Summary
本文介绍了流体剪切应力作用下内皮细胞培养和基因表达分析的工作流程。包括一个物理安排, 可同时在受控环境中同时外壳和监测多个流室, 并使用外源参考 RNA 进行定量 PCR。
Abstract
我们描述了一个工作流程, 用于分析受稳定层流流的内皮细胞的基因表达, 使用多个监控的平行板流室。内皮细胞形成血管内细胞衬里, 长期暴露于血流的摩擦力, 称为剪切应力。在生理条件下, 内皮细胞在不同的剪切应力条件下发挥作用。因此, 在体外模型中应用剪切应力条件可以更深入地了解体内的内皮反应。平行板流室以前由车道等出版。9是适应研究内皮基因调控在存在和缺乏稳定 (非脉动) 层流。此处介绍的层流流设置的关键调整包括一个大的、专用的环境来容纳并发流电路、实时监控流速和包含外源参考 RNA 以实现标准化定量的实时 PCR 数据。为了评估多重处理/条件与应用的剪切应力, 多流电路和泵在同一加热和加湿孵化器中同时使用。在整个实验过程中, 实时测量每个流量回路的流速, 以实现剪切应力条件的标准化。由于这些实验有多个条件, 我们还使用在 rna 提取时被刺入的外源参考 rna, 用于 rna 提取和第一链 cDNA 合成效率的正常化。这些步骤可将样本之间的变异性降至最低。该策略在我们的管道中使用平行板流室进行了剪切应力实验的基因表达分析, 但该策略的一些部分, 如外源参考 RNA 尖峰, 可以很容易且经济有效地用于其他应用程序。
Introduction
血管内皮细胞形成的血管内细胞衬里在封闭心血管系统的较高物种。它们形成血液和组织之间的接口, 并具有管腔和 abluminal 表面的特征。内皮是一个多样化的, 活跃的和适应的系统, 调节血液流动, 养分的贩运, 免疫力和新血管的生长1。在体内, 内皮细胞通常存在于暴露于循环摩擦力的环境中, 剪切应力2。剪切应力是内皮细胞基因表达3的重要调节因子, 内皮细胞试图在给定范围内保持剪切应力2,4。内皮细胞在缺乏剪切应力5的情况下显示血管生成模式, 可改善组织灌注。扰动流和改变的剪切应力的区域模式与炎症基因6的表达和动脉粥样硬化7,8的发展有关。因此, 包括剪切应力的模型是了解内皮基因调控的主要组成部分。
本文介绍了一种在剪切应力作用下研究血管内皮细胞基因调控的方法。该系统使用非脉动流和模拟流体剪切应力水平和氧浓度, 模型条件的动脉内皮细胞。本协议包括使用 RNA 干扰 (RNAi) 进行基因敲除的方法的详细信息、使用平行板流仪进行剪切应力的设置以及在分析前对外源参考 RNA 进行尖峰的方法。逆转录定量聚合酶链反应 (rt-pcr)。该管道用于研究内皮细胞在层流剪切应力存在和无时的基因调控, 包括由车道等描述的平行板流动装置的适应。9. 这种特殊的设置旨在促进同时评估多种实验条件, 从而直接比较剪切应力条件, 以及 RNA 分析的规范化。采用控制湿度的大型加热装置, 可使多个独立的流室和泵同时运行, 并实时监控每个流室总成的流速。这种设置用于在层流/剪切应力的设置中使用 RNAi 进行基因敲除, 但该协议的各个方面可用于 RNA 表达的任何评估。
在内皮细胞中应用剪切应力的常用方法包括微流控系统10、锥板粘度计11和平行板流室12。来自不同制造商的微流控系统在研究多种细胞和组织类型的力学生物学和路狸以及各种生物物理刺激方面都非常有用。对于内皮细胞, 它们被用来研究内皮细胞的隔离, 以及内皮细胞的相互作用和免疫或肿瘤细胞的贩运10。然而, 这些系统不太适合回收大量的细胞9。圆锥和平板粘度计和平行板流室允许在汇合单分子12中回收大量细胞。这些系统可以产生一系列的剪切力和模式12。平行板流腔总成9具有可通过玻璃窗口进行实时成像, 在任何时间点评估细胞形态学的优点。此外, 灌流液可在无菌条件下收集。对于此处介绍的系统, 还可以实时监控流量, 并在多室设置中进行监测, 这有利于维护腔室之间的剪切条件。
对于有代表性的实验, 使用了代表大血管内皮细胞类型的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC), 而我们使用的剪切应力条件 (1 pa) 反映动脉条件 (0.1-0.7 pa)。然而, 该协议可与其他内皮细胞类型一起使用, 并可根据实验问题调整剪切应力条件。例如, 对人体内皮细胞进行模型静脉循环的评估需要较低的剪切应力水平 (1-6 pa), 并研究模型微血管循环利用了 0.4-1.2 Pa13的剪切应力水平,14. 此外, 在同一血管6内的内皮细胞之间, 剪切应力也可能发生变化。在当前设置中, 使用单个监控系统, 可同时监控四个独立的流量环路。对于需要更多流量环路的实验室, 在专用环境中有空间用于额外的监控系统。
