Summary
Эта статья описывает простой метод для подготовки мелких животных мозги микро-КТ, в котором поражения могут быть количественно и электродов, расположенных с высокой точностью в контексте всего мозга.
Abstract
Поражения и электродом расположение проверки являются традиционно делается через гистологическом окрашенных мозга срезов, длительная процедура, которая требует ручной оценки. Здесь мы опишем простой, простой метод количественной оценки поражения и размещения электродов в мозг, который является менее трудоемким и более подробные результаты. Весь мозг окрашенных с осмия тетраоксид, встроенные в смоле и образ с микро КТ-сканера. Сканирует привести объемов 3D цифровой мозг с резолюциями и толщины виртуального раздела зависит от размера выборки (12 – 15 и 5 – 6 мкм за voxel для крыс и зебры Финч мозги, соответственно). Поверхностные и глубокие поражения можно охарактеризовать и одна tetrodes, тетрод массивы, электролитическое поражений, и кремния зонды также могут быть локализованы. Свободные и несвободные программное обеспечение позволяет экспериментаторов для изучения объем образца от любой плоскости и сегмент громкость вручную или автоматически. Потому что этот метод создает объем всего мозга, поражений и электроды могут быть количественно гораздо более высокой степени, чем в нынешних методов, который поможет стандартизировать сопоставлений в рамках исследования и.
Introduction
Неврологи полагались на поражения долгое время для того, чтобы понять связь между функцией и местоположение в головном мозге. Например наше понимание гиппокамп как необходимым для обучения и памяти и префронтальной коры как ключ для импульсного управления были оба продукта счастливое поражения людей1,2. Использование животных моделей, однако, позволило неврологи использовать всю мощь поражений, выходя за рамки serendipity, и функция бесчисленных областях мозга были выяснены путем систематического исследования структуры функция отношений через поражения3,4.
Однако, чтобы правильно назначить функцию к структуре, поражения исследования требуют точную количественную оценку процедур, что является областью, которая отсутствует. Текущий золотой стандарт для количественной оценки поражения является Секция, горе и изображения мозги с световой микроскоп. Фотосъемка кусочки затем сопоставляются в ближайший разделы на Атлас, и приблизительные координаты поражения по предметам косвенно сообщается, часто с помощью камеры lucida изображения или пример Гистологические срезы3,4 ,5,6,,78,9,10.
За пределами неточностей текущей поражения количественной оценки процедур эти методы являются длительным и склонны к провалу. Небольшие изменения в мозг жесткость, лезвие резкость и температуры может привести к неудачной, деформированные или порванные секций. Разделы также может испачкать неравномерно и быть неправильно imaged вследствие пузыри в средне-и монтажа. Важно отметить, что при резании, трехмерный контекст место поражения головного мозга теряется, делать точные 3D-реконструкции поражения в мозге трудные.
Другое общее приложение для поражения был для определения местоположения одного и нескольких записей электрода в головном мозге. В конце сессии окончательного звукозаписи исследователи побудить малые электролитический поражения на электрода и гистологически, как это сделано в обычных поражения эксперимент11процесса мозга. Эта техника страдает от же недостатки, описанные выше, с дополнительными проблемами, что электролитические поражений обычно больше, чем электроды, используемый для сделать их, но обычно достаточно малы, что они бросают вызов, чтобы найти гистологически. При вставке нескольких электродов, как и в случае массива тетрод, проверка через электролитический поражения является еще более сложной. Альтернативой электролитический поражения является использование красителя на электроде позже проверить гистологически12, но эта техника страдает от же недостатки, которые приходят с обычными гистологии.
