Summary
Denne artikel beskriver en enkel metode til at forberede små dyr hjerner til micro-CT billeddannelse, i hvilke læsioner kan kvantificeres og elektroder placeret med høj præcision i forbindelse med hele hjernen.
Abstract
Læsion og elektrode placering verifikation er traditionelt udført via histologisk undersøgelse af bejdset hjernen skiver, en tidskrævende procedure, der kræver manuel vurdering. Her, beskriver vi en enkel, ligefrem metode til kvantificering læsioner og at placere elektroder i hjernen, der er mindre besværlige og giver mere detaljerede resultater. Hele hjerner er plettet med osmium dinitrogentetraoxid, indkapslet i harpiks og afbildet med en mikro-CT-scanneren. Scanninger resultere i 3D digital bind af hjerner resolutioner og virtuelle snittykkelsen afhængig af prøvestørrelse (12-15 og 5-6 µm per voxel til rotte og zebrafinke brains, henholdsvis). Overflade og dyb læsioner kan karakteriseres, og enkelt Tetroder, triode arrays, elektrolytisk læsioner, og silicium sonder kan også lokaliseres. Fri og proprietær software tillader eksperimentatorer at undersøge sample volumen fra enhver plan og segment lydstyrken manuelt eller automatisk. Fordi denne metode genererer hele hjernen volumen, kan læsioner og elektroder kvantificeres i langt højere grad end i de nuværende metoder, som vil hjælpe med at standardisere sammenligninger inden for og på tværs af undersøgelser.
Introduction
Neuroforskere har stolet på læsioner i lang tid for at forstå forholdet mellem funktion og placering i hjernen. For eksempel, var vores forståelse af hippocampus som værende nødvendig for indlæring og hukommelse og den præfrontale cortex som værende nøglen til impulskontrol begge produkter af serendipitous læsioner i mennesker1,2. Anvendelsen af dyremodeller, dog har tilladt neuroforskere at udnytte styrken af læsioner ved at gå ud over serendipity, og funktionen af utallige områder i hjernen er blevet belyst gennem systematiske undersøgelser af struktur-funktion relationer gennem læsioner3,4.
For at tildele korrekt funktion til en struktur, men kræver læsion undersøgelser præcis kvantificering procedurer, som er et område, der har manglet. Den nuværende guld standard for kvantificering læsioner er til afsnittet, mount og billede hjerner med et lysmikroskop. De afbildede skiver derefter matches til de nærmeste afsnit på et atlas, og de omtrentlige koordinater af læsioner på tværs af fag rapporteres ofte indirekte gennem brug af camera lucida billeder eller eksempel histologiske skiver3,4 ,5,6,7,8,9,10.
Ud over de upræcise nuværende læsion kvantificering procedurer er disse teknikker tidskrævende og tilbøjelige til at mislykkes. Små ændringer i hjernen stivhed, kniv skarphed og temperatur kan føre til forkludrede, skæv eller revet sektioner. Sektioner kan også plette ujævnt og afbildning forkert på grund af bobler i montering medium. Vigtigere, ved skæring er tre-dimensionelle forbindelse med læsions placering i hjernen tabt, hvilket gør præcis 3D rekonstruktion af en læsion i hjernen udfordrende.
Et andet fælles program for læsioner har været til at bestemme placeringen af enkelt og flere elektrode optagelser i hjernen. For enden af den endelige optagelse session forskere fremkalde lille elektrolytisk læsioner på elektrode spids og behandle hjernen histologisk som gjort i en konventionel læsion eksperiment11. Denne teknik lider af de samme ulemper beskrevet ovenfor, med yderligere problemer er, at de elektrolytiske læsioner er normalt større end elektroderne bruges til at lave dem, men er som regel små nok, de er udfordrende for at finde histologisk. Når flere elektroder er indsat, som i tilfælde af en triode array, er verifikation gennem elektrolytisk læsioner endnu mere udfordrende. Et alternativ til elektrolytisk læsioner er brugen af et farvestof på elektrode til senere kontrollere histologisk12, men denne teknik lider af de samme ulemper, der følger med konventionelle histologi.
Her, vi beskriver dybdegående en nylig beskrevne metode13 baseret på farvning teknikker i elektronmikroskopi (EM) og X-ray computertomografi (mikro-CT) der kvantificerer læsioner og lokaliserer elektroder i små dyr hjerner bedre end nuværende metoder. Mikro-CT er en billedbehandling teknik, hvor x-stråler er skudt på en stikprøve, der roteres 360°, mens et scintillator indsamler x-stråler ikke afbøjet af prøven. Resultatet er en høj opløsning digitale 3D rekonstruktion af den prøve, der kan visualiseres i enhver orientering og kvantificeres præcist. Mange uddannelsesinstitutioner har mikro-CT-scannere, som tilbydes også kommercielt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle pleje og eksperimenterende manipulation af dyr blev gennemgået og godkendt af Harvard institutionelle dyrs pleje og brug udvalget. Perfusion beskrevet her er specifik for rotter, men proceduren gælder for alle dyr med mindre eller tilsvarende størrelse hjerner.
1. perfusion
- Forberede 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS). For en rotte (alder: 0,5-1,5 år gammel, vægt: 250-600 g), 800-1.000 mL bør være tilstrækkeligt. Bruge 400 mL til perfuse dyret og en yderligere 400 mL til at fortynde fiksativ.
- Forberede fiksativ bestående af 2% (w/v) PARAFORMALDEHYD (PFA) og 2,5% (w/v) glutaraldehyd (GA) i 1 x PBS. For en rotte er 400 mL tilstrækkeligt. Gemme 50 mL i en 50 mL konisk slange til efter fiksering af hjernen efter perfusion.
- Bedøver rotte med 4 – 5% isofluran gas (på 0,8 L/min. O2 på 1,0 bar ved 21 ° C) i 15 min.
- Indsprøjtes en dødelig dosis af natrium pentobarbital intraperitoneal (180 mg/kg).
- Test for refleks tab i dyret ved at foretage en tå-knivspids refleks eksamen. Vente med at begynde perfusion, indtil dyret har mistet sin refleks reaktion.
- Følg den tidligere beskrevne intracardial perfusion og hjernen udvinding protokol14 med følgende løsninger: perfuse dyr med 400 mL 1 x PBS på 125 mm Hg at fjerne blod. Når alle blodet er fjernet og erstattet med 1 x PBS, begynde perfusing med 400 mL af opløsning af 2% PFA og 2,5% GA opløst i 1 x PBS på 125 mm Hg.
Bemærk: Hvis proceduren føres i et dyr, der ikke er en rotte, de eneste vigtige komponenter af proