تحليل التعبير الجيني غشائي الخلايا المعرضة للإجهاد باستخدام عدة تدفق مواز-لوحة الدوائر للقص
Summary
ويرد هنا، سير عمل لتحليل التعبير الثقافة والجينات لخلايا بطانية إجهاد القص السوائل. وشملت ترتيب مادية للسكن ورصد الدوائر التدفق متعددة في بيئة تسيطر عليها، واستخدام الحمض النووي الريبي مرجعية خارجية ل PCR الكمي في الوقت نفسه.
Abstract
يمكننا وصف سير عمل لتحليل التعبير الجيني من خلايا بطانية رهنا بتدفق الصفحي استخدام متعددة رصد تدفق مواز-لوحة الدوائر. خلايا بطانية تشكل البطانة الخلوية الداخلية للأوعية الدموية ومزمن ويتعرض للاحتكاك قوة تدفق الدم يسمى إجهاد القص. في ظل الظروف الفسيولوجية، وظيفة خلايا بطانية حضور مختلف ظروف الإجهاد القص. وهكذا، يمكن أن توفر تطبيق شروط إجهاد القص في نماذج في المختبر مزيد من التبصر في الردود غشائي فيفو. تدفق مواز-لوحة الدائرة المنشورة سابقا بلين et al. 9 يتم تكييفها لدراسة تنظيم الجينات غشائي في وجود وغياب مطرد الاندفاق الصفحي (غير نابض). وتشمل التعديلات الرئيسية في التشكيل للتدفق الصفحي كما عرضت هنا بيئة كبيرة مخصصة للدوائر التدفق المتزامنة البيت، ورصد معدلات التدفق في الوقت الحقيقي، وإدراج إشارة خارجية الحمض النووي الريبي للتطبيع من كمية بيانات PCR الوقت الحقيقي. تقييم العلاجات/شروط متعددة مع تطبيق إجهاد القص، تستخدم دوائر تدفق ومضخات متعددة في وقت واحد داخل حاضنة دافئة وهوميديفيد نفس. يتم قياس معدل التدفق لكل دارة التدفق باستمرار في الوقت الحقيقي لتوحيد شروط الضغط القص في جميع أنحاء هذه التجارب. لأن هذه التجارب قد شروط متعددة، نستخدم أيضا مرجعية خارجية الحمض النووي الريبي التي ارتفعت في وقت استخراج الحمض النووي الريبي لتطبيع استخراج الحمض النووي الريبي وكدنا أول حبلا توليف الكفاءة. هذه الخطوات تقليل التفاوت بين العينات. هذه الاستراتيجية يعملون في خط أنابيب لدينا لتحليل التعبير الجيني مع تجارب إجهاد القص باستخدام الدائرة تدفق مواز-لوحة، لكن أجزاء من هذه الاستراتيجية، مثل الخارجية مرجع المصطلحات الخاصة في الجيش الملكي النيبالي ويمكن بسهولة وفعالية من حيث التكلفة لاستخدامها التطبيقات الأخرى.
Introduction
خلايا بطانية الأوعية الدموية تشكل البطانة الخلوية الداخلية للأوعية الدموية في نظام القلب والأوعية الدموية المغلقة الأنواع أعلى. وهي تشكل الواجهة بين الدم والأنسجة وتتميز لومينال والأسطح أبلومينال. البطانة هو نظام متنوعة ونشطة، والتكيف الذي ينظم تدفق الدم، والاتجار بالمواد الغذائية، والحصانة، ونمو الأوعية الدموية الجديدة1. في الجسم، وتوجد خلايا بطانية عادة في بيئة حيث يتعرضون للاحتكاك قوة الدورة الدموية، وإجهاد القص2. إجهاد القص منظم هام ل التعبير الجيني غشائي خلية3، وخلايا بطانية محاولة الحفاظ على إجهاد القص داخل نطاق معين2،4. إظهار خلايا بطانية الأوعية الزخرفة في غياب إجهاد القص5 التي يمكن تحسين التروية الأنسجة. الأنماط الإقليمية لتدفق الانزعاج وغيرت القص الإجهاد المرتبطة بالتعبير عن الجينات التحريضية6 وتطوير تصلب الشرايين7،8. وهكذا، النماذج التي تشمل الإجهاد القص مكوناً رئيسيا لفهم تنظيم الجينات بطانية.
يصف لنا طريقة لدراسة تنظيم الجينات في خلايا بطانية الأوعية الدموية تحت إجهاد القص. هذا النظام يستخدم التدفق غير نابض ويقلد مستويات السوائل القص إجهاد وتركيز الأكسجين أن الشروط النموذجية لخلايا بطانية الشرياني. هذا البروتوكول يتضمن تفاصيل عن أساليب لضربة قاضية الجينات باستخدام الإعداد لتطبيق إجهاد القص باستخدام جهاز تدفق مواز-لوحة، وأساليب للمصطلحات الخاصة في إشارة خارجية الحمض النووي الريبي قبل التحليل بالحمض النووي الريبي التدخل ([رني])، المنتسخة العكسية الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-قبكر). هذا الأنبوب يستخدم لدراسة تنظيم الجينات في خلايا بطانية في وجود وعدم وجود إجهاد القص الصفحي ويتضمن تعديلاً لجهاز تدفق مواز-لوحة وصف لين et al. 9-هذا التشكيل خاصة صممت لتيسير تقييم ظروف تجريبية متعددة متزامنة يتيح إجراء مقارنة مباشرة لظروف الإجهاد القص، فضلا عن التطبيع لتحليل الحمض النووي الريبي. وتستخدم وحدة ساخنة كبيرة مع الرطوبة التي تسيطر عليها للسماح لعدة دوائر منفصلة التدفق ومضخات تكون قيد التشغيل في نفس الوقت مع معدلات التدفق التي ترصد لكل تدفق قاعة الجمعية في الوقت الحقيقي. يستخدم تطبيق هذا الإعداد لضربة قاضية الجينات باستخدام [رني] في الإعداد للإجهاد الاندفاق الصفحي/القص، ولكن يمكن تطبيق جوانب من هذا البروتوكول لأي تقييم للتعبير الجيش الملكي النيبالي.
وتشمل نهج مشتركة لتطبيق إجهاد القص لخلايا بطانية موائع جزيئية نظم10ومخروط ولوحة فيسكوميتير11و تدفق مواز-لوحة دائرة12. نظم موائع جزيئية من مختلف الشركات المصنعة كانت مفيدة في دراسة ميتشانوبيولوجي وميتشانوترانسدوكتيون في خلايا متعددة وأنواع الأنسجة ومجموعة متنوعة من المنبهات الفيزيائية الأحيائية. لخلايا بطانية، فقد استخدمت لدراسة خلايا بطانية في العزلة، فضلا عن التفاعل بين خلايا بطانية والاتجار بالمناعة أو ورم الخلايا10. بيد أن هذه النظم أقل ملاءمة لاسترداد عدد كبير من الخلايا9. كل مخروط ولوحة فيسكوميتير وتدفق مواز-لوحة الدوائر السماح باسترداد عدد كبير من الخلايا في مونولاييرس المتلاقية12. هذه النظم يمكن أن تولد مجموعة من القوات وأنماط القص12. الجمعية الدائرة تدفق مواز-لوحة9 له الميزة أن التصوير في الوقت الحقيقي يمكن أن يؤديها من خلال زجاج النافذة لتقييم مورفولوجيا الخلوية في أي وقت. وعلاوة على ذلك، يمكن جمعها في بيرفوساتي تحت ظروف معقمة. لنظام المعروضة هنا، يمكن أيضا رصد التدفق في الوقت الحقيقي، وفي إنشاء قاعة متعددة، مما يسهل الحفاظ على شروط القص بين الدوائر.
للتجارب التمثيلية، وتستخدم الخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيك)، التي تمثل نوع خلية بطانية ماكروفاسكولار، وظروف الإجهاد القص نستخدم (1 Pa) تعكس ظروف الشرياني (0.1-0.7 السلطة الفلسطينية). بيد أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها مع أنواع أخرى من الخلايا البطانية وظروف الإجهاد القص يمكن تعديلها وفقا لمسألة تجريبية. على سبيل المثال، يتطلب تقييم الخلايا البطانية البشرية في ظروف نموذج الدورة الدموية الوريدية مستويات أدنى من إجهاد القص (1-6 باسكال) واستخدمت الدراسات نموذج دوران microvascular مستويات الإجهاد القص من 0.4-1.2 السلطة الفلسطينية13 , 14-وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تختلف إجهاد القص حتى بين خلايا بطانية داخل الأوعية الدموية نفس6. يتم استخدام نظام واحد لرصد في التشكيل الحالي، في نفس الوقت الذي يمكن رصد أربع حلقات منفصلة التدفق. للمختبرات التي تحتاج إلى مزيد من الحلقات تدفق، هناك مساحة في بيئة مخصصة لنظام رصد إضافية.
يستخدم qPCR الرايت كوانتيتيشن المطلقة للتعبير الجيني في الإعداد لإجهاد القص. التعبير النسبي للجينات المستهدفة غالباً لمقارنة الحمض النووي الريبي التعبير عبر الشروط. يمكن بعض الأنواع رنا موجودة في كميات منخفضة جداً أو يكون غائبا، مما يعقد القياسات النسبية. على سبيل المثال، يمكن أن تمارس الكشف فضله منذ وقت طويل في خلايا بطانية تأثيرات قوية على أرقام نسخة منخفضة نسبيا لكل خلية5. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي الاختلافات في الكفاءة التمهيدي إلى تفسيراً غير دقيق من استخدام الأسلوب عتبة (Ct) دورة دلتا دلتا لتحليل البيانات. لمعالجة هذا الشاغل، نقوم كوانتيتيشن المطلقة عن طريق توليد منحنى قياسي باستخدام كمية معروفة من بلازميد الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، تكمل تركيب الدنا (كدنا) عملية غير فعالة، ويمكن حساب الفروق في كفاءة كدنا للاختلافات في الحمض النووي الريبي التعبير بين الشروط وبين العينات15. تطبيق إجهاد القص و/أو الكواشف تعداء يمكن أن تؤثر على تكاثر الخلايا والمبرمج والجدوى، أو إضافة المكونات التي قد تتداخل مع توليف الحمض النووي الريبي العزلة و/أو كدنا. لحساب احتمال التحيز من عزل الحمض النووي الريبي وتوليف كدنا، نستخدم المصطلحات خاصة في الجيش الملكي النيبالي تحكم توليفها في المختبر، وأضيف في وقت استخراج الحمض النووي الريبي وتقاس بكل كدنا التوليف عبر RT-قبكر. يسمح هذا التعديل ليس فقط التقنية الاختلافات في توليف الحمض النووي الريبي الاستخراج وكدنا ولكن أيضا يسمح حساب الكميات المطلقة كل خلية، عندما يعرف عدد الخلايا.
يستخدم هذا النظام اتخاذ خطوات إضافية للحفاظ على التشابه أو مراعاة للاختلافات التقنية بين الشروط. نؤكد هذه الخطوات لا سيما بسبب الطبيعة المعقدة لهذه التجارب، التي تنطوي على العديد من الهياكل المادية والظروف التجريبية يمكن أن تؤدي إلى تقلب التجريبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إجهاد القص هو شرط الفسيولوجية التي ينظم وظيفة بطانية، جزئيا، بالتأثير على الجينات الحالة المستقرة التعبير2،5. نماذج لتنظيم الجينات في مختلف ظروف الإجهاد القص سوف يسهم في مزيد من فهم لوظيفة غشائي. يقوم سير العمل هذا عملي يتضمن دارة تدفق باستخدام دائرة التوا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها استوفوا باتاكا 142307 إلى P.A.M. H.S.J.M. مستلم الكندية المعاهد من صحة البحث برنامج التدريب في “زمالة الطب التجديدي”. H.S.J.M.، A.N.S.، K.H.K.، M.K.D.، وهي المتلقية “الملكة إليزابيث الثانية الدراسات العليا المنح الدراسية” في مجال العلم والتكنولوجيا.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
- Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
- Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
- Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
- Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
- Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
- Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
- Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
- Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
