Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En mikro-CT-basert metode for å karakterisere lesjoner og finne elektrodene i små dyr hjernen

Published: November 8, 2018 doi: 10.3791/58585
Automatic Translation
1,2, 2, 2,3, 1,2, 4, 1,2
1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Center for Brain Science, Harvard University, 3Department of Organismic and Evolutionary Biology, Harvard University, 4Institute of Science and Technology Austria

Summary

Denne artikkelen beskriver en enkel metode for å forberede liten dyr hjerne mikro-CT bildebehandling, som lesjoner kan kvantifiseres og elektroder med høy presisjon i sammenheng med hele hjernen.

Abstract

Lesjonen og elektroden plassering bekreftelse er tradisjonelt gjort via histologiske undersøkelse av farget hjernen skiver, en tidkrevende prosedyre som krever manuell beregning. Her beskriver vi en enkel, grei metode for kvantifisere lesjoner og finne elektrodene i hjernen som er mindre arbeidskrevende og gir mer detaljerte resultater. Hele hjernen er farget med osmium tetroxide, innebygd i harpiks og fotografert med en mikro-CT skanner. Skanner føre 3D digitale mengder hjernen med resolusjoner og virtuelle delen tykkelser avhengig av utvalgsstørrelsen (12-15 og 5 – 6 µm per voxel rotte og zebra finch hjerner, henholdsvis). Overflate og dyp lesjoner kan være preget og single tetrodes, sperrende matriser, elektrolytisk lesjoner og silisium sonder kan også være lokalisert. Gratis og proprietær programvare kan forskere å undersøke eksempel volumet fra flyet og segmentet volumet manuelt eller automatisk. Fordi denne metoden genererer hele hjernen volum, kan lesjoner og elektroder kvantifiseres i mye større grad enn i gjeldende metoder, som vil hjelpe standardisere sammenligninger innen og over studier.

Introduction

Nevrologer har stolt på lesjoner i lang tid for å forstå forholdet mellom funksjon og plassering i hjernen. For eksempel var vår forståelse av hippocampus som uunnværlig for læring og hukommelse og prefrontal cortex som nøkkel for impulskontroll begge produkter av serendipitous lesjoner i mennesker1,2. Bruk av dyr modeller, men har lov nevrologer å dra nytte av lesjoner ved å gå utover serendipity, og funksjonen til utallige hjernen områder har blitt belyst gjennom systematiske studier av struktur-funksjon relasjoner gjennom lesjoner3,4.

Hvis du vil tilordne riktig funksjon til en struktur, krever imidlertid lesjon studier nøyaktig kvantifisering prosedyrer, som er et område som har manglet. Gjeldende gullstandarden for kvantifisere lesjoner er å delen og montere bildet hjerne med lys mikroskop. Fotografert skiver deretter passer til de nærmeste delene på en atlas og de omtrentlige koordinatene av lesjonene over fag er indirekte rapportert, ofte ved bruk av kameraet lucida bilder eller eksempel histologiske skiver3,4 ,5,6,7,8,9,10.

Utover den upresisjonsverdier gjeldende lesjon kvantifisering prosedyrer er disse teknikkene tidkrevende og utsatt for svikt. Små endringer i hjernen stivhet, blad skarphet og temperatur kan føre til mislykket, vindskjev eller revet deler. Inndelinger kan også flekker ujevnt og avbildes feil på grunn av bobler i montering medium. Viktigere ved snitting er tredimensjonale sammenheng med lesjonens plassering i hjernen tapt, gjør nøyaktig 3D rekonstruksjon av lesjonen i hjernen utfordrende.

