Summary
이 문서에서는 마이크로-CT 영상, 어떤 병 변 양이 정해질 수 있다와 전극 전체 뇌의 맥락에서 높은 정밀도와 위치에 대 한 작은 동물 두뇌를 준비 하는 간단한 방법을 설명 합니다.
Abstract
병 변 및 전극 위치 확인은 전통적으로 통해 조직학 검사 스테인드 뇌 조각의 수동 추정을 요구 하는 시간이 걸리는 절차 다. 여기, 우리는 장애를 측정 하 고 덜 힘 드는 이며 더 자세한 결과 뇌의 전극 위치에 대 한 간단 하 고, 간단한 방법을 설명 합니다. 전체 두뇌 오스뮴 tetroxide 물, 수 지에 포함 되며 마이크로 CT 스캐너로 촬영. 검사 결과 해상도와 가상 섹션 두께 샘플 크기에 따라 두뇌의 3D 디지털 볼륨 (쥐와 얼룩말 피리 새 류 대 한 복 당 12-15와 5-6 µ m 머리, 각각). 표면과 깊은 병 변 특징 하실 수 있습니다 및 단일 tetrodes, tetrode 배열, 전해질 장애, 그리고 실리콘 프로브도 지역화할 수 있습니다. 무료 및 독점 소프트웨어는 수동 또는 자동으로 모든 비행기와 세그먼트 볼륨에서 샘플 볼륨을 검사 하는 경험이 있습니다. 이 방법은 뇌 볼륨을 생성 하기 때문에 병 변 및 전극 비교 시간과 연구에 걸쳐 표준화 하는 데 도움이 됩니다 현재 방법에 보다 훨씬 더 높은 학위를 측정할 수 수 있습니다.
Introduction
신경 기능 및 뇌의 위치 사이의 관계를 이해 하기 위해서는 오랜 시간에 대 한 장애에 의존 했습니다. 예를 들어 우리의 이해 학습 및 메모리 불가결 되 고 마 키 충 동 제어에 대 한 것으로 전 두 엽 피 질 인간1,2serendipitous 변의 두 제품을 했다. 그러나 동물 모델,,를 사용 하 여 세 렌, 저쪽에 하 여 병 변의 힘을 활용 하는 신경 수 있다 그리고 수많은 뇌 영역의 기능을 통해 구조-기능 관계의 체계적인 연구를 통해 해명 되었습니다 했습니다. 병 변3,4.
그러나 올바르게 구조에 함수를 할당,, 병 변 연구는 부족 했던 지역 이다 정확한 정량화 절차 필요 합니다. 장애를 측정을 위한 현재 골드 표준 섹션, 마운트, 및 가벼운 현미경 이미지 두뇌입니다. 이미지 분할 영역 다음 아틀라스에 가장 가까운 부분에 일치와 과목에 걸쳐 변의 대략적인 좌표는 직접 보고, 종종 카메라 루시 다 이미지 또는 예제 조직학 조각3,4 사용 ,5,6,7,8,,910.
현재 병 변 부 량 절차의 부정확성을 넘어 이러한 기술은 시간과 실패 하는 경향이 있습니다. 뇌 경직, 블레이드 선명도, 및 온도에 작은 변화는 어설픈, 뒤틀린, 또는 찢어진 섹션으로 이어질 수 있습니다. 섹션 수 있습니다 또한 얼룩 하지 균등 하 게 하 고 설치 매체에 거품 때문에 몇 군데 잘못 될. 중요 한 것은, 단면, 시 뇌의 병 변의 위치의 3 차원 컨텍스트 손실, 두뇌 도전 병 변의 정확한 3D 개조를 만들기 됩니다.
병 변에 대 한 또 다른 일반적인 응용 단일 및 다중 전극 녹음 뇌에서의 위치 결정 되었습니다. 마지막 녹음 세션의 끝에, 연구팀은 전극 끝에 작은 전해질 병 변 유발 하 고 두뇌 조직학 기존 병 변 실험11에서 처리. 조직학 찾을 수 도전 되는 전해질 병 변 일반적으로 그들을 확인 하는 데 사용 하는 전극 보다 큰 하지만 충분히 작은 일반적으로 추가 문제, 위에서 설명한 동일한 단점에서 겪고 있다이 기술. Tetrode 배열의 경우 여러 전극 삽입 되 면 전해 병 변 통해 확인은 훨씬 더 도전. 대신 전해 병 변은 나중에12, 조직학 확인 전극에 염료를 사용 하 여 하지만이 기술은 전통적인 조직학와 함께 제공 되는 동일한 단점이 있습니다 겪고 있다.
여기, 우리는 깊이 있는 설명 얼룩 전자 현미경 (EM) 및 x-선 기법에 따라 최근 설명된 방법13 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT) 병 변 단정 하 고 전류 보다 작은 동물 두뇌에서 전극을 찾습니다 방법입니다. 마이크로-CT는 엑스레이 선과 하지 샘플에서 반사 하는 엑스레이 수집 하는 동안 360 ° 회전 하는 샘플에서 촬영 하는 이미징 기법입니다. 결과 어떤 방향으로 시각화 하 고 정확 하 게 측정할 수 있는 샘플의 고해상도 디지털 3D 재구성. 많은 교육 기관 있다 마이크로 CT 스캐너, 상업적으로 사용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 관심과 동물의 실험적인 조작 검토 하 고 하버드 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다. 여기에 설명 된 관류 쥐에 대 한 특정 하지만 작거나 비슷한 크기 두뇌를 가진 어떤 동물 든 지에 적용 되는 절차.
1입니다. 관류
- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1을 준비 합니다. 쥐에 대 한 (나이: 0.5-1.5 세, 무게: 250-600 g), 800-1000 mL 충분 해야 한다. 400 mL를 사용 하 여 동물과 정착 액을 희석 하는 추가적인 400 mL perfuse.
- 정착 액 2% (w/v) paraformaldehyde (PFA) 및 1 x PBS에 2.5% (w/v)도 (GA)으로 구성 된 준비. 쥐, 400 mL 충분 하다입니다. 재 관류 후 뇌의 후 고정을 위한 50 mL 원뿔 튜브에 50ml를 저장 합니다.
- 4-5 %isoflurane 가스 (0.8 L/min O2 21 ° C에서 1.0 바에서)에서 15 분 동안 쥐 anesthetize
- Intraperitoneally 나트륨 pentobarbital의 치명적인 복용량을 주사 (180 mg/kg).
- 발가락-핀치 반사 시험을 실시 하 여 동물에 반사 손실에 대 한 테스트. 동물의 반사 응답 잃은 때까지 관류를 시작을 기다립니다.
- 앞에서 설명한 intracardial 관류와 뇌 추출 프로토콜14 다음 솔루션에 따라: 1 x 125 mm Hg 피 제거 하에서 PBS의 400 mL와 함께 동물을 perfuse. 일단 모든 혈액 제거 되었으며 1 x PBS로 대체, PFA와 2.5%가 125 mm Hg에 1 x PBS에 용 해 2%의 솔루션의 400 mL와 함께 perfusing 시작 합니다.
참고: 경우에 절차는 쥐를 동물에 실시 되 고, 관류 절차만 중요 한 구성 요소는 PBS와 2% x 1 사용 하 여 PFA, 1 x PBS에 2.5%가. 솔루션 볼륨 및 관류 압력은 종에 따라 조정할 수 있다.
2입니다. 포스트 고정
- 2%에서 추출한 뇌를 배치 PFA, 2.5%가 PBS 솔루션 (이전 동물을 perfuse 하는 데 사용 하는 동일한 솔루션) x 1에서. 솔루션 볼륨 적어도 10 배는 두뇌의 볼륨 인지 확인 합니다. 쥐를 위해 솔루션 50 mL 50 mL 원뿔 튜브에 두뇌를 놓습니다. 2-3 일, 4 ° c.에 가볍게 흔들어 후 고정 샘플 저장
주: 샘플 50 mL 원뿔 튜브에 경우에, 궤도 통에 가로로 배치 됩니다 확인 최상의 결과. - 샘플 후 수정 되었습니다 오랫동안 충분히, 후 씻어 두 번 증 류 물 (ddH2O), 드 이온된 수 (diH2O), 또는 초순 샘플 4 다음 기간에 대 한 시간 ( 재료의 표참조): 1, 1, 1, 및 15 분.
참고:이 프로토콜 ddH2O, diH2O, 또는 초순 이어야 한다 상호 교환. 편의상, ddH2O 이제부터 물 정화를 참조 하 사용 됩니다.
3. 얼룩
주의:이 단계에 대 한 장갑을 사용 하는 동안 모든 솔루션 준비는 후드 아래를 수행 합니다.
- 적어도 10 배 솔루션 얼룩의 두뇌 볼륨을 준비 합니다. 쥐 두뇌, 2% (w/v) 오스뮴 tetroxide (OsO4) 50 mL에에서 준비 ddH2O 주식 4% OsO4 솔루션의 25 mL 및 ddH2오의 25 mL
주의: 오스뮴 tetroxide 휘발성 및 임시 실명 및 호흡기 문제를 일으킬 수 있습니다 하지 않을 경우 적절 하 게 처리. 보조 컨테이너 내에서 적절 한 화학 위험 컨테이너에서 오스뮴 tetroxide를 문의 하는 모든 자료를 삭제 합니다. - 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 두뇌를 놓고 OsO4 솔루션을 추가 합니다. 두뇌는 OsO4 조직에서 지질과 반응으로 갈색을 시작 한다.
- 튜브를 닫고 파라핀과 그것을 철저 하 게 봉인 외피 동안 누설 하지 않습니다 있도록 ( 재료의 표참조) 영화.
참고:는 오스뮴 휘발성 이며 반응할지 가벼운 튜브, 플라스틱 튜브를 제대로 밀봉 하는 것은 무척 중요 하다. 튜브 추가 보호를 위해 알루미늄 호 일 포장 될 수 있습니다. - 2 주 동안 50 rpm에서 궤도 셰이 커에 가볍게 흔들어 4 ° C에서 밀봉 된 튜브를 저장 합니다. 가로로 최고의 혼합 되도록 튜브를 놓습니다. 샘플 흔들어 동안 솔루션에 완전히 빠져들은 확인 합니다.
참고: 지속적으로 순환 하는 오스뮴은 허용 되지 않습니다, 만약 그것 수 있습니다 완전히 침투 하지 샘플, 그래서 뿌리에 수평 배치는 매우 중요 하다.
4. 포함
- 샘플은 2 주 동안 OsO4 incubated 되어, 후에 그것을 세척 ddH2O 5 시간 실 온 (RT)에서 다음 기간에 대 한: 1, 1, 1, 15, 및 모든 언바운드 OsO4 샘플에서 제거 60 분.
참고: 지난 60 분 교환를 포함 하 여 여러 교류는 밖으로 확산에 순환 시스템에서 모든 오스뮴을 허용 하는 데 필요한. - 4 ° c.에서 ddH2O 30 분 샘플을 씻어
참고: 오스뮴 샘플, 밖으로 확산 계속 수 있습니다 하지만 그 수량을 크게 이전 단계에서 감소 한다. - 결국 수 지로 침투 하는 에탄올과 샘플을 탈수. 탈수, 바꿉니다 ddH2O (30 분 각 4 ° C에서)에 대 한 다음 에탄올 희석의 10-20 mL: 20% (v/v) 에탄올과 80% (v/v) ddH2O; 50% (v/v) 에탄올과 50% (v/v) ddH2O; 70% (v/v) 에탄올 및 30% (v/v) ddH2O; 90% (v/v) 에탄올과 10% (v/v) ddH2O; 100%의 에탄올
- 다음과 같이 아세톤 또는 수 지 희석을 준비 합니다.
- ( 재료의 표참조)을 포함 하기 위한 제조업체의 지침에 따라 수 지의 100 mL를 준비 합니다.
- 33% (v/v) 수 지-67% 아세톤 솔루션으로 만들기 위해 50 mL 원뿔 튜브에 수 지의 15 mL를 붓고 하 고 100% 유리 증 류 아세톤의 30 mL를 추가 합니다.
- 50% (v/v) 수 지-50% 아세톤, 수 지의 22.5 mL 50 mL 원뿔 튜브로 부 어와 100% 유리 증 류 아세톤의 22.5 mL을 추가.
