Summary
Denna artikel beskriver en enkel metod för att förbereda små djurs hjärnor för mikro-CT imaging, i vilka lesioner kan kvantifieras och elektroder ligger med hög precision i samband med hela hjärnan.
Abstract
Lesion och elektroden läge verifiering görs traditionellt via Histologisk undersökning av färgade hjärnan skivor, en tidskrävande procedur som kräver manuell uppskattning. Här, beskriver vi en enkel metod för att kvantifiera lesioner och placera elektroder i hjärnan som är mindre arbetskrävande och ger mer detaljerade resultat. Hela hjärnan är fläckade osmium vanligtvis, inbäddade i harts och avbildas med en mikro-CT-skanner. Skanningar resultera i 3D digital volymer av hjärnor med resolutioner och virtuella snittjocklekar beroende av urvalets storlek (12 – 15 och 5 – 6 µm per voxel för råtta och zebra Fink hjärna, respektive). Yta och djup lesioner kan karakteriseras, och enda tetrodes, tetrod matriser, elektrolytiska lesioner, och kisel sonder kan också lokaliseras. Gratis och egenutvecklade programvara tillåter praktiker att undersöka provvolymen från planet och segmentet volymen manuellt eller automatiskt. Eftersom denna metod genererar hela hjärnvolym, kan lesioner och elektroder kvantifieras i mycket högre grad än i nuvarande metoder, som hjälper dig att standardisera jämförelser inom och mellan studier.
Introduction
Neuroforskare har förlitat sig på lesioner under lång tid för att förstå förhållandet mellan funktion och läge i hjärnan. Exempelvis var vår förståelse av hippocampus som oumbärlig för inlärning och minne och prefrontala cortex som nyckeln för impulskontroll både produkter av serendipitous lesioner i människor1,2. Användning av djurmodeller, dock har tillåtit neuroforskare att utnyttja kraften av lesioner genom att gå utöver serendipity, och funktionen av otaliga hjärnområden har klargjorts genom systematiska studier av struktur-funktionssamband genom lesioner3,4.
Om du vill tilldela korrekt funktion en struktur, men kräver lesion studier exakt kvantifiering förfaranden, som är ett område som har saknats. Den nuvarande gyllene standarden för att kvantifiera lesioner är att avsnitt, mount och bild hjärnor med ett ljusmikroskop. Avbildad skivor matchas sedan närmaste avsnitten på en atlas, och de ungefärliga koordinaterna av lesioner över ämnen redovisas indirekt, ofta med hjälp av camera lucida bilder eller exempel histologiska skivor3,4 ,5,6,7,8,9,10.
Utöver den vaghet av nuvarande förfaranden för kvantifiering av lesion är dessa tekniker tidskrävande och benägna att misslyckas. Små förändringar i hjärnan stelhet, blade skärpa och temperatur kan leda till klantiga, skev eller trasiga delar. Sektioner kan också färga ojämnt och avbildas felaktigt på grund av bubblor i monteringsmedium. Viktigt, vid snittning är tredimensionella ramen för lesionens plats i hjärnan förlorad, att göra exakta 3D rekonstruktion av lesion i hjärnan utmanande.
En annan vanlig tillämpning för lesioner har varit att fastställa platsen för enstaka och flera elektrod inspelningar i hjärnan. I slutet av den sista sessionen, forskare inducera små elektrolytisk lesioner på elektroden spetsen och bearbeta hjärnan histologiskt som gjort i en konventionell lesion experiment11. Denna teknik lider de samma nackdelar som beskrivs ovan, med ytterligare problem är att de elektrolytiska lesionerna är oftast större än de elektroder som används för att göra dem men är vanligtvis tillräckligt små som de är utmanande för att hitta histologiskt. När flera elektroder sätts in, som i fallet med en tetrod array, är kontroll genom elektrolytisk lesioner ännu mer utmanande. Ett alternativ till elektrolytisk lesioner är en färgämnet på elektroden senare kontrollera histologiskt12, men denna teknik lider med samma nackdelar som kommer med konventionella histologi.
