Summary
ここでは、流体せん断応力下における血管内皮細胞の培養と遺伝子発現解析のワークフローが表示されます。同時に監視制御環境および外因性参照 RNA の定量的 PCR 用に複数のフロー室住宅の物理的な配置は、含まれています。
Abstract
我々 は複数の監視対象の平行平板流チャンバーを用いた定常層流を受ける血管内皮細胞からの遺伝子発現の分析用のワークフローについて説明します。血管内皮細胞は、血管の内側の細胞層を形成して慢性的なせん断応力と呼ばれる血流の摩擦力にさらされています。生理的に様々 な剪断応力の存在下で血管内皮細胞機能。したがって、せん断応力条件の in vitroモデルのアプリケーションは、血管内皮反応の生体に大きい洞察力を提供できます。以前はレーンらによって公開されて平行平板流チャンバー9は安定した (非拍動性) 流の有無における内皮細胞の遺伝子発現制御に適応。セットアップは、ここで示す流でキーの適応を含める家同時実行フロー回路の流量監視に大型の専用環境、リアルタイムと国交正常化のための参照 RNA が外因性の包含定量的リアルタイム PCR のデータ。剪断応力のアプリケーションで複数の治療/条件を評価するために複数のフロー回路とポンプが、同じ加熱と加湿のインキュベーター内で同時に使用されます。各フロー回路の流量を連続で測定実験中せん断応力条件を標準化するためにリアルタイム。これらの実験は、複数の条件を持っている、のでまた RNA の抽出および最初繊維の cDNA 合成効率の正規化のための RNA の抽出時にスパイクで外因性参照 RNA を使用します。これらの手順では、サンプル間の可変性を最小限に抑えます。この戦略とせん断応力実験平行平板流チャンバーを用いた遺伝子発現解析のパイプラインで用いられるが、この戦略を外因性など部品 RNA スパイクで参照が簡単に、低コストで使用します。他のアプリケーション。
Introduction
血管内皮細胞は、血管より高い種のクローズドの心血管系の細胞内層を形成します。彼らは、血液と組織間のインタ フェースを形成し、内腔によって特徴付けられると abluminal 表面。血管内皮細胞は、血流や栄養人身売買、免疫、新しい血容器1の成長を調節する多様なアクティブ、および適応型システムです。体内の血管内皮細胞は通常循環、せん断応力2の摩擦力に公開されている環境で存在します。せん断応力が内皮細胞の遺伝子の表現3の重要な制御因子、血管内皮細胞が2,4の指定した範囲内のせん断応力を維持しようとします。血管内皮細胞は、血管新生組織灌流を改善できるせん断応力5の不在でのパターン化を示しています。邪魔の流れと変化のせん断応力の地域パターンは6炎症性遺伝子の発現と動脈硬化症7,8の開発に関連付けられます。したがって、せん断応力を含むモデルは、内皮細胞の遺伝子の規則の理解の主要なコンポーネントです。
せん断応力下における血管内皮細胞の遺伝子の規則を勉強するための手法について述べる。このシステムは、非拍動流を使用し、流体せん断応力レベルと酸素濃度動脈内皮細胞のモデルの条件を模倣しています。このプロトコルには、RNA 干渉 (RNAi) せん断応力によって分析の前に外因性参照 RNA のスパイクの平行平板流装置、およびメソッドを使用してアプリケーションのセットアップを使用して遺伝子ノックダウン法の詳細が含まれています。逆転写酵素定量ポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR-RT)。このパイプラインは層流のせん断応力の有無で血管内皮細胞の遺伝子の規則の勉強のため使用され、レーンらによって記述された平行平板流装置の適応が含まれています9. せん断応力条件の直接の比較だけでなく、RNA 解析の標準化を可能にする複数の実験条件の同時評価を容易にするには、この特定のセットアップ。湿度の制御大型温水ユニットを使用して複数の独立した流れの部屋と流量リアルタイムでフロー チャンバー アセンブリごとに監視を同時に実行しているポンプをできるように。流/せん断応力の設定で RNAi を用いた遺伝子ノックダウンのこのセットアップ アプリケーションを使用が、このプロトコルの側面は RNA 発現の任意の評価に適用できます。
マイクロ流体システム10、コーン プレート粘度計11, 平行平板流室12などの内皮細胞の剪断応力のアプリケーションの一般的な方法。様々 なメーカーからマイクロ流体システムは、メカノバイオロジーと複数の細胞と組織型およびさまざまな生物物理学的刺激のメカノトランスダクションの研究に有用されています。内皮細胞の彼らは血管内皮細胞の相互作用と免疫や腫瘍細胞10の人身売買同様の分離、内皮細胞を研究に使用されています。ただし、これらのシステムは、少ないセル9の多数の回復に適しています。コーン プレート粘度計と平行平板流室の両方は、コンフルエント単層膜12のセルの数が多いのリカバリを行うこと。これらのシステムは、せん断力、パターン12の範囲を生成できます。平行平板流チャンバー アセンブリ9そのリアルタイム イメージング利点がある任意の時点での細胞形態を評価するためのガラス窓から実行することができます。さらに、液を無菌条件下で収集できます。ここで紹介システム、流れマルチチャンバ設定、室間せん断条件の整備を容易にする、リアルタイムでもに監視できます。
代表的な実験のため血管内皮細胞の型を表す、ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (新生活) を使用し、せん断応力を用いて (1 Pa) 動脈の状態を反映 (0.1 - 0.7 Pa)。他の血管内皮細胞の種類、このプロトコルを使用することができ、実験の質問によるとせん断応力条件を調整できます。たとえば、静脈循環のモデル条件でひと内皮細胞の評価はせん断応力 (1-6 Pa) のより低いレベルを必要となる、微小循環モデル研究は 0.4 - せん断応力レベルを利用して 1.2 Pa13,14します。 さらに、せん断応力6同じ血管内の内皮細胞間でも異なります。現在の設定では、単一の監視システムが用いられることは同時に 4 つの別々 の流れループを監視できます。もっと流れのループを必要とする研究所の追加監視システム専用の環境でスペースがあります。
RT qPCR は剪断応力の設定における遺伝子発現の絶対定量に使用されます。標的遺伝子の相対的な表現はよく条件が RNA 発現を比較する使用されます。いくつかの RNA 種は、非常に低い量で存在したり、欠席、相対測定をこのように複雑。たとえば、内皮細胞における長鎖非コード Rna は細胞5あたりの比較的低コピー数で強力な効果を発揮できます。さらに、プライマー効率の違いはデータを分析するデルタ-デルタ サイクル (Ct) しきい値法を用いたから不正確な解釈につながることができます。この問題に対処するためのプラスミド DNA 既知量を使用して標準的な曲線を生成することによって絶対定量を実行します。さらに、相補的 DNA (cDNA) 合成非効率的なプロセスであるし、cDNA の効率の違いは条件およびサンプル15間 RNA 発現の違いを考慮することができます。せん断応力やトランスフェクション試薬のアプリケーションは、細胞増殖、アポトーシスおよび生存率に影響を与えるまたは RNA の分離および/または cDNA の合成を妨げる可能性がありますコンポーネントを追加できます。RNA の隔離と cDNA 合成からバイアスの可能性を考慮、スパイクで RNA ラボで合成、RNA の抽出の時に追加されたコントロールおよびコントロール各 cDNA 合成を介してRT qPCR 測定を使用します。これにより調整だけでなく、技術は RNA 抽出と cDNA の合成における違いが、細胞数がわかっている場合、セル当たり絶対数量計算ができます。
このシステムでは、追加の手順を使用して類似性を維持する条件の技術的な違いを考慮します。我々 は特に、複数の物理的なセットアップと実験的変動につながる実験的条件を含むこれらの実験の複雑な性質のため手順を強調します。
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Protocol
(1) 外因性参照 RNA の準備
注: は、種または興味のモデルで外因性の参照が存在しない RNA を選択します。哺乳類システムのホタルのルシフェラーゼ RNA を使用する可能性があります。
-
外因性参照 RNA プラスミドの線形化
- 外因性参照 RNA の少なくとも 48 時間前に予想される RNA の抽出を準備します。取得または選択した外因性内の参照の RNA、ホタルのルシフェラーゼの cDNA のクローンなどプラスミッドのベクトルを生体外のトランスクリプションのため適切な cDNA のクローンを製造 (材料の表を参照してください)。
- フルレングスのプラスミッドの 1 μ g (RE) 制限酵素消化を実行 (ホタルのルシフェラーゼ プラスミドは pSP-リュック + 4100 bp を持つ) シングル カッターを使用して (XhoI) 再 1.5 mL microfuge の管に。シングル カッターは、RE を選択 (プラスミドをカットのみ 1 x) 3' 5' 突出部分または鈍い端の葉 RNA シーケンスの外因性の参照の終わりに。典型的な準備のため十分な RNA 濃度と実験または 1 つのプロジェクトの 1 つのセットを完了するための量を生成する並列 7 プラスミド線形化反応 (1.1.4 1.1.7 の手順) を実行します。
- 吸光光度法、蛍光光度法を用いたプラスミド濃度を測定します。
- 各チューブの再混合物の準備: XhoIの 4 μ L を追加 (20,000 単位/mL)、バッファー、80 μ L のトータル ソリューションに到達するプラスミド (1 μ g) で十分な H2O の x µL の 8 μ L。
- 37 ° C で 2 時間再混合物を孵化させなさいスター活動の増加や非特異的 DNA ターゲットの胸の谷間で変更が発生する、製造元のプロトコルによると日時を使用します。熱が 65 ° C で 20 分反応混合物を不活性化します。
- 各チューブのエタノールの沈殿物を再ダイジェストを終了します。再ミックス 0.5 M EDTA pH 8.0、8 μ L の 3 M ナトリウム酢酸 pH 5.2、および 100% のエタノールの 184 μ L の 4 μ L を直接追加します。よく混合し、-20 ° c で 30 分間混合物を凍結します。
- 16,100 x gの相対的な遠心力 (RCF) で 20 分のための 4 ° C で混合物をスピンします。
- ペレットに触れることがなく、繊細なティップを持つ上清を除去します。5 分のペレットを風乾、5 倍 - 10 倍上下ピペッティングで 6 μ L H2O (37 ° C に加温) のでそれを再懸濁します。
- 1 kb + はしご、スーパーはしごとカット ノーカット プラスミドと臭化エチジウム (EtBr) を含む 2% の agarose のゲルの消化の製品を実行することによってルシフェラーゼ プラスミドの線形化を確認します。ゲルを検査し、カットのプラスミッドのため車線 ~ 4 kb (ノーカットのプラスミドがある 3 つのバンドで単一のバンドを示して 場合の in vitro転写に進みます図 1)。
注意: EtBr は発がん性があります。化学の発煙のフードで働いてください。
-
で外因性参照 RNA プラスミドの生体外のトランスクリプション
- 消化プラスミド製品の各チューブの in vitro転写法を用いたin vitro転写を実行します (テーブルの材料を参照してください)。製造元の指示に従って、適切なファージ RNA ポリメラーゼを使用します。CDNA 合成法はポリ a の尾を必要とする他のアプリケーションは、ポリ a の尾を必要とする場合、ポリ a テールの追加が含まれていますの in vitro転写方法の選択 (材料の表を参照してください)。
- すべてを組み合わせるの in vitro転写製品精製前シングル 1.5 mL ポリプロピレン チューブに。
-
Purif生体外のトランスクリプション反作用からの RNA の ication
- 浄化の in vitro転写製品の in vitro転写クリーン アップ キット (材料の表を参照してください)。製造元のプロトコルに従ってください。
- 260 で吸光度を測定することにより RNA 濃度を評価する nm 吸光光度法を用いたします。
注: RNA 濃度がビール ランベルトの法則を使って計算されます。これは、核酸の吸光度 (260 強く光を吸収する nm) は濃度に比例します。1.0 の吸光度は、一本鎖 RNA の 40 μ g/mL と同じです。
-
早かった PCR にストック RNA 実験用チューブします。
- RNA 濃度が 1 μ g/μ L を確認します。
- RNA 濃度が > 1 μ g/μ L の場合、1 μ g に株式を希薄化/μ L。 PCR に μ L 分注 1 チューブ、-80 ° C で保存
- RNA 濃度が < 1 μ g/μ L の場合 5 M 酢酸アンモニウム (キットに付属) を使用して追加の降水量は製造元のプロトコルに従って実行できます。RNA 濃度が < 1 μ g/μ L でまだ場合は、PCR チューブに早かった 1 μ L で進みます。
- RNA 濃度が 1 μ g/μ L を確認します。
2. コーティング
注: 手順 2.1 2.10 は、予想される細胞の播種前に実行される 24-48 h をする必要があります。
- 250 ° C のオーブンを予熱します。
- 2 スライド グラスを包む滅菌手袋を使用して、アルミ箔で x。スライドの表面に直接触れないでください。
- 250 ° C で 1 時間オーブンでスライドを焼くし、部屋の温度に冷却するためのスライドを許可します。
注: この手順は、任意の汚染のエンドトキシンを破壊するために重要です。 - スライドは、冷却しながらフィブロネクチンの原液 1 mg/mL の蒸留水を行い解散する 37 ° C で 30 分間インキュベートします。100 μ L の因数を作る。脇に即座の使用のための因数と将来の使用のための残りの因数をフリーズします。
- キャビネット、バイオ セーフティにスライド ガラスを入れる前にアルミ箔の外側のカバーの包みを開けます。バイオ セーフティ キャビネットの 2.9 と 2.6 2.7 の手順を実行します。
- 無菌長方形 4 よく細胞培養皿にスライド ガラスを配置します。
- 蒸留水とフィブロネクチン原液 1: 100 を希釈します。1 ml の希釈フィブロネクチン、滴ずつ、ピペットを使用して各スライドをコートします。スライド全体が覆われていることを確認します。
- スライド 37 ° C で 24-48 時間の培養インキュベーターで孵化させなさい。
- 、孵化後 4 も細胞培養皿を傾けることによって、フィブロネクチンを吸引します。アスピレータを直接スライドに触れないでください。
3. への細胞播種ガラス スライドします。
- 初期の通路 (通路 2-5) でひと内皮細胞をカウントでメディア (1.0 x 10 の6セル/mL メディア) の 1 ml 各フィブロネクチン コーテッド ガラス スライド上に 10 の6セル × ~1.0 をシードします。実行される他の治療ではない場合、セル流の予想されるアプリケーションの前に 24 h をシードします。
注: これらの数字は、24 h の流れの実験のためのガイドとして使用されます。- 細胞の収穫および RNA の抽出時に細胞のコンフルエント単層を達成するために播種密度を調整します。
- 37 ° C で 15 分間のスライドに付着細胞を聞かせてください。
- スライドをカバーする細胞培養皿のメディアの 3 mL を追加し、37 ° C、5% CO2で 24 時間で細胞をインキュベートします。
4. 小型による干渉 RNA (siRNA) トランスフェクション
-
SiRNA トランスフェクションと流れの実験用スライド ガラス上のセルの作製
- ガラスのスライドの準備と流れの実験のためのコーティングの手順 2 (スライド コーティング) と 3 (細胞がスライド ガラス上に播種) でプロトコルに従ってください。
- 種子は、siRNA の治療 (層流の申請の前に 48 h) 前に 24 h 細胞します。
- シード翌日合流点 85-95% を達成するためにスライドごと 750,000 に 1 x 10 の6セルで抗生物質自由な媒体のひと内皮細胞。
注: 新生活はこのプロトコルで使用されます。
-
(スライド) あたり siRNA 脂質ベースのトランスフェクション試薬複合体の作製
- デザイン カスタム Sirna や興味の目的遺伝子の Sirna をあらかじめ作られた順序。
注: は、バイオ セーフティ キャビネットで以下の手順を実行します。 - 減らされた血清中の 414 μ L の siRNA (20 μ M 株式) の 6 μ L を追加 (材料の表を参照してください)、軽くピペッティングで混ぜます。
- 軽く混合脂質ベースのトランスフェクション試薬の 49.5 μ L を希釈 (材料の表を参照してください) 減らされた血清中の 130.5 μ L で。
- 優しく混ぜ、5 分間室温で孵化させなさい。
- 希釈した Sirna と脂質ベースのトランスフェクション試薬を組み合わせて、優しく、ミックス、室温で 15 分間インキュベートします。脂質ベースのトランスフェクション試薬複合体の中断を避けるために優しくミックス。
注: ソリューションが曇り錯体フォームとして表示されます。 - 複合体を形成している, の成長培地を取り除き、洗浄セル 1 減少血清培地で x。
- 2.4 mL 減少血清培地を各スライドに追加します。
- 各プレートにゆっくり混合 siRNA 脂質ベースのトランスフェクション試薬複合体の 600 μ l 添加し前後にミックス プレートをロックします。SiRNA の最終濃度が 40 nM。スライドが完全に覆われているを確認します。
- 4 h の 37 ° C でセルを孵化させなさい。
- トランスフェクション混合物の取り外しなしで通常濃度のウシ胎児血清 (FBS) × 3 を含む抗生物質無料内皮細胞成長媒体の 1 つの mL を追加します。
- 使用する準備ができるまでは、37 ° C でセルを孵化させなさい。
- デザイン カスタム Sirna や興味の目的遺伝子の Sirna をあらかじめ作られた順序。
5.9せん断応力に基づく流量の計算
- 次の式に従って目的のせん断応力に基づく流量を計算します。
ここは
Qは mL/分の流量
Τは、ダイン/cm2で目的のせん断応力 (1 Pa = 10 ダイン/cm2);
wは cm の平行平板流室の幅
hは cm の平行平板流室の高さ
μは cP (g/cm·s) でメディアの粘度です。
注: 典型的な薄層せん断応力実験 (非拍動性) このワークフローでは、 τで行われます = 1 Pa (10 ダイン/cm2)。μなどコーン プレート粘度計粘度計を使用して測定することができますおよび血清および追加デキストラン9を含む媒体の内容によって異なります。 - 特定τ (剪断応力) を達成するために、流量や粘度を調整します。高い流動度で付着性のセルがスライドから切り離して考えます。典型的なフロー室サンプル流量は表 1のとおりです。
6. システムと複数の平行平板流室 (図 2) を監視するための専用の環境のセットアップ
- 大型温水ユニット/インキュベーターを使用し複数の棚、内部電気へのアクセス、およびガラスのドア-(調節可能な CO2と組み込み環境) と熱のビーチと呼ばれる-を同時に複数のフロー室を収容するための実験せん断応力とトリートメントまたは出力 (つまりDNA、RNA および蛋白質) の 2 つ以上間の直接比較の両方が必要です。
注: ビーチ環境の頻繁に中断することがなく流量を含むフロー回路を頻繁に監視できます。 - 十分な CO2が実験のため利用可能な CO2監視が機能していることを確認します。加湿の空気があるように水トレイが適切に満ちているを確認します。
7. 平行平板流装置のセットアップ
注: 平行平板の製造を参照してくださいレーンら9。
- オートクレーブ流れ表 2に示されているように各平行平板流室設定のためプレート、貯水池、ダンパー、チューブ、ルアーズを部屋します。
-
流れループ アセンブリ (図 3) のセットアップ。
- 滅菌タオル生物学的安全キャビネット。流れループ システム、生物学的安全キャビネット内の平行平板流チャンバーなし最初を組み立てます。
- 貯水池のチューブ アセンブリに接続します。
- 1 つの穴に 2 つ #14 流量リザーバーのキャップ 2 つの穴の他にソフト チューブ #14 ハード チューブを挿入します。流出管として貯水池の底に触れてソフト チューブのいずれかいることを確認します。
- 1/16"の場所 #14 ハード末雄ルアー管し、通気孔として滅菌フィルターを付けます。
- 1/16「場 #14 ソフト流入終わりに女性ルアー チューブ、貯蔵所から、4 ウェイの活栓を接続。
注: 遺伝子発現解析や perfusates がない収集する必要があります他の研究は、2 三方活栓は 4 三方活栓のこのプロトコルの代わりに使用できます。 - 1/16「場貯水池からの #14 ソフト流出管端から男性のルアー。
- ポンプ用チューブにタンク流出管を接続: 場所 1/16"#13 ハード管 (チューブ ポンプ) の各端に女性のルアー。1/16"接続することによって、#13 ハード チューブに貯水池から #14 ソフト流出管を接続一緒に男性と女性の称号。
- 'ダンパー橋' チューブ ポンプ用チューブを接続: 場所 1/8"男性ルアーと 1/8" #16 ソフト チューブの両端に女性のルアー。1/16"接続と 1/8」(末の流出ポンプ用チューブ) #13 ハード チューブの女性ルアー #16 ソフト チューブの男性のルアー。
- フロー ダンパーのチューブを組み立てる: 場所 3/16"#25 ソフト チューブの一方の端に男性ルアー フロー ダンパーの反対側にこの手順を繰り返しますと。#25 ソフト チューブの自由端をフロー ダンパーのそれぞれの側に接続します。
- チューブとフロー ダンパーの 'ダンパー橋' チューブを接続: 1/8"を使用して 'ダンパー橋' の #16 ソフト チューブとフロー ダンパーから #25 ソフト チューブを接続女性ルアー #16 'ダンパー橋」側から、既に配置した 3/16" 男性ルアー#25 柔らかいダンパー チューブ側。
- 「商工会議所橋' チューブを組み立てます。
- 1/8「場女性ルアーと 1/8"#16 ソフト チューブ ('商工会議所橋' チューブ) の各端男性のルアー。
- 接続 1/8"3/16" と「商工会議所の橋」の女性ルアー フロー ダンパーの自由端から #25 ソフト チューブで男性のルアー。
- 1/8"'商工会議所橋' チューブの男性ルアー (自由端) の 4 ウェイ活栓を場所します。
- (ステップ 7.2.2.3) から貯水池流入ソフト チューブから 4 ウェイ活栓に '商工会議所橋' の自由端から 4 ウェイ活栓を接続します。活栓を閉じる。
- 貯水池とダンパーにメディアを追加します。せん断応力に 48 h 露出、貯水池、ナイトシーンを 25 mL にメディアの 35 mL を追加します。動実験及び播種された細胞の数の期間に基づいてメディアのボリュームを調整します。
- ビーチでポンプに組み立てられた流れのループ システムをもたらします。ポンプの頭に #13 ハード チューブ (ポンプ チューブ) に置き、固定します。活栓を開きます。
- ポンプをオンにし、ポンプの速度を徐々 に増やします。ループ システムを通って循環するメディアをしましょう。任意のリークや閉塞 (例えば、圧力上昇) を確認します。メディアが貯蔵所に戻って流れることを確認します。
-
フロー チャンバー アセンブリのセットアップ
- 1/8「場 #16 ソフト一方端に女性ルアー管し、、4 ウェイ活栓を接続。トップ プレート (流入側) の右側に管の自由端を接続します。
- 1/8「場ソフト #16 一方端に男性ルアー管し、、4 ウェイ活栓を接続。トップ プレート (流出側) の左側に管の自由端を接続します。
- 1/8「場男性ルアーと 1/8"#16 ソフト チューブ両端女性のルアー (バブル トラップ管)。バブル トラップを介して1/8"チューブを付ける男性ルアー。チューブを介して1/8"の他の端に 4 ウェイの活栓を接続女性ルアー。
- 滅菌ピンセットを使用して、セル シード ガラス スライドから転送 4 ウェルの細胞培養ディッシュ凹部に底板に。スライド ガラスのセル シード側を向いていることを確認します。
- 10 mL のシリンジを使用して、プレートの周りの赤いガスケット ライン内底板に暖かいメディアの 10 mL を追加します。スライドを通過し、セルをカバーするメディアを許可します。スライドに直接メディアを追加しないでください。
- 1 つの側面から他への位置合わせ、底板の上に天板をそっと置きます。気泡の導入は避けてください。しっかりと一緒にプレートをネジします。
- プレートの右側にある (流入) 活栓を開いて、30 mL シリンジを使用して温かみのあるメディアの 20 mL をゆっくりフラッシュ バブル トラップから空気の泡を削除します。プレートの左側にある (流出) 活栓を閉じてし、メディアはバブル トラップ活栓 (オープン) が流れることを確認します。フラッシュ メディアを破棄します。
- バブル トラップの活栓を閉じて、部屋の左側にある (流出) 活栓を開きます。45 ° の角度に商工会議所の左側にある (流出) を昇格させるし、優しく暖かいメディア室から空気の泡を削除する商工会議所の右側にある (流入) から 30 mL シリンジを使用しての 20 mL をフラッシュします。窓からは、泡を視覚化できます。フラッシュ メディアを破棄します。
- 商工会議所とキャップの両側の活栓を閉じる。顕微鏡で細胞を検査します。
- 以前組み立てたループ システムが付いている浜に商工会議所を輸送します。
- ゆっくりとポンプの速度を減少し、ポンプを停止します。漏れを防ぐために流動ループ系の活栓を閉じる。
- 商工会議所を接続し、システムを介して一緒に活栓をループします。すべての活栓を開きます。
- ゆっくりとポンプの速度を増加し、セットアップは、任意のリークや閉塞を調べます。メディアが一方向に循環する貯水池に戻ることを確認します。
- 商工会議所の流入側にある '商工会議所橋' チューブにフロー センサーを配置します。センサーは流れの方向に正しく指向であることを確認します。
- 目的のせん断応力に基づく計算された、流量を取得するポンプの速度を調整します。
注: 流量は高さと各商工会議所の幅だけでなく、メディアの粘度に応じて異なる場合があります。 - 5% CO2を達成し、ビーチ内水トレイを配置する CO2タンクを入れます。
8. 流れ区域からの RNA の抽出、細胞の収穫
- 流れの目的の期間が完了すると、ゆっくり 0 蠕動ポンプの速度を下げるし、電源を切ります。すぐに開いているすべての活栓を閉じるし、商工会議所と各端の活栓に接続されているチューブを削除します。
- クリーン ベンチに商工会議所を取るし、優しくトップ プレートを削除するすべてのネジを外します。針鼻ピンセットを使用して、底板からスライド ガラスを削除し、100 mm 径の組織培養皿に入れます。
- 10 ml の冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)-/- のスライドを洗浄し、細胞接着性と流れの方向の配置を確認する顕微鏡下で細胞をチェックします。
- プレートから PBS を吸引し、スライドをきれいな 100 mm 径の皿に転送します。RNA の抽出からの換散バッファーの 350 μ L を追加キット (材料の表を参照)、β-メルカプトエタノール、スライドの 1/100 を含みます。
注意: は、化学の発煙のフード β-メルカプトエタノールを追加します。 - ポリエチレン翼細胞スクレーパーを使用してスライドの外細胞をこすり取る。下部には、プールに液体を有効に組織培養皿を傾けて、鉗子でスライド ガラスを取り外します。ピペットの細胞ライセート 1.5 mL チューブに氷の上保管してください。
- 0.0025 ng/μ L のサンプルに追加する前にシリアル希薄によるストック外因性参照 RNA (ルシフェラーゼ RNA) を希釈します。たとえば、ストック濃度が 1 μ g/μ L、1/400,000 の希釈が 0.0025 を達成するために必要です ng/μ L の追加 10 μ L 希釈ルシフェラーゼの細胞ライセート下流の RNA の単離と解析のために各サンプルに RNA。
- 製造元の指示に従って RNA の抽出のプロトコルを続行または凍結ライセート-80 ° c まで書き出しを続行することができます。
9。 RNA の抽出および cDNA の統合の効率の計算
注: は、理論収量および実験の収量を比較することによって RT qPCR 後ルシフェラーゼ効率を計算します。
- ルシフェラーゼ RNA の理論収量を決定します。
- ルシフェラーゼ コピー サンプルあたり追加の総額を決定します。(0.025 ng/サンプルを追加する = ルシフェラーゼ RNA RNA の抽出前にサンプルごとの 10 の7枚 × 2.73)。
- 330 g/mol のヌクレオチドあたり平均分子固まりをしてホタルのルシフェラーゼ 1652 ヌクレオチド RNA の長さを掛け合わせることで、ルシフェラーゼの RNA の分子の質量を計算します。
- ルシフェラーゼ追加 RNA の量を分割 (0.025 ng) モル量を生成する分子固まりによって RNA の抽出の前に各サンプルの。乗算をアボガドロ数サンプルあたり追加コピーを生成します。
- 式を使用してのルシフェラーゼ コピー各 RT qPCR 反応理論収率を計算します。
- RT qPCR の標準曲線を生成するルシフェラーゼ プラスミドを用いたルシフェラーゼ コピー各 RT qPCR 反応の実験的利回りを計算します。
- 方程式を用いたルシフェラーゼ効率 (%) を計算します。
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Representative Results
制限酵素を用いたルシフェラーゼ プラスミドの成功した線形は agarose のゲル (図 1) の実行中の消化製品によって確認されました。DNA の梯子を使用して線形補間の製品のサイズを確かめたとノーカットのプラスミドとの比較。
我々 は車線らから平行平板流室設定を適応しています。9複数条件/トリートメントせん断応力または複数のせん断応力条件を必要とする実験。我々 は複数を収容することができます、ビーチ専用の環境を使用してフローの完全に組み立てられた回路の流量 (図 2) を監視しているすべて。流量の監視だけ上流平行平板アセンブリ (図 3)。流回路と料金は、温度、湿度、またはビーチ内ガスの含有量の変動を引き起こすことがなくガラスのドアを介して直接監視できます。
製造工程は、室高さの小さな変化につながることができます。したがって、同じせん断応力 (表 1) を達成するために各商工会議所の流量を計算する必要があります。理論的には、同一の高さと同じせん断応力を達成するために同一流量を使用することができますベーキングチャンバー シリーズで使用することができます。血管内皮細胞での典型的な実験 0 - のせん断応力を使用して 1 のペンシルバニア州流のせん断応力を 1.5 Pa モデル動脈内皮せん断応力がこのワークフローで使用されていた。使用時間の経過とともにポンプ ヘッド設定間やポンプ ヘッド バリエーションするもことができます。流量計を使用してこれらの違いを考慮できます。
よくせん断応力のアプリケーションを用いて実験を含む複数のせん断応力の条件、治療条件、および時点。可能であれば、我々 は実験の設定で任意の変動のアカウントへの内因性参照 RNA を使用します。いくつかの実験のため定量的な安定性と内因性参照 RNA を見つけることはない実現可能な16です。さらに、定量安定性または内因性遺伝子サンプル間の不安定性をどちら刺激依存性に及ぼす細胞発現レベルまたは RNA の抽出または逆のトランスクリプションの効率の変化に起因することができます。アカウントのこれらの非効率性と内因性の参照の遺伝子が定量的に安定ではない設定で、スパイクの外因性参照の遺伝子を使用します。哺乳類の血管内皮細胞における層流のせん断応力を組み込む実験、外因性 RNA スパイクで、(図 4 a) としてホタルのルシフェラーゼ RNA を使用します。
図 4に示すせん断応力実験 Krüppel 様因子 2 (KLF2) を評価する分析 Rt-qpcr 実験データ損失の機能 siRNA を用いたします。KLF2 は血管内皮細胞の流れと流2設定で内皮細胞の遺伝子発現の主要な転写仲介で転写因子誘導されます。
図 4 aは、それぞれ 2 つの流れの部屋を使用して 3 つの独立実験のルシフェラーゼ効率を示しています。ルシフェラーゼ効率が実験 (実験 1) のサンプル間に似ているまたはいくつかの可変性 (実験 2 と 3) を表示できます (図 4 a)。これらの結果は実験的システムで特に貴重な小さな絶対変更だけが見られています。外因性の参照の遺伝子の使用は、実験的治療が逆のトランスクリプションまたは PCR17の効率を妨げる可能性が実験で特に重要かもしれません。図 4 aに示されている結果は典型的であります。ルシフェラーゼ効率 5% RT qPCR によってルシフェラーゼ RNA (すなわちRNA の初期開始量) の RNA の抽出前にサンプルに追加その 5% が検出されたことを示します。サンプルまたは単一の実験内の条件のルシフェラーゼの効率は、通常 ± 50%。ルシフェラーゼ効率の変動は > 50%、実験手順や条件の見直しを含める必要があります注意して結果を解釈する必要があります。
図 4 bは、それぞれ複数の平行平板流チャンバーを使用して繰り返しせん断応力の実験から RT qPCR の典型的な実験結果を示しています。各実験内 KLF2 mRNA の発現は、3 つの方法で正規化されます。最初の正規化は、内因性参照 RNA、サイクロフィリン A (CycA) を使用しています。第 2 正規化では、外因性参照 RNA、ホタルのルシフェラーゼ (リュック) を使用しています。第 3 正規化参照を使用して両方、内因性と外因性 RNA。各実験は、図 4 bに示すように、内 3 つの正規化方法 (内因性の参照の遺伝子、外因性の参照の遺伝子、一緒に両方の内因性と外因性の参照の遺伝子の正規化) 同様の結果が得られます。大幅、正規化法では、(例えば、> 50% の差につながる) 結果が変更された場合、結果は慎重に解釈すべき。正規化の方法間にかなり変動がある実験における従属変数をすることができる、内因性参照発現確認必要があります。同様に、実験手続きと条件を確認必要があります。図 4 bsiRNA を用いた KLF2 ノックダウンには、3 つの独立した実験 (実験 1、2、および 3) 間と同様のノックダウン効率が得られます。1 せん断応力両院同時実行されているフローを使用してこれらの実験では、3 つの異なる生物学的サンプルを使用我々 各実験のための Pa。
図 1: 外因性ルシフェラーゼ プラスミドの線形化の Agarose のゲル画像。スーパーと 1 kb + DNA の梯子は、ノーカットの両方を決定し、(kb) の kilobases のルシフェラーゼ プラスミドのカットサイズのマーカーとして使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 専用の環境 (ビーチ) 内の複数のフロー回路アセンブリの概要。両方流回路の流量が簡単にリアルタイムで監視、乱すことがなく環境、および両方の回路を同時実行できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 単一のフロー回路アセンブリの概要。チューブのサイズと使用ルアーズはこの図で示されます。流量計は流れの方向に流れ区域の上流側に配置ことを確認します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 代表に起因するせん断応力負荷内皮細胞における KLF2 機能喪失実験 (1 Pa) 24 時間の(A) このパネルは、3 つの別々 の流れ実験外因性ルシフェラーゼ RNA の定量化。ルシフェラーゼ効率実験 (実験 1) のサンプル間で類似またはいくつかの可変性 (実験 2 と 3) を表示できます。ルシフェラーゼ (絶対コピー)は、ルシフェラーゼ標準曲線を用いた絶対定量による量的な PCR の逆転写酵素 (RT qPCR) によって検出された RNA のコピー数です。ルシフェラーゼの効率は、(プロトコルの手順 8 参照) を乗じた各サンプルの理論ルシフェラーゼ コピーで割った値実験ルシフェラーゼのコピーです。ルシフェラーゼの相対的な効率は、各実験内基準状態 (フロー + Ctlsi) で割った各サンプルのルシフェラーゼ効率です。(B) これらのパネルを見るサンプルの剪断応力のセットにおける遺伝子発現の正常化実験両方の内因性と外因性の参照の遺伝子。結果は、量的な PCR の逆転写酵素 (RT qPCR) からです。1 のせん断応力を伴う層流存在下で KLF2 mRNA 発現のノックダウンを示す 24 時間 FC の Pa = フォールドの変更;CycA = サイクロフィリン A、内因性参照 RNA; として使用リュック = ルシフェラーゼ、外因性参照 RNA として使用されます。男らから適応データ5.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 室内高さ (ミクロン; μ m) |
室内幅 (センチメートル; cm) |
1 Pa のせん断応力は流量 (mL/分) | 粘度 (センチポアズ; cP) |
| 303.80 | 1.90 | 19.48 | 0.90 |
| 326.10 | 1.90 | 22.45 | 0.90 |
| 344.84 | 1.90 | 25.10 | 0.90 |
| 319.06 | 1.90 | 21.49 | 0.90 |
表 1:の高さと 1 のせん断応力を達成するためにいろいろなフロー装置の流量の例の部屋のペンシルバニア州
| J 布 |
| ピンセット |
| リザーバー ボトルとキャップ |
| ダンパーとキャップ |
| 流れのループ |
| 1/16"男性ルアー x 3 |
| 1/16「女性ルアー x 3 |
| 1/8「男性ルアー x 2 |
| 1/8「女性ルアー x 4 |
| 3/16"男性アダプター x 2 |
| 14 L/S ハード チューブ (2 インチ) x 1 |
| 14 L/S ソフト チューブ (5 インチ) x 2 |
| 16 L/S ソフト チューブ (3 インチ) x 2 |
| 25 L/S ソフト チューブ (3 インチ) x 2 |
| 13 L/S ハード チューブ (10 インチ) x 1 |
| 流れの部屋 |
| 1/8「男性ルアー x 2 |
| 1/8「女性ルアー x 2 |
| 16 L/S ソフト チューブ (3 インチ) x 3 |
| 上部と底板 |
| ネジ |
表 2: 部分プロトコルの手順 6.2 でオートクレーブになります。
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Discussion
せん断応力は、定常状態の遺伝子表現2,5に影響を与える部分、血管内皮機能を調節する生理的な条件です。様々 な剪断応力条件下での遺伝子発現制御のモデルは、血管内皮機能の一層の理解に貢献します。この実用的なワークフローに適応レーンらから平行平板流チャンバーを用いたフロー回路が含まれています9と表します層流、非拍動流。全体のセットアップは、複数フロー チャンバーを必要とし、この設定で実験的変動を最小限に抑えるための実験を容易にするために設計されました。
流回路アセンブリこのワークフローの主要部品である、レーンらから適応9します。 このアセンブリおよびプロトコルのいくつかの適応実験システムの違いを反映して行われました。大型温水ユニット、ビーチは同時操作と同じ環境の中でいくつかのフロー回路の監視を容易にします。このシステムは、1 h の 7 日、せん断応力のいくつかのレベルから様々 な期間の血管内皮細胞にずり応力のアプリケーションの正常に使用されています (例えば1.0、1.5、および 2.0 Pa)。このシステムは遺伝子ノックダウン研究せん断応力 (図 4)5の設定でフロー反応内皮細胞遺伝子の機能を評価するためにも使われました。ポンプとポンプのヘッドは、通常の磨耗・損傷による時間の経過を変更可能性がありますもかなりばらつきがあります。位置フロー センサーを使用して、これらの違いのために、我々 継続的に流量を監視の流れ区域の近位。チューブ ・ ルアーズの様々 なサイズは、各コンポーネントのタイトなフィットを確保するため、実験中に漏洩を防ぐために使用されます。我々 はセルをカウントしスライド ガラス、滴状、あたりの約 1,000,000 セルをシードし、37 ° C、付着効率を高める 15 分インキュベート細胞をさせます。我々 は剪断応力の申請の前に少なくとも 24 時間ひと内皮細胞をシードせん断応力9の申請の前に短時間のためシードできるよう、血管内皮前駆細胞と比較しています。短い期間は、流れ、または不連続層にしても適切な播種密度の内皮細胞の中に細胞の外れにつながります。せん断応力の適用の前後の両方前に内皮細胞のコンフルエント単層のスライドの検査を重視しています。我々 はフィブロネクチン、自然な細胞外マトリックス成分18、被覆スライドがゼラチンでコーティングされた側面と比較して一貫して内皮細胞単層より多くを維持するを見つける (維変性コラーゲン I 型)。最後に、このプロトコルでフロー ダンパーは、メディア、他のメーカーのメディアの 190 mL と比較しての 30 mL を使用する最適化されています。
流回路アセンブリ内のいくつかの手順では、追加の心配を要求します。内皮細胞も単分子膜が剪断応力の適用前に確立されます。スライドと、したがって、全体のスライド範囲に準拠した細胞の数を増やすに滴下ガラス スライド上に細胞をシードすることが重要です。マルチ スライド トレイに流されるのではなく、スライドに付着する細胞の十分な時間を提供するので、シードと一般的にスライドに他のメディアを追加のセル間の待機時間は播種効率を向上します。せん断応力の適用中に、前後にセルを視覚的に検査します。顕微鏡は、この目的のため、ビーチで配置できます。フロー センサーは正しい向きで接続する必要があり、それぞれ個々 の流れ区域の対象流量をチェック必要があります。流れループ システムは、メディア漏れ無しまたは実際の実験中に細胞の摂動を避けるために、圧力の上昇など、他の問題を確保するため商工会議所なし潅流する必要があります。点検し、システム内の気泡を除去します。流れのループ システムをテストしながら、活栓、中断のない、一方向のフローを許可する蠕動性ポンプの電源を入れる前にすべての開いているを確認します。すべて活栓はループする流れ区域を接続する前に閉じられ、ポンプを再起動する前に完全に開くことを確認します。
我々 は、外因性の参照の遺伝子の添加がさまざまなシナリオで役に立つことを見つけます。内皮細胞のメディアはしばしば PCR17の阻害剤であるヘパリンを含んでいます。いくつかの RNA の抽出のプロトコルは、ヘパリンを削除する手順を組み込む中微量サンプルの PCR の効率の違いを引き起こす可能性が。強力なトリートメントも定量的に安定している内因性の参照の遺伝子の識別を妨げることがあります。私たちの研究室では、外因性参照 RNA として使用する 5' キャップ、ポリ A の尾を持つルシフェラーゼの RNA を総合する効率的なプロトコルを作成しています。この戦略は、市販の RNA を購入と比較してコスト効率の高いアプローチを証明しています。外因性参照 RNA の準備時に、複数の凍結融解サイクルを避けるために使い捨ての因数に割り切れる RNA に重要です。徹底的なミキシングと正確なピペッティング因数間の整合性の維持に重要です。典型的な実験 5% ± 2.5% の範囲のルシフェラーゼ効率が 1%-10% から及ぶことができます。外因性参照 RNA 効率の内因性参照 (ハウスキーピング) 遺伝子 RT qPCR 結果を修正することをお勧めします。
実施実験哺乳類モデルで参照 RNA スパイクの非哺乳類としてホタルのルシフェラーゼ シーケンスが使用されます。実験では、ホタルのルシフェラーゼがセルで表される、適切な参照の遺伝子は言えません。線虫miRNA cel ミール 3919およびリブロース二リン酸カルボキシラーゼ植物 RNA20を含む、他種特異的な遺伝子を使用ことができます。
この流れの回路は、2 D 単層培養プラスチックやガラスは、かなり硬い上に成長した内皮細胞をモデル化します。剛性マトリックスは、流体せん断応力21に内皮細胞の応答に影響を与えます。このモデルを用いて比較的高い酸素濃度の静脈血酸素濃度よりも動脈のよう。このモデル閉じた心血管系の大きな船の直線セグメントに似ておりスライドに内皮細胞の比較的均一な環境を提供します。分岐や血管、曲率などの 3次元構造で他の特定の条件は、このモデルでは表されません。他のシステムは、血管系の湾曲地域のそれらを含む他のフロー パターンをモデルが、このプロトコルで記述されているシステムより少ない細胞をもたらします。同様に、他のアセンブリは、> 10 の6セル × 1 が必要な場合、または単一細胞解析が必要な場合より適切かもしれない。私たちの現在のアプリケーションは、非拍動流をモデル化します。しかし、このモデルは、流量を常時監視、一貫性と、脈動や振動の波形を含む他の波形を生成する使用できます。
全体的に、この実用的なワークフローは、監視対象流量と複数のフロー チャンバーに剪断応力の同時申請システムを提供します。材料と手順このワークフローの中では、サンプルと条件の実験的変動を最小限に抑えるために設計されています。このワークフローは、RNAi 実験層流の設定で正常に使用されています、層流のせん断応力で複数の条件または複数層のせん断応力の大きさおよび/または時間ポイントなどを必要とする実験にも使えます代替の波形。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は機構モップ 142307 デザイナーデュオに支えられた H.S.J.M. はカナダの協会の健康研究研修プログラムの再生医学の交わりで受信者。H.S.J.M.、A.N.S.、京浜、および M.K.D. は、女王エリザベス II 大学院奨学金の科学技術の受信者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
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