Здесь мы описываем углубленного недавно описан метод13 , основанный на пятная методы электронной микроскопии (ЭМ) и рентгеновского компьютерная томография (микро CT), который дает количественную оценку повреждений и находит электродов в небольших животных мозги лучше, чем текущий методы. Микро-CT является Тепловизионная техника в котором рентген снимаются на образец, который поворачивается на 360° в то время как сцинтиллятора собирает рентген не отклоняются в образце. Результатом является высоким разрешением цифровой 3D-реконструкции образца, могут быть визуализированы в любой ориентации и количественно точно. Многие академические институты имеют микро КТ-сканеры, которые также доступны коммерчески.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все уход и экспериментальных манипуляций животных были рассмотрели и утвердили Гарвардского институциональный уход за животными и использования Комитетом. Перфузии, описанные здесь специфически для крыс, но процедура применима к любой животных с меньшим или аналогичных размеров мозги.
1. перфузии
- Подготовка 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Для крысы (возраст: 0,5 – 1,5 лет, вес: 250-600 g), 800-1000 мл должно быть достаточно. Используйте 400 мл для perfuse животных и еще 400 мл для разбавления фиксатором.
- Подготовьте фиксатором, состоящий из 2% (w/v) параформальдегида (PFA) и глутаровый (GA) 2,5% (w/v) в однократном ПБС. Для крыс 400 мл достаточно. Сэкономить 50 мл в 50 мл Конические трубки после фиксации после перфузии мозга.
- Анестезировать Крыса с 4 – 5% изофлюрановая газа (0,8 Л/мин O2 1.0 бар при температуре 21 ° C) для 15 мин.
- Придать смертельной дозы Пентобарбитал натрия внутрибрюшинно (180 мг/кг).
- Тест для рефлекторной потери в животное, проводя мыс щепотка рефлекторной экзаменов. Ждать, чтобы начать перфузии, до тех пор, пока животное потеряло свою рефлекторной реакции.
- Следовать ранее описанных intracardial перфузии и мозг извлечения протокола14 с следующие решения: perfuse животное с 400 мл 1 x PBS на 125 мм Hg для удаления крови. После того, как вся кровь были удалены и заменены ПБС, начните perfusing с 400 мл 2% раствора PFA и 2,5% GA, растворенных в 1 x PBS на 125 мм ртутного столба.
Примечание: Если процедура проводится в животное, которое не является крыса, только важными компонентами перфузии процедуры являются использование 1 x PBS и 2% PFA, 2,5% га в однократном ПБС. Решение томов и перфузионного давления может быть скорректирована в зависимости от вида.
2. После фиксации
- Поместить извлеченные мозга в 2% PFA, GA 2,5% в 1 x PBS раствор (же используется для perfuse животное ранее). Убедитесь, что объем раствора по крайней мере 10 x размер мозга. Для крыс место мозга в 50 мл Конические трубки с 50 мл раствора. Магазин образец в после фиксации для 2-3 дня, тряски слегка на 4 ° C.
Примечание: Если образец в 50 мл Конические трубки, поместив его горизонтально на орбитальный шейкер обеспечит наилучшие результаты. - После того, как образец пост исправлена для длиной достаточно, мыть образца в двойной дистиллированной воды (ddH2O), деионизированной воды (diH2O) или ультрачистая вода (см. Таблицу материалы) четыре раза за следующим: 1, 1, 1 и 15 мин.
Примечание: Для этого протокола, ddH2O, diH2O или ультрачистая вода должна быть взаимозаменяемыми. Для простоты ddH2O будет использоваться для обозначения очищенной воды впредь.
3. Окрашивание
Предупреждение: Для этого шага, проводить все приготовления раствора под капотом при использовании перчатки.
- Подготовьте по крайней мере 10 x объем мозга окрашивания раствора. Для крыс мозги Подготовьте 50 мл 2% (w/v) осмия тетраоксид (4OsO) ddH2O, объединяя 25 мл 4% раствор OsO4 и 25 мл ddH2O.
Предупреждение: осмия тетраоксид неустойчивой и может вызвать временную слепоту и респираторные проблемы если не обрабатываются надлежащим образом. Отменить все материалы, которые связаться осмия тетраоксид в контейнере соответствующей химической опасности в рамках вторичного контейнера. - Мозг в новой 50 мл Конические трубки и добавить решение4 OsO. Мозг должен начать становятся коричневыми как OsO4 реагирует с липидов в ткани.