Här, vi beskriver ingående en nyligen beskriven metod13 baserat på färgningsteknik i elektronmikroskopi (EM) och röntgen datortomografi (mikro-CT) som kvantifierar lesioner och lokaliserar elektroder i små djurs hjärnor bättre än nuvarande metoder. Micro-CT är en bildteknik som röntgen är skott på ett prov som roteras 360° medan en scintillator samlar röntgenstrålarna inte avlänkas av provet. Resultatet är en högupplöst digital 3D rekonstruktion av provet som kan visualiseras i någon riktning och kvantifieras just. Många akademiska institutioner har mikro-CT-skannrar, som finns också kommersiellt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla vård och experimentella manipulation av djur var granskas och godkänns av Harvard institutionella djur vård och användning kommittén. Perfusionen beskrivs här är specifika för råttor, men förfarandet är tillämpligt på alla djur med mindre eller lika stora hjärnor.
1. perfusion
- Bered 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). För en råtta (ålder: 0,5 – 1,5 år gammal, vikt: 250 – 600 g), 800 – 1000 mL bör räcka. Använd 400 mL att BEGJUTA djuret och ytterligare 400 mL att späda fixativ.
- Förbereda fixeringsvätskan bestående av 2% (w/v) PARAFORMALDEHYD (PFA) och 2.5% (w/v) glutaraldehyd (GA) i 1 x PBS. 400 mL räcker för en råtta. Spara 50 mL i en 50 mL konisk tub för efter fixering av hjärnan efter perfusion.
- Söva råtta med 4 – 5% isofluran gas (vid 0,8 L/min O2 på 1,0 bar vid 21 ° C) i 15 min.
- Injicera en dödlig dos av natrium pentobarbital intraperitonealt (180 mg/kg).
- Test för reflex förlust i djuret genom att bedriva en tå-nypa reflex examen. Vänta med att börja perfusionen tills djuret har förlorat sin reflex svar.
- Följ de tidigare beskrivna intracardial perfusion och hjärnan extraktion protokoll14 med följande lösningar: BEGJUTA djuret med 400 mL 1 x PBS på 125 mm Hg för att ta bort blodet. När alla blod har tagits bort och ersatts med 1 x PBS, börja startas med 400 mL av en lösning av 2% PFA och 2,5% GA upplöst i 1 x PBS på 125 mm Hg.
Obs: Om förfarandet genomförs i ett djur som inte är en råtta, de enda viktiga komponenterna av perfusion förfarandet är användningen av 1 x PBS och 2% PFA, 2,5% GA i 1 x PBS. Lösning volymer och perfusionstrycket kan justeras efter arten.
2. efter fixering
- Placera de extraherade hjärnan i 2% PFA, 2,5% GA 1 x PBS lösning (samma lösning som används för att BEGJUTA djuret tidigare). Se till att lösningen volymen är minst 10 gånger volymen av hjärnan. För råttor, placera hjärnan i en 50 mL konisk tub med 50 mL lösning. Förvara provet i efter fixering för 2 – 3 dagar, skaka lätt vid 4 ° C.
Obs: Om provet är i en 50 mL konisk tub, placera den horisontellt i orbitalskak kommer att säkerställa bästa resultat. - Efter provet efter fastställts för länge nog, tvätta provet i dubbeldestillerat vatten (ddH2O), avjoniserat vatten (Dihs2O) eller ultrarent vatten (se Tabell för material) fyra gånger för de följande löptider: 1, 1, 1 och 15 min.
Obs: För detta protokoll, ddH2O, Dihs2O eller ultrarent vatten bör vara utbytbara. För enkelhetens skull kommer att ddH2O användas för att hänvisa till renat vatten hädanefter.
3. färgning
Varning: I detta steg måste genomföra alla lösning preparat under en huv medan du använder handskar.
- Bered minst 10 x hjärnvolymen av färgning lösning. För råtta hjärnor, förbereda 50 mL 2% (w/v) osmium vanligtvis (OsO4) i ddH2O genom att kombinera 25 mL av stamlösningen 4% OsO4 och 25 mL av ddH2O.
FÖRSIKTIGHET: Osmium vanligtvis är flyktiga och kan orsaka tillfällig blindhet och andningsproblem om inte hanteras korrekt. Kassera alla material som kontaktar den osmium vanligtvis i en lämpliga kemiska risker-behållare i en sekundär behållare. - Placera hjärnan i en ny 50 mL koniska tub och tillsätt OsO4 lösningen. Hjärnan ska börja bli brun som OsO4 reagerar med lipider i vävnaden.
- Nära röret och försegla det grundligt med paraffin filma (se Tabell för material) för att säkerställa att det inte läcker under inkubation.
Obs: Osmium är flyktiga och reagerar milt med plast-av röret, så tätning röret ordentligt är mycket viktigt. Röret kan vara radbrutna med aluminiumfolie för extra skydd. - Lagra förseglad röret vid 4 ° C, skaka lätt i orbitalskak vid 50 rpm i 2 veckor. Placera röret horisontellt för att säkerställa den bästa blandning. Säkerställa att provet är helt nedsänkt i lösningen under omskakning.
Obs: Om osmium inte är tillåtet att cirkulera kontinuerligt, det kan inte helt tränga igenom provet, så horisontell placering på shakern är mycket viktigt.
4. inbäddning
- Efter provet har inkuberats i OsO4 i 2 veckor, tvätta det med ddH2O 5 gånger vid rumstemperatur (RT) för de följande löptider: 1, 1, 1, 15 och 60 min att ta bort alla de obundna OsO4 i provet.
Obs: Flera utbyte, inklusive de senaste 60 min exchange, är nödvändigt att tillåta alla de osmium i cirkulationssystemet att sprida ut. - Tvätta provet med ddH2O under 30 minuter vid 4 ° C.
Obs: Osmium kan fortsätta att sprida ut ur provet, men dess kvantitet bör sänkas kraftigt från föregående steg. - Torkar ut provet med etanol så småningom infiltrera det med harts. För att torka, ersätta den ddH2O med 10 – 20 mL av de följande etanol spädningarna (för 30 min varje vid 4 ° C): 20% (v/v) etanol och 80% (v/v) ddH2O; 50% (v/v) etanol och 50% (v/v) ddH2O; 70% (v/v) etanol och 30% (v/v) ddH2O; 90% (v/v) etanol och 10% (v/v) ddH2O; 100% etanol.
- Bered de aceton/kåda utspädningarna enligt följande.
- Bereda 100 mL av kådan för inbäddning (se Tabell för material) enligt tillverkarens instruktioner.
- För att göra 33% (v/v) harts - 67% aceton lösning, 15 mL av harts och häll i en 50 mL konisk tub 30 mL 100% glas-destillerat aceton.
- För att göra 50% (v/v) harts - 50% aceton, 22,5 mL av harts och häll i en 50 mL konisk tub 22,5 mL 100% glas-destillerat aceton.
- För att göra 67% (v/v) harts - 33% aceton lösning, 30 mL av harts och häll i en 50 mL konisk tub 15 mL 100% glas-destillerat aceton.
- Använda de återstående 32,5 mL av harts som den första lösningen av 100% harts nedan.
- Påbörja harts infiltration processen genom att flytta provet genom 10-20 mL av de följande aceton och aceton/kåda spädningarna: 100% aceton för 30 minuter vid 4 ° C; 100% aceton för 30 minuter vid 4 ° C; och 100% aceton för 30 min i rumstemperatur (RT).
Obs: Resten av infiltration processen kommer att äga rum på RT. - Fördjupa provet i 33% (v/v) harts 67% aceton för 3 h på RT, sedan 50% (v/v) harts - 50% aceton för 3 h på RT, 67% (v/v) harts 33% aceton för 3 h på RT och 100% harts för 12 h på RT.
- Göra en färsk 50 mL parti av harts anvisningarna på flaskan. Överför provet till behållaren där det kommer att bli botade (t.ex., disponibel formarna beskrivs i Tabell för material). Ingjuta provet med fräsch 100% harts i 4 timmar vid RT.
Obs: Om färsk harts inte används, kådan gjort föregående dag börjar härda förtidigt och provet kommer att bli svårt att manipulera. - Degas provet i en vakuumugn för 15 min vid 45 ° C.
