C.
- Добавить 3 мл средства массовой информации в каждой скважине клетки культуры блюдо для покрытия слайд и инкубации клеток при 37 ° C в течение 24 ч с 5% CO2.
4. Малые вмешательство РНК (siRNA) Transfection
-
Подготовка клетки на стеклянных вставках siRNA transfection и потока экспериментов
- Следуйте протокол в шагах 2 (скользящим покрытием) и 3 (ячейка посева на стеклянных вставках) для подготовки слайд стекла и покрытие для потока экспериментов.
- Семя клетки 24 ч до начала лечения малых интерферирующих РНК (48 ч до применения ламинарного потока).
- Семя человека эндотелиальных клеток в антибиотик свободных СМИ в 750 000 до 1 x 106 клеток на слайд, чтобы достичь слияния 85% - 95% на следующий день.
Примечание: HUVEC используются в настоящем Протоколе.
-
Подготовка на основе малых интерферирующих РНК липидов трансфекции реагент комплексов (на слайде)
- Проектирование пользовательских малые интерферирующие РНК или заказать готовые малые интерферирующие РНК для нужного гена интереса.
Примечание: Выполните следующие действия в области биобезопасности кабинета. - 6 мкл интерферирующей РНК (20 мкм акций) в 414 мкл сокращение сыворотке среды (см. Таблицу материалы) и осторожно перемешать, закупорить.
- Разбавить 49,5 мкл Реагента нежно смешанных липидных transfection (см. Таблицу материалы) в 130,5 мкл сокращение сыворотке среды.
- Осторожно перемешать и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Объединить разреженных малые интерферирующие РНК и липидных трансфекции реагента, осторожно перемешать и Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре. Смесь осторожно, чтобы избежать нарушения комплексов на основе липидов трансфекции реагента.
Примечание: Решение может появиться облачно виде комплексов. - В то время как формируются комплексы, удалите среднего роста и вымыть клетки 1 x с сокращение сыворотке среднего.
- Добавление 2,4 мл среды сокращение сыворотке каждый слайд.
- 600 мкл нежно смешанные на основе малых интерферирующих РНК липидов трансфекции реагент комплексов для каждой пластины и рок плита взад и вперед, чтобы смешать. Конечная концентрация siRNA обеспечивает 40 Нм. Убедитесь, что слайд полностью покрыта.
- Инкубируйте клетки при 37 ° C в течение 4 ч.
- Добавьте 1 mL антибиотиков бесплатно эндотелиальных клеток роста сред, содержащих 3 x нормальной концентрации плода бычьим сывороточным (ФБС) без удаления трансфекции смеси.
- Инкубируйте клетки при 37 ° C до готовой к использованию.
- Проектирование пользовательских малые интерферирующие РНК или заказать готовые малые интерферирующие РНК для нужного гена интереса.
5. Расчет скорости потока, основанные на желаемый касательное напряжение9
- Рассчитайте скорость потока, основанные на желаемый касательные напряжения по следующему уравнению:
Здесь,
Q является скорость потока мл/мин;
Τ является желаемой касательное напряжение в Дин/см2 (1 ПА = 10 Дин/см2);
w – ширина потока параллельной пластине камеры в см;
h – высота параллель плита потока камеры в см;
мкг является вязкость СМИ в cP (g/cm·s).
Примечание: Типичные слоистые касательное напряжение (не ударные) в этом рабочем процессе являются эксперименты на τ = 1 Па (10 Дин/см2). µ может быть измерена с помощью вискозиметра как вискозиметр конус и пластины и может варьироваться в зависимости от содержания средств массовой информации, включая сыворотки и дополнительные декстрана9. - Для достижения конкретных τ (касательное напряжение), отрегулируйте скорость потока и/или вязкость. На более высокой скорости потока адэрентных клеток может отмежеваться от слайда. Образец потока с типичного потока камеры приводятся в таблице 1.