在剪切应力的设定中, 采用 rt-pcr 法进行基因表达的绝对定量。目标基因的相对表达通常用于比较不同条件下的 RNA 表达。某些 RNA 种类可以存在于非常低的数量或缺乏, 从而复杂化相对测量。例如, 内皮细胞中的长非编码 rna 可以在相对较低的每个细胞5的拷贝数上发挥有效的作用。此外, 在引物效率上的差异可能导致不准确的解释利用三角洲-三角洲周期阈值 (Ct) 方法来分析数据。为了解决这一问题, 我们通过使用已知数量的质粒 DNA 生成标准曲线来进行绝对定量。此外, 互补 DNA (cDNA) 合成是一个低效的过程, 而 cDNA 效率的差异可以解释不同条件之间的 RNA 表达和样本15之间的差异。剪切应力和/或转染试剂的应用会影响细胞增殖、凋亡和活性, 或者添加可能干扰 RNA 分离和/或 cDNA 合成的成分。为了考虑 rna 分离和 cDNA 合成的偏倚的可能性, 我们使用实验室合成的尖峰 rna 控制, 在 rna 提取时添加, 并通过rt-pcr 对每个 cDNA 合成进行测量。这不仅可以调整 RNA 提取和 cDNA 合成的技术差异, 还可以在已知细胞计数时计算每个细胞的绝对数量。
此系统使用其他步骤来保持相似性或说明条件之间的技术差异。我们特别强调这些步骤, 因为这些实验的复杂性质, 涉及多个物理设置和实验条件, 可以导致实验的变异性。
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Protocol
1. 外源参考 RNA 的制备
注: 选择不存在于感兴趣的物种或模型中的外源参考 RNA。对于哺乳动物系统, 可以使用萤火虫荧光素酶 RNA。
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外源参考 RNA 质粒的线性化
- 在预期 rna 提取前至少48小时准备外源参考 rna。获取或制造所选择的外源参考 RNA 的 cdna 克隆, 如萤火虫荧光素酶 cdna 克隆, 适合于体外转录的质粒载体 (见材料表)。
- 执行限制性酶 (RE) 消化1µg 的全长质粒 (萤火虫荧光素酶质粒是 pSP-卢克 + 这有 4100 bp) 使用单刀 RE (XhoI) 在1.5 毫升微量离心管。在外源参考 RNA 序列的 3 ' 末端, 选择一个在 5 ' 悬伸或钝端上的单刀 (切割质粒仅为 1x) 的 RE。对于一个典型的制备, 执行七质粒线性化反应 (步骤 1.1.4-1.1.7) 并行生成足够的 RNA 浓度和数量, 以完成一组实验或一个项目。
- 使用分光光度法或 spectrofluorometry 测量质粒浓度。
- 在每管中准备 RE 混合物: 添加4µL 的XhoI (2万个单位/毫升), 8 µL 的 re 缓冲液, x µL 的质粒 (1 µg), 足够的 H2O 达到80µL 的总溶液。
- 在37摄氏度下孵育2小时的 RE 混合物。根据制造商的协议使用 RE, 因为任何修改都可能导致目标 DNA 的恒星活动或非特定的裂解。热停用反应混合物20分钟, 在65摄氏度。
- 在每管中终止含乙醇沉淀的 RE 文摘。对 RE 混合, 直接添加4µL 0.5 m EDTA ph 8.0, 8 µL 3 m 醋酸钠 ph 5.2 和184µL 的100% 乙醇。混合均匀, 在-20 摄氏度冷冻混合物30分钟。
- 在 16100 x g的相对离心力 (RCF) 下, 在4摄氏度下旋转混合物20分钟。
- 用细尖取出上清液, 不接触颗粒。空气干燥的颗粒5分钟, 并重悬在6µL H2O (加热到37摄氏度) 通过移液向上和向下 5x-10x。
- 通过在含有溴化乙锭 (EtBr) 的2% 琼脂糖凝胶上运行消化产物, 并使用 1 kb + 阶梯、超螺旋阶梯、切割和未切割质粒, 确认荧光素酶质粒的线形。检查凝胶并进行体外转录如果切割质粒的车道显示单个波段在 ~ 4 kb (未切割质粒将有三个波段;图 1)。
注意: EtBr 是致癌的。在化学烟雾罩中工作。
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在外源性参考 RNA 质粒的体外转录
- 对于每管消化质粒产品, 使用体外转录法进行体外转录 (见材料表)。按照制造商的说明使用适当的噬菌体 RNA 聚合酶。如果 cDNA 合成的方法需要一个聚 (a) 尾, 或者其他应用需要一个聚 (a) 尾, 请选择包括聚 (a) 尾加法的体外转录方法 (见材料表)。
- 在纯化前, 将所有体外转录产物组合成单个1.5 毫升聚丙烯管。
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宾石珍从体外转录反应中提取 RNA 的系统工程
- 体外转录清除试剂盒纯化 体外转录产物 (见材料表)。请遵循制造商的协议。
- 利用分光光度法测定 260 nm 的吸光度, 评估 RNA 浓度。
注意: RNA 浓度是使用啤酒-兰伯特定律计算出来的。这表明核酸 (吸收光强于 260 nm) 的吸光度与浓度成正比。1.0 的吸光度等于单链 RNA 的40µg/毫升。
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将 RNA 将到 PCR 管中以供实验使用
- 确保 RNA 浓度为1µg/µL。
- 如果 RNA 浓度为 > 1 µg/µL, 则将库存稀释至1µg/µL. 等分1µL 到 PCR 管中, 并将其存储在-80 摄氏度。
- 如果 RNA 浓度为 < 1 µg/µL, 则可根据制造商的协议, 使用 5 M 醋酸铵 (在试剂盒中提供) 进行额外降水。如果 RNA 浓度仍然 < 1 µg/µL, 继续将1µL 到 PCR 管。
- 确保 RNA 浓度为1µg/µL。
2. 滑动涂层
注意: 在预期的细胞播种之前, 应执行步骤 2.1-2.10. 24-48 小时。
- 将烤箱预热至250摄氏度。
- 使用无菌手套, 用铝箔包裹每张2x 玻片。避免直接接触幻灯片的表面。
- 烘烤在烤箱的幻灯片1小时在250摄氏度, 并允许幻灯片冷却到室温。
注意: 此步骤对于销毁任何污染内毒素非常重要。 - 当滑块冷却时, 用蒸馏水制作1毫克/毫升的纤维连接蛋白溶液, 在37摄氏度下孵育30分钟以溶解。使 100-µL 等份。搁置等份立即使用和冻结剩余的等份供将来使用。
- 在将玻璃滑入生物安全柜之前, 拆开铝箔的外层覆盖物。在生物安全柜中执行步骤 2.6-2.7 和2.9。
- 将玻璃滑块放入无菌长方形4孔细胞培养皿中。
- 用蒸馏水稀释纤维连接蛋白库存溶液1:100。将每张幻灯片涂上1毫升稀释纤维连接蛋白, 用移液器掉落。确保整个幻灯片都覆盖。
- 在37摄氏度的组织培养孵化器中孵育 24-48 h 的玻片。
- 孵化后, 通过倾斜4孔细胞培养皿吸去纤维连接蛋白。避免直接与吸气手接触幻灯片。
3. 玻璃滑梯上的细胞播种
- 将人类内皮细胞在早期通道 (2-5) 和种子 ~ 1.0 x 106细胞到每一个纤维连接蛋白涂层的玻片上, 用1毫升的培养基 (1.0 x 106细胞/毫升介质) 进行计数。如果没有其他处理方法, 则在预期的层流流应用前24小时对细胞进行种子培养。
注: 这些数字用作24小时流量实验的指南。- 调整播种密度, 在细胞采集和 RNA 提取时实现细胞的汇合单层。
- 让细胞在37摄氏度时粘附在幻灯片上15分钟。
- 在细胞培养皿的每个孔中添加3毫升培养基, 以覆盖滑块, 并在37摄氏度孵育细胞, 24 h, 5% CO2。
4. 小干扰 RNA (siRNA) 转染
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用于 siRNA 转染和流动实验的玻璃玻片上细胞的制备
- 按照步骤 2 (滑动涂层) 和 3 (在玻片上的细胞播种) 中的协议, 为流体实验准备玻璃滑块和涂层。
- 在 siRNA 处理前24小时的种子细胞 (在层流流动的应用前48小时)。
- 在无抗生素培养基中以75万至 1 x 106细胞为单位, 在第二天实现 85%-95% 汇流。
注意: 此协议中使用 HUVEC。
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基于 siRNA 脂质的转染试剂配合物的制备 (每张幻灯片)
- 为感兴趣的基因设计定制 siRNAs 或订单预制 siRNAs。
注: 在生物安全柜中执行以下步骤。 - 添加6µL siRNA (20 µM 库存) 在414µL 减少血清培养基 (见材料表), 并通过移液轻轻混合。
- 稀释49.5 µL 温和混合脂基转染试剂 (见材料表) 在130.5 µL 减少血清培养基。
- 轻轻拌匀, 在室温下孵育5分钟。
- 结合稀释的 siRNAs 和脂基转染试剂, 轻轻混合, 在室温下孵育15分钟。轻轻混合, 避免破坏脂质基转染试剂复合物。
