Summary
Her præsenteres en arbejdsproces for kultur og gen expression analysen i endothelial celler under væske shear stress. Inkluderet er en fysisk arrangement for samtidig boliger og overvågning flere flow kamre i et kontrolleret miljø og brugen af en udefrakommende reference RNA til kvantitativ PCR.
Abstract
Vi beskriver en arbejdsgang til analyse af genekspression fra endotelceller underlagt en stabil laminar flow ved hjælp af flere overvågede parallel-plade flow kamre. Endotelceller danne indre cellulære foring af blodkar og kronisk er udsat for den friktion kraft af blodgennemstrømningen kaldet shear stress. Under fysiologiske tilstande, endotelceller funktion i forskellige shear stress betingelser. Anvendelse af shear stress betingelser i in vitro- modeller giver således, kan større indsigt i endothelial svar in vivo. Parallel-plade flow salen tidligere udgivet af Lane et al. 9 er tilpasset til at studere endotel RIBOREGULATION i tilstedeværelse og fravær af stabil (ikke-pulsatile) laminar flow. Centrale tilpasninger i set-up for laminar flow som præsenteres her omfatter en stor, dedikeret miljø til hus samtidige flow kredsløb, overvågning af strømningshastigheder i realtid, og medtagelsen af en udefrakommende henvisning RNA for en normalisering af kvantitative real-time PCR data. For at vurdere flere behandlinger/betingelser med anvendelse af shear stress, bruges flere flow kredsløb og pumper samtidig inden for den samme opvarmet og befugtet inkubator. Strømningshastigheden af hver flow kredsløb måles kontinuerligt i realtid at standardisere shear stress betingelser i hele eksperimenterne. Fordi disse eksperimenter har flere betingelser, bruge vi også en eksogen reference RNA, der er tilsat i på tidspunktet for RNA udvinding til normalisering af RNA udvinding og første-streng cDNA syntese effektivitetsgevinster. Disse trin minimerer variabiliteten mellem prøver. Denne strategi er beskæftiget i vores pipeline for gen expression analyse med shear stress eksperimenter ved hjælp af parallel-plade flow kammer, men dele af denne strategi, som de eksogene reference RNA spike-in, kan nemt og omkostningseffektivt bruges til andre programmer.
Introduction
Vaskulære endotel celler danner den indvendige cellulære foring af blodkar i det lukkede kardiovaskulære system af større arter. De udgør grænsefladen mellem blod og væv og er karakteriseret ved luminale og abluminal overflader. Endotelet er et mangfoldigt, aktive og adaptive system, der regulerer blodgennemstrømning, næringsstof handel, immunitet, og væksten af nyt blod fartøjer1. I kroppen findes endotelceller normalt i et miljø, hvor de er udsat for omsætning, shear stress2friktion kraft. Shear stress er en vigtig regulator i endothelial celle gen expression3, og endotelceller forsøger at opretholde shear stress inden for et givet område2,4. Endotelceller demonstrere angiogene mønster i mangel af shear stress5 , der kan forbedre væv perfusion. Regionale mønstre forstyrret strømmen og ændrede shear stress er tilknyttet udtryk for inflammatoriske gener6 og udviklingen af åreforkalkning7,8. Således er modeller, der omfatter shear stress en vigtig del i forståelsen af endotel genregulering.
Vi beskriver en metode til at studere genregulering i vaskulære endotel celler under shear stress. Dette system bruger ikke-pulsatile flow og efterligner væske shear stress niveauer og koncentration af ilt at model betingelser for arteriel endotelceller. Denne protokol indeholder oplysninger om metoder til gen knockdown ved hjælp af RNA-interferens (RNAi), set-up for anvendelsen af shear stress ved hjælp af parallel-plade flow apparater og metoder til spike-in af en udefrakommende reference RNA inden analyse af reverse transkriptase kvantitative polymerase kædereaktion (RT-qPCR). Denne rørledning er brugt til at studere RIBOREGULATION i endothelial celler i tilstedeværelse og fravær af laminar shear stress og omfatter en tilpasning af parallel-plade flow apparatet beskrevet af Lane et al. 9. denne særlige set-up var designet til at lette den samtidige vurdering af flere forsøgsbetingelser, der giver mulighed for direkte sammenligning af shear stress tilstande, samt normalisering af RNA analyse. En stor opvarmet enhed med kontrolleret fugtighed er udnyttet til at tillade flere separate flow kamre og pumper skal køre samtidig med strømningshastigheder overvåges for hver flow kammer forsamling i realtid. Anvendelsen af dette set-up bruges til gen knockdown ved hjælp af RNAi i fastsættelsen af laminar flow/shear stress, men aspekter af denne protokol kan anvendes på enhver vurdering af RNA udtryk.
Fælles tilgange til anvendelsen af shear stress i endothelial celler omfatter mikrofluid systemer10, en kegle og plade viskosimeter11og en parallel-plade flow afdeling12. Mikrofluid systemer fra forskellige producenter har været nyttige i at studere mechanobiology og mechanotransduction i flere celler og vævstyper og en bred vifte af biofysiske stimuli. I endothelial celler, har de været brugt til at studere endotelceller i isolation, samt interaktion i endothelial celler og handel med immun eller tumor celler10. Men disse systemer er mindre egnet til genopretning af et stort antal celler9. Både kegle og plade viskosimeter og parallel-plade flow kamre tillader inddrivelse af stort antal celler i Konfluerende monolag12. Disse systemer kan generere en række shear styrker og mønstre12. Parallel-plade flow kammer forsamling9 har fordelen at real-time imaging kan udføres gennem glasrude at evaluere cellulære morfologi på ethvert tidspunkt. Derudover kan perfusate indsamles under sterile forhold. For det system, der præsenteres her, kan strømmen også overvåges i realtid og i en multi kammer set-up, som letter vedligeholdelsen af shear forhold mellem afdelingerne.
Repræsentative eksperimenter, menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVEC), som repræsenterer en makrovaskulære endotel celletype, der anvendes, og shear stress betingelser vi bruger (1 Pa) afspejler arteriel betingelser (0,1 - 0,7 Pa). Men denne protokol kan bruges med andre endotel celletyper, og shear stress betingelser kan reguleres efter de eksperimentelle spørgsmål. For eksempel, vurderingen af menneskelige endotelceller i betingelser, som model venøs cirkulation ville kræve lavere niveauer af shear stress (1-6 Pa) og undersøgelser, at model mikrovaskulære omsætning har udnyttet shear stress niveauer af 0,4 - 1,2 Pa13 , 14. Derudover shear stress kan variere selv mellem endotelceller inden for den samme blodkar6. I den nuværende struktur, en enkelt overvågningssystem anvendes der kan samtidig overvåge fire separate flow sløjfer. For laboratorier, der har brug for mere flow sløjfer, er der plads i den dedikerede miljø for en yderligere overvågningssystem.
RT-qPCR bruges til den absolutte kvantitering af genekspression i indstillingen af shear stress. Den relative udtryk for target gener er ofte bruges til at sammenligne RNA udtryk på tværs af betingelser. Nogle RNA arter kan findes i meget små mængder eller være fraværende og således komplicere relative målinger. For eksempel, kan længe noncoding RNA'er i endothelial celler udøve potent virkninger på relativt lav copy numre pr. celle5. Desuden kan forskelle i primer effektivitet føre til en unøjagtig fortolkning fra udnytte delta-delta cycle tærskel (Ct) metode til at analysere dataene. For at imødegå denne bekymring, udføre vi absolutte kvantitering ved at generere en standardkurve ved hjælp af en kendt mængde af plasmid DNA. Desuden supplerer DNA (cDNA) syntese er en ineffektiv proces, og forskelle i cDNA effektivitet kan redegøre for forskelle i RNA udtryk mellem betingelser og prøver15. Anvendelsen af shear stress og/eller Transfektion reagenser kan påvirke celleproliferation, apoptose og levedygtighed eller tilføje komponenter, der kan forstyrre RNA isolering og/eller cDNA syntese. For at tage hensyn til muligheden for bias fra RNA isolering og cDNA syntese, bruger vi en spike-RNA objektet syntetiseret i laboratoriet, tilføjet på tidspunktet for RNA udvinding og målt med hver cDNA syntese via RT-qPCR. Dette giver ikke kun en justering for tekniske forskelle i RNA udvinding og cDNA syntese, men også tillader beregning af absolutte mængder pr. celle, når celletal er kendt.
Dette system bruger yderligere skridt til at opretholde lighed eller redegøre for tekniske forskelle mellem betingelser. Vi understrege især disse trin på grund af den komplekse karakter af disse eksperimenter, der involverer flere fysiske set-ups og forsøgsbetingelser, som kan føre til eksperimentel variation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af eksogene Reference RNA
Bemærk: Vælg en eksogen reference RNA, der ikke findes i den art eller model af interesse. For pattedyr systemer, kan firefly luciferase RNA anvendes.
-
Linearisering af eksogene reference RNA plasmid
- Forberede eksogene reference RNA mindst 48 timer før den forventede RNA udvinding. Opnå eller fremstille en cDNA klon af den valgte eksogene reference RNA, såsom en firefly luciferase cDNA klon i et plasmid vektor passer til in vitro- transskription (Se Tabel af materialer).
- Udføre begrænsning enzym (RE) fordøjelsen af 1 µg i fuld længde plasmid (firefly luciferase plasmid er pSP-luc + som har 4100 bp) ved hjælp af single-cutter RE (XhoI) i 1,5 mL mikrofuge rør. Vælg en RE, der er en enkelt kutter (skærer plasmid kun 1 x) i 3'-slutningen af eksogene henvisningen RNA-sekvens, der efterlader en 5' udhæng eller en stump ende. For en typisk forberedelse, udføre syv plasmid linearisering reaktioner (trin 1.1.4 - 1.1.7) i parallel til at generere tilstrækkelig RNA koncentration og mængde til at fuldføre en række eksperimenter eller et projekt.
- Måle plasmid koncentrationen ved hjælp af spektrofotometri eller spectrofluorometry.
- Forbered en RE blanding i hver tube: tilføje 4 µL af XhoI (20.000 enheder/mL), 8 µL af RE buffer, x µL plasmid (1 µg) og tilstrækkelig H2O at nå frem til en samlet løsning af 80 µL.
- Inkuber RE blandingen i 2 timer ved 37 ° C. Bruge RE efter producentens protokol, da ændringer kan resultere i øget stjerne aktivitet eller uspecifikke kløvningen af target-DNA. Varme inaktivere reaktionsblandingen i 20 min. ved 65 ° C.
- Opsige RE digest med ethanol nedbør i hver tube. RE mix, direkte tilføje 4 µL af 0,5 M EDTA pH 8.0, 8 µL af 3 M natrium acetat pH 5,2 og 184 µL af 100% ethanol. Bland godt og fryse blanding ved-20 ° C i 30 min.
- Spin ned blanding på 4 ° C i 20 min. på en relativ centrifugalkraft (Genbrugsfibre) af 16,100 x g.
- Fjern supernatanten med en fin spids, uden at røre pelleten. Lufttørre pellet i 5 min og resuspend det i 6 µL af H2O (opvarmet til 37 ° C) af pipettering op og ned 5 x - 10 x.
- Bekræfte linearisering af luciferase plasmid ved at køre den fordøjede produkt på 2%-agarosegel indeholdende ethidiumbromid (EtBr) samt en 1 kb + stige, en supercoiled stigen, og cut og uncut plasmid. Inspicere gel og Fortsæt til in vitro- transskription, hvis lane for de afskårne plasmid viser en enkelt band på ~ 4 kb (de uslebne plasmid vil have tre bands; Figur 1).
Forsigtig: EtBr er kræftfremkaldende. Arbejde i en kemisk stinkskab.
-
I vitro transskription af eksogene reference RNA plasmid
- For hver tube fordøjet plasmid produkter, udføre in vitro transskription med en in vitro- transskription metode (Se Tabel af materialer). Følg producentens anvisninger og bruge det passende phage RNA polymerase. Hvis den cDNA syntese kræver en poly(A) hale, eller andre programmer kræver en poly(A) hale, vælge en metode til in vitro- transskription, der omfatter en poly(A) hale tilføjelse (Se Tabel af materialer).
- Kombinere alle in vitro- transskriberet produkter ind i et enkelt 1,5 mL polypropylen rør inden rensning.
-
Purif ication af RNA fra in vitro- transskription reaktion
- Rense i vitro transskriberet produkter med en in vitro- transskription oprydning kit (Se Tabel af materialer). Følg producentens protokol.
- Vurdere RNA-koncentrationen ved at måle absorbans på 260 nm ved hjælp af spektrofotometri.
Bemærk: RNA koncentrationen beregnes ved hjælp af øl-Lambert lov. Det hedder, at absorbansen af nukleinsyrer (som absorberer lys kraftigt på 260 nm) er proportional med koncentrationen. En absorbans på 1,0 er lig med 40 µg/mL af enkeltstrenget RNA.
-
Aliquoting materiel RNA i PCR rør til eksperimenterende brug
- Sikre RNA-koncentrationen er 1 µg/µL.
- Hvis RNA-koncentrationen er > 1 µg/µL, fortyndes materiel til 1 µg / µL. alikvot 1 µL i PCR rør og opbevar dem ved-80 ° C.
- Hvis RNA-koncentrationen er < 1 µg/µL, kan yderligere nedbør ved hjælp af 5 M ammoniumacetat (medfølger i sættet) udføres som pr fabrikantens protokol. Hvis RNA-koncentrationen er stadig < 1 µg/µL, fortsætte med aliquoting 1 µL i PCR rør.
- Sikre RNA-koncentrationen er 1 µg/µL.
2. Skub belægning
Bemærk: Trin 2.1-2.10 skal være udført 24-48 h før den forventede celle såning.
- Forvarm ovnen til 250 ° C.
- Bruger sterile handsker, wrap hvert glas dias 2 x med aluminiumsfolie. Undgå at berøre overfladen af diaset direkte.
- Bage dias i ovnen i 1 time ved 250 ° C og tillade dias afkøle til stuetemperatur.
Bemærk: Dette trin er vigtigt for at ødelægge enhver kontaminerende endotoxin. - Mens diasene køling, gøre en fibronektin stamopløsning af 1 mg/mL med destilleret vand og Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C til at opløse. Gøre 100 µL delprøver. Afsætte delprøver til øjeblikkelig brug og fryse de resterende delprøver til fremtidig brug.
- Udpakke den ydre dækker alufolie før du sætter glas dias i en biosikkerhed kabinet. Udføre trin 2.6-2.7 og 2.9 i biosikkerhed kabinet.
- Placer glas dias i en steril rektangulære 4-godt celle kultur parabol.
- Fortynd fibronektin stamopløsning 1: 100 med destilleret vand. Coat hver dias med 1 mL fortyndet fibronektin, dråbe for dråbe, ved hjælp af en pipette. Sørg for hele diaset er dækket.
- Glassene inkuberes i en vævskultur inkubator ved 37 ° C i 24-48 timer.
- Efter inkubering tilsættes Opsug fibronektin ved at vippe 4-godt celle kultur parabol. Undgå at berøre dias direkte med betjent sug.
3. celle såning på glas dias
- Tæller de menneskelige endotelceller på tidlige passage (passage 2-5) og seed ~1.0 x 106 celler på hver fibronektin-belagt glas dias med 1 mL af medier (1,0 x 106 celler/mL medier). Seed celler 24 timer inden den forventede anvendelse af laminar flow, hvis ingen anden behandling skal udføres.
Bemærk: Disse tal bruges som en guide til eksperimenter med 24 h vandføring.- Justere seeding tætheden for at opnå en sammenflydende éncellelag af celler på tidspunktet for celle høst og RNA udvinding.
- Lad cellerne overholde dias i 15 min. ved 37 ° C.
- Tilføj 3 mL af medierne i hvert hul i celle kultur parabol til at dække diasset, og Inkuber celler ved 37 ° C i 24 timer med 5% CO2.
4. små at RNA (siRNA) Transfektion
-
Forberedelse af celler på glas dias til siRNA Transfektion og flow eksperimenter
- Følg protokollen i trin 2 (belægning) og 3 (celle såning på glas dias) for glas dias forberedelse og belægning for flow eksperimenter.
- Frø celler 24 timer før siRNA behandling (48 timer forud for påføring af laminar flow).
- Frø menneskelige endotelceller i antibiotikum-gratis medier på 750.000 til 1 x 106 celler pr. slide at opnå 85-95% sammenløbet næste dag.
Bemærk: HUVEC er brugt i denne protokol.
-
Forberedelse af siRNA-lipid-baserede Transfektion reagens komplekser (pr. slide)
- Designe brugerdefinerede siRNAs eller for tidlig siRNAs for det ønskede gen af interesse.
Bemærk: Udfør følgende trin i en biosikkerhed kabinet. - Tilføj 6 µL af siRNA (20 µM stock) i 414 µL af reducerede serum medium (Se Tabel af materialer) og bland forsigtigt af pipettering.
- Fortynd 49.5 µL forsigtigt blandet lipid-baserede Transfektion reagens (Se Tabel af materialer) i 130.5 µL af reducerede serum medium.
- Bland forsigtigt og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Kombinere fortyndet siRNAs og lipid-baserede Transfektion reagens, blandes forsigtigt, og Inkuber i 15 min ved stuetemperatur. Bland forsigtigt at undgå forstyrrelser i lipid-baserede Transfektion reagens komplekser.
Bemærk: Løsningen kan forekomme uklar som komplekser form. - Mens komplekser danner, fjerne vækstmediet og vaske cellerne 1 x med nedsat serum medium.
- Tilføje 2,4 mL af reducerede serum medium til hver dias.
- Tilføje 600 µL af forsigtigt blandet siRNA-lipid-baserede Transfektion reagens komplekser til hver plade, og rock plade frem og tilbage til mix. Sikre den endelige koncentration af siRNA er 40 nM. Sørge for at diasset er helt dækket.
- Inkuber celler ved 37 ° C i 4 timer.
- Der tilsættes 1 mL af antibiotika-fri endotel celle vækst medier indeholdende 3 x normal koncentrationen af føtal bovint serum (FBS) uden at fjerne Transfektion blanding.
- Inkuber celler ved 37 ° C indtil klar til brug.
- Designe brugerdefinerede siRNAs eller for tidlig siRNAs for det ønskede gen af interesse.
5. beregning af flow baseret på den ønskede Shear Stress9
- Beregne strømningshastigheden baseret på de ønskede shear understreger efter følgende ligning:
Her
Q er strømningshastigheden i mL/min.
Τ er den ønskede shear stress i Dynerne/cm2 (1 Pa = 10 Dynerne/cm2);
w er bredden af parallel-plade flow kammer i cm;
h er højden af parallel-plade flow kammer i cm;
µ er viskositet af medierne i cP (g/cm·s).
Bemærk: Typisk laminar shear stress eksperimenter (ikke-pulsatile) i denne arbejdsproces er udført på τ = 1 Pa (10 Dynerne/cm2). µ kan måles ved hjælp af en viskosimeter som en kegle og plade viskosimeter og kan variere afhængigt af indholdet af medierne herunder serum og yderligere dextran9. - For at opnå en bestemt τ (shear stress), justere gennemstrømningshastighed og/eller viskositet. På højere strømningshastigheder, vedhængende celler kan tage afstand fra diaset. Prøven strømningshastigheder med typiske flow kamre er vist i tabel 1.
6. opsætning af et dedikeret miljø for at overvåge systemet og flere Parallel-plade Flow kamre (figur 2)
- Brug en stor opvarmet enhed/kuvøse med flere hylder, indre elektricitet adgang og glasdøre — omtales som stranden (indbygget miljø med justerbar CO2 ) og varme – til at huse flere flow kamre samtidig for eksperimenter, kræve både shear stress og direkte sammenligning mellem to eller flere behandlinger eller output (dvs., DNA, RNA og protein).
Bemærk: Stranden giver mulighed for hyppig overvågning af flow kredsløb, herunder strømningshastighed, uden hyppigt afbrydelse af miljøet. - Sikre tilstrækkelig CO2 er tilgængelig for eksperimentet og at CO2 skærm er funktionelle. Sikre vand bakke er korrekt udfyldt, således at der vil blive befugtet luft.
7. opstilling af apparatet Parallel-plade Flow
Bemærk: Til fremstilling af parallelle plader, se venligst Lane et al. 9.
- Autoklave strømmen kammer plader, reservoir, aktionsgrænse, slanger og Luers for hver parallel-plade flow kammer set-up som angivet i tabel 2.
-
Opsætning af flow loop Forsamling (figur 3).
- Placere sterile håndklæder i den biologiske sikkerhed kabinet. Samle flow loop system, først uden parallel-plade flow-kammer i den biologiske sikkerhed kabinet.
- Tilslut slangen forsamling for reservoiret:
- Indsætte et #14 hårde rør i et hul og to #14 bløde rør ind i de andre to huller i fælles landbrugspolitik af flow reservoir. Sikre, at en af de bløde rør rører bunden af reservoiret som udstrømning slanger.
- Placer en 1/16" mandlige Luer i slutningen af #14 hårdt tube og fastgør et sterilt filter som et udluftningshul.
- Placer en 1/16" kvindelige Luer i slutningen af #14 bløde indstrømning tube, kommer fra reservoiret, og Vedhæft en 4-vejs stophane.
Bemærk: For gen expression analyse eller andre undersøgelser, hvor perfusates skal ikke indsamles, 2-vejs stopcocks kan bruges i stedet for 4-vejs stopcocks i denne protokol. - Placer en 1/16" mandlige Luer for enden af røret #14 bløde udstrømning fra reservoiret.
- Tilslut reservoir udstrømning slanger til pumpen slanger: Placer en 1/16" kvindelige Luer i hver ende af en #13 hårdt tube (pumpe slangen). Tilslut #14 bløde udstrømning røret fra reservoiret til #13 hårdt tube ved at forbinde 1/16" mandlige og kvindelige Luers sammen.
- Tilslut pumpe slangen med 'aktionsgrænse bridge' slange: Placer en 1/8" mandlige Luer og en 1/8" kvindelige Luer i hver ende af en #16 bløde rør. Tilslut 1/16" kvindelige Luer i #13 hårdt tube (enden udstrømning af pumpe slangen) med 1/8" mandlige Luer i #16 bløde rør.
- Samle slanger for flow aktionsgrænse: Placer en 3/16" mandlige Luer i den ene ende af #25 blød slange og Gentag dette for anden siden af flow dæmper. Vedhæfte de frie ender af #25 bløde rør til hver side af flow dæmper.
- Tilslut 'aktionsgrænse bridge' slangen med slanger for flow aktionsgrænse: Tilslut en #25 bløde rør fra flow aktionsgrænsen med #16 bløde rør af den dæmper-broen ved hjælp af 1/8" kvindelige Luer fra #16 'aktionsgrænse bridge' side og de allerede placerede 3/16" mandlige Luer fra #25 bløde aktionsgrænse tube side.
- Samle 'kammer bridge' slanger:
- Placer en 1/8" kvindelige Luer og en 1/8" mandlige Luer i hver ende af en #16 bløde rør ('kammer bridge' slangen).
- Tilslut 1/8" kvindelige Luer af kammer-broen med 3/16" mandlige Luer på #25 bløde rør fra den frie ende af flow dæmper.
- På 1/8" mandlige Luer (frie ende) af 'kammer bridge' slangen, placere en 4-vejs stophane.
- Tilslut den 4-vejs stophane fra 'kammer bridge' frie ende til 4-vejs stophane fra reservoir indstrømning blød slange (fra trin 7.2.2.3). Tæt på stopcocks.
- Tilføj medier til reservoir og dæmper. Tilføje 35 mL af medier til reservoir og 25 mL til Aktionsgrænsen for 48-h eksponering for shear stress. Justering af lydstyrken for medierne baseret på varigheden af flow eksperiment og antallet af celler seedet.
- Bringe det samlede flow kredsløb til pumpen i stranden. Placer #13 hårdt tube (pumpe slangen) i pumpehoved og sikre det. Åbn stopcocks.
- Drej på pumpen og øg langsomt pumpens omdrejningstal. Lad mediet cirkulerer gennem kredsløb. Kontrollere for lækage eller blokering (fx, pres opbygning). Sikre, at medierne flyder tilbage til reservoiret.
-
Opsætning af flow kammer forsamling
- Placer en 1/8" kvindelige Luer i den ene ende af en #16 bløde rør og vedhæfte en 4-vejs stophane. Vedhæfte den frie ende af røret til den højre side af den øverste plade (indstrømning side).
- Placer en 1/8" mandlige Luer i den ene ende af en #16 bløde rør og vedhæfte en 4-vejs stophane. Vedhæfte den frie ende af røret til den venstre side af den øverste plade (udstrømning side).
- Placer en 1/8" mandlige Luer og en 1/8" kvindelige Luer i hver ende af en #16 bløde rør (boble fælde slangen). Fastgør slangen til boble fælde via 1/8" mandlige Luer. Vedhæfte en 4-vejs stophane til anden enden af den slange via 1/8" kvindelige Luer.
- Overføre ved hjælp af steril pincet, celle-seedede glas dias fra 4-godt celle kultur parabol til ferien på bundpladen. Sikre den celle-seedede side af glas dias vender opad.
- Ved hjælp af en 10-mL sprøjte, der tilsættes 10 mL varm medier til bundplade i rød pakning linje omkring pladen. Give medierne til at flyde gennem diaset og dække cellerne. Undgå at tilføje medier direkte i diaset.
- Anbring forsigtigt den øverste plade på bundpladen, justering fra den ene side til den anden. Undgå indførelsen af luftbobler. Skru pladerne sammen stramt.
- Fjerne luftbobler fra den boble fælde ved at åbne stophane højre (indstrømning) på pladen og forsigtigt rødmen 20 mL varm medier ved hjælp af en 30 mL sprøjten. Sørg for hanen i venstre side (udstrømning) af pladen er lukket, og at medierne flyder gennem boble fælde stophane (åben). Kassér den blussende medier.
- Luk hanen på boble fælde og åbne hanen i venstre side (udstrømning) for sal. Ophøje til venstre (udstrømning) i salen til en 45° vinkel og forsigtigt flush 20 mL varm medier ved hjælp af en 30 mL sprøjte fra den højre side (indstrømning) af salen for at fjerne luftbobler fra salen. Bobler kan visualiseres gennem vinduet. Kassér den blussende medier.
- Lukke stopcocks på begge sider af salen og cap. Inspicere cellerne ved mikroskopi.
- Transport i salen til stranden med det tidligere samlet kredsløb.
- Langsomt reducere pumpehastighed og pause pumpen. Lukke stopcocks på flow loop systemet for at forhindre lækage.
- Tilslut kammeret og loop system sammen via stopcocks. Åbne alle stopcocks.
- Langsomt øge pumpens omdrejningstal og undersøge set-up for enhver lækage eller blokering. Sikre mediet cirkulerer i én retning og vender tilbage til reservoiret.
- Placere flowsensor på 'kammer bridge' slangen beliggende på indstrømning side af salen. Kontroller, at sensoren er orienteret korrekt i retning af flow.
- Juster pumpehastigheden på for at få den strømningshastighed, der blev beregnet tidligere, baseret på den ønskede shear stress.
Bemærk: Flowet kan variere afhængigt af højde og bredde for hver afdeling, samt viskositeten af medierne. - Tænde CO2 tank til at opnå 5% CO2 og placere en vand bakke inde i stranden.
8. høst af celler og udvinding af RNA fra Flow kammer
- Når den ønskede tidsperiode af flow er færdig, langsomt skru ned den peristaltiske pumpehastighed til 0 og slukke for strømmen. Hurtigt lukker alle åbne stopcocks og fjerne kammeret og vedlagte slange med en stophane i hver ende.
- Tage salen til en ren benchtop og forsigtigt skrue alle skruer for at fjerne den øverste plade. Ved hjælp af nåle-næse pincet, fjerne glas dias fra bundpladen og læg det i et 100 mm diameter vævskultur parabol.
- Vaske dias med 10 mL koldt fosfatbufferet saltopløsning (PBS)- / - og se celler under mikroskop at bekræfte celle tilslutning og justering i retning af flow.
- Opsug PBS fra pladen og overføre diasset til en ren 100 mm diameter parabol. Tilføje 350 µL af lysisbuffer fra RNA udvinding kit (Se Tabel af materialer), der indeholder 1/100 af beta-mercaptoethanol, til diaset.
Forsigtig: Tilføje beta-mercaptoethanol i en kemisk stinkskab. - Skrabe celler væk fra diaset, ved hjælp af en polyethylen-bladet celle skraber. Dreje vævskultur parabol, gør det muligt for væsken at pool forneden, og fjerne glas dias med pincet. Afpipetteres cellen lysate ind i en 1,5 mL rør og holde det på is.
- Fortynd stock eksogene reference RNA (luciferase RNA) til 0.0025 ng/µL via seriel fortynding forud for føje det prøven. For eksempel, hvis den bestand koncentration er 1 µg/µL, en fortynding på 1/400.000 er forpligtet til at opnå 0,0025 ng / µL. tilføje 10 µL af fortyndet luciferase RNA til hver prøve af celle lysate for downstream RNA isolering og analyse.
- Fortsætte med RNA udvinding protokollen ifølge fabrikantens anvisninger, eller fryse den lysate ved-80 ° C indtil fortsætte med udvinding.
9. beregning af effektiviteten ved RNA udvinding og cDNA syntese
Bemærk: Beregne luciferase effektivitet efter RT-qPCR ved at sammenligne det teoretiske udbytte og experimental udbytte.
- Bestemme det teoretiske udbytte for luciferase RNA.
- Bestemme den samlede mængde af luciferase kopier tilføjet pr. prøve. (Tilføje 0,025 ng/prøve = 2,73 x 107 eksemplarer af luciferase RNA pr. prøve før RNA udvinding.)
- Beregne luciferase RNA molekylvægt ved hjælp af en gennemsnitlig molekylvægt pr. nukleotid 330 g/mol og multiplikation med længden af firefly luciferase RNA, 1652 nukleotider.
- Opdele mængden af luciferase RNA tilføjet (0.025 ng) for hver prøve før RNA udvinding af molekylmasse at give den molære mængde. Derefter, Multiplicer, at ved Avogadro's tal at give kopier tilføjet pr. prøve.
- Beregn det teoretiske udbytte for luciferase eksemplarerne for hver RT-qPCR reaktion ved hjælp af ligningen:
- Beregne den experimental udbytte for luciferase eksemplarerne for hver RT-qPCR reaktion ved hjælp af luciferase plasmid til at generere en standardkurve for RT-qPCR.
- Beregne den luciferase effektivitet (%) ved hjælp af ligningen:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket linearisering af luciferase plasmid ved hjælp af restriktionsenzymer blev bekræftet af kører fordøjet produkter på en agarosegel (figur 1). Størrelsen af den lineariseret produkt blev bekræftet ved hjælp af DNA stiger og forhold til uncut plasmid.
Vi har tilpasset parallel-plade flow kammer set-up fra Lane et al. 9 for eksperimenter, der kræver flere betingelser/behandlinger med shear stress eller flere shear stress tilstande. Vi bruger et dedikeret miljø, strand, der kan huse flere, fuldt samlet flow kredsløb at alle har overvåget strømningshastigheder (figur 2). Strømningshastigheden er overvåget bare opstrøms af parallel-plade samling (figur 3). Flow kredsløb og priser kan følges direkte gennem glasdøre uden at forårsage udsving i temperatur, fugtighed eller gas indhold i stranden.
Fremstillingsprocessen kan føre til små variationer i kammer højde. Således skal strømningshastigheder beregnes for hvert kammer til at opnå den samme shear stress (tabel 1). I teorien, kamre med identiske højder kan bruge identiske strømningshastigheder til at opnå den samme shear stress og kan bruges i serien. Typiske eksperimenter med endotelceller bruge shear stress af 0 - 1,5 Pa. Laminar shear stress af 1 Pa blev brugt i denne arbejdsproces til model arteriel endotel shear stress. Der kan også være variationer mellem pumpe hoved indstillinger og inden for pumpen hoveder over tid med brug. Ved hjælp af flowmeteret kan gøre rede for disse forskelle.
Eksperimenter ved hjælp af programmet af shear stress ofte involverer flere shear stress betingelser, behandling betingelser og tidspunkter. Hvor det er muligt, bruger vi en endogen reference RNA-konto til enhver variabilitet i den eksperimentelle set-up. For nogle eksperimenter, finde en endogen reference RNA med kvantitative stabilitet er ikke mulig16. Desuden kan kvantitative stabilitet eller ustabilitet af endogene reference gener mellem prøver henføres til enten stimulus-afhængige effekter på cellulære udtryk niveauer eller variationer i effektivitetsgevinster af RNA ekstraktioner eller omvendt transkription. For at tage hensyn til disse mangler, og i de omgivelser, hvor en endogen reference gen ikke er kvantitativt stabil, bruger vi en spike-i eksogene reference genet. Til eksperimenter indarbejde laminar shear stress i endothelial pattedyrceller, bruger vi en firefly luciferase RNA som en udefrakommende RNA spike-i (figur 4A).
Figur 4 viser analyserede RT-qPCR eksperimentelle data fra shear stress eksperimenter vurdering af Krüppel-lignende faktor 2 (KLF2) tab af funktion ved hjælp af siRNA. KLF2 er en transskription faktor upregulated af laminar flow i endothelial celler og store transcriptional mægler i endothelial genekspression i indstillingen af laminar flow2.
Figur 4A viser luciferase effektivitetsgevinster for tre separate eksperimenter, hver med to flow kamre. Luciferase effektivitetsgevinster kan være lignende mellem prøver af et eksperiment (eksperimentere 1) eller vise nogle variation (forsøg 2 og 3) (figur 4A). Disse resultater er særligt værdifuldt i eksperimentelle systemer hvor kun små ændringer, absolut er set. Brug af en udefrakommende reference gen kan være særlig vigtig i eksperimenter hvor eksperimentelle behandlinger kan påvirke effektiviteten af reverse transkription eller PCR17. De resultater, der er afbildet i figur 4A er typiske. En luciferase effektivitet på 5% angiver, at 5% af luciferase RNA (dvs, det første grundbeløbet for RNA) tilsættes prøven før RNA udvinding registreres af RT-qPCR. Mellem prøver eller betingelser inden for en enkelt eksperiment er luciferase effektivitetsgevinster normalt ± 50%. Resultater bør fortolkes med forsigtighed, hvis variation af luciferase effektivitetsgevinster er > 50% og bør omfatte en gennemgang af de eksperimentelle procedurer og betingelser.
Figur 4B viser typiske eksperimentelle resultater af RT-qPCR fra gentagne shear stress eksperimenter, hver bruger flere parallel-plade flow kamre. Inden for hvert forsøg, er KLF2 mRNA udtryk normaliseret på tre måder. Den første normalisering bruger en endogen reference RNA, Cyclophilin A (CycA). Den anden normalisering bruger en eksogen reference RNA, firefly luciferase (Luc). Den tredje normalisering bruger både den endogene og eksogene reference RNA. Inden for hvert forsøg, vist i figur 4B, alle tre normalisering metoder (normalisering endogene reference-genet, det eksogene reference gen og begge endogene og eksogene reference gener sammen) giver lignende resultater. Hvis metoden normalisering ændres betydeligt resultaterne (fxfører til > 50% forskel), skal resultaterne tolkes med forsigtighed. Når der er betydelig variation mellem metoderne til normalisering, bør endogene reference molekylærgenetisk revideres, da det kan være en afhængige variabel i den eksperimentelle system. På samme måde, eksperimentelle procedurer og betingelser bør revideres. I figur 4Budbytter KLF2 knockdown bruger siRNA lignende knockdown effektivitet mellem tre separate eksperimenter (eksperiment 1, 2 og 3). Vi brugte tre adskilte biologiske prøver for disse eksperimenter ved hjælp af to samtidig kører flow kamre med shear stress på 1 Pa for hvert forsøg.
Figur 1: Agarosen gel billede af linearisering af eksogene luciferase plasmid. Supercoiled og 1 kb + DNA stiger bruges som markører til at bestemme både uncut og skære luciferase plasmid størrelser i kilobases (kb). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk oversigt over flere flow kredsløb forsamlinger i et dedikeret miljø (strand). Strømningshastigheder i både flow kredsløb er let overvåges i realtid, uden at forstyrre miljøet, og både kredsløb kan køre samtidigt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: skematisk oversigt over en enkelt flow kredsløb forsamling. Slangen størrelser og Luers bruges er angivet i denne figur. Sikre at flowmåler er orienteret i retning af strømmen og placeret opstrøms flow kammer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentant resultat af KLF2 tab af funktion eksperimenter i endothelial celler udsat for shear stress (1 Pa) for 24 h. (A) dette panel viser kvantificering af eksogene luciferase RNA i tre separate flow eksperimenter. Luciferase effektivitetsgevinster kan være lignende mellem prøver af et eksperiment (eksperimentere 1) eller vise nogle variation (forsøg 2 og 3). Luciferase (absolut kopier) er kopi antal luciferase RNA opdaget af reverse transkriptase kvantitativ PCR (RT-qPCR) af absolutte kvantificering ved hjælp af en standardkurve. Luciferase effektivitet er de eksperimentelle luciferase kopier divideret med de teoretiske luciferase eksemplarer for hver prøve, ganges med 100 (se efter skridt 8 i protokollen). Relative luciferase effektivitet er luciferase effektiviteten af hver prøve divideret med reference tilstand (strøm + Ctlsi) inden for hvert forsøg. (B) disse paneler Vis normalisering af genekspression i et sæt af prøven shear stress eksperimenter ved hjælp af begge endogene og eksogene reference gener. Resultaterne er fra reverse transkriptase kvantitativ PCR (RT-qPCR). Knockdown KLF2 mRNA udtryk er vist i overværelse af laminar flow med shear stress af 1 Pa for 24 h. FC = fold ændring; CycA = cyclophilin A, bruges som en endogen reference RNA; Luc = luciferase, bruges som en udefrakommende reference RNA. De data, der er tilpasset fra mand et al. 5. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Kammer højde (mikron; µm) |
Salen bredde (centimeter, cm) |
Flow sats (mL/min) for 1 Pa shear stress | Viskositet (centipoise, cP) |
| 303.80 | 1,90 | 19.48 | 0.90 |
| 326.10 | 1,90 | 22.45 | 0.90 |
| 344.84 | 1,90 | 25.10 | 0.90 |
| 319.06 | 1,90 | 21.49 | 0.90 |
Tabel 1: Kammer højder og eksempler på strømningshastigheder for forskellige flow kamre til at opnå shear stress af 1 Pa.
| J klude |
| Pincet |
| Reservoir flaske og Cap |
| Aktionsgrænse og Cap |
| Flow løkke |
| 1/16" mandlige Luer x 3 |
| 1/16" kvindelige Luer x 3 |
| 1/8" mandlige Luer x 2 |
| 1/8" kvindelige Luer x 4 |
| 3/16" mandlige adapter x 2 |
| 14 L/S hårdt Tube (2 inches) x 1 |
| 14 L/S bløde rør (5 inches) x 2 |
| 16 L/S bløde rør (3 inches) x 2 |
| 25 L/S bløde rør (3 inches) x 2 |
| 13 L/S hårdt Tube (10 tommer) x 1 |
| Flow kammer |
| 1/8" mandlige Luer x 2 |
| 1/8" kvindelige Luer x 2 |
| 16 L/S bløde rør (3 inches) x 3 |
| Top og bundplade |
| Skruer |
Tabel 2: Dele skal autoklaveres i trin 6.2 i protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Shear stress er en fysiologisk tilstand, der modulerer endotelfunktion, dels ved at påvirke steady-state gen expression2,5. Modeller af RIBOREGULATION i forskellige shear stress betingelser vil bidrage til en større forståelse af endotelfunktion. Denne pragmatiske arbejdsproces indeholder et flow kredsløb ved hjælp af en parallel-plade flow kammer tilpasset fra Lane et al. 9 og repræsenterer laminar, ikke-pulsatile flow. Den overordnede struktur blev designet til at lette eksperimenter, der kræver flere flow kamre og minimere eksperimentel variation i denne indstilling.
Flow kredsløb forsamling er en vigtig del af denne arbejdsproces og er tilpasset fra Lane et al. 9. flere tilpasninger af denne forsamling og protokol blev foretaget for at afspejle forskelle i de eksperimentelle systemer. En stor opvarmet enhed, stranden, er en tilpasning, der letter samtidig anvendelse og overvågning af flere flow kredsløb inden for det samme miljø. Dette system har været anvendt med succes til anvendelse af shear stress i endothelial celler for forskellige perioder, fra 1 time til 7 dage, og på flere niveauer af shear stress (fx, 1,0, 1,5 og 2,0 Pa). Dette system blev også brugt til gen knockdown undersøgelser for at vurdere funktionen af en flow-responderende endotel gen i fastsættelsen af shear stress (figur 4)5. Der er betydelig variation mellem pumper og pumpe hoveder, som også kan ændre sig over tid som følge af normale slitage. For at tage hensyn til disse forskelle, bruger vi et flowsensor beliggende proksimale flow herhen for at løbende overvåge strømningshastigheder. Forskellige størrelser af slanger og Luers bruges til at sikre en stram pasform for hver komponent, og at forebygge enhver lækage under eksperimenter. Vi tælles celler og seedet cirka 1.000.000 celler pr. glas dias, dråbevis, og derefter lade cellerne inkuberes ved 37 ° C i 15 min at øge fastholdelse effektivitet. I forhold til endotelceller stamceller, som kan være seedet for en kort tid før anvendelsen af shear stress9, seed vi menneskelige endotelceller i mindst 24 timer forud for påføring af shear stress. Kortere varigheder kan føre til løs af celler under flow eller en diskontinuerlig lag i endothelial celler, selv med den passende seeding tæthed. Vi lægger vægt på kontrol af dias til en sammenflydende éncellelag i endothelial celler både før og efter anvendelsen af shear stress. Vi finder, at dias belagt med fibronektin, en naturlig ekstracellulære matrix komponent18, opretholde i endothelial éncellelag mere konsekvent i forhold til sider belagt med gelatine (denatureret fibrillar type I-kollagen). Endelig er flow aktionsgrænser i denne protokol optimeret til at bruge 30 mL af medier, sammenlignet med 190 mL af medier til andre producenter.
Flere trin i flow kredsløb forsamling kræver ekstra pleje. En selv éncellelag i endothelial celler bør fastlægges forud for påføring af shear stress. Det er vigtigt at frø celler i glas diaset dråbevis til at øge antallet af celler, der overholder diasset og dermed den samlede slide dækning. Ventetiden mellem celle såning og tilføjer yderligere medier til diaset generelt forbedrer seeding effektivitet, da det giver tilstrækkelig tid til cellerne til at tiltræde diasset i stedet for at blive skyllet væk i flere dias magasinet. Inspicere celler visuelt, før, under og efter anvendelsen af shear stress. Et mikroskop kan placeres i stranden til dette formål. Flowsensoren skal være fastgjort i den rigtige retning og mål strømningshastighed skal kontrolleres for hver enkelte flow kammer. Flow loop system bør være perfunderet uden kammer at sikre ingen medier lækage eller andre problemer, såsom pres oprustning, at undgå forstyrrende cellerne under de faktiske eksperimenter. Inspicér for og fjerne bobler i systemet. Mens teste flow loop system, sikre at stopcocks er alle åbne før du tænder den peristaltiske pumpe til at tillade uafbrudt, ensrettet flow. Sikre, at alle stopcocks er lukket før montering flow kammer til løkken og fuldt åbnet før genstart pumpen.
Vi finder, at tilføjelsen af en udefrakommende reference gen er nyttige i en række scenarier. Endotel celle medier indeholder ofte heparin, som er en hæmmer af PCR17. Mens nogle RNA udvinding protokoller indarbejde skridt til at fjerne heparin, kan spormængder forårsage forskelle i PCR effektivitetsgevinster mellem prøver. Potent behandlinger kan også udelukke identifikation af en endogen reference gen, som er kvantitativt stabil. Vores lab har skabt en effektiv protokol for at syntetisere 5'-udjævnede og poly-A-tailed luciferase RNA til brug som en udefrakommende reference RNA. Denne strategi har vist sig for at være en omkostningseffektiv tilgang i forhold til at købe en kommercielt tilgængelig RNA. Under udarbejdelsen af eksogene reference RNA er det vigtigt at alikvot RNA til engangsbrug delprøver at undgå flere fryse-tø cykler. Grundig blanding og præcis pipettering er afgørende for at opretholde Inter alikvot konsistens. Typiske eksperimenter viser en luciferase effektivitet i rækken af 5% ± 2,5%, men kan variere fra 1-10%. Det er klogt at korrigere RT-qPCR resultater for både eksogene reference RNA effektivitet og en endogen reference (rengøring) genet.
For de eksperimenter, vi gennemfører, anvendes firefly luciferase sekvenser som ikke-pattedyr spike-i reference RNA i pattedyr modeller. I eksperimenter hvor firefly luciferase er udtrykt i celler, ville dette ikke være en passende henvisning genet. Andre artsspecifikke reference gener kan bruges, herunder den Caenorhabditis elegans miRNA cel-miR-3919 og ribulose bisfosfat carboxylase plante RNA20.
Dette flow kredsløb modeller en 2-D éncellelag i endothelial celler dyrket på vævskultur plast eller glas, som er helt stiv. Matrix stivhed kan påvirke i endothelial svar på væske shear stress21. Denne modelsystemet bruger en relativt høj iltkoncentration mere ligner arteriel end venøs ilt koncentrationer. Denne model nøje ligner lige segmenter af større skibe i en lukket hjerte-kar-system og giver en relativt homogent miljø i endothelial celler på diaset. Andre specifikke betingelser i 3D-strukturer, som bifurcationer eller krumning af fartøjer, ikke er repræsenteret med denne model. Andre systemer kan model andre flow mønstre, herunder i buede regioner af Vaskulaturen, men give færre celler end det system, der er beskrevet i denne protokol. På samme måde, andre forsamlinger kan være mere hensigtsmæssigt, hvis > 1 x 106 celler er påkrævet, eller hvis en enkelt celle analyse er påkrævet. Vores nuværende program modeller ikke-pulsatile laminar flow. Endnu, kan denne model bruges til at generere andre bølgeformer, herunder pulsatile eller oscillerende bølgeformer, med konsekvens, som strømningshastigheder overvåges kontinuerligt.
Samlet set indeholder denne pragmatiske arbejdsproces et system til den samtidige anvendelse af shear stress på flere flow kamre med overvågede strømningshastigheder. Materialer og procedurer i hele denne arbejdsproces er designet til at minimere eksperimentel variation mellem prøver og betingelser. Denne arbejdsproces held har været anvendt til eksperimenter med RNAi i fastsættelsen af laminar flow og kan også bruges til eksperimenter der kræver flere betingelser med laminar shear stress, eller flere laminar shear stress størrelser og/eller tidspunkter, herunder alternative bølgeformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af CIHR MOP 142307 til P.A.M. H.S.J.M. er en modtager af en canadisk institutter af sundhed forskning træningsprogram i regenerativ medicin Fellowship. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. og M.K.D. er modtagere af dronning Elizabeth II ph.d. stipendier inden for videnskab og teknologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Aird, W. C.
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
- Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
- Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
- Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
- Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
- Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
- Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
- Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
- Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