En annen vanlig søknad for lesjoner har vært å finne hvor enkelt og flere elektrode opptak i hjernen. På slutten av siste innspillingen, forskerne indusere liten elektrolytisk lesjoner på elektroden spissen og behandle hjernen histologisk som gjort i en vanlig lesjon eksperiment11. Denne teknikken lider fra samme ulempene beskrevet ovenfor, ytterligere problemer er at elektrolytisk lesjonene er vanligvis større enn elektrodene brukes til å gjøre dem, men er vanligvis små nok som de er utfordrende for å finne histologisk. Når flere elektroder settes, som i tilfelle av en sperrende matrise er bekreftelse via elektrolytisk lesjoner enda mer utfordrende. Et alternativ til elektrolytisk lesjoner er bruken av en farge på elektroden senere kontrollere histologisk12, men denne teknikken lider samme ulempene som følger med konvensjonelle histology.

Her beskriver vi grundig en nylig beskrevet metoden13 basert på flekker teknikker i elektronmikroskop (EM) og X-ray tomografi (mikro-CT) som quantifies lesjoner og finner elektrodene i små dyr hjerne bedre enn gjeldende metoder. Mikro-CT er en tenkelig teknikk som røntgenstråler skutt på et utvalg som roteres 360° mens en scintillator samler x-stråler ikke avledet av prøven. Resultatet er et høyoppløselig digitale 3D rekonstruksjon av prøven som kan visualiseres i noen orientering og kvantifisert nøyaktig. Mange akademiske institusjoner har mikro-CT skanner, som også er tilgjengelig kommersielt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle omsorg og eksperimentelle manipulering av dyr ble vurdert og godkjent av Harvard institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen. Perfusjon beskrevet her er spesifikk for rotter, men fremgangsmåten gjelder noen dyr med mindre eller tilsvarende størrelse hjerner.

1. perfusjon

  1. Forberede 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS). For en rotten (alder: 0,5-1,5 år, vekt: 250-600 g), 800-1000 mL bør være tilstrekkelig. Bruk 400 mL å perfuse dyr og en ekstra 400 mL å fortynne bindemiddel.
  2. Forberede bindemiddel bestående av 2% (w/v) paraformaldehyde (PFA) og 2,5% (w/v) glutaraldehyde (GA) i 1 x PBS. For en rotte er 400 mL tilstrekkelig. Lagre 50 mL i et 50 mL konisk rør for post fiksering av hjernen etter perfusjon.
  3. Bedøve rotte med 4-5% isoflurane gass (på 0,8 L/min O2 på 1,0 bar på 21 ° C) i 15 min.
  4. Injisere en dødelig dose av natrium pentobarbital intraperitoneally (180 mg/kg).
  5. Teste for refleks tap i dyr ved å gjennomføre en tå-klype refleks eksamen. Vent med å starte perfusjonen til dyret har mistet sitt refleks svar.
  6. Følg den tidligere beskrevet intracardial perfusjon og hjernen utvinning protokollen14 med følgende løsninger: perfuse dyret med 400 mL 1 x PBS på 125 mm Hg fjerne blodet. Når alle blod er fjernet og erstattet med 1 x PBS, starte perfusing med 400 mL av en løsning på 2% PFA og 2,5% GA oppløst i 1 x PBS på 125 mm Hg.
    Merk: Hvis prosedyren utføres i et dyr som ikke er en rotte, bare viktige komponenter i perfusjon prosedyren er bruk av 1 x PBS og 2% PFA, 2,5% GA i 1 x PBS. Den løsningen volumer og perfusjon press kan justeres avhengig.

2. etter fiksering

  1. Plasserer utpakkede hjernen i 2% PFA, 2,5% GA i 1 x PBS løsning (samme løsning brukes til å perfuse dyr tidligere). Kontroller at løsningen volumet er minst 10 x volumet av hjernen. For rotter, sette hjernen i en 50 mL konisk tube med 50 mL. Lagre utvalget i post fiksering for 2-3 dager, risting lett på 4 ° C.
    Merk: Hvis prøven er i et 50 mL konisk rør, plassere den horisontalt på en orbital shaker vil sikre best resultater.
  2. Når prøven er etter løst for lenge nok, vaske eksemplet i dobbel-destillert vann (ddH2O), de-ionisert vann (di2O), eller ultrapure vann (se Tabell for materiale) fire ganger for følgende varighet: 1, 1, 1 og 15 min.
    Merk: For denne protokollen, ddH2O, di2O eller ultrapure vann skal utskiftbare. For enkelhet brukes ddH2O til å referere til renset vann heretter.