- 67% (v/v) 수 지-33% 아세톤 솔루션으로 만들기 위해 수 지의 30 mL 50 mL 원뿔 관에 부 어 하 고 100% 유리 증 류 아세톤의 15 mL를 추가 합니다.
- 수 지의 잔여 32.5 mL를 사용 하 여 100% 수 지 아래의 첫 번째 솔루션으로.
- 수 지 침투 과정 다음 아세톤 및 아세톤 또는 수 지 희석의 10-20 mL를 통해 샘플을 이동 하 여 시작: 4 ° C에서 30 분 동안 100% 아세톤 4 ° C에서 30 분 동안 100% 아세톤 그리고 실 온 (RT)에서 30 분 동안 100% 아세톤.
참고: 침투 과정의 나머지 부분에서 열린다 실시간 - 33% (v/v) 수 지 67% 아세톤 3 h RT에 RT, RT에서 3 h 67% (v/v) 수 지 33% 아세톤 및 실시간에 12 h에 대 한 100% 수 지에서 3 h에 대 한 50% (v/v) 수 지-50% 아세톤에 샘플을 담가
- 병에는 지침에 따라 수 지의 신선한 50 mL 배치를 확인 합니다. 그것은 치료 하실 것입니다 컨테이너에 샘플을 전송 (예., 일회용 금형 재료의 테이블에서에서 설명). 실시간에서 4 시간 동안 신선한 100% 수 지와 함께 샘플을 고취
참고: 신선한 수 지를 사용 하지 않으면 전날 만든 수 지 성급 하 게, 강화에 시작 되 고 샘플 조작 하기 어려울 것입니다. - 45 ° c.에 15 분 동안 진공 오븐에서 샘플을 드
참고:이 단계는 샘플 내에서 어떤 덫을 놓은 공기 거품을 제거 도움이 될 것입니다 하지만 그것은 중요 하지 않은 데이터의 품질에는 영향을 미치지 것입니다. - 마지막으로, 60 ° c.에서 48 h에 대 한 오븐에 샘플을 치료
5입니다. 마이크로-CT
- 일단 샘플을 치료 껍질 일회용 형을 하 고 마이크로-CT 기계와 스캔.
참고: 사용 되는 기계에 따라 설정이 달라 집니다. 재료의 테이블에에서 나열 된 저자에 의해 사용 되는 스캐너에 대 한 권장 설정이 130 kV, 0.1 m m 구리 필터 및 몰 리브 덴 소스, 1 초 노출, 프로젝션 4 프레임의 평균 135 µ A. 그러나, 경험 한다 보정 스캐너 개별적으로, 많은 요인 특정 세션 동안 최적의 설정에 영향을 미칠 것입니다. - 검사가 완료 되 면, 스캐너 소프트웨어와 함께 컴퓨터에 실험의 스캐너/소프트웨어 조합에 대 한 권장 매개 변수 샘플을 재구성 합니다.
- 마지막으로, 시각화 하 고 분석 하는 선택의 실험의 소프트웨어를 사용 하 여 복원된 디지털 볼륨 (예제 테이블의 자료 를 참조).
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Representative Results
전통적으로, 두뇌는 구분 병 변 계량 하 고 전극, 찾을 스테인드 하지만이 방법은 오류 발생, 노동 집약, 일반적으로 결과의 추정을 필요 합니다. 마이크로-CT 영상에 대 한 전체 두뇌를 준비 하 여 샘플을 손상의 가능성이 크게 감소, 관심의 기능, 전체 뇌의 맥락에서 분석 될 수 있습니다 및 방법을 빌려준다 많은 샘플의 병렬 처리를 상당히 샘플 준비를 과속.
메서드는 4 개의 주요 단계를 포함 한다: (1) 얼룩 오스뮴 tetroxide와 perfused 뇌, (2) 수 지에 두뇌를 포함, (3) 마이크로 CT 스캐너로 두뇌 이미징 및 (4) 분석 결과 디지털 볼륨 (그림 1). 이 문서에서는 1-3 단계는,으로 설명 4 (분석) 단계는 프로젝트의 특정 요구에 따라 상당히 달라 집니다.
반면 전통적인 단면화는 하나의 단면 방향을 미리 선택 되어야 한다에이 방법에서 결과 디지털 볼륨 3 차원에서 조작 그리고 거의 모든 방향에서 슬라이스 (그림 2a-2b). 사용자 또한 신경 섬유와 개별 glomeruli 있는 표시그림 2(c) 쥐 뇌의 후 각 전구 등 필요한 경우 더 높은 해상도에서 샘플의 일부를 스캔 수 있습니다. 메서드 또한 작은 동물 두뇌에 광범위 하 게 적용 됩니다. 이 확인 하려면 얼룩말 피리 새 류 뇌 쥐 두뇌에 대 한 사용 및 성공적인 디지털 볼륨 (그림 2e) 결과 동일한 프로토콜을 사용 하 여 준비 되었다. 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 마이크로-CT에 대 한 준비는 샘플의 조직 했다 마이크로-CT의 해상도 (그림 2d)을 초과 해 서 해상도에 크기 순서까지 손상 되지 확인. 그러나,이 기술은 전자 현미경 (EM)를 위해 부적 한 만드는 상당한 ultrastructural 손상 했다 주목 해야한다.
기술은 표면 병 변 (그림 3)를 찾는 데 사용할 수 있습니다 및 뇌 (그림 4) 내 깊은 병 변. 기술은 또한 제자리에단일 tetrodes, 전해질 장애, 충분 한 직경의 전극 트랙 찾기 허용, tetrode 배열 원래의 및 실리콘 프로브 제자리에 (그림 5).
실패 한 준비 잘못 된 버퍼를 사용 하는 경우에 발생할 수 있습니다 조직의 불완전 한 강화 작용 구성 된다 (그림 6). 그러나, 표면 특징은 필요한 경우에 예를 들어 다음 샘플의 표면에만 얼룩이 있을 수 있습니다는 실험에 대 한 충분 한.
그림 1 : 방법 개요. 준비 하 고 마이크로-CT 이미지를 사용 하 여 전체 뇌를 분석 하는 데 필요한 단계의 개요입니다. 그림13작가 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 마이크로 CT 화상 진 찰을 통해 병 변 특성의 기능. (한) Manipulatable 3D 볼륨 및 (b) 가상 조각 (13.9 μ m 복) 긴 에반스 쥐의 마이크로-CT 스캔에서 임의 방향에서. (c) 후 각 전구 높은 해상도 (4.9 µ m 복) glomeruli (흰색 화살표) 및 개별 신경 섬유 (파란색 화살표) 공개 스캔. (d) 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 이미지 (10 nm/픽셀) 마이크로 CT 영상에 대 한 준비는 쥐 뇌의 시각 피 질. (e) 얼룩말 피리 새 류 (Taeniopygia guttata) 뇌 이미징; 마이크로-CT에 대 한 준비 3D 볼륨 및 2D 조각 (5.6 µ m 복) 화관, 수평, 화살 비행기. 그림13작가 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 시각 피 질 병 변 특성 마이크로-중부를 사용 하 여 쥐 뇌 시각 피 질 quinolinic 산에서 lesioned의 (한) 3D 시각화. 왼쪽된 패널은 뇌 (뇌 병 변에 시각적 액세스할 수 있도록 약간 투명해)의 맥락에서 병 변의 볼륨을 보여줍니다. 오른쪽 패널 고립된 병 변 볼륨을 보여줍니다. (b) 화관, 수평, 화살 비행기 (12.8 µ m 복)에 병 변 2D 조각 상위 3 패널 돌아가려면된 섹션을 표시 하 고 하단 3 패널 표시 중첩된 병 변 주석 섹션. 이 병 변은 수동으로 주석이 추가 된 코로나 방향에서 마다 2 조각. 볼륨 다음 보간을 통해 만들었습니다. 그림13작가 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: dorso 측면이 병 변 특성 마이크로-CT 및 조직학을 사용 하 여 비교. 왼쪽 "뇌 1" 하반기 마이크로-CT (13.5 µ m 복) 이미징에 대 한 처리 (는) 화살, 수평 및 코로나 보기. 상위 3 패널 돌아가려면된 섹션을 표시 하 고 하단 3 패널 같은 섹션에 주석된 병 변 표시. 병 변은 수동으로 화살 비행기에 모든 2 섹션을 세그먼트와 연속적으로 보간됩니다. (b) "두뇌 1"의 절반 처리 조직학 가벼운 현미경 검사 법에 대 한 권리의 가장 가까운 일치 코로나 섹션. 