- Закройте трубку и запечатать его тщательно с парафином фильм (см. Таблицу материалы) для обеспечения, что он не протекает во время инкубации.
Примечание: Осмий летучих и будет реагировать мягко с пластиковой трубки, поэтому уплотнения трубка правильно очень важно. Трубка может быть обернуты алюминиевой фольгой для дополнительной защиты. - Храните запечатанный пробки на 4 ° C, слегка покачивая на орбитальный шейкер на 50 об/мин в течение 2 недель. Положите трубку горизонтально, чтобы обеспечить лучшее смешивание. Убедитесь, что образец полностью погружен в раствор при встряхивании.
Примечание: Если осмий не разрешается непрерывно приводиться в движение, она может не проникает полностью образца, поэтому горизонтальное размещение на шейкер является очень важным.
4. Встраивание
- После того, как образец был инкубировали в OsO4 за 2 недели, промойте его с ddH2O 5 раз при комнатной температуре (RT) для следующей продолжительности: 1, 1, 1, 15 и 60 мин, чтобы удалить все непривязанные OsO4 в образце.
Примечание: Несколько обменов, включая последний обмен 60 мин, необходимо разрешить все осмий в кровеносной системе для диффузного вне. - Вымойте образца с ddH2O 30 мин при 4 ° C.
Примечание: Осмий может продолжать распространять из выборки, но ее количество должно быть значительно сокращено с предыдущего шага. - Обезвоживает образца с этанолом в конечном итоге проникнуть его смолой. К обезвоживанию, замените ddH2O 10 – 20 мл следующих растворов этанола (за 30 мин при температуре 4 ° C): 20% (v/v) этанола и 80% (v/v) ddH2O; 50% (v/v) этанола и 50% (v/v) ddH2O; 70% (v/v) этанола и 30% (v/v) ddH2O; 90% (v/v) этанола и 10% (v/v) ddH2O; 100% этанола.
- Готовят ацетон/смолы разведений следующим образом.
- Подготовка 100 мл смолы для встраивания (см. Таблицу материалы) в соответствии с инструкциями производителя.
- Чтобы сделать 33% (v/v) смолы - 67% раствор ацетона, налейте в 50 мл Конические трубки 15 мл смолы и добавьте 30 мл ацетона стекла дистиллированной 100%.
- Чтобы сделать ацетон смолы - 50% 50% (v/v), Налейте 50 мл Конические трубки 22,5 мл смолы и добавьте 22,5 мл ацетона стекла дистиллированной 100%.
- Чтобы сделать 67% (v/v) смолы - 33% раствор ацетона, залить 30 мл смолы в 50 мл Конические трубки и добавить 15 мл ацетона стекла дистиллированной 100%.
- Используйте остальные 32.5 мл смолы как первое решение ниже 100% смолы.
- Начать процесс проникновения смолы, перемещая образца через 10-20 мл следующих разведений ацетон и ацетон/смолы: 100% ацетона для 30 мин при температуре 4 ° C; 100% ацетона для 30 мин при температуре 4 ° C; и 100% ацетона для 30 мин при комнатной температуре (RT).
Примечание: Остальная часть процесс проникновения будет проходить на RT. - Погрузить образец в 33% (v/v) смолы 67% ацетона для 3 h на RT, а затем 50% (v/v) смолы - 50% ацетона для 3 h на RT, 67% (v/v) смолы 33% ацетона для 3 h на RT и 100% смолы для 12 h на RT.
- Сделайте свежий 50 мл партию смолы после инструкции на бутылке. Передача образца в контейнер, в котором он будет лечиться (например., одноразовые формы, описанные в Таблица материалов). Наполнить образца с свежими 100% смолы 4 часа на RT.
Примечание: Если свежие смола не используется, смолы, сделал в предыдущий день начнется затвердеть преждевременно, и образец будет трудно манипулировать. - Дега образца в вакуумной печи для 15 мин при температуре 45 ° C.