Obs: Detta steg hjälper bort någon instängd luftbubblor i provet, men det är icke-väsentliga och påverkar inte kvaliteten på data. - Slutligen, bota provet i en ugn för 48 h vid 60 ° C.
5. micro-CT
- När provet har torkats, lossnar den disponibla mögel och Skanna den med mikro-CT maskinen.
Obs: Beroende på vilken maskin som används, inställningarna är olika. För skannern används av författarna som anges i Tabell av material, är de rekommenderade inställningarna 130 kV, 135 µA med 0,1 mm koppar filter och en molybden källa, en 1 sekund exponering och ett genomsnitt på 4 bilder per projektion. Dock bör praktiker kalibrera skannern individuellt, eftersom många faktorer påverkar optimala inställningar under en viss session. - När genomsökningen är klar, rekonstruera provet med de rekommenderade parametrarna för de experimenter's skannerprogrammet/kombination på en dator med skannerprogramvaran.
- Slutligen, visualisera och analysera den rekonstruerade digital volym med de experimenter's programvara val (se Tabell av material för exempel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Traditionellt har hjärnor är sektioneras och färgas för att kvantifiera lesioner och lokalisera elektroder, men denna metod är tidskrävande, arbetsintensiva, och vanligtvis kräver uppskattning av resultaten. Genom att förbereda hela hjärnor för mikro-CT imaging, sannolikheten för skada proverna är kraftigt reducerad, funktioner av intresse kan analyseras inom ramen för hela hjärnan, och metoden lämpar sig för parallell bearbetning av många prover, betydligt påskynda provberedning.
Metoden innebär att fyra huvudsteg: (1) färgning en perfunderade hjärna med osmium vanligtvis, (2) bädda in hjärnan i harts, (3) imaging hjärnan med en mikro-CT-skanner och (4) analysera den resulterande digital volymen (figur 1). I den här artikeln beskrivs endast steg 1 – 3, som steg 4 (analysen) varierar avsevärt beroende på projektets specifika behov.
I traditionella snittning där ett snittningsfönster orientering måste väljas i förväg, den resulterande digital volymen från denna metod kan vara manipulerade i tre dimensioner och praktiskt taget skivad i någon riktning (figur 2a-2b). Användaren kan också skanna ett underavsnitt av provet vid en högre upplösning om så önskas, såsom luktbulben av en råtta hjärna, där nervtrådarna och enskilda glomeruli är synlig (figur 2c). Metoden är också i stort sett gäller för små djurs hjärnor. Kontrollera detta utarbetades en zebra Fink hjärna använder samma protokoll som används för råtta hjärnor och resulterat i en lyckad digital volym (figur 2e). Svepelektronmikroskopi (SEM) av ett prov som förberett för mikro-CT bekräftade att vävnaden inte skadad upp till en storleksordning i resolution bortom mikro-CT upplösning (figur 2d). Det bör dock noteras att det fanns betydande ultrastrukturella skada, vilket gör denna teknik olämpliga för elektronmikroskopi (EM).
Tekniken kan användas för att hitta ytan lesioner (figur 3) och skador djupt i hjärnan (figur 4). Tekniken möjliggör också den att lokalisera för enstaka tetrodes i situ, elektrolytiska lesioner, elektrod spår av tillräcklig diameter, tetrod matriser i situ, och kisel sonder i situ (figur 5).
Misslyckade preparat kommer att omfatta ofullständig mineralisering av vävnad, som kan också uppstå om felaktiga buffertar används (figur 6). Dock om bara ytstrukturen är nödvändiga, kan exempelvis då endast surface-färgning av provet vara tillräckligt för experimenter.