6. Создание специальных условий для системы мониторинга и несколько камер параллель плита потока (рис. 2)
- Используйте большой подогреваемый единица/инкубатор с несколькими полками, доступ внутренних электричество и стеклянные двери — называется пляж (встроенный среды с регулируемый CO2 ) и тепла — в доме несколько камер потока одновременно для экспериментов, требуют касательное напряжение и прямое сравнение между двумя или более лечения или результатов (например, ДНК, РНК и белков).
Примечание: Пляж позволяет частый мониторинг потока цепи, включая скорость потока, без частые нарушения окружающей среды. - Обеспечение адекватного CO2 доступен для эксперимента и что CO2 монитора является функциональным. Убедитесь, что лоток для воды надлежащим образом заполнены, таким образом, что там будет увлажненный воздух.
7. Настройка потока параллельной пластине аппарата
Примечание: Для изготовления параллельных пластин, пожалуйста, смотрите Лейн и др. 9.
- Автоклав потока камеры плиты, водохранилище, увлажнитель, труб и Люрс для каждой настройки камеры параллельно плита потока как указано в таблице 2.
-
Настройка потока Петля Ассамблеи (рис. 3).
- Место стерильным полотенца в биологической безопасности кабинета. Соберите поток цикла системы, сначала без камеры потока параллельной пластине, в кабинете биологической безопасности.
- Подключение трубки Ассамблеи для водохранилища:
- Вставьте трубу жесткий #14 в одно отверстие и два #14 мягкие трубы в другие два отверстия в крышке резервуара потока. Убедитесь, что один из мягких труб касается нижней части водохранилища как отток труб.
- Место 1/16" мужской Luer в конце #14 жесткие трубки и прикрепить стерильные фильтр как вентиляционного воздуха.
- Место 1/16" женский Luer в конце #14 мягкие приток трубки, приходя от водохранилища и прикрепите 4-ходовой кран.
Примечание: Анализ выражения гена или других исследований, где перфузатов не обязательно должны быть собраны, 2-полосная запорные краны может использоваться вместо 4-ходовые краны запорные в настоящем Протоколе. - Место 1/16" мужской Luer в конце трубки #14 мягкие отток, приходя из водохранилища.
- Подключиться насос труб НКТ отток водохранилище: место 1/16" женский Luer на каждом конце жесткие трубки #13 (насос труб). Подключение трубки #14 мягкие отток из водохранилища к жесткие трубки #13 путем соединения 1/16" мужского и женского Люрс вместе.
- Подключение шланга насоса с «увлажнитель мост» трубы: место 1/8" мужской Луер и 1/8" женский Luer на каждом конце #16 мягкой трубки. Подключение 1/16" женский Luer #13 жесткие трубки (в конце отток насоса трубки) с 1/8" мужской Luer #16 мягкой трубки.
- Монтаж труб для потока увлажнитель: место 3/16" мужской Luer на одном конце #25 мягких труб и повторите для другой стороны потока увлажнитель. Прикрепите свободные концы #25 мягкие трубы к каждой стороны потока увлажнитель.
- Подключение трубки «увлажнитель мост» с трубки для потока увлажнитель: подключение #25 мягкие трубки из потока увлажнитель с мягкой трубки #16 «увлажнитель моста», используя 1/8" женский Luer со стороны #16 «увлажнитель мост» и уже размещены 3/16" мужской Luer со стороны метро #25 мягкие увлажнитель.
- Сборка «палата мост» труб:
- Место 1/8" женский Луер и 1/8" мужской Luer на каждом конце #16 мягкой трубки («палата мост» трубы).
- Подключение 1/8" женский Luer «мост камеры» с 3/16" мужской Luer на мягкой трубки #25 от свободного конца потока увлажнитель.
- В 1/8" мужской Luer (свободный конец) «Палата мост» труб, место 4-ходовой кран.
- Подключите 4-ходовой кран от «палата мост» свободный конец к 4-ходовой кран от водохранилища приток мягких труб (из 7.2.2.3 шага). Закройте запорные краны.
- Добавьте средства массовой информации в водохранилище и увлажнитель. Для сдвига стресс воздействия 48-h добавьте 35 мл средства массовой информации в водохранилище и 25 мл в увлажнитель. Отрегулируйте громкость средств массовой информации, основанные на продолжительность эксперимента потока и количество клеток семенами.