3. farging

Advarsel: For dette trinnet, kan du utføre alle løsning forberedelser under hette mens du bruker hansker.

  1. Forbered minst 10 x hjernen mengden fargingen løsning. For rotte hjernen, forberede 50 mL av 2% (w/v) osmium tetroxide (OsO4) i ddH2O ved å kombinere 25 mL lager 4% OsO4 løsning og 25 mL av ddH2O.
    FORSIKTIG: Osmium tetroxide er flyktig og kan forårsake midlertidig blindhet og luftveisproblemer hvis ikke behandles på riktig måte. Forkaste alle materialer som kontakt osmium tetroxide i en passende kjemiske fare beholder i en sekundær beholder.
  2. Sette hjernen i en ny 50 mL konisk tube og legge til OsO4 løsningen. Hjernen skal begynne å bli brun som OsO4 reagerer med lipider i vevet.
  3. Lukk røret og forsegle den grundig med parafin film (se Tabell for materiale) for å sikre at det ikke lekker under inkubasjon.
    Merk: Osmium er flyktig og vil reagere mildt med plast rør, så tetting røret riktig er veldig viktig. Røret kan være brutt med aluminiumsfolie for ekstra beskyttelse.
  4. Lagre forseglet røret ved 4 ° C, rister lett på en orbital shaker på 50 rpm i 2 uker. Sett røret vannrett for å sikre den beste blanding. Kontroller at prøven er fullstendig neddykket i løsningen mens risting.
    Merk: Hvis osmium ikke er tillatt å sirkulere kontinuerlig, det kan ikke helt trenge prøven, så vannrett plassering på shaker er svært viktig.

4. innebygging

  1. Etter prøven har blitt ruget i OsO4 i 2 uker, vask den med ddH2O 5 ganger ved romtemperatur (RT) for de følgende varighetene: 1, 1, 1, 15 og 60 min fjerne alle ubundet OsO4 i utvalget.
    Merk: Flere børsene, inkludert siste 60 min utveksling, er nødvendig for å tillate alle osmium i sirkulasjonssystemet å spre ut.
  2. Vask prøven med ddH2O for 30 min på 4 ° C.
    Merk: Osmium kan fortsette å spre av prøven, men dypeste bør bli sterkt redusert fra forrige trinn.
  3. Tørke prøven med etanol å til slutt infiltrere det med harpiks. For å tørke, erstatte ddH2O med 10-20 mL av følgende etanol fortynninger (for 30 min hver på 4 ° C): 20% (v/v) etanol og 80% (v/v) ddH2O; 50% (v/v) etanol og 50% (v/v) ddH2O; 70% (v/v) etanol og 30% (v/v) ddH2O; 90% (v/v) etanol og 10% (v/v) ddH2O; 100% etanol.
  4. Forberede aceton/harpiks fortynninger som følger.
    1. Forberede 100 mL av harpiks for innebygging (se Tabell for materiale) ifølge instruksjonene fra produsenten.
    2. 33% (v/v) harpiks - 67% aceton løsning, hell 15 mL av harpiks i en 50 mL konisk rør og legge til 30 mL av 100% glass-destillert aceton.
    3. For å gjøre 50% (v/v) harpiks - 50% aceton, hell 22,5 mL av harpiks i en 50 mL konisk rør og legge 22,5 mL av 100% glass-destillert aceton.
    4. 67% (v/v) harpiks - 33% aceton løsning, hell 30 mL av harpiks i en 50 mL konisk rør og legge til 15 mL 100% glass-destillert aceton.
    5. Bruk det gjenværende 32,5 mL av harpiks som første løsning 100% harpiks nedenfor.
  5. Starte harpiks infiltrasjon prosessen ved å flytte utvalget gjennom 10-20 mL av følgende aceton eller aceton/harpiks fortynninger: 100% aceton i 30 min på 4 ° C; 100% aceton i 30 min på 4 ° C; og 100% aceton i 30 min ved romtemperatur (RT).
    Merk: Resten av infiltrasjon prosessen finner sted på RT.
  6. Fordype eksemplet i 33% (v/v) harpiks 67% aceton for 3t på RT og 50% (v/v) harpiks - 50% aceton for 3t på RT, 67% (v/v) harpiks 33% aceton for 3t på RT og 100% harpiks for 12 h på RT.
  7. Lage en frisk 50 mL batch av harpiks følge instruksjonene på flasken. Overføre prøven til beholderen der det vil bli kurert (f.eks., disponibel formene beskrevet i Tabellen for materiale). Sette mot prøven med fersk harpiks 100% 4 timer på RT.
    Merk: Hvis fersk harpiks ikke brukes, harpiks gjorde dagen begynner å stivne for tidlig og prøven vil være vanskelig å manipulere.
  8. Degas eksemplet i et vakuum ovnen i 15 min på 45 ° C.
    Merk: Dette trinnet vil bidra til å fjerne eventuelle fanget luftbobler i prøven, men det er uvesentlig og vil ikke påvirke kvaliteten på dataene.
  9. Til slutt, helbrede prøven i en ovn i 48 timer på 60 ° C.