Figur 1 : Metoden översikt. Översikt över de steg som krävs för att förbereda och analysera en hela hjärnan med hjälp av mikro-CT imaging. Figur som används med tillstånd från upphovsmännen13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Kapacitet av lesion karakterisering genom mikro-CT imaging. (en) Manipulatable 3D volym och (b) virtuella skivor (13,9 µm voxlar) på godtyckliga riktlinjer från en mikro-datortomografi på en lång-Evans råtta. (c) luktbulben skannas på högre upplösning (4,9 µm voxlar) avslöjar glomeruli (vit pil) och enskilda nervtrådar (Blå pilspets). (d), svepelektronmikroskop (SEM) bild (10 nm/pixel) av visuella cortex av en råtthjärna förberedd för mikro-CT imaging. (e), Zebra Fink (Taeniopygia guttata) hjärnan förberedd för mikro-CT imaging; 3D-volym och 2D skivor (5,6 µm voxlar) i den koronala, horisontella och pilformigt flygplan. Figur som används med tillstånd från upphovsmännen13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Syncentrum lesion karakterisering med mikro-CT. (en) 3D visualisering av en råtta hjärnan bort i visuella cortex med quinolinic syra. Den vänstra panelen visar lesion volym i samband med hjärnan (hjärnan gjort något insyn för att möjliggöra visuell tillgång till lesion). Den högra panelen visar isolerade lesion volym. (b) 2D skivor av lesion i den koronala, horisontella och pilformigt flygplan (12,8 µm voxlar). De översta 3 panelerna visar avsnitten unsegmented och 3 bottenpaneler visar sektioner med putsade lesion annotation. Denna lesion var manuellt kommenterad i koronalt orientering varje 2 skivor. Volymen skapades sedan genom interpolation. Figur som används med tillstånd från upphovsmännen13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: jämförelse av dorso-laterala striatum lesion karakterisering med hjälp av mikro-CT och histologi. (en) pilformigt, horisontell och koronalt utsikt över vänster hälften av ”hjärnan 1” bearbetas för mikro-CT imaging (13,5 µm voxlar). De översta 3 panelerna visar unsegmented sektioner och 3 bottenpaneler visar kommenterad lesionen på samma avsnitt. Lesionen var manuellt segmenterade i sagittalplanet varje 2 sektioner och därefter interpolerade. (b) närmaste matchande koronalt avsnitt av rätten hälften av ”hjärnan 1” bearbetade histologiskt för ljusmikroskopi. Paneler (c, d) liknar (a, b) men motsvarar ”hjärnan 2”. Hjärnan 2 lesionen var manuellt segmenterad i koronalt planet varje 8 sektioner. (e) Lesion karakterisering av histologi-behandlade rätt halvorna av hjärnor 1 (mörkgrå) och 2 (ljusgrå). Numren i (b, d, e) under panelerna motsvarar positioner i förhållande till bregma. (f), Lesion karakterisering av vänster halva av hjärnan 1 bearbetas för mikro-CT. Den första panelen visar isolerade lesionen. Andra och tredje panelerna visar lesionen i samband med hjärnan från två synvinklar. (g) samma som (f) men motsvarande till hjärna 2. (h), överlagring av lesioner i (f, g) illustrerar möjligheten till jämförelse av lesion karakterisering med digitala hjärnan volymer. Lesion i f var registrerad på lesionen i (g), och båda är visat i samband med den vänstra halvan av hjärnan 2. Figur som används med tillstånd från upphovsmännen13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Elektrod lokalisering genom mikro-CT imaging. (en) enda tetrod vänster i situ (14,0 µm voxlar). Övre vänstra panelen: max intensitet projektion av virtuella koronalt avsnitt visar platsen för en kromnickellegering tetrod reser genom syncentrum i corpus callosum av en råtta; överst till höger: närbild av en bild som visas i den övre vänstra panelen av (a) (vit rektangel). Längst ned till vänster: sagittal; längst ned till höger: horisontella visningar av inopererade elektroden (vit pil anger platsen för tetrod). (b), elektrolytisk lesion och elektroden spår i den främre regionen en råtthjärna (13,9 µm voxlar). Överst till vänster: 3D-rendering av en hjärna med elektrolytisk lesionen segmenterad ut (vit pil som indikerar lila lesion); överst till höger: koronala. Längst ned till vänster: sagittal; längst ned till höger: horisontella sektioner som anger elektrolytisk lesion (vita pilar) produceras med en 75 µm diameter volframelektrod. Dessutom