Примечание: Этот шаг поможет снять любые пузыри воздуха в образце, но это не является необходимым и не влияет на качество данных. - Наконец вылечить образец в духовке в течение 48 часов при температуре 60 ° C.
5. микро CT
- После того, как образец был вылечен, шелушиться одноразовые формы и его проверки с микро CT машиной.
Примечание: В зависимости от машины используется, параметры будут отличаться. Для сканера, используемые авторами, перечисленных в Таблице материалы, Рекомендуемые параметры являются 130 кв, 135 МКА с фильтр 0,1 мм медь и молибден источник, 1-секундной экспозицией и в среднем 4 кадров в проекции. Однако экспериментаторов следует калибровки сканера индивидуально, как многие факторы будут влиять на оптимальные настройки для конкретной сессии. - После завершения сканирования, реконструировать образца с рекомендованные параметры для комбинации экспериментатора сканера и программного обеспечения на компьютере с помощью программного обеспечения сканера.
- Наконец, визуализировать и анализировать реконструированный цифровой тома, с помощью программного обеспечения экспериментатора выбора (см. Таблицу материалы для примеров).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Традиционно, мозги секционного и витражи с целью количественного определения поражений и найдите электродов, но этот метод ошибкам, трудоемкий и обычно требует оценки результатов. Подготовив все мозги для микро-КТ, значительно снижается вероятность повреждения образцов, особенности интерес могут быть проанализированы в контексте всего мозга, и метод поддается параллельной обработки многих образцов, значительно ускорения подготовки проб.
Метод включает четыре основных этапа: (1) пятная перфузии мозга с осмия тетраоксид, (2) встраивание мозга в смоле, (3) визуализации мозга с микро КТ-сканера и (4) анализа результате цифровой тома (рис. 1). В этой статье описаны только шаги 1 — 3, как шаг 4 (анализ) будет варьироваться в зависимости от конкретных потребностей проекта.
В то время как в традиционных секционирование, в котором одной секущей ориентации должны быть выбраны заранее, полученный цифровой объем от этого метода может манипулировать в трех измерениях и нарезанный практически в любой ориентации (Рисунок 2а-2Б). Пользователь также может сканировать подраздел образца с более высоким разрешением, при желании, таких как обонятельные луковицы мозга крысы, где нервных волокон и отдельных клубочков являются видимыми (рис. 2c). Метод широко применяется для мелких животных мозги. Чтобы проверить это, мозг зебры Финч был подготовлен, используя тот же протокол используется для мозг крыс и привели к успешной цифровой тома (Рисунок 2e). Сканирующая электронная микроскопия (SEM) образца, подготовленные для микро CT подтвердил, что ткань не был поврежден до на порядок величины в резолюции за рамки резолюции микро CT (рис.d). Следует, однако, отметить, что существует значительный ущерб ультраструктурных, делая этот метод подходит для электронной микроскопии (EM).
Методика может использоваться для поиска повреждений поверхности (рис. 3) и поражения, глубоко внутри мозга (рис. 4). Метод позволяет также местонахождения одного tetrodes на месте, электролитическое поражения, электрод треков достаточного диаметра, тетрод массивы в situ и кремния зонды в situ (рис. 5).
Неудачной подготовки будет состоять из неполной минерализации ткани, которая также может возникнуть, если используются неправильные буферы (рис. 6). Однако если только особенности поверхности необходимы, например, затем поверхность только окрашивание образца может быть достаточно для экспериментатора.