注意: 该解决方案可能会出现多云作为复合形式。 - 当配合物形成, 去除生长培养基和洗涤细胞1x 与减少血清培养基。
- 每张幻灯片添加2.4 毫升的减少血清培养基。
- 添加600µL 温和混合的 siRNA 脂基转染试剂配合物的每个板块, 并摇动板来回混合。确保 siRNA 的最终浓度为 40 nM。确保幻灯片完全覆盖。
- 在37摄氏度孵育4小时的细胞。
- 添加1毫升无抗生素的内皮细胞生长培养基含有3x 的正常浓度的胎儿牛血清 (FBS) 不去除转染混合物。
- 孵育细胞在37摄氏度, 直到准备使用。
- 为感兴趣的基因设计定制 siRNAs 或订单预制 siRNAs。
5. 根据所需的剪切应力计算流速9
- 根据所需的剪切应力计算流速, 按照以下公式:
这里
Q是流速在毫升/分钟;
τ是达因/cm2 (1 Pa = 10 达因/厘米2) 所需的剪切应力;
w是平行板流室的宽度 (cm);
h是平行板流室的高度 (cm);
µ是在 cP (g/cm·s) 介质的粘度。
注: 此工作流程中的典型层流剪切应力实验 (非脉动) 在τ = 1 Pa (10 达因/厘米2) 进行。µ可以使用粘度计 (如圆锥和平板粘度计) 进行测量, 并根据包括血清和其他葡聚糖9的培养基的含量而变化。 - 要实现特定的τ (剪切应力), 请调整流速和/或粘度。在较高流速下, 贴壁细胞可能与幻灯片分离。表 1显示了典型流室的采样流速。
6. 为监测系统和多个平行板流室设置专用环境 (图 2)
- 使用大型加热单元/孵化器的多个货架, 内部电力接入, 玻璃门-称为海滩 (内置环境, 可调 CO2和热)-同时容纳多个流动室的实验,需要两个或多个处理或输出 (即DNA、RNA 和蛋白质) 之间的剪切应力和直接比较。
注意: 海滩允许频繁监控流量回路, 包括流速, 而不会频繁地破坏环境。 - 确保为实验提供足够的 co2 , 并且 co2监视器正常工作。确保水托盘适当地填充, 这样就会有加湿空气。
7. 平行板流动装置的设置
注: 对于平行板的制造, 请参阅车道等。9。
- 如表 2所示, 为每个平行板流室设置热压罐的流室板、储层、阻尼器、油管和鲁尔接头。
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流循环组件的设置 (图 3)。
- 将无菌毛巾放入生物安全柜中。在生物安全柜中, 首先在没有平行板流室的情况下组装流量回路系统。
- 连接储罐的油管总成:
- 将 #14 硬管插入一个孔和两个 #14 软管进入流储罐盖的其他两个孔中。确保其中一个软管触及水库底部作为流出管。
- 在 #14 硬管末端放置一个 1/16 "男鲁尔, 并将无菌过滤器作为通风口安装。
- 在 #14 软流入管的末端放置一个 1/16 "雌性鲁尔, 从水库中出来, 并附上4路旋塞阀。
注意: 对于基因表达分析或其他不需要收集 perfusates 的研究, 可以使用2路活塞代替4路活塞。 - 在 #14 软流出管的末端放置一个 1/16 "男鲁尔, 来自水库。
- 将储层流出管连接到泵油管: 在 #13 硬管 (泵管) 的两端放置一个 1/16 "母鲁尔。将 #14 软流出管从储层连接到 #13 硬管, 并将 1/16 "公、母鲁尔接头连接在一起。
- 连接泵油管与 ' 阻尼器桥 ' 油管: 放置一个 1/8 "男性鲁尔和 1/8" 女性鲁尔在 #16 软管的两端。连接 1/16 "的 #13 硬管 (在流出端的泵油管) 与 1/8" 的 #16 软管的男性鲁尔。
- 用于流阻尼器的装配管: 在 #25 软管的一端放置一个 3/16 "公鲁尔, 并对流阻尼器的另一侧重复此操作。将 #25 软管的自由端连接到流阻尼器的每一侧。
- 将 "阻尼器桥" 油管与管路阻尼器连接: 通过 "阻尼器桥" 的 #16 软管连接 #25 软管, 并使用来自 #16 "阻尼器桥" 侧的 1/8 "雌性鲁尔和已放置的 3/16" 男鲁尔从 #25 软阻尼器管侧。
- 组装 ' 室桥 ' 管:
- 在 #16 软管 (' 腔桥 ' 管) 的两端放置一个 1/8 "女鲁尔和 1/8" 男鲁尔。
- 连接 1/8 "女鲁尔的 ' 商会桥 ' 与 3/16" 男性鲁尔在 #25 软管从流阻尼器的自由端。
- 在 "腔桥" 油管的 1/8 "男鲁尔 (自由端), 放置一个4路旋塞阀。
- 将4路旋塞阀从 "硐室桥" 的自由端连接到4路旋塞阀从水库流入软油管 (从步骤 7.2.2.3)。关闭活塞。
- 将介质添加到储层和阻尼器。对于 48-小时接触剪切应力, 增加35毫升的介质到水库和25毫升到阻尼器。根据流动实验的持续时间和播种的细胞数量调整介质的体积。