syns lite metall som deponerats av elektroden vid indragning längs spåret i vyn sagittal (vit pilspetsar). (c) 16-tetrod implantat kvar i situ i främre cortex av en råtthjärna. Överst till vänster: 3D-rendering av en hela hjärnan med en 16-tetrod array vänster implanteras; överst till höger: koronala. Längst ned till vänster: sagittal; längst ned till höger: horisontella sektioner som anger ett 16-tetrod implantat (8,9 µm voxlar). (d), kisel sonden (10 mm skaft, 32 platser) kvar i situ reser genom den bakre cortex, hippocampus och subkortikala strukturer (13,9 µm voxlar). Överst till vänster: 3D-rendering av en hela hjärnan med en segmenterad kisel sond (vit pil indikerar grönt probe); överst till höger: koronala. Längst ned till vänster: sagittal; längst ned till höger: horisontellt över en kisel sond i hjärnan. Dessutom är den hänvisning webbplatsen på kisel sonden synlig i avsnitten koronalt och sagittal (spetsen av vita pilarna). Figur som används med tillstånd från upphovsmännen13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Effekt av osmium vanligtvis lösningsmedel på osmium penetration. (en) vänstra panelen: råtthjärna inkuberas i osmium vanligtvis i ddH2O i 1 vecka. Högra panelen: råtthjärna inkuberas i osmium vanligtvis i ddH2O 2 veckor. (b) två råtta hjärnor inkuberas i osmium vanligtvis i natrium cacodylate buffert i 6 veckor. Figur som används med tillstånd från upphovsmännen13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Följande är viktiga steg till protokollet: först användning av en kombination av PFA och GA att BEGJUTA djuret och därefter efter fixa hjärnan var avgörande för att uppnå konsekvent full osmium penetration av vävnad. Även om vi inte testa detta uttryckligen, är en sannolik förklaring att PFA fixering är reversibel15, GA fixering är inte reversibel16,17. Eftersom en två veckors inkubation i osmium vanligtvis krävs för full infiltration av vävnad, är det möjligt att PFA inne i hjärnan diffunderar ut och vävnaden bryts ned under färgningen. Osmium kan inte således bevara de interiöra strukturerna.
Användningen av vattenbaserade osmium, i motsats till osmium upplöst i en buffert (dvs. natrium cacodylate), var absolut nödvändigt att säkerställa full vävnad penetration genom osmium. Även efter en 6 veckors ruvning, osmium upplöst i natrium cacodylate infiltrera inte vävnaden helt och tycktes möter en diffusionsspärr (figur 6). Osmium är extremt reaktiva till lipider och trodde att binda dem i cellmembranen18,19,20. Om vävnaden inte är tillräckligt permeabilized, som kan vara fallet med en mild buffert som natrium cacodylate, är det möjligt att cellmembranen kan mätta med osmium och produkter förhindrar mer osmium sprida i vävnaden. Vi hypotes, dock som vatten som lösningsmedel för osmium fungerar som ett ljus rengöringsmedel och permeabilizes vävnaden tillräckligt för att tillåta djupa diffusion in i vävnaden.
Om praktiker förbereder en mindre hjärna, såsom en mus kan inkubationstiden i osmium sannolikt minskas. Likaså behöver inkubationstiden ökas i större prover. Detta kan testas för att fastställa den minsta tid för konsekvent färgning i en hjärna som är olika i storlek än en råtta. Om praktiker får problem med full osmium infiltration, använder sannolikt problemen inte både PFA och GA under perfusion och efter fixering, inte med vatten som lösningsmedel för osmium (enligt ovan), och otillräckliga agitation under osmium inkubation. Vi hittade, exempelvis som när inkubation i 50 mL koniska rör, om rören på deras sida (i motsats till vertikalt på en hållare), fylla dem med fläcken och placera dem i orbitalskak vid 50 rpm för hela ruvningen period garanteras korrekt infiltration.
Denna metod är begränsad på flera sätt. Det första bevaras preparatet inte ultrastruktur mycket väl, så det inte bör användas för elektronmikroskopi. Denna metod kan inte kombineras med någon ytterligare histologi eller immunofluorescens. Resolutionen av den digitala volymen bestäms av storleken på provet (mindre prover kan skannas vid högre upplösningar) och av geometri av skannern, om det är beroende av geometriska förstoring; underavsnitt av provet kan dock skannas vid högre upplösningar, om så önskas.