Рисунок 1 : Метод обзор. Обзор шагов, необходимых для подготовки и проанализировать весь мозг с помощью микро-КТ. Используется с разрешения авторов13рисунок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Возможности поражения характеристика через микро-КТ. () Manipulatable 3D объем и (b) виртуальный ломтиками (13,9 мкм вокселей) в произвольной ориентации от микро-КТ Лонг-Эванс крысы. (c) обонятельные луковицы, отсканированных с высоким разрешением (4.9 мкм вокселей) выявление клубочков (белая стрелка) и отдельных нервных волокон (синяя стрелка). (d) сканирующего электронного микроскопа (SEM) изображение (10 Нм/пиксель) зрительной коры мозга крысы, подготовленный для микро-КТ. (e) зебры Финч (Taeniopygia guttata) головного мозга, подготовленные для микро КТ изображений; 2D и 3D-объем ломтиками (5,6 вокселей мкм) в корональных, горизонтальные и сагиттальной плоскости. Используется с разрешения авторов13рисунок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Характеристика поражения зрительной коры, с помощью микро КТ () 3D визуализации мозга крысы, пораженного в зрительной коре с quinolinic кислотой. Левая панель показывает объем поражения в контексте мозга (слегка прозрачными для визуального доступа к поражения головного мозга). Правая панель показывает объём изолированные поражения. (b) 2D фрагменты поражения в корональных, горизонтальные и сагиттальной плоскости (12,8 вокселей мкм). Топ 3 панели показывают сегментацией секции, и нижней 3 панели показывают секции с накладными поражения аннотации. Это поражение было вручную Аннотированная в корональных ориентации каждые 2 ломтика. Объем был создан путем интерполяции. Используется с разрешения авторов13рисунок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Сравнение dorso боковом стриатума поражения характеристик с помощью микро CT и гистология. () сагиттальной, горизонтальные и корональные видом левой половины «мозг 1» обработаны для микро КТ изображений (13,5 мкм вокселей). Топ 3 панели показывают сегментацией разделы, и нижней 3 панели показывают аннотированный поражения на те же разделы. Поражение было вручную сегментирована в сагиттальной плоскости каждые 2 секции и впоследствии интерполяцией. (b) ближайший соответствия корональных разделе права половина «мозг 1» обработано гистологически для световой микроскопии. Панели (c, d) похожи на (a, b), но соответствуют «мозг 2». Поражением мозга 2 был вручную сегментирована в плоскости корональных каждые 8 секций. (e) поражения характеристика гистология лечение правой половинки мозга (темно-серый) 1 и 2 (светло-серый). Номера в (b, d, e) под панели соответствуют позиции по отношению к bregma. (f) поражения характеристика левой половины мозга 1 обрабатываются для микро CT. Первая группа показывает изолированные поражения. Второй и третий панели показывают поражения в контексте мозга с двух точек зрения. (g) так же как (f), но соответствующее мозга 2. (h) наложение поражений в (f, g) иллюстрирует возможности для сравнения характеристик поражения с объемами цифровой мозг. Поражения в (f) было зарегистрировано к поражению в (g), и оба представлены в контексте в левой половине мозга 2. Используется с разрешения авторов13рисунок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Электрод локализации через микро-КТ. () сингл тетрод слева в situ (14.0 вокселей мкм). Верхней левой панели: Макс интенсивности проекции виртуальных корональных разделов расположения Нихром тетрод, путешествуя по зрительной коры в мозолистого крыса; вверху справа: крупным планом изображение показано в верхней левой панели () (белый прямоугольник). Внизу слева: сагиттальной; внизу справа: горизонтальный вид имплантированных электродов (белая стрелка указывает расположение тетрод). (b) электролитическая поражения и электрода трек в регионе переднего мозга крысы (13,9 вокселей мкм). Вверху слева: 3D визуализации мозга с электролитическим поражением сегментированные вне (белая стрелка, указывающая фиолетовые поражения); вверху справа: корональный. Внизу слева: сагиттальной; внизу справа: горизонтальные секции, указывающее электролитический поражения (белые стрелки) производится с вольфрамовым электродом диаметром 75 мкм. Кроме того некоторые металла, сданный электрода на опровержение видны вдоль дорожки в