- Привести систему цикла собраны потока к насосу на пляже. Поместите жесткие трубки #13 (насос шланги) в головку насоса и закрепите его. Откройте запорные краны.
- Включите насос и постепенно увеличить скорость насоса. Пусть средства массовой информации распространять через систему цикла. Проверьте любой утечки или блокировки (например, давления). Убедитесь, что средства массовой информации поступает обратно в резервуар.
-
Настройка потока палата Ассамблеи
- Место 1/8" женский Luer на одном конце #16 мягкой трубки и прикрепите 4-ходовой кран. Прикрепите свободный конец трубки на правой стороне верхней пластины (приток сторона).
- Место 1/8" мужской Luer на одном конце #16 мягкой трубки и прикрепите 4-ходовой кран. Прикрепите свободный конец трубки в левой части верхней пластины (отток сторона) .
- Место 1/8" мужской" Луер "и 1/8" женский Luer на каждом конце мягкой трубки #16 (Пузырь ловушки труб). Прикрепить трубку к Пузырь ловушки через 1/8" мужской" Луер ". Прикрепить кран 4-путь к другой конец трубки через 1/8" женский Luer.
- С помощью стерильных пинцетов, передать клетки семенами стекло слайд из 4-ну клетки культуры блюдо выемку на нижней пластине. Убедитесь, что ячейки с семенами сторону стеклянное скольжение вверх.
- С помощью 10-мл шприца, добавьте 10 мл теплой СМИ к нижней пластине в пределах красных прокладки линии вокруг пластины. Разрешить СМИ через слайд и охватывают клетки. Избегайте добавления средств массовой информации непосредственно на слайд.
- Осторожно поместите верхней пластины на нижней пластине, совместив от одной стороны к другой. Избегайте введения воздушных пузырьков. Винт пластины вместе плотно.
- Удалите пузырьки воздуха из Пузырь ловушки, открыв кран на правой стороне (приток) пластины и осторожно промывки 20 мл теплого средств массовой информации, с помощью шприца 30 мл. Убедитесь, что кран на левой стороне (отток) пластины закрыт и что СМИ течет через запорный ловушка пузырь (открыть). Выбросите покраснел средств массовой информации.
- Закройте кран на пузырь ловушки и откройте кран на левой стороне (отток) камеры. Поднять с левой стороны (отток) камеры под углом в 45° и осторожно промойте 20 мл теплого носителей с помощью 30 мл шприц с правой стороны (приток) камеры для удаления пузырьков воздуха из камеры. Пузыри могут быть визуализированы через окно. Выбросите покраснел средств массовой информации.
- Закройте запорные краны по обе стороны камеры и Кап. Проверьте ячейки по микроскопии.
- Транспортные камеры на пляж с ранее собранный цикла системы.
- Медленно уменьшить скорость насоса и приостановить насоса. Закройте запорные краны на системе петлю потока для предотвращения утечки.
- Подключите камеру и петли системы вместе через запорные краны. Откройте все запорные краны.
- Постепенно увеличить скорость насоса и изучить настройки для любой утечки или закупорки. Обеспечить средства массовой информации распространяет в одном направлении и возвращает в водохранилище.
- Поместите датчик расхода на трубопроводах «палата мост», расположенный на приток стороне камеры. Убедитесь, что датчик правильно ориентирован в направлении потока.
- Отрегулируйте скорость насоса для получения скорости потока, которая была рассчитана ранее, основанный на нужное напряжение сдвига.
Примечание: Скорость потока может варьироваться в зависимости от высоты и ширины каждой палаты, а также вязкость средств массовой информации. - Включите CO2 танк для достижения 5% CO2 и поместите поддон для воды пляжа.
8. заготовка клеток и экстракции РНК из потока камеры
- После завершения периода желаемого времени потока, медленно поверните вниз Перистальтический насос скорость 0 и выключите питание. Быстро закрыть все открытые Краны запорные и удалить камеру и прилагаемой трубки с краном на каждом конце.