En ny metod som kombinerar elektronmikroskopi-stil vävnad behandling med mikro-CT imaging för kvantifiera lesioner och lokalisera elektroder i små djurs hjärnor har presenterats. Denna metod är utan tvekan mindre arbetskrävande, kräver mindre sakkunskap och ger mätbara resultat lättare än nuvarande guldmyntfoten för snittning och färgning en hjärna. Tidigare har forskare beskrivit ett protokoll för även osmium penetration i mus hjärnor som är tänkt att bevara ultrastruktur för elektronmikroskopi21,22. Detta protokoll är dock ganska komplexa. I denna studie författarna syftar till att utveckla en enklare metod för mikro-CT tänkbar hellre än elektronmikroskopi. Det har gjorts andra studier tillämpar micro-CT för imaging hjärnor för olika ändamål. En tidigare utredning hos kaniner och möss används mikro-CT för att hitta tumörer och andra avvikelser23. Denna undersökning som gjort användningen av egenutvecklade Mr-kontrastmedel, men forskarna gjorde förutsäga mikro-CTS potentiella användbarhet i lesionen studier. En annan studie på möss som syftar till att hitta brutto morfologiska skillnader för en drog skärm inblandad färgningen av mus hjärnor med jod i skallen, men författarna inför ojämn vävnad krympning och valde att bädda in vävnaden i en hydrogel24. Andra studier på möss har syftade till att hitta cerebral cavernous missbildningar, en störning i onormalt stora och oregelbundna kapillärerna, och har gjort användningen av osmium vanligtvis och vattenhaltiga jod som fläckar; dessa utfördes dock i mycket mindre prover (fristående mus hindbrains) än beskrivs här25,26,27. Alternativa metoder för att generera 3D hjärnan volymer är µMRI28 och högupplösta episcopic mikroskopi31. µMRI upplösning är fattigare (~ 25 µm voxlar för liknande prov28), och tekniken är dyrare23,30. Högupplöst episcopic mikroskopi också står inför utmaningar: att det är en destruktiv teknik, och en block-face apparater så att hela-hjärnan snittning skulle behöva produceras. Arbetet presenteras här omfattar även tidigare ansträngningar att hitta elektroder i hjärnan med röntgenstrålar32,33,34 genom att fånga båda elektroden och omgivande vävnad. Dessutom tillåter tekniken för att lokalisera enda elektroder, tetrod matriser, elektrolytiska lesioner, elektrod spår och kisel sonder.
En värdefull framtida riktning skulle inrättandet av en ”genomsnittlig hjärna” atlas som lesion studier Co kunde registreras för att standardisera lesion läge och storlek kvantifiering. Denna metod kan också utökas till andra modell och icke-modell organismer, som exemplifieras av dess omedelbara tillämpningen till zebra Fink hjärnan (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Greg Lin och Arthur McClelland för sin kompetens med mikro-CT maskin, David Richmond och Hunter Elliott på bild och Data analys Core (IDAC) vid Harvard Medical School för deras bildbehandling råd, och William Liberti på Boston Universitetar för nådigt tillhandahåller en zebra Fink hjärna. Detta arbete utfördes delvis på Center för nanoskala system (CNS), en medlem av den nationella nanoteknik samordnad infrastruktur Network (NNCI), som stöds av National Science Foundation under NSF award nr 1541959. CNS är en del av Harvard University. Detta arbete stöddes av Richard och Susan Smith Family Foundation och IARPA (kontrakt #D16PC00002). S.B.E.W. stöddes av stipendier från Human Frontier Science Program (HFSP; LT000514/2014) och Europeiska molekylärbiologiska organisationen (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. stöddes av National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Program (GRFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1x PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
References
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
- Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
- Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
- Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
- Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
- Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
- Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
- Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
- Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
- Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
- Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
- Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
- Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
- Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
- Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
- Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
- Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
- Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
- Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
- Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
- Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
- Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
- Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
- Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
- Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
- Sharpe, J.
- Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
- Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
- Fu, T. -M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).