5. micro-CT

  1. Når prøven er blitt helbredet, løsner disponibel mold og avsøke den med mikro-CT maskinen.
    Merk: Avhengig av maskinen brukes, innstillingene være forskjellige. Skanneren som ble brukt av forfatterne oppført i Tabell av materialer, de anbefalte innstillingene er 130 kV, 135 µA med filtere 0,1 mm kobber og noen molybden, en 1 sekund eksponering og gjennomsnittlig 4 bilder per projeksjon. Men burde forskere kalibrere skanneren, ettersom mange faktorer påvirker optimale innstillinger under en bestemt økt.
  2. Når skanningen er fullført, kan du rekonstruere prøven med anbefalte parameterne for den eksperimentator skanner/software kombinasjon på en datamaskin med skannerprogrammet.
  3. Til slutt, visualisere og analysere rekonstruert digital volumet ved hjelp av eksperimentator programvaren til valg (se Tabell for materiale for eksempel).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tradisjonelt hjernen er delt og farget for å kvantifisere lesjoner og finne elektroder, men denne metoden er upålitelig, arbeidskrevende, og vanligvis krever vurdering av resultatene. Ved å forberede hele hjernen for mikro-CT bildebehandling, sannsynligheten for skade prøvene er sterkt redusert, funksjoner av interesse kan analyseres i sammenheng med hele hjernen og metoden gir seg til parallell behandling av mange prøver, betydelig påskynde eksempel forberedelse.

Metoden innebærer fire hovedtrinn: (1) flekker perfused hjernen med osmium tetroxide, (2) bygge hjernen i harpiks, (3) imaging hjernen med en mikro-CT skanner og (4) analysere det digitale volumet (figur 1). I denne artikkelen er bare trinn 1-3 beskrevet, trinn 4 (analyse) vil variere betydelig avhengig av behovene til prosjektet.

Mens i tradisjonelle skjæring som snitting retningen må velges på forhånd, det digital volumet fra denne metoden kan være manipulert i tre dimensjoner og nesten skiver i en orientering (figur 2a-2b). Brukeren kan også skanne et ledd i prøven høyere oppløsning Omnødvendig, som Luktelappen av en rotte hjerne, der nerve fiber og personlige glomeruli er synlig (figur 2c). Metoden er også generelt gjelder små dyr hjerne. For å bekrefte dette var zebra finch hjerne forberedt bruke samme protokoll brukes til rotte hjernen og resulterte i en vellykket digital styrkekontroll (figur 2e). Skanning elektronmikroskop (SEM) av en prøve forberedt for mikro-CT bekreftet at vevet ikke er skadet til en størrelsesorden i oppløsning utover mikro-CT oppløsning (figur 2d). Det bør imidlertid bemerkes at det var betydelige ultrastructural skader, gjør denne teknikken uegnet for elektronmikroskop (EM).