- Взять камеру чистой benchtop и аккуратно Открутите все винты, чтобы удалить верхнюю крышку. С помощью иглы нос пинцета удалите стекло слайд из нижней плиты и поместить его в блюдо культуры ткани диаметром 100 мм.
- Вымойте слайд с 10 мл холодного фосфат амортизированное saline (PBS)- / - и проверьте клетки под микроскопом, чтобы подтвердить сотовый присоединению и выравнивание в направлении потока.
- Аспирационная PBS с плиты и передача слайд на чистой 100 мм диаметр блюдо. 350 мкл буфера lysis от РНК добыча комплект (см. Таблицу материалы), содержащие 1/100 бета меркаптоэтанол, к слайду.
Предупреждение: Добавьте бета меркаптоэтанол в химической зонта. - Скрип клетки со слайда с помощью скребка полиэтилен лопастной клеток. Наклоните тканевой культуры блюдо, позволяя жидкости бассейн внизу и удалить слайд стекло пинцетом. Пипетка ячейки lysate в 1,5 мл пробирку и держать его на льду.
- Разбавить запасов экзогенных ссылка РНК (Люцифераза РНК) 0,0025 нг/мкл путем последовательного растворения до его добавления в образце. Например, если акции концентрация составляет 1 мкг/мкл, разбавления 1/400 000 необходим для достижения 0.0025 нг / мкл. Добавить 10 мкл разбавленный Люцифераза РНК для каждого образца клеток lysate течению РНК изоляции и анализа.
- Продолжить с РНК добыча протокола в соответствии с инструкциями производителя, или заморозить lysate-80 ° c, пока не в состоянии приступить к добыче.
9. Расчет эффективности добычи РНК и синтез cDNA
Примечание: Рассчитайте эффективность Люцифераза после RT-ПЦР, сравнивая теоретическую доходность и экспериментальная урожайность.
- Определите теоретическую доходность для Люцифераза РНК.
- Определите общее количество копий Люцифераза, добавил на сэмпл. (Добавление 0,025 нг/образец = 2,73 x 107 копий Люцифераза РНК на сэмпл до извлечение RNA.)
- Вычислить молекулярную массу Люцифераза РНК с помощью средняя молекулярная масса за нуклеотидов 330 г/моль и умножив продолжительность Светлячок Люцифераза РНК, 1652 нуклеотидов.
- Разделите количество Люцифераза РНК добавил (0,025 нг) для каждого образца до РНК добыча по молекулярной массе приносить молярный объем. Затем умножьте это число Авогадро приносить свои копии, добавил на сэмпл.
- Рассчитайте теоретическую доходность для Люцифераза копий для каждой реакции RT-ПЦР, используя уравнение:
- Вычислить экспериментальная урожайность Люцифераза копий для каждой реакции RT-ПЦР с помощью Люцифераза плазмиду для создания стандартной кривой для RT-ПЦР.
- Рассчитайте Люцифераза КПД (%), используя уравнение:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное Линеаризация Люцифераза плазмида с помощью энзимов ограничения было подтверждено работает переваривается продуктов на геле агарозы (рис. 1). Размер линеаризованного продукта был подтвержден с помощью ДНК лестницы и по сравнению с необрезанный плазмиды.
Мы адаптировали настройки камеры параллельно плита потока от Лейн et al. 9 для экспериментов, которые требуют нескольких условий/лечения с касательное напряжение или напряжение сдвига несколько условий. Мы используем специальной среде, на пляж, может размещаться несколько, полностью собранный потока цепей, что все наблюдали скорости потока (рис . 2). Скорость потока проверяется только вверх по течению от Ассамблеи параллель пластины (рис . 3). Схемы потока и тарифы могут контролироваться непосредственно через стеклянные двери не вызывая колебания температуры, влажности или содержание газа в пределах пляжа.