- 将组装好的流量回路系统带到海滩的水泵上。将 #13 硬管 (泵管) 放入泵头并将其固定。打开活塞。
- 打开泵, 慢慢增加泵的速度。让媒体通过循环系统循环。检查是否有泄漏或堵塞 (例如, 压力积聚)。确保介质回流至储层。
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流室总成的设置
- 在 #16 软管的一端放置一个 1/8 "雌性鲁尔, 并附上4路旋塞阀。将管的自由端连接到顶板的右侧(流入侧)。
- 在 #16 软管的一端放置一个 1/8 "男性鲁尔, 并附上4路旋塞阀。将管的自由端连接到顶板的左侧(流出侧)。
- 在 #16 软管 (气泡疏水阀管) 的两端放置一个 1/8 "男鲁尔和 1/8" 女鲁尔。通过1/8 "男性鲁尔连接管道到气泡陷阱。通过1/8 "女鲁尔, 将4路旋塞阀连接到油管的另一端。
- 使用无菌镊子将细胞种子玻璃滑块从4孔细胞培养皿转移到底板的凹槽上。确保玻璃滑块的细胞种子面朝上。
- 使用10毫升注射器, 在板周围的红色垫片线内的底部板上添加10毫升温暖的介质。允许媒体流经幻灯片并覆盖单元格。避免直接在幻灯片上添加媒体。
- 将顶板轻轻地放在底板上, 从一侧向另一边对齐。避免空气气泡的引入。把盘子紧紧地拧在一起。
- 通过打开板的右侧 (流入) 上的旋塞阀, 用30毫升注射器轻轻冲洗20毫升温暖的介质, 从气泡疏水阀中去除气泡。确保板的左侧 (流出) 旋塞阀关闭, 并且介质流经气泡陷印旋塞阀 (打开)。丢弃已刷新的媒体。
- 关闭气泡疏水阀上的旋塞阀, 打开腔室左侧 (流出) 的旋塞阀。将腔室的左侧 (流出) 提升为45°角, 然后用30毫升的注射器从腔体右侧 (流入) 中轻轻冲洗20毫升的热介质, 以去除腔室中的气泡。气泡可以通过窗口进行可视化。丢弃已刷新的媒体。
- 关闭活塞的两侧和盖子。显微镜检查细胞。
- 使用以前组装的环路系统将分室输送到海滩。
- 缓慢降低泵速度并暂停泵。关闭流量环路系统上的活塞, 防止泄漏。
- 通过活塞将腔室和环路系统连接在一起。打开所有的活塞。
- 缓慢增加泵速度, 检查安装是否有泄漏或堵塞。确保介质在一个方向循环, 并返回到储层。
- 将流量传感器放置在室的流入侧的 "腔桥" 油管上。确保传感器在流量方向上正确定向。
- 根据所需的剪切应力, 调整泵速度以获得先前计算的流速。
注: 流速可能因每个腔室的高度和宽度以及介质的粘度而异。 - 打开 co2罐, 实现 5% co2 , 并在海滩内放置一个水盘。
8. 采集细胞并从流室提取 RNA
- 一旦所需的时间段的流量完成, 慢慢地把蠕动泵的速度降低到 0, 关掉电源。快速关闭所有打开的活塞, 并卸下腔室和连接的油管, 每个端都有一个旋塞阀。
- 将分室带到干净的台式, 轻轻拧松所有螺钉以卸下顶板。使用针鼻镊子, 从底部板上取下玻璃滑块, 放入100毫米直径的组织培养皿中。
- 用10毫升冷磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗幻灯片, 并检查显微镜下的细胞, 以确认细胞在流动方向上的附着和对准。
- 从盘子中吸出 PBS 并将滑块转移到干净的100毫米直径的盘子中。从 RNA 萃取试剂盒中添加350µL 裂解缓冲液 (见材料表), 其中含有1/100 的β巯基乙醇。
注意: 在化学烟雾罩中添加β-巯基乙醇。 - 使用聚乙烯叶片电池刮刀刮掉滑块上的细胞。倾斜组织培养皿, 使液体在底部池, 并用镊子取下玻璃滑块。将细胞裂解液移入1.5 毫升管中, 并保持在冰上。
- 稀释股票外源参考 rna (荧光素酶 rna) 到 0.0025 ng/µL 通过序列稀释之前添加到样品。例如, 如果库存浓度为1µg/µL, 则需要稀释 1/40万才能达到 0.0025 ng/µL. 将稀释的荧光素酶 RNA 的10µL 添加到细胞裂解物的每个样本中, 用于下游 RNA 的分离和分析。
- 按照制造商的说明继续执行 RNA 提取协议, 或将裂解液冻结在-80 摄氏度, 直到能够进行萃取。
9. RNA 提取和 cDNA 合成效率的计算
注: 通过比较理论产量和实验产量, 计算 rt-pcr 后的荧光素酶效率。
- 测定荧光素酶 RNA 的理论产量。
- 确定每个样本添加的荧光素酶拷贝总量。(添加 0.025 ng/样本 = 2.73 x 107复制荧光素酶 rna 每样本在 RNA 提取之前。