Teknikken kan brukes til å finne overflaten lesjoner (Figur 3) og lesjoner dypt i hjernen (Figur 4). Teknikken tillater også lokalisering av én tetrodes i situ, elektrolytisk lesjoner, elektrode spor av tilstrekkelig diameter, sperrende matriser i situ, og silisium sonder i situ (figur 5).

Mislykket forberedelser vil omfatte ufullstendig mineralisering av vev, som kan også oppstå hvis feil bufre brukes (figur 6). Men hvis bare overflaten er nødvendig, kan for eksempel deretter overflaten bare flekker av utvalget være tilstrekkelig for eksperimentator.

Figure 1
Figur 1 : Metoden oversikt. Oversikt over trinnene som kreves for å forberede og analysere hele hjernen med mikro-CT imaging. Figur brukt med tillatelse fra forfatterne13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Evner av lesjon karakterisering gjennom mikro-CT avbildning. (en) Manipulatable 3D volum og (b) virtuelle skiver (13.9 µm voxels) på tilfeldig orientering av et mikro-CT av rotte lang-Evans. (c) Luktelappen skannet med høyere oppløsning (4,9 µm voxels) avsløre glomeruli (hvitt pilhode) og individuelle nerve fiber (blå pilspiss). (d) Scanning elektron mikroskop (SEM) bilde (10 nm/bildepunkt) av i hjernebarken av en rotte hjerne forberedt for mikro-CT avbilding. (e) Zebra finch (Taeniopygia guttata) hjernen forberedt for mikro-CT imaging; 3D-volum og 2D skiver (5.6 µm voxels) i Koronal, vannrett og sagittal fly. Figur brukt med tillatelse fra forfatterne13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Hjernebarken lesjon karakterisering ved hjelp mikro-CT. (en) 3D visualisering av en rotte hjerne lesioned i hjernebarken med quinolinic syre. Informasjonsvinduet viser lesjon volumet i forbindelse med hjernen (hjernen gjorde litt gjennomsiktig å gi visuell tilgang til lesjonen). Panelet til høyre viser isolert lesjon volumet. (b) 2D skiver av leksjonen i Koronal, vannrett og sagittal fly (12,8 µm voxels). Topp 3 panelene viser unsegmented inndelingene, og den nederste 3 paneler viser seksjoner med overlappet lesjon merknad. Denne leksjonen var manuelt kommenterte i koronale retningen hver 2 skiver. Volumet ble deretter opprettet gjennom interpolering. Figur brukt med tillatelse fra forfatterne13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: sammenligning av dorso-lateral striatum lesjon karakterisering mikro-CT og histology. (en) Sagittal, vannrett og koronale utsikt over venstre halvparten av "hjernen 1" behandlet for mikro-CT imaging (13,5 µm voxels). Topp 3 panelene viser unsegmented deler, og den nederste 3 paneler Vis kommenterte lesjonen på de samme delene. Lesjonen var manuelt segmentert i sagittal flyet hver 2 seksjoner og senere interpolert. (b) nærmeste samsvarende koronale delen av høyre halvparten av "hjernen 1" behandlet histologisk for * lys. Paneler (c, d) er lik (a, b) men tilsvarer "hjernen 2". Hjernen 2 lesjonen var manuelt segmentert i koronale flyet alle 8 deler. (e) lesjon karakterisering histology-behandlet riktig halvdeler hjerner 1 (mørk grå) og 2 (lys grå). Tallene i (b, d, e) under panelene tilsvarer posisjon i forhold til bregma. (f) lesjon karakteristikk av venstre halvparten av hjernen 1 behandlet for mikro-CT. Det første panelet viser isolert lesjonen. Andre og tredje panelene viser lesjonen i sammenheng med hjernen fra to synsvinkler. (g) samme som (f) men