Производственных процессов может привести к небольшие вариации в высота камеры. Таким образом скорость потока должны рассчитываться для каждой камеры для достижения же напряжение сдвига (Таблица 1). В теории камеры с идентичными высот можно использовать идентичные расхода для достижения же касательное напряжение и может быть использован в серии. Типичный эксперименты с эндотелиальных клеток использовать касательное напряжение 0 - 1.5 Па ламинарные касательное напряжение 1 ПА был использован в этот рабочий процесс для модели артериальной эндотелиальной касательное напряжение. Со временем с использованием также могут быть различия между головы параметров насоса и внутри головки насоса. С помощью индикатора потока можно объяснить эти различия.
Эксперименты с использованием приложения касательное напряжение часто включают несколько касательное напряжение условий, условий лечения и моменты времени. Там, где это возможно, мы используем эндогенного ссылку РНК на счет для любого вариативности в экспериментальной установки. Для некоторых экспериментов нахождение эндогенного ссылка РНК с количественной стабильностью не является осуществимым16. Кроме того количественные стабильности или нестабильности эндогенного ссылку генов между выборками может объясняться либо стимул зависимых эффектов на уровнях сотовой выражения или различия в эффективности экстракции РНК или обратной транскрипции. Чтобы учесть эти недостатки и в обстановке, где ген эндогенного ссылка не количественно стабильным, мы используем гена Спайк в внешних ссылок. Для экспериментов, включающих ламинарные касательное напряжение в эндотелиальных клетках млекопитающих мы используем Светлячок Люцифераза РНК как экзогенные РНК Спайк в (рис. 4A).
Рисунок 4 показывает анализируемого RT-ПЦР экспериментальных данных от экспериментов касательное напряжение, оценке Krüppel подобный фактор 2 (KLF2) функция потерь с использованием siRNA. KLF2 является upregulated фактором транскрипции ламинарного потока в эндотелиальных клетках и посредником основных транскрипционный анализ экспрессии генов эндотелия в параметре ламинарного потока2.
На рисунке 4A показывает Люцифераза эффективности для трех отдельных экспериментов, каждый с помощью двух палат потока. Люцифераза эффективности может быть похожи между образцами эксперимента (эксперимент 1) или показать некоторые изменчивости (эксперименты, 2 и 3) (рис. 4A). Эти результаты являются особенно ценным в экспериментальных систем где видны лишь небольшие абсолютные изменения. Использование внешних ссылок гена может быть особенно важным в экспериментах где экспериментальное лечение может мешать эффективности обратной транскрипции или ПЦР17. Результаты, изображенные в рисунке 4A типичны. Люцифераза эффективности 5% означает, что что 5% Люцифераза РНК (т.е., первоначальный начальное количество РНК) добавляется в образце до РНК добыча обнаруживается RT-ПЦР. Образцы или условий в рамках одного эксперимента Люцифераза эффективности обычно являются ± 50%. Результаты следует интерпретировать с осторожностью, если изменчивость Люцифераза эффективность составляет > 50% и должен включать обзор экспериментальных процедур и условий.
Рисунок 4B показывает типичный экспериментальные результаты по RT-ПЦР из повторяющихся касательное напряжение экспериментов, каждый с помощью нескольких камер параллель плита потока. В рамках каждого эксперимента выражение KLF2 mRNA нормируется тремя способами. Первый нормализации использует эндогенного ссылка РНК, циклофилина A (CycA). Второй нормализации использует внешние ссылки РНК, Светлячок Люцифераза (Люк). Третий нормализации использует оба эндогенных и экзогенных ссылка РНК. В рамках каждого эксперимента, показано на рисунке 4Ввсе три метода нормализации (нормализация эндогенного ссылку генов, ген внешних ссылок и обе ссылки эндогенных и экзогенных генов вместе) дает аналогичные результаты. Если метод нормализации значительно изменяет результаты (например, приводит к > 50% разницы), результаты следует интерпретировать с осторожностью. Когда есть значительные различия между методами нормализации, gene(s) эндогенных ссылку следует пересмотреть, как это может быть зависимой переменной в экспериментальной системы. Аналогичным образом следует пересмотреть экспериментальной процедуры и условия. В рисунке 4ВKLF2 нокдаун, с помощью малых интерферирующих РНК дает аналогичные нокдаун эффективности между трех отдельных экспериментов (эксперимент 1, 2 и 3). Мы использовали три различных биологических образцов для этих экспериментов с использованием двух камер одновременно запущенных потоков с касательное напряжение в 1 ПА для каждого эксперимента.