- 使用每核苷酸330克/摩尔的平均分子质量计算荧光素酶 rna 的分子量, 并乘以萤火虫荧光素酶 rna 的长度, 1652 个核苷酸。
- 在通过分子量提取 rna 之前, 将每个样本的荧光素酶 rna 添加量 (0.025 ng) 除以摩尔量。然后, 乘以阿佛加德罗常数的数字, 以生成每个样本添加的副本。
- 使用方程式计算每个 RT-qPCR 反应的荧光素酶拷贝的理论屈服:
- 使用荧光素酶质粒为 rt-pcr 生成标准曲线, 计算每种 rt-pcr 反应的荧光素酶拷贝的实验产量。
- 使用方程式计算荧光素酶的效率 (%):
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Representative Results
通过在琼脂糖凝胶上运行消化产物, 证实了荧光素酶质粒的成功线性化 (图 1)。使用 DNA 梯子和未切割质粒进行比较, 确定线性化产品的尺寸。
我们已经适应了平行板流室设置从车道等。9用于需要多个条件/处理剪切应力或多重剪应力条件的实验。我们使用一个专用的环境, 海滩, 可以房子多, 完全组装的流量电路, 所有有监控的流量 (图 2)。流量仅在平行板组件的上游进行监测 (图 3)。可通过玻璃门直接监测流量电路和速率, 而不会引起海滩内温度、湿度或气体含量的波动。
制造过程可能导致腔室高度的细微变化。因此, 必须计算每个分室的流速以达到相同的剪应力 (表 1)。理论上, 相同高度的腔室可以使用相同的流速来达到相同的剪切应力, 并且可以串联使用。用内皮细胞的典型实验, 采用 0-1.5 宾夕法尼亚州层流剪切应力 1 Pa 的剪切应力对动脉内皮剪切应力模型进行建模。泵头设置和泵头之间的变化也可能随着时间的推移而使用。使用流量计可以解释这些差异。
使用剪切应力的实验通常涉及多重剪应力条件、处理条件和时间点。在可能的情况下, 我们使用内源参考 RNA 来解释实验设置中的任何变化规律。对于某些实验, 寻找具有定量稳定性的内源性参考 RNA 是不可行的16。此外, 样本间内源参考基因的定量稳定性或不稳定性可归因于刺激因素对细胞表达水平的影响, 或 RNA 提取或反转转录效率的变化。为了解释这些低效, 并且在一个内源参考基因没有定量稳定的设置中, 我们使用了一个尖刺的外源参考基因。对于在哺乳动物内皮细胞中加入层流剪切应力的实验, 我们使用萤火虫荧光素酶 rna 作为外源 rna 尖刺 (图 4A)。
图 4显示了使用 siRNA 评估 Krüppel 样因子 2 (KLF2) 功能损失的剪切应力实验中的 rt-pcr 实验数据。KLF2 是一种转录因子, 上调由内皮细胞的层流流动和内皮基因在层流2中表达的主要转录介质。
图 4A显示了荧光素酶在三个单独实验中的效率, 每种都使用两个流腔。荧光素酶的效率可以类似于实验样品 (实验 1) 或显示一些变异性 (实验2和 3) (图 4A)。这些结果在只有微小的绝对变化的实验系统中特别有价值。在实验治疗可能干扰逆转录或 PCR17的效率的实验中, 使用外源参考基因可能特别重要。图 4A所示的结果是典型的。荧光素酶的效率为 5%, 表明在 rna 提取前添加到样品中的荧光素酶 rna 的 5% (即rna 的初始起始量) 被 rt-pcr 检测到。在单个实验中的样本或条件之间, 荧光素酶效率通常为±50%。如果荧光素酶效率的变异性为 > 50%, 并应包括对实验程序和条件的审查, 则应谨慎地解释结果。
图 4B显示了重复剪切应力实验中的 RT-qPCR 的典型实验结果, 每个都使用多个平行板流室。在每个实验中, KLF2 mRNA 表达式以三种方式规范化。第一个规范化使用内源引用 RNA, Cyclophilin A (CycA)。第二个规范化使用外源参考 RNA, 萤火虫荧光素酶 (Luc)。第三个规范化使用内源和外源参考 RNA。在图 4B所示的每个实验中, 所有三规范化方法 (对内源参考基因、外源参考基因和内源和外源参考基因的规范化) 产生相似的结果。如果规范化方法显著更改结果 (例如, 导致 > 50% 差异), 则应谨慎解释结果。当规范化方法之间存在相当大的变异性时, 应审查内源参考基因, 因为它可能是实验系统中的一个从属变量。同样, 应审查实验程序和条件。在图 4B中, 使用 siRNA 的 KLF2 敲出在三独立实验 (实验1、2和 3) 之间产生相似的击倒效率。我们在这些实验中使用了三种不同的生物样品, 在每个实验中使用两个同时运行的带剪切应力的流室 1 Pa。