tilsvarende hjernen 2. (h) en overlapping av lesjoner i (f, g) illustrerer mulighet for sammenligning av lesjon karakterisering med digitale hjernen volumer. Lesjonen i (f) ble registrert til lesjonen (g), og begge vises i sammenheng med den venstre halvdelen av hjernen 2. Figur brukt med tillatelse fra forfatterne13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Elektrode lokalisering gjennom mikro-CT avbildning. (en) enkelt sperrende venstre i situ (14.0 µm voxels). Panelet øverst til venstre: max intensitet projeksjon av virtuelle framskaffet viser plasseringen av en nichrome sperrende reiser gjennom i hjernebarken i corpus callosum av rotte; øverst til høyre: nærbilde av et bilde vises i panelet øverst til venstre (a) (hvitt rektangel). Nederst til venstre: sagittal; nederst til høyre: vannrette utsikt over implantert elektroden (hvite pil viser plasseringen av sperrende). (b) elektrolytisk lesjon og elektroden spor i fremre regionen en rotte hjerne (13.9 µm voxels). Øverst fra venstre: 3D-gjengivelse av en hjerne med elektrolytisk lesjonen segmentert ut (hvit pil som angir lilla lesjon); øverst til høyre: Koronal. Nederst til venstre: sagittal; nederst til høyre: horisontale seksjoner som angir elektrolytisk lesjon (hvite piler) produsert med en 75 µm diameter wolfram elektrode. I tillegg vises noen metall avsatt av elektroden på retraksjon langs sporet i visningen sagittal (hvit pilspisser). (c) 16-sperrende implantat igjen i situ i fremre cortex av en rotte hjerne. Øverst fra venstre: 3D-gjengivelse av hele hjernen med en 16-sperrende utvalg venstre implantert; øverst til høyre: Koronal. Nederst til venstre: sagittal; nederst til høyre: horisontale seksjoner som indikerer en 16-sperrende implantatet (8.9 µm voxels). (d) Silicon sonde (10 mm skaft, 32 oppstillingsplasser) igjen i situ reiser gjennom bakre cortex, hippocampus og subkortikal strukturer (13.9 µm voxels). Øverst fra venstre: 3D-gjengivelse av hele hjernen med en segmentert silisium sonde (hvit pil som angir grønn probe); øverst til høyre: Koronal. Nederst til venstre: sagittal; nederst til høyre: vannrette utsikt over en silikonbasert sonde i hjernen. I tillegg er nettstedet på silisium sonden synlig i delene koronale og sagittal (spissen av hvite piler). Figur brukt med tillatelse fra forfatterne13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Effekten av osmium tetroxide løsemidler på osmium gjennomtrenging. (en) venstre panel: rotte hjernen ruges i osmium tetroxide i ddH2O for 1 uke. Høyre panel: rotte hjernen ruges i osmium tetroxide i ddH2O i 2 uker. (b) to rotte hjerner ruges i osmium tetroxide natrium cacodylate buffer for 6 uker. Figur brukt med tillatelse fra forfatterne13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Følgende er avgjørende skritt i protokollen: første bruk av en kombinasjon av PFA og GA perfuse dyr og senere etter fikse hjernen var viktig for å oppnå konsistent full osmium penetrasjon av vev. Selv om vi ikke teste dette eksplisitt, er en plausibel forklaring at PFA fiksering er reversibel15, mens GA fiksering ikke er reversibel16,17. Fordi en to ukers inkubasjon i osmium tetroxide kreves for fulle infiltrasjon av vev, er det mulig at PFA i indre av hjernen diffunderer ut og vevet forringer under den flekker. Osmium kan ikke dermed bevare indre strukturer.