Рисунок 1: образ гель агарозы Линеаризация экзогенных Люцифераза плазмида. Supercoiled и 1 КБ + ДНК лестницы используются в качестве маркеров для определения как режиссерский и вырезать Люцифераза плазмида размеров в kilobases (КБ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Схематичный обзор несколько сборок цепь потока в специальной среде (пляж). Скорости потока в обеих схемах потока легко отслеживаются в режиме реального времени, не нарушая окружающей среды и обе схемы могут выполняться одновременно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Схематичный обзор Ассамблеи цепи одного потока. На этом рисунке указаны размеры труб и Люрс используются. Убедитесь, что расходомер ориентированы в направлении потока и помещены вверх по течению потока камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель результаты от KLF2 функция потерь эксперименты в эндотелиальных клетках человека подвергается сдвига стресс (1 ПА) за 24 ч. (A) Эта группа показывает количественная оценка экзогенных Люцифераза РНК в трех отдельных потока экспериментов. Люцифераза эффективность может быть похожи между образцами эксперимента (эксперимент 1) или показать некоторые изменчивости (эксперименты, 2 и 3). Люцифераза (абсолютное копий) — это копия количество Люцифераза РНК, обнаруженных обратной транскриптазы количественного PCR (RT-ПЦР) путем абсолютного количественный, с использованием стандартной кривой. Люцифераза эффективности является экспериментальной Люцифераза копий, деленное на теоретические Люцифераза копий для каждого образца, умноженное на 100 (см. шаг 8 протокола). Люцифераза относительной эффективности -Люцифераза эффективность каждого образца, деленное на ссылку состояние (поток + Ctlsi) в пределах каждого эксперимента. (B) эти панели показывают нормализации экспрессии генов в набор образца касательное напряжение эксперименты с использованием обоих Справочник эндогенных и экзогенных генов. Результаты являются от обратной транскриптазы количественного PCR (RT-ПЦР). Нокдаун экспрессии мРНК KLF2 показана при наличии ламинарного потока с касательное напряжение 1 ПА для 24 h. FC = изменение раза; CycA = циклофилина А, используется в качестве ссылки на эндогенных РНК; Люк = Люцифераза, используется в качестве ссылки на экзогенные РНК. Данные, адаптированный человек и др. 5. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Высота камеры (мкм, мкм) |
Ширина камеры (сантиметров; см.) |
Расход (мл/мин) для 1 ПА касательное напряжение | Вязкость (centipoise; cP) |
| 303.80 | 1.90 | 19.48 | 0.90 |
| 326.10 | 1.90 | 22.45 | 0.90 |
| 344.84 | 1.90 | 25.10 | 0.90 |
| 319.06 | 1.90 | 21.49 | 0.90 |
Таблица 1: Камеры высот и примеры скорости потока для различных камер потока для достижения касательное напряжение 1 ПА
| J полотна |
| Пинцет |
| Водохранилище бутылка и крышка |
| Увлажнитель и шапочка |
| Цикл потока |
| 1/16" мужской" Луер "x 3 |
| 1/16" женского" Луер "x 3 |
| 1/8" мужской" Луер "x 2 |
| 1/8" женского" Луер "x 4 |
| 3/16" мужчины адаптер x 2 |
| 14 Л/С жесткие трубки (2 дюйма) x 1 |
| 14 Л/С мягкой трубки (5 дюймов) x 2 |
| 16 Л/С мягкой трубки (3 дюйма) x 2 |
| 25 Л/С мягкой трубки (3 дюйма) x 2 |
| 13 Л/С жесткие трубки (10 дюймов) x 1 |
| Палата потока |
| 1/8" мужской" Луер "x 2 |
| 1/8" женского" Луер "x 2 |
| 16 Л/С мягкой трубки (3 дюйма) x 3 |
| Верхней и нижней плиты |
| Винты |
Таблица 2: Детали для газобетона в шаге 6.2 протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Касательное напряжение является физиологическое состояние, который модулирует функции эндотелия, в частности, воздействуя на стационарном ген выражение2,5. Модели регулирования генов в различных условиях касательное напряжение будет способствовать более глубокому пониманию функции эндотелия. Этот прагматичный процесс включает цепь потока, используя камеру потока параллельной пластине, адаптированный Лейн et al. 9 и представляет поток ламинарный, не ударные. Общая установка была разработана для облегчения экспериментов, которые требуют несколько камер потока и свести к минимуму экспериментальной изменчивости в этот параметр.
Ассамблея цепь потока является одним из основных компонентов этого процесса и адаптированный Лейн et al. 9. несколько адаптаций этой Ассамблеи и протокола были сделаны, чтобы отразить различия в экспериментальных систем. Большой блок с подогревом, пляж, является адаптация, что облегчает одновременное эксплуатация и мониторинг нескольких цепей потока в пределах той же среды. Эта система успешно используется для применения касательное напряжение в эндотелиальных клеток для различных периодов времени, от 1 h до 7 дней и на нескольких уровнях касательное напряжение (например, 1.0, 1.5 и 2.0 Па). Эта система также используется для исследования нокдаун гена для оценки функции потока отзывчивым эндотелиальной гена в параметре касательное напряжение (рис. 4)5. Существует значительная изменчивость между насосов и головки насоса, который может также меняться с течением времени из-за износа. Чтобы учесть эти различия, мы используем расходомер расположен проксимальнее зале поток непрерывно контролировать скорость потока. Различные размеры труб и Люрс используются обеспечить плотное прилегание для каждого компонента и для предотвращения любой утечки во время экспериментов. Мы подсчет клеток и посеяна приблизительно 1 000 000 ячеек на стеклянное скольжение, прикапывают, а затем пусть клетки инкубации при 37 ° C 15 мин для повышения эффективности соблюдения. По сравнению с эндотелиальной прогениторных клеток, которые могут быть посеяны на короткое время до применения касательное напряжение9, мы семян эндотелиальных клеток человека для по крайней мере за 24 часа до применения касательное напряжение. Короткие сроки может привести к выбить клеток во время поток, или разрывными слоем эндотелиальных клеток, даже с соответствующей плотности посева. Мы подчеркиваем инспекции слайды для вырожденная монослоя эндотелиальных клеток как до, так и после приложения напряжения сдвига. Мы находим, что слайды, покрытые фибронектин, естественный внеклеточного матрикса компонент18, поддерживать эндотелиальной монослоя более последовательно по сравнению с стороны покрытием с желатином (денатурированный фибриллярного коллагена типа). Наконец демпферы поток в этом протоколе оптимизированы для использования средствами массовой информации, по сравнению с 190 мл средств массовой информации для других производителей по 30 мл.
Несколько шагов в Ассамблее цепь потока требует дополнительного ухода. Перед применением касательное напряжение должны устанавливаться даже монослоя эндотелиальных клеток. Важно, чтобы клетки семян на стакан слайд каплям, чтобы увеличить количество ячеек, которые придерживаются слайд и, таким образом, общий охват слайд. Время ожидания между клеток посева и добавление дополнительных средств массовой информации к слайду обычно улучшает посева эффективность как она обеспечивает достаточное время для клетки, чтобы присоединиться к слайду, вместо того, чтобы быть смыты в лоток нескольких слайдов. Визуально осмотрите клетки до, во время и после приложения напряжения сдвига. Микроскопом могут быть размещены на пляже для этой цели. Датчик потока должен быть присоединен в правильной ориентации и скорость потока целевого объекта должны быть проверены для каждой камеры отдельный поток. Система цикл потока следует увлажненную без камеры для обеспечения утечки средств массовой информации или другие проблемы, такие как наращивание давления, чтобы избежать нарушается клетки во время реальных экспериментов. Проверить и устранить пузыри в системе. При тестировании потока цикла системы, убедитесь, что все запорные краны открыты перед включением Перистальтический насос позволяет непрерывно, однонаправленный поток. Убедитесь, что все запорные краны закрыты до подключения камеры потока к петле и полностью открыт до перезапуска насоса.
