Micron-skala fenotypning tekniker för majs kärlknippena baserat på röntgen Microcomputed tomografi
Summary
Vi erbjuder en ny metod för att förbättra X-ray absorption kontrasten av majs vävnad passar vanliga microcomputed tomografi skanning. Baserat på CT-bilder, införa vi en uppsättning bild-bearbetningen arbetsflöden för olika majs material effektivt extrahera mikroskopiska fenotyper av kärlknippena majs.
Abstract
Det är nödvändigt att exakt kvantifiera de anatomiska strukturerna av majs material baserat på hög genomströmning bild analystekniker. Här ger vi en ‘prov förberedelse protocol’ för majs material (dvs., stjälk, blad och rot) som är lämpliga för vanliga microcomputed datortomografi (mikro-CT) skanning. Baserat på högupplösta CT bilder av majs stjälk, blad och rot, beskriver vi två protokoll för fenotypisk analys av kärlknippena: (1) baserat på CT bilden av majs stammen och blad, vi utvecklat en viss bild analys rörledning för att automatiskt extrahera 31 och 33 fenotypiska drag av kärlknippena; (2) baserat på CT bild serien av majs rot, vi sätter upp en bild bearbetningen system för tredimensionell (3-D) segmentering av metaxylem fartyg, och utvinns tvådimensionell (2D) och 3D-fenotypiska drag, såsom volym, yta metaxylem fartyg, m.m. Jämfört med traditionell manuell mätning av kärlknippena majs material, förbättra de föreslagna protokoll avsevärt effektiviteten och precisionen av micron-skala fenotypiska kvantifiering.
Introduction
Majs kärlsystemet löper genom hela anläggningen, från rot och stam på bladen, som bildar viktiga transport sökvägar för att leverera vatten, mineral näringsämnen och organiska ämnen1. En annan viktig funktion i det vaskulära systemet är att ge mekaniskt stöd för majs växten. Till exempel är morfologi, antal och fördelning av kärlknippena i rötter och stammar närbesläktade med logi motståndet av majs växter2,3. För närvarande studier på anatomiska struktur kärlknippena utnyttja främst mikroskopiska och ultramicroscopic tekniker för att visa en viss del av den stam, blad eller rot, anatomiska strukturer och sedan mäta och räkna dessa strukturer av intresse av manuell undersökning. Utan tvekan, manuell mätning av olika mikroskopiska strukturer i storskaliga microimages är en mycket tidskrävande och ineffektiva arbete och begränsar allvarligt precision microphenotypic drag, på grund av dess subjektivitet och inkonsekvens4, 5.
Majs har ingen sekundär tillväxt och cellinnehållet består huvudsakligen av vatten i primär meristemen. Utan någon förbehandling, kan färska prover av majs vävnader direkt skannas med en mikro-CT enhet; avsökningen resultaten är dock förmodligen dålig och grov. De främsta orsakerna kan sammanfattas som följer: (1) låg dämpning tätheter av växt vävnader, vilket resulterar i en låg kontrast atomnummer och höga brus i bilder; (2) färskt växtmaterial är benägna att torka ut och krympa under normala skanning miljön, som rapporterats av Du6. Ovannämnda problemen har blivit de huvudsakliga begränsningarna för utveckling och tillämpning av microphenotyping teknik för majs, vete, ris och andra monokotyledoner. Här, vi införa Protokollet’ prov förberedelse’ att förbehandla proverna på majs stjälk, blad och rot. Detta protokoll undviker uttorkning och deformation av växtmaterial under CT skanning; Därför är det fördelaktigt att öka bevarandetiden för av växtprover med nondeformation. Dessutom förbättrar steget färgning baserat på solid jod också kontrast av växtmaterial; därmed, det gör betydande förbättringar i imaging kvaliteten på mikro-CT. Dessutom har vi utvecklat programvara bildbehandling, heter VesselParser, att bearbeta CT bilderna av majs stjälkar och blad. Denna programvara integrerar en uppsättning bild-bearbetningen rörledningarna att utföra hög genomströmning och automatisk fenotypning analys för 2D-CT-bilder av olika vävnader. Kärlknippena i hela tvärsnittet av majs stammen och blad upptäcks, extraheras och identifieras med hjälp av en automatisk bildbehandling metod. Som ett resultat, får vi 31 mikroskopiska fenotyper av majs stammen och 33 mikroskopiska fenotyper av majs blad. För CT bild serien av majs roten utvecklat vi ett system för bildbehandling att förvärva 3-D fenotypiska drag av metaxylem fartyg. Detta system är överlägsen i effektivitet bild förvärv och återuppbyggnad jämfört med traditionella metoder.
Dessa resultat tyder på att bildbehandling rörledningar med tanke på vanlig röntgen mikro-CT imaging egenskaper ger en effektiv metod för den mikroskopiska fenotypning av kärlknippena; Detta extremt vidgar tillämpningar av CT tekniker i växtbiologi och förbättrar den automatiska fenotypning av växtmaterial på cellulära resolution6,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med en framgångsrik tillämpning av CT teknik inom biomedicin och materialvetenskap, har denna teknik gradvis införts i fälten i botanik och jordbruk, främja forskningar i växten biovetenskap som en lovande tekniska verktyg . I slutet av 1990 användes CT teknik först studera de morfologiska strukturer och utveckling av anläggningen rotsystem. Under det senaste decenniet, synchrotron HRCT har blivit ett kraftfullt och icke-förstörande verktyg för växt biologer, och har framgångsrikt använts för att identifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av den nationella natur Science Foundation i Kina (No.31671577), vetenskap och teknik Innovation speciella konstruktion finansierade Program för Beijing Academy av jordbruk och skogsbruk Sciences(KJCX20180423), forskningen Utvecklingsprogram i Kina (2016YFD0300605-01), Stiftelsen Beijing naturvetenskap (5174033), Peking postdoktoral forskning Foundation (2016 ZZ-66), och Beijing Academy av jordbruket och skogsbruket vetenskaper Grant (KJCX20170404),) JNKYT201604).
Materials
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
References
- Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
- Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
- Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
- Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
- Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
- Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
- Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
- Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
- Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
- Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
- Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
- Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295 (2013).
- Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
- Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673 (2014).
- Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26 (2015).
- Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
- Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655 (2015).
- Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829 (2016).