Bruk av vandig osmium, i motsetning til osmium oppløst i en buffer (dvs. natrium cacodylate), var absolutt nødvendig for å sikre full vev penetrasjon av osmium. Selv etter en 6 ukers inkubasjon osmium oppløst i natrium cacodylate infiltrere ikke vevet helt og syntes å møte en diffusjon barriere (figur 6). Osmium er svært reaktive til lipider og tenkte å binde i cellemembranene18,19,20. Hvis vevet ikke er tilstrekkelig permeabilized, som kan være tilfelle med en mild buffer som natrium cacodylate, er det mulig at cellemembraner kan mette med osmium og sterically hindre mer osmium i å spre inn i vevet. Vi hypothesize imidlertid som vann som et løsemiddel for osmium fungerer som et lys vaskemiddel og permeabilizes vev tilstrekkelig å tillate dyp spredningen i vevet.

Hvis forskere forbereder en mindre hjerne, som en mus, kan inkubasjonstiden tiden i osmium sannsynlig reduseres. Tilsvarende må inkubasjon tiden økes i større prøver. Dette kan testes for å bestemme minimum tid for konsekvent farging i hjernen som er forskjellig i størrelse enn en rotte. Hvis forskere oppstår problemer med full osmium infiltrasjon, bruker sannsynligvis problemene ikke både PFA og GA under perfusjon og etter fiksering, ikke bruker vann som løsemiddelet for osmium (som beskrevet ovenfor), og ikke nok agitasjon under osmium inkubasjon. Vi fant, for eksempel at når incubating inne 50 mL konisk rør, legging rør på sin side (i motsetning til loddrett på en), fylle dem med flekker og plasserer dem på en orbital shaker på 50 rpm for den hele inkubering periode sikret skikkelig infiltrasjon.

Denne metoden er begrenset på flere måter. Først bevarer forberede ikke ultrastructure veldig bra, så det ikke bør brukes for elektronmikroskop. Denne metoden kan ikke kombineres med ytterligere histology eller immunofluorescence. Oppløsningen av digitale bestemmes av størrelsen på utvalget (mindre prøver kan skannes ved høyere oppløsninger) og ved geometrien til skanneren, hvis den er avhengig av geometriske forstørrelse; Imidlertid kan undersider av prøven skannes ved høyere oppløsninger, om ønskelig.

En ny metode kombinere elektronmikroskop-stil vev behandling med mikro-CT bildebehandling for kvantifisere lesjoner og lokalisere elektrodene i små dyr hjerner har blitt presentert. Denne metoden er kanskje mindre arbeidskrevende, krever mindre kompetanse og gir målbare resultater lettere enn gjeldende gullstandarden for skjæring og flekker en hjerne. Tidligere har forskere beskrevet en protokoll for selv osmium penetrasjon i musen hjernen som er ment å bevare ultrastructure for elektronmikroskop21,22. Denne protokollen, er imidlertid ganske komplisert. I denne studien forfatterne som mål å utvikle et mye enklere metode for mikro-CT bildebehandling i stedet for elektronmikroskop. Det har vært andre studier bruke mikro-CT imaging hjernen for ulike formål. En tidligere undersøkelse i kanin og mus brukes mikro-CT svulster og andre abnormiteter23. Undersøkelsen gjort bruk av proprietære MRI kontrast agenter, men forskerne gjorde spå mikro-CT potensielle nytteverdien i lesjon studier. En annen studie i mus sikte på å finne brutto morfologiske forskjellene for en narkotika-skjerm involvert farging av musen hjernen med jod i skallen, men forfatterne møtte ujevn vev krymping og valgt for å inkludere vevet i en hydrogel24. Andre studier i mus har som mål å finne cerebral kavernøse misdannelser, en lidelse av unormalt store og uregelmessig kapillærene, og har gjort bruk av osmium tetroxide og vandig jod som flekker; men ble disse utført i mye mindre prøver (frittstående musen hindbrains) enn beskrevet her25,26,27. Alternative metoder for å generere 3D hjernen volumer er µMRI28 og høy oppløsning episcopic mikroskopi31. Oppløsningen av µMRI er dårligere (~ 25 µm voxels for lignende prøver28), og teknikken er dyrere23,30. Høy oppløsning episcopic mikroskopi også overfor utfordringer: at det er en destruktiv teknikk, og en blokk-ansikt apparater slik at hele-hjerne snitting må produseres. Arbeidet presentert her strekker seg også tidligere innsats å finne elektrodene i hjernen med røntgenstråler32,33,34 ved fange både elektroden og omkringliggende vev. Videre er kan teknikken for å finne enkelt elektroder, sperrende matriser, elektrolytisk lesjoner, elektrode spor og silisium sonder.