Мы находим, что ген внешних ссылок является полезным в различных сценариях. Эндотелиальные клетки СМИ часто содержит гепарина, который является ингибитором ПЦР17. Хотя некоторые протоколы извлечения РНК включать шаги для удаления гепарина, следовых количествах может вызвать различия в эффективности ПЦР пробы. Мощным процедуры также могут исключать выявление эндогенного ссылка гена, что количественно стабильной. Наша лаборатория создала эффективный протокол для синтеза РНК 5'-максимум и поли A-белохвост Люцифераза для использования в качестве внешних ссылок РНК. Эта стратегия оказалась эффективным подходом по сравнению с покупкой коммерчески доступных РНК. В ходе подготовки внешних ссылок РНК важно, чтобы аликвота РНК в одноразовых аликвоты, чтобы избежать нескольких циклов замораживания оттаивания. Тщательное перемешивание и точное дозирование критически важны для поддержания согласованности между аликвота. Типичные эксперименты показывают эффективность Люцифераза в диапазоне 5% ± 2,5%, но может варьироваться от 1% - 10%. Это разумно исправить результаты RT-ПЦР для эффективности внешних ссылок РНК и эндогенных ссылку (домоустройство) гена.
Для экспериментов, которые мы проводим Светлячок Люцифераза последовательности используются не млекопитающих Спайк в в качестве ссылки РНК у млекопитающих моделей. В экспериментах, где Светлячок Люцифераза выражается в клетках это не будет гена соответствующую ссылку. Могут использоваться другие вегетационных ссылку генов, включая Caenorhabditis elegans Мирна чел мир-3919 и рибулоза Бисфосфат carboxylase завод РНК20.
Эта схема потока модели 2-D монослоя эндотелиальных клеток, выращиваемых на культуре ткани пластика или стекла, который является достаточно жесткой. Матрицы жесткости могут влиять эндотелиальной ответ жидкости касательное напряжение21. Эта модель система использует относительно высокие кислорода концентрация подобне к артериальной чем концентрации кислорода венозной. Эта модель тесно напоминает прямые сегменты более крупных судов в закрытой сердечно-сосудистой системы и обеспечивает относительно однородную среду для эндотелиальных клеток на слайде. Другие конкретные условия в 3-D структуры, например бифуркаций или искривлений судов, не представлены с этой моделью. Другие системы могут моделировать другие шаблоны потока, в том числе в изогнутые регионах сосудистую, но дают меньшее количество клеток, чем система, описанная в настоящем Протоколе. Аналогичным образом другие сборки может быть более подходящим, если требуются > 1 х 106 клеток, или если требуется анализ одной ячейки. Наше текущее приложение модели не пульсирующего ламинарного потока. Тем не менее эта модель может использоваться для создания других форматов, включая ударные или колебательные волновые формы, с консистенцией, как непрерывный мониторинг скорости потока.
В целом этот прагматичный процесс обеспечивает систему для одновременного применения касательное напряжение несколько камер потока с контроль расхода. Материалы и процедуры на протяжении всего этого процесса предназначены для сведения к минимуму экспериментальных изменчивость между образцами и условий. Этот рабочий процесс успешно используется для экспериментов RNAi в параметре ламинарного потока и может также использоваться для любых экспериментов, требующих несколько условий с ламинарным касательное напряжение, или нескольких величин ламинарные касательное напряжение или моменты времени, в том числе альтернативных форматов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана КНИИЗ СС 142307 абстрагироваться H.S.J.M. является получателем канадский институтов из исследований учебные программы в области здравоохранения в регенеративной медицине стипендий. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. и M.K.D. являются получателями королевы Елизаветы II Магистратура стипендии в области науки и техники.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Aird, W. C.
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
- Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
- Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
- Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
- Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
- Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
- Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
- Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
- Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