图 1: 外源荧光素酶质粒线性化的琼脂糖凝胶图像.超螺旋和 1 kb + DNA 梯子被用作标记, 以确定在 kilobases (kb) 未切割和切割荧光素酶质粒大小。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 在专用环境 (海滩) 中的多个流量电路组件的原理图概述.这两种流量电路的流速都可以实时监控, 而不会干扰环境, 同时两个电路可同时运行。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 单个流量电路组件的原理图概述.使用的油管尺寸和鲁尔接头如下图所示。确保流量计朝向流向, 并放置在流室的上游。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 有代表性的结果从 KLF2 丧失功能实验的人内皮细胞暴露在剪切应力 (1 Pa) 24 h.(A) 此面板显示三个单独的流动实验中外源荧光素酶 RNA 的定量。荧光素酶的效率可以类似于实验样品 (实验 1) 或显示一些变异性 (实验2和 3)。荧光素酶 (绝对拷贝)是用标准曲线绝对定量检测逆转录酶定量 PCR (RT-qPCR) 的拷贝数。荧光素酶的效率是实验荧光素酶拷贝除以理论荧光素酶拷贝的每个样本乘以 100 (参见协议的步骤 8)。相对荧光素酶的效率是每个样本的荧光素酶效率除以参考条件 (流 + Ctlsi) 在每个实验。(B) 这些面板显示了一组使用内源和外源参考基因的样本剪切应力实验中基因表达的规范化。结果来源于逆转录酶定量 PCR (rt-pcr)。在 1 Pa 的剪切应力作用下, KLF2 mRNA 表达的击倒表现为 24 h. FC = 折变;CycA = cyclophilin A, 用作内源参考 RNA;卢克 = 荧光素酶, 用作外源参考 RNA。从人类等方面改编的数据。5.请点击这里查看这个数字的更大版本.
| 室高度 (微米; µm) |
腔室宽度 (厘米; 厘米) |
1 Pa 剪切应力的流速 (毫升/分钟) | 粘度 (厘泊; cP) |
| 303.80 | 1.90 | 19.48 | 0.90 |
| 326.10 | 1.90 | 22.45 | 0.90 |
| 344.84 | 1.90 | 25.10 | 0.90 |
| 319.06 | 1.90 | 21.49 | 0.90 |
表 1:燃烧室高度和各种流量室的流速示例, 以达到1宾夕法尼亚州的剪切应力
| J 布 |
| 镊子 |
| 储罐和瓶盖 |
| 阻尼器和瓶盖 |
| 流量回路 |
| 1/16 "男鲁尔 x 3 |
| 1/16 "母鲁尔 x 3 |
| 1/8 "男鲁尔 x 2 |
| 1/8 "母鲁尔 x 4 |
| 3/16 "公接头 x 2 |
| 14升/秒硬管 (2 英寸) x 1 |
| 14升/秒软管 (5 英寸) x 2 |
| 16升/秒软管 (3 英寸) x 2 |
| 25升/秒软管 (3 英寸) x 2 |
| 13升/秒硬管 (10 英寸) x 1 |
| 流室 |
| 1/8 "男鲁尔 x 2 |
| 1/8 "母鲁尔 x 2 |
| 16升/秒软管 (3 英寸) x 3 |
| 顶部和底部板 |
| 螺丝 |
表 2: 在议定书的步骤6.2 中要蒸压的零件。
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Discussion
剪切应力是调节内皮功能的生理条件, 部分通过影响稳态基因表达2,5。各种剪切应力条件下的基因调控模型将有助于更深入地了解内皮功能。这一实用的工作流程包括一个使用平行板流腔的流动电路, 它适合车道等。9表示层流, 非脉动流。总体设置旨在促进需要多个流室的实验, 并将此设置中的实验变异性降至最低。
流量电路组件是该工作流程的主要组成部分, 并根据车道等进行调整。9. 本大会和议定书的若干改编是为了反映实验系统的差异。一个大的加热单元, 海滩, 是一个适应, 有利于同时运行和监测在同一环境中的几个流电路。该系统已成功应用于不同时间段的内皮细胞的剪切应力, 从1小时到7天, 并在几个层次的剪切应力 (例如, 1.0, 1.5, 和 2.0 Pa)。该系统还用于基因敲除研究, 以评估流动反应性内皮基因在剪切应力设置中的作用 (图 4)5。泵和泵头之间存在相当大的差异, 由于正常磨损, 也可能随着时间的推移而改变。为了解释这些差异, 我们使用位于流室近端的流量传感器来持续监控流速。各种尺寸的油管和鲁尔接头用于确保每个部件的紧密配合, 并防止实验过程中出现泄漏。我们计数细胞和种子大约100万细胞每玻片滑动, 滴, 然后让细胞孵育37摄氏度15分钟, 以提高粘附效率。与内皮祖细胞相比, 在剪切应力9的应用前, 可在短时间内播种, 在剪切应力应用之前, 我们将人类内皮细胞培养为至少24小时。较短的持续时间可能导致细胞在流动过程中的撞出, 或不连续的内皮细胞层, 即使有适当的播种密度。我们强调在剪切应力应用之前和之后对血管内皮细胞的汇合层进行检查。我们发现, 涂有纤维连接蛋白的幻灯片, 天然细胞外基质成分18, 保持内皮单层更一致与涂明胶 (变性纤维 i 型胶原蛋白) 的两侧。最后, 本协议中的流减震器优化为使用30毫升的介质, 而其他制造商的介质比190毫升。