En verdifull fremtidige retning ville etableringen av en "gjennomsnittlig hjernen" atlas som lesjon studier kan co registrere for å standardisere lesjon plassering og størrelse kvantifisering. Denne metoden kan også utvides til andre modellen og ikke-modellen organismer, som eksemplifisert ved sin umiddelbare søknad til zebra finch hjernen (figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Greg Lin og Arthur McClelland for sin kompetanse med mikro-CT maskin, David Richmond og Hunter Elliott på bildet og Data analyse kjernen (IDAC) ved Harvard Medical School for deres bildebehandling råd og William Liberti på Boston Universitetet for allernådigst gi zebra finch hjernen. Dette arbeidet ble utført delvis ved Center for nanoskala systemer (CNS), medlem av det nasjonale nanoteknologi koordinert infrastruktur nettverk (NNCI), som støttes av National Science Foundation under NSF prisen nr. 1541959. CNS er en del av Harvard University. Dette arbeidet ble støttet av Richard og Susan Smith Family Foundation og IARPA (kontrakt #D16PC00002). S.B.E.W. ble støttet av stipend fra menneskelige Frontier Science Program (HFSP; LT000514/2014) og europeiske molekylærbiologi organisasjonen (EMBO; ALTF1561-2013). GG ble støttet av den National Science Foundation (NSF) Graduate forskning Fellowship Program (GRFP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences (EMS) 15710 2% (w/v/) in 1X PBS
Glutaraldehyde (GA) EMS 16220 2.5% (w/v) GA in 1x PBS
OsO4 EMS 19190 Work in fume hood
Ethanol Decon Labs Koptec 140, 190, 200 proof
Acetone EMS 10015 Glass-distilled
Durcupan ACM resin Sigma-Aldrich 44610 A, B, C and D components, resin for embedding
Disposable molds Ted Pella 27114 Suggested
milliQ water (ultrapure water) Millipore Sigma QGARD00R1 (or related purifier) Suggested
Parafilm (paraffin film) Millipore Sigma P7793 Suggested paraffin film
Micro-CT scanner Nikon Metrology Ltd., Tring, UK X-Tek HMS ST 225 Used by authors
Software for visualizing and analyzing micro-CT scans:
Volume Graphics VG Studio Max Used by authors
FEI / Thermo Scientific Avizo Used by authors
FEI / Thermo Scientific Amira Similar to Avizo
Mark Sutton & Russell Garwood Spiers Free, http://spiers-software.org/
Pixmeo Sarl Osirix Lite Free, https://www.osirix-viewer.com/
Open Source FIJI Free, https://fiji.sc/
Adobe Photoshop Good for analyzing one slice at a time

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
  2. Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
  3. Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
  4. Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
  5. Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
  6. Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
  7. Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
  8. Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
  9. Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
  10. Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
  11. Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
  12. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
  13. Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
  14. Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
  15. Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
  16. Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
  17. Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
  18. Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
  19. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  20. Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
  21. Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
  22. Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
  23. Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
  24. Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
  25. Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
  26. Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
  27. Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  28. Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
  29. Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
  30. Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
  31. Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
  32. Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
  33. Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
  34. Fu, T. -M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).

Tags

Nevrovitenskap problemet 141: mikro-CT lesjon elektrode nevrovitenskap rotte gnagere zebra finch
En mikro-CT-basert metode for å karakterisere lesjoner og finne elektrodene i små dyr hjernen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Masis, J., Mankus, D., Wolff, S. B.… More

Masis, J., Mankus, D., Wolff, S. B. E., Guitchounts, G., Joesch, M., Cox, D. D. A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains. J. Vis. Exp. (141), e58585, doi:10.3791/58585 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter