剪断応力の複数の平行平板流チャンバーを使用して内皮細胞の遺伝子発現解析
Summary
ここでは、流体せん断応力下における血管内皮細胞の培養と遺伝子発現解析のワークフローが表示されます。同時に監視制御環境および外因性参照 RNA の定量的 PCR 用に複数のフロー室住宅の物理的な配置は、含まれています。
Abstract
我々 は複数の監視対象の平行平板流チャンバーを用いた定常層流を受ける血管内皮細胞からの遺伝子発現の分析用のワークフローについて説明します。血管内皮細胞は、血管の内側の細胞層を形成して慢性的なせん断応力と呼ばれる血流の摩擦力にさらされています。生理的に様々 な剪断応力の存在下で血管内皮細胞機能。したがって、せん断応力条件の in vitroモデルのアプリケーションは、血管内皮反応の生体に大きい洞察力を提供できます。以前はレーンらによって公開されて平行平板流チャンバー9は安定した (非拍動性) 流の有無における内皮細胞の遺伝子発現制御に適応。セットアップは、ここで示す流でキーの適応を含める家同時実行フロー回路の流量監視に大型の専用環境、リアルタイムと国交正常化のための参照 RNA が外因性の包含定量的リアルタイム PCR のデータ。剪断応力のアプリケーションで複数の治療/条件を評価するために複数のフロー回路とポンプが、同じ加熱と加湿のインキュベーター内で同時に使用されます。各フロー回路の流量を連続で測定実験中せん断応力条件を標準化するためにリアルタイム。これらの実験は、複数の条件を持っている、のでまた RNA の抽出および最初繊維の cDNA 合成効率の正規化のための RNA の抽出時にスパイクで外因性参照 RNA を使用します。これらの手順では、サンプル間の可変性を最小限に抑えます。この戦略とせん断応力実験平行平板流チャンバーを用いた遺伝子発現解析のパイプラインで用いられるが、この戦略を外因性など部品 RNA スパイクで参照が簡単に、低コストで使用します。他のアプリケーション。
Introduction
血管内皮細胞は、血管より高い種のクローズドの心血管系の細胞内層を形成します。彼らは、血液と組織間のインタ フェースを形成し、内腔によって特徴付けられると abluminal 表面。血管内皮細胞は、血流や栄養人身売買、免疫、新しい血容器1の成長を調節する多様なアクティブ、および適応型システムです。体内の血管内皮細胞は通常循環、せん断応力2の摩擦力に公開されている環境で存在します。せん断応力が内皮細胞の遺伝子の表現3の重要な制御因子、血管内皮細胞が2,4の指定した範囲内のせん断応力を維持しようとします。血管内皮細胞は、血管新生組織灌流を改善できるせん断応力5の不在でのパターン化を示しています。邪魔の流れと変化のせん断応力の地域パターンは6炎症性遺伝子の発現と動脈硬化症7,8の開発に関連付けられます。したがって、せん断応力を含むモデルは、内皮細胞の遺伝子の規則の理解の主要なコンポーネントです。
せん断応力下における血管内皮細胞の遺伝子の規則を勉強するための手法について述べる。このシステムは、非拍動流を使用し、流体せん断応力レベルと酸素濃度動脈内皮細胞のモデルの条件を模倣しています。このプロトコルには、RNA 干渉 (RNAi) せん断応力によって分析の前に外因性参照 RNA のスパイクの平行平板流装置、およびメソッドを使用してアプリケーションのセットアップを使用して遺伝子ノックダウン法の詳細が含まれています。逆転写酵素定量ポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR-RT)。このパイプラインは層流のせん断応力の有無で血管内皮細胞の遺伝子の規則の勉強のため使用され、レーンらによって記述された平行平板流装置の適応が含まれています9. せん断応力条件の直接の比較だけでなく、RNA 解析の標準化を可能にする複数の実験条件の同時評価を容易にするには、この特定のセットアップ。湿度の制御大型温水ユニットを使用して複数の独立した流れの部屋と流量リアルタイムでフロー チャンバー アセンブリごとに監視を同時に実行しているポンプをできるように。流/せん断応力の設定で RNAi を用いた遺伝子ノックダウンのこのセットアップ アプリケーションを使用が、このプロトコルの側面は RNA 発現の任意の評価に適用できます。
マイクロ流体システム10、コーン プレート粘度計11, 平行平板流室12などの内皮細胞の剪断応力のアプリケーションの一般的な方法。様々 なメーカーからマイクロ流体システムは、メカノバイオロジーと複数の細胞と組織型およびさまざまな生物物理学的刺激のメカノトランスダクションの研究に有用されています。内皮細胞の彼らは血管内皮細胞の相互作用と免疫や腫瘍細胞10の人身売買同様の分離、内皮細胞を研究に使用されています。ただし、これらのシステムは、少ないセル9の多数の回復に適しています。コーン プレート粘度計と平行平板流室の両方は、コンフルエント単層膜12のセルの数が多いのリカバリを行うこと。これらのシステムは、せん断力、パターン12の範囲を生成できます。平行平板流チャンバー アセンブリ9そのリアルタイム イメージング利点がある任意の時点での細胞形態を評価するためのガラス窓から実行することができます。さらに、液を無菌条件下で収集できます。ここで紹介システム、流れマルチチャンバ設定、室間せん断条件の整備を容易にする、リアルタイムでもに監視できます。
代表的な実験のため血管内皮細胞の型を表す、ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (新生活) を使用し、せん断応力を用いて (1 Pa) 動脈の状態を反映 (0.1 – 0.7 Pa)。他の血管内皮細胞の種類、このプロトコルを使用することができ、実験の質問によるとせん断応力条件を調整できます。たとえば、静脈循環のモデル条件でひと内皮細胞の評価はせん断応力 (1-6 Pa) のより低いレベルを必要となる、微小循環モデル研究は 0.4 – せん断応力レベルを利用して 1.2 Pa13,14します。 さらに、せん断応力6同じ血管内の内皮細胞間でも異なります。現在の設定では、単一の監視システムが用いられることは同時に 4 つの別々 の流れループを監視できます。もっと流れのループを必要とする研究所の追加監視システム専用の環境でスペースがあります。
RT qPCR は剪断応力の設定における遺伝子発現の絶対定量に使用されます。標的遺伝子の相対的な表現はよく条件が RNA 発現を比較する使用されます。いくつかの RNA 種は、非常に低い量で存在したり、欠席、相対測定をこのように複雑。たとえば、内皮細胞における長鎖非コード Rna は細胞5あたりの比較的低コピー数で強力な効果を発揮できます。さらに、プライマー効率の違いはデータを分析するデルタ-デルタ サイクル (Ct) しきい値法を用いたから不正確な解釈につながることができます。この問題に対処するためのプラスミド DNA 既知量を使用して標準的な曲線を生成することによって絶対定量を実行します。さらに、相補的 DNA (cDNA) 合成非効率的なプロセスであるし、cDNA の効率の違いは条件およびサンプル15間 RNA 発現の違いを考慮することができます。せん断応力やトランスフェクション試薬のアプリケーションは、細胞増殖、アポトーシスおよび生存率に影響を与えるまたは RNA の分離および/または cDNA の合成を妨げる可能性がありますコンポーネントを追加できます。RNA の隔離と cDNA 合成からバイアスの可能性を考慮、スパイクで RNA ラボで合成、RNA の抽出の時に追加されたコントロールおよびコントロール各 cDNA 合成を介してRT qPCR 測定を使用します。これにより調整だけでなく、技術は RNA 抽出と cDNA の合成における違いが、細胞数がわかっている場合、セル当たり絶対数量計算ができます。
このシステムでは、追加の手順を使用して類似性を維持する条件の技術的な違いを考慮します。我々 は特に、複数の物理的なセットアップと実験的変動につながる実験的条件を含むこれらの実験の複雑な性質のため手順を強調します。
Protocol
Representative Results
Discussion
せん断応力は、定常状態の遺伝子表現2,5に影響を与える部分、血管内皮機能を調節する生理的な条件です。様々 な剪断応力条件下での遺伝子発現制御のモデルは、血管内皮機能の一層の理解に貢献します。この実用的なワークフローに適応レーンらから平行平板流チャンバーを用いたフロー回路が含まれています9と表しま…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は機構モップ 142307 デザイナーデュオに支えられた H.S.J.M. はカナダの協会の健康研究研修プログラムの再生医学の交わりで受信者。H.S.J.M.、A.N.S.、京浜、および M.K.D. は、女王エリザベス II 大学院奨学金の科学技術の受信者です。
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
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