Techniques de phénotypage micron-échelle de maïs faisceaux vasculaires issu de tomographie à rayons x Microcomputed
Summary
Nous fournissons une méthode originale pour améliorer le contraste d’absorption des rayons x des tissus de maïs adapté pour la numérisation de la tomographie microcomputed ordinaire. Basée sur des images de CT, nous présentons un ensemble de flux de traitement d’image pour différents matériaux de maïs extraire efficacement des phénotypes microscopiques des faisceaux vasculaires du maïs.
Abstract
Il est nécessaire de quantifier avec précision les structures anatomiques des matériaux maïs issu des techniques d’analyse d’images de haut débit. Ici, nous fournissons un « protocole de préparation d’échantillon » de maïs matériaux (c.-à-d., tige, feuilles et racine) adaptés aux microcomputed ordinaires tomodensitométrie micro-numérisation. Basé sur des images haute résolution de CT de tige de maïs, feuilles et racine, les auteurs décrivent deux protocoles pour l’analyse phénotypique des faisceaux vasculaires : (1) basé sur l’image de CT de tige de maïs et de feuilles, nous avons développé un pipeline d’analyse d’image spécifique pour extraire automatiquement 31 et 33 caractères phénotypiques des faisceaux vasculaires ; (2) basé sur la série d’image de CT des racines de maïs, nous avons mis en place un régime de traitement d’image pour la segmentation d’en trois dimensions (3d) des navires de métaxylème et extrait bidimensionnel (2d) et des caractères phénotypiques 3D, tels que volume, surface habitable de navires de métaxylème, etc. Les protocoles proposés par rapport à la mesure manuelle traditionnelle des faisceaux vasculaires de maïs matériaux, améliorent considérablement l’efficacité et la précision de dosage phénotypique à l’échelle du micron.
Introduction
Le système vasculaire maïs traverse toute la plante, de la racine et la tige à feuilles, qui forme les chemins de transport clé pour livrer de l’eau, minéraux et substances organiques1. Une autre fonction importante du système vasculaire est de fournir un soutien mécanique pour les plants de maïs. Par exemple, la morphologie, le nombre et la répartition des faisceaux vasculaires dans les racines et les tiges sont étroitement liés à la résistance à la verse des plants de maïs2,3. À l’heure actuelle, des études sur la structure anatomique des faisceaux vasculaires principalement utilisent des techniques microscopiques et ultramicroscopiques pour afficher les structures anatomiques d’une certaine partie de la tige, feuille ou racine et ensuite mesurent et comptent ces structures de intérêt par enquête manuelle. Sans aucun doute, mesure manuelle de différentes structures microscopiques dans microimages à grande échelle est une œuvre très fastidieuse et inefficace et limite considérablement la précision des traits microphenotypic, en raison de sa subjectivité et incohérence4, 5.
Maïs n’a aucune croissance secondaire, et le contenu de la cellule se compose essentiellement de l’eau dans le méristème primaire. Sans aucun traitement préalable, les échantillons frais des tissus de maïs peuvent être directement numérisés en utilisant un dispositif de micro-CT ; Toutefois, les résultats d’analyse sont probablement pauvre et rugueuse. Les principales raisons sont résumées comme suit : la densité (1) faible atténuation des tissus végétaux, ce qui entraîne un faible contraste de numéro atomique et un bruit élevé en images ; (2) matières végétales frais ont tendance à déshydrater et rétrécir pendant l’environnement balayage normal, tel que rapporté par Du6. Les problèmes susmentionnés sont devenus les principaux obstacles pour le développement et l’application de la technologie microphenotyping pour le maïs, le blé, riz et autres monocotylédones. Ici, nous introduisons le « protocole de préparation d’échantillon » d’un prétraitement des échantillons de maïs tige, feuilles et racine. Ce protocole permet d’éviter la déshydratation et la déformation des matériaux végétaux pendant la tomodensitométrie ; ainsi, il est utile d’augmenter la durée de conservation des échantillons de plantes avec nondeformation. Par ailleurs, l’étape de teinture basée sur l’iode solide aussi améliore le contraste des matières végétales ; ainsi, il apporte des améliorations significatives dans la qualité d’image de micro-CT. En outre, nous avons développé le logiciel de traitement d’image, nommé VesselParser, à traiter les images de CT des feuilles et des tiges de maïs. Ce logiciel intègre un ensemble de pipelines de traitement des images pour réaliser une analyse phénotypage haut-débit et automatique pour les images CT 2-D des tissus végétaux différents. Faisceaux vasculaires à toute coupe transversale de la tige de maïs et de la feuille sont détectés, extraits et identifié à l’aide d’une méthode de traitement d’image automatique. Ainsi, nous obtenons 31 phénotypes microscopiques de la tige de maïs et 33 phénotypes microscopiques de la feuille de maïs. Pour les séries d’images CT de la racine du maïs, nous avons élaboré un schéma de traitement d’image d’acquérir 3D caractéristiques phénotypiques des vaisseaux de métaxylème. Ce régime est supérieur en efficacité d’acquisition d’images et de la reconstruction par rapport aux méthodes traditionnelles.
Ces résultats indiquent que l’image, traitement des tuyaux étant donné que les caractéristiques d’imagerie d’ordinaire micro-tomodensitométrie fournissent une méthode efficace pour le phénotypage microscopique des faisceaux vasculaires ; C’est extrêmement élargit les applications des techniques de CT en phytologie et améliore le phénotypage automatique du matériel végétal à résolution cellulaire6,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avec l’application réussie de la technologie de CT dans les domaines de la biomédecine et science des matériaux, cette technologie a été progressivement introduite dans les domaines de la botanique et l’agriculture, la promotion de recherches en sciences de la vie comme un outil technique prometteur . Dans les années 1990, technologie CT a été tout d’abord utilisée pour étudier les structures morphologiques et développement des systèmes de racine de plante. Au cours de la dernière décennie, synchrotro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par National Nature Science Foundation of China (No.31671577), la Science et technologie Innovation spécial Construction financés par le programme de Pékin Académie d’Agriculture et foresterie Sciences(KJCX20180423), la recherche Programme de développement de la Chine (2016YFD0300605-01), la Fondation des sciences naturelles de Beijing (5174033), la Beijing Postdoctoral Foundation (2016 ZZ-66) et recherche la Beijing Academy of Agricultural et subvention de Sciences forestières (KJCX20170404),) JNKYT201604).
Materials
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
References
- Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
- Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
- Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
- Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
- Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
- Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
- Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
- Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
- Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
- Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
- Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
- Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295 (2013).
- Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
- Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673 (2014).
- Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26 (2015).
- Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
- Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655 (2015).
- Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829 (2016).