представлении Сагиттальная (белые стрелки). (c) 16-тетрод имплантат оставил на месте в передней коры мозга крысы. Вверху слева: 3D-рендеринга весь мозг с массивом 16-тетрод слева имплантированных; вверху справа: корональный. Внизу слева: сагиттальной; внизу справа: горизонтальные секции, указывающий 16-тетрод имплантата (8,9 вокселей мкм). (d) кремния зонд (хвостовик 10 мм, 32 сайтов) оставил в situ путешествуя по задней коры, гиппокамп и подкорковых структур (13,9 мкм вокселей). Вверху слева: 3D-рендеринга весь мозг с зондом сегментирована кремния (белая стрелка указывает зеленый зонд); вверху справа: корональный. Внизу слева: сагиттальной; внизу справа: горизонтальный вид кремния зонд в головном мозге. Кроме того сайта ссылка на зонд кремния является видимым в секции фронтальная и сагиттальная плоскости (кончик белые стрелки). Используется с разрешения авторов13рисунок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Влияние осмия тетраоксид растворителя на осмий проникновения. () левой панели: мозга крысы инкубировали в осмия тетраоксид ddH2O в течение 1 недели. Правая панель: мозга крысы инкубировали в осмия тетраоксид ddH2O в течение 2 недель. (b) две крысы мозги инкубировали в осмия тетраоксид в буфер cacodylate натрия на 6 недель. Используется с разрешения авторов13рисунок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ниже приводятся важнейшие шаги к протоколу: во-первых, использование сочетания PFA и GA perfuse животное и впоследствии пост исправить мозг имеет первостепенное значение для достижения последовательного полного осмий проникновения ткани. Хотя мы не проверить это явно, правдоподобное объяснение, что ПФА фиксации реверсивные15, тогда как GA фиксации не является обратимой16,17. Потому что две недели инкубации в осмия тетраоксид требуется для полного проникновения ткани, вполне возможно, что ПФА в интерьере мозга диффундирует вне и ткани ухудшается во время окрашивания. Осмий, таким образом, не может сохранить внутренних структур.
Использование водной осмий, в отличие от осмий растворяют в буфер (т.е. натрия cacodylate), было абсолютно необходимым для обеспечения полного ткани проникновения осмий. Даже после 6 неделе инкубации осмий, растворяется в cacodylate натрия не проникнуть в ткани полностью и появилась сталкиваются с диффузионным барьером (рис. 6). Осмий чрезвычайно реагировать липидов и мысли для связывания в клеточных мембранах18,19,20. Если ткань не permeabilized достаточно, как может быть в случае с буфером нежный как натрия cacodylate, вполне возможно, что клеточные мембраны может насытить осмий и труднодоступных предотвратить более осмий от распространения в ткань. Мы предполагаем, однако, что воду в качестве растворителя для осмий действует как слабым моющим средством и permeabilizes ткани достаточно, чтобы позволить глубокой диффузии в ткани.
Если экспериментаторов готовят меньше мозга, например, что мыши, время инкубации в осмий скорее всего может быть уменьшено. Аналогично время инкубации необходимо увеличить в больших образцов. Это можно проверить, чтобы определить минимальное время для последовательного пятнать в мозге, что разные по размеру чем крысы. Если экспериментаторы сталкиваются с проблемами с полным осмий инфильтрации, скорее всего, проблемы не используете PFA и GA во время перфузии и после фиксации, не используя воду в качестве растворителя для осмий (как обсуждалось выше) и недостаточное возбуждение во время осмий инкубации. Мы нашли, например, что при инкубации в 50 мл конические трубы, прокладка труб на их стороне (в соотношении с вертикально на держателе), их заполнения с пятно и размещение их на орбитальный шейкер на 50 об/мин для всего инкубационного периода обеспечивает надлежащее проникновение.
Этот метод ограничен несколькими способами. Во-первых подготовка не сохранить Ультраструктура очень хорошо, поэтому он не должен использоваться для электронной микроскопии. Этот метод не может сочетаться с любой дальнейшей гистология или иммунофлюоресценции. Разрешение цифровых объем определяется размером выборки (небольшие образцы могут быть отсканированы в высоких разрешениях) и геометрия сканера, если она опирается на геометрическое увеличение; Однако подразделы образца могут быть проверены в высоком разрешении, при желании.
Был представлен новый метод, объединяющий электронной микроскопии стиле ткани лечение с микро-КТ для количественного определения поражений и локализация электродов в небольших животных мозги. Этот метод возможно менее трудоемкой, требует меньше опыта и более легко, чем текущий стандарт золото для разрезания и пятнать мозг дает количественные результаты. Ранее ученые описали протокол для проникновения даже осмий в мозг мыши, которая предназначена для сохранения Ультраструктура для электронной микроскопии21,22. Этот протокол, однако, является весьма сложным. В этом исследовании авторы стремились разработать метод намного проще для микро-КТ, а не электронной микроскопии. Там были другие исследования, применение микро CT для визуализации мозги для различных целей. Предыдущие расследования, кроликов и мышей используется микро CT для обнаружения опухолей и других аномалий23. Это расследование сделал использование несвободных МРТ контрастного вещества, но исследователи сделал предсказать потенциальной полезности микро CT в исследованиях поражения. Еще одно исследование на мышах, направленных на поиск грубые морфологические различия для экрана наркотиков вовлечены пятнать мыши мозги с йода в череп, но авторы сталкиваются с неравномерным ткани усадки и решили внедрить ткани в гидрогеля24. Другие исследования на мышах, были направлены на найти мозгового кавернозных мальформации, расстройство аномально крупные и нерегулярные капилляров и сделали использование осмия тетраоксид и водного раствора йода как пятна; Однако эти были исполнены в гораздо меньше проб (отдельностоящий мыши hindbrains), чем описано здесь25,,2627. Альтернативные методы для создания 3D мозга тома являются µMRI28 и микроскопии высокого разрешения episcopic31. Разрешение µMRI бедных (~ 25 мкм воксели для подобных образцов28), и методика является более дорогим23,30. Микроскопия высокого разрешения episcopic также сталкивается с проблемами: что это разрушительные техника, и блок лицо аппарат, позволяя целом мозг секционирование необходимо будет производиться. Работы, представленные здесь также расширяет предыдущие попытки найти электродов в мозг с рентген32,,3334 , захватив оба электрода и окружающих тканей. Кроме того метод позволяет для размещения одного электродов, тетрод массивы, электролитическое поражения, электрод треков и кремния зонды.
Ценный будущее направление будет создание совместного поражения исследования могут регистрироваться стандартизировать поражения расположение и размер количественной Атлас «средний мозг». Этот метод может также распространить на другие модели и не модельных организмов, о чем свидетельствует его немедленного применения зебры Финч мозга (рис. 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Грег Лин и Артур Макклеланд за их опыт с микро КТ машина, Дэвид Ричмонд и Эллиотт охотник на изображение и данных анализа Core (IDAC) при Гарвардской медицинской школе для их обработки советы изображений и Уильям Liberti в Бостон Университет за любезное предоставление зебры Финч мозга. Эта работа была выполнена частично в центре для наноразмерных систем (ЦНС), членом из национального нанотехнологии скоординированной инфраструктуры сети (NNCI), который поддерживается Национальный научный фонд под NSF премии № 1541959. CNS является частью Гарвардского университета. Эта работа была поддержана Ричард и Фонда семьи Сьюзан Смит и IARPA (Договор #D16PC00002). S.B.E.W. была поддержана стипендии от человека пограничной науки программы (HFSP; LT000514/2014) и организация европейских молекулярной биологии (EMBO; ALTF1561-2013). Г.г. была поддержана, программа стипендий аспирантов исследований (GRFP) Национальный фонд науки (NSF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1x PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
References
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
- Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
- Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
- Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
- Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
- Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
- Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
- Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
- Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
- Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
- Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
- Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
- Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
- Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
- Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
- Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
- Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
- Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
- Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
- Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
- Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
- Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
- Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
- Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
- Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
- Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
- Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
- Fu, T. -M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).