패널 (c, d) (a, b) 유사 하지만 "두뇌 2"에 해당 됩니다. 2 뇌 병 변은 수동으로 세그먼트 코로나 비행기에 모든 8 섹션. (e) 1 (어두운 회색) 및 2 (밝은 회색) 두뇌의 오른쪽 반쪽 조직학 치료 병 변 특성. 패널 아래 (b, d, e) 숫자 bregma에 상대적인 위치에 해당합니다. (f) 왼쪽 뇌 1의 마이크로-코네티컷에 대 한 처리의 병 변 특성 첫 번째 패널 격리 된 병 변을 보여줍니다. 두 번째 및 세 번째 패널 두 관점에서 뇌의 병 변을 보여줍니다. (g) (f)와 동일 하지만 해당 뇌 2. (h) 병 변의 오버레이에 (f, g) 볼륨 디지털 뇌 병 변 특성의 비교에 대 한 능력을 보여주는. (F)에 병 변 (g), 병 변에 등록 하 고 모두 뇌 2의 왼쪽된 절반의 맥락에서 표시 됩니다. 그림13작가 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 마이크로-CT 영상 통해 전극 지역화. (a) 단일 tetrode 왼쪽 제자리에 (14.0 µ m 복). 상단 왼쪽된 패널: 크롬 tetrode; 쥐의 신체 callosum에 시각 피 질을 통해 여행의 위치를 보여주는 가상 코로나 섹션의 최대 강도 투영 오른쪽 상단: (a) (흰색 사각형)의 맨 위 왼쪽된 패널에 표시 된 이미지의 근접. 왼쪽 아래: 화살; 오른쪽 아래: 이식된 전극의 가로 보기 (흰색 화살표는 tetrode의 위치를 나타냅니다). (b) 전해 병 변 및 전극 (13.9 μ m 복) 쥐 뇌의 앞쪽 지역에 추적합니다. 상단 왼쪽: 전해 병 변으로 뇌의 3D 렌더링 (보라색 병 변을 나타내는 흰색 화살표) 밖으로 세그먼트; 오른쪽 상단: 코로나. 왼쪽 아래: 화살; 오른쪽 아래: 75 µ m 직경 텅스텐 전극과 전해질 병 변 (흰색 화살표)를 나타내는 수평 섹션 생산. 또한, 철회 시 전극에서 일부 금속 화살 보기 (흰색 화살표)에서 트랙을 따라 표시 됩니다. (c) 16-tetrode 이식 쥐 뇌의 앞쪽 피 질에 제자리에서 왼쪽. 상단 왼쪽: 왼쪽 이식; 16-tetrode 배열 전체 뇌의 3 차원 렌더링 오른쪽 상단: 코로나. 왼쪽 아래: 화살; 오른쪽 아래: 16 tetrode 이식 (8.9 µ m 복)를 나타내는 수평 섹션. (d) 실리콘 프로브 (10mm 생크, 32 사이트) 왼쪽 제자리에 후부 피 질, 해 마, 그리고 subcortical 구조 (13.9 μ m 복)을 통해 여행. 상단 왼쪽: 세그먼트 실리콘 프로브 (흰색 화살표 나타내는 녹색 프로브); 전체 뇌의 3 차원 렌더링 오른쪽 상단: 코로나. 왼쪽 아래: 화살; 오른쪽 아래: 수평 보기는 실리콘의 뇌에 조사. 또한, 실리콘 프로브에 참조 사이트 코로나와 화살 섹션 (흰색 화살표의 끝)에 표시 됩니다. 그림13작가 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 침투 오스뮴 오스뮴 tetroxide 용 매 효과. (a) 왼쪽된 패널: 쥐 뇌 ddH2O에서에서 오스뮴 tetroxide에 1 주 동안 incubated. 오른쪽 패널: 쥐 뇌 오스뮴 tetroxide ddH2O에서에서 2 주 동안 incubated. (b) 2 쥐 두뇌 오스뮴 tetroxide 나트륨 cacodylate 버퍼에서에 6 주 동안 incubated. 그림13작가 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
다음은 프로토콜에 중요 한 단계: 첫째, PFA와 조지아 동물 perfuse 이후 두뇌를 수정 후의 조합의 사용 했다 조직의 일관 된 전체 오스뮴 침투를 달성 하는 최고. 우리가 테스트 하지 않 았 명시적으로, 비록 그럴듯한 설명이입니다 PFA 고정 가역15, 반면 조지아 고정은 가역16,17. 오스뮴 tetroxide에서 2 주간 배양 조직의 전체 침투에 대 한 필요 하기 때문에, 뇌의 내부에 PFA 밖으로 확산 하 고 조직의 얼룩이 지기는 하는 동안 저하 가능 하다. 오스뮴 따라서 내부 구조를 유지할 수 없습니다.