在流量电路组件中的几个步骤需要额外的照顾。在应用剪切应力之前, 应建立一层均匀的内皮细胞。重要的是, 种子细胞到玻璃滑滴, 以增加粘附在幻灯片的单元格的数量, 因此, 整体幻灯片覆盖。细胞播种和向幻灯片添加额外介质之间的等待时间通常会提高播种效率, 因为它为细胞提供了足够的时间来粘附在幻灯片上, 而不是被冲走到多张幻灯片托盘中。在剪切应力应用之前、期间和之后对细胞进行目视检查。为了达到这个目的, 可以将显微镜放在海滩上。流量传感器必须以正确的方向连接, 并且每个单独的流量室应检查目标流速。在实际实验过程中, 应在没有腔室的情况下灌流回路系统, 以确保没有介质泄漏或其他问题, 如压力积聚, 以避免扰动细胞。检查并消除系统中的气泡。在测试流量环路系统时, 确保活塞在开启蠕动泵之前都打开, 以允许不间断的单向流量。确保所有活塞在将流室连接到环路之前关闭, 并在重新启动泵之前完全打开。
我们发现, 添加外源参考基因有助于在各种情况下。内皮细胞培养基通常含有肝素, 是 PCR17的抑制剂。虽然一些 RNA 提取方案包含了去除肝素的步骤, 但微量含量可能会导致样品之间 PCR 效率的差异。有效的治疗也可能排除定量稳定的内源性参考基因的识别。我们的实验室已经创建了一个有效的协议, 合成 5 ' 上限和聚 A 尾荧光素酶 rna 作为外源参考 rna 使用。与购买商业可用的 RNA 相比, 这一策略已被证明是一种成本效益高的方法。在制备外源性参考 rna 过程中, 重要的是等分 rna 进入一次性等份, 避免多次冻融循环。彻底混合和精确移液是保持等分一致性的关键。典型的实验显示荧光素酶在5% ±2.5% 范围内的效率, 但可以从 1%-10%。对于外源参考 RNA 效率和内源性参考 (家政) 基因, 纠正 rt-pcr 结果是审慎的。
在我们进行的实验中, 萤火虫荧光素酶序列被用作哺乳动物模型中的非哺乳动物穗型参考 RNA。在实验中, 萤火虫荧光素酶在细胞中表达, 这不是一个合适的参考基因。其他物种特定的参考基因可以使用, 包括线虫线虫miRNA cel-miR-3919和该派别羧化酶植物 RNA20。
这种流动电路模型的2维单层内皮细胞生长在组织培养塑料或玻璃, 这是相当僵硬。基质刚度对流体剪切应力21的内皮反应有影响。这个模型系统使用相对较高的氧浓度更类似于动脉比静脉氧浓度。该模型与闭合心血管系统中较大血管的直线段相似, 为幻灯片上的内皮细胞提供了相对均匀的环境。3维结构中的其他特定条件 (如容器的分岔或曲率) 不以此模型表示。其他系统可以模拟其他流模式, 包括那些在血管的曲线区域, 但产生比本协议中描述的系统更少的单元格。同样, 如果需要 > 1 x 106单元格, 或者需要单细胞分析, 则其他程序集可能更合适。我们目前的应用模型非脉动层流。然而, 此模型可用于生成其他波形, 包括脉动或振荡波形, 具有一致性, 因为流速连续监测。
总的来说, 这种务实的工作流程提供了一个系统, 可同时应用剪切应力, 以监测流速的多个流室。整个工作流程中的材料和过程旨在最大限度地减少样品和条件之间的实验变异性。此工作流已成功用于在层流的设置中进行 RNAi 实验, 也可用于任何需要层流剪切应力的多个条件的实验, 或多个层流剪切应力大小和/或时间点, 包括可选波形。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了卫生研究院 MOP 142307 的支持 P.A.M. h.s.j. m 是加拿大卫生研究院再生医学研究培训项目的接受者。h.s.j. m、A.N.S.、K.H.K. 和方程都是伊丽莎白二世的科技研究生奖学金获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
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