버퍼에 녹아 있는 수성 오스뮴 오스뮴 반대를 사용 하 여 (즉, 나트륨 cacodylate)는 오스뮴에 의해 전체 조직 침투를 위해 절대적으로 필요 했다. 6 주 부 화 후에 나트륨 cacodylate에 녹아 오스뮴 완전히 조직에 침투 하지 않았다 그리고 발생 확산 배리어 (그림 6). 오스뮴 지질에 매우 민감 이며 세포 막18,,1920에 바인딩할 생각. 조직 충분히 permeabilized 하지 경우로 나트륨 cacodylate 같은 부드러운 버퍼의 경우 수도, 세포 막 수 오스뮴 포화 하 고 더 많은 오스뮴 조직으로 확산을 방지 sterically 가능 하다. 그러나 우리가 가설,, 물은 오스뮴에 대 한 용 매로 역할을 가벼운 세제를 충분히 조직에 깊은 확산 수 있도록 조직 permeabilizes.
경험 하는 마우스와 같은 더 작은 두뇌를 준비 하는 오스뮴에 부 화 시간 줄일 가능성이 있습니다. 마찬가지로, 부 화 시간 더 큰 견본에 증가 될 필요가 있다. 이 크기에 다른 쥐의 두뇌에서 일관 된 얼룩에 대 한 최소 시간 확인을 테스트할 수 있습니다. PFA와 오스뮴 (위에서 설명한) 대로, 그리고 오스뮴 중 부족 한 동요에 대 한 용 매로 물을 사용 하지 않는 관류와 후 고정 하는 동안 조지아 가능성이 문제 경험 전체 오스뮴 침투와 문제가 발생 하는 경우 사용 하지 않는 부 화입니다. 우리, 예를 들어, 그 때 발견 50 mL 원뿔 튜브에 잠복기 (으로 세로로 소유자에) 튜브 그들의 측면에 누워, 얼룩와 그들을 작성 하는 것과 전체 보육 기간 적절 한 보장에 대 한 50 rpm에서 궤도 셰이 커에 배치 침투입니다.
이 메서드는 여러 가지 방법으로 제한 됩니다. 첫째, 준비 유지 하지 않습니다 열 대권 외의 아주 잘, 그래서 전자 현미경 검사 법에 대 한 사용 하지 않아야. 이 메서드는 추가 조직학 나 면역 형광 검사와 결합할 수 없습니다. 디지털 볼륨의 해상도 샘플의 크기에 의해 결정 됩니다 (작은 샘플 높은 해상도에서 스캔 될 수 있습니다) 및 스캐너, 기하학적 배율;에 의존 하는 경우의 형상에 의해 그러나, 샘플의 하위 원하는 경우 더 높은 해상도에서 검색할 수 있습니다.
마이크로-CT 영상 측정 병 변에 대 한과 작은 동물 두뇌에 전극을 지역화 스타일 전자 현미경 조직 치료를 결합 하는 새로운 방법을 제시 하고있다. 이 메서드는 틀림 없이 덜 힘 드는, 적은 전문 지식이 필요로 고 단면화 및 두뇌를 얼룩이 지기에 대 한 현재 금 표준 보다는 더 쉽게 같지는 결과 생성 합니다. 이전에 과학자 들은 열 대권 외의 전자 현미경 검사 법21,22를 보존 하기 위한 것입니다 마우스 두뇌에 심지어 오스뮴 침투에 대 한 프로토콜을 설명 했습니다. 그러나,이 프로토콜은 매우 복잡 하다. 이 연구에서 저자 마이크로 CT 영상 전자 현미경 검사 법 보다는 훨씬 간단한 방법 개발 목적. 다양 한 목적에 대 한 두뇌 이미징에 마이크로-CT를 적용 하는 다른 연구 되었습니다. 토끼와 쥐에 이전 조사 마이크로-CT를 사용 찾을 종양과 다른 이상23. 이 조사 했다 독점 MRI 조 영제, 연구원은의 사용 병 변 연구에서 마이크로-CT의 잠재적인 유용성을 예측 했 어. 쥐에 있는 또 다른 연구 약 스크린에 대 한 심한 형태학 차이 마우스 두뇌는 두개골에서 요오드의 얼룩 참여 하지만 저자 고르지 조직 수축에 직면 하 고 히드로24에 조직을 포함 하기로 찾는 목적. 대뇌 동굴 같은 기형, 비정상적으로 크고 불규칙 한 모세 혈관의 장애를 찾아서 만든 쥐에 다른 연구 목적 있다 오스뮴 tetroxide 및 수성 요오드 얼룩;로 사용 그러나, 이들은 훨씬 작은 샘플 (분리 된 마우스 hindbrains) 보다 여기25,,2627에서 수행 했다. 3 차원 뇌 볼륨을 생성 하기 위한 다른 방법 µMRI28 있으며 고해상도 episcopic 현미경 검사 법31. µMRI의 해상도 가난한 (25 µ m 복 비슷한 샘플28), 그리고 기술은 더 비싼23,30. 고해상도 episcopic 현미경 검사 법에는도 전에 직면해: 그것은 파괴적인 기술, 그리고 전체 뇌 단면 수 있도록 블록 얼굴 기구 생산 될 필요가 있을 것입니다. 여기에 제시 된 작품은 또한 두 전극 캡처하고 주변 조직 하 여 엑스레이32,,3334 와 뇌에 전극을 찾으려고 노력 이전 확장 합니다. 또한, 기술은 단일 전극, tetrode 배열, 전해 병 변, 전극, 트랙과 실리콘 프로브를 찾는 수 있습니다.
가치 있는 미래 방향을 창조 된 병 변 연구 등록 될 수 있었다 공동 병 변의 위치와 크기 정량화를 표준화 하는 "평균 뇌" 아틀라스의 것 이다. 이 방법은 또한 다른 모델과 얼룩말 피리 새 류 뇌 (그림 2)에 즉시 응용 프로그램에 의해 exemplified로 비 모델 생물을 확대 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 감사 합니다 그렉 린과 아서 McClelland 자신의 전문성에 대 한 마이크로-CT 기계와 데이비드 리치몬드 및 이미지에서 헌터 엘리엇과 데이터 분석 코어 (IDAC) 처리 조언, 그들의 이미지에 대 한 하버드의과 대학에 보스턴에서 윌리엄 Liberti 기꺼이 얼룩말 피리 새 류 두뇌를 제공 하는 대학. 이 작업 수행 되었다 일부 센터에서 대 한 나노 시스템 (CNS), 구성원의는 국가 나노기술 조정 인프라 네트워크 (NNCI), NSF 보너스 번호 1541959에서 국립 과학 재단에 의해 지원 되는. CNS는 하버드 대학교의 일부입니다. 이 작품은 리처드와 수잔 스미스 가족 재단과 IARPA (계약 #D16PC00002)에 의해 지원 되었다. S.B.E.W. 인간 프론티어 과학 프로그램 (HFSP;에서 장학금에 의해 지원 되었다 LT000514/2014)와 유럽 분자 생물학 기구 (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. 여는 국립 과학 재단 (NSF) 대학원 연구 친교 프로그램 (GRFP)을 지원 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1x PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
References
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
- Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
- Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
- Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
- Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
- Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
- Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
- Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
- Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
- Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
- Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
- Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
- Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
- Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
- Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
- Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
- Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
- Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
- Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
- Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
- Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
- Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
- Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
- Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
- Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
- Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
- Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
- Fu, T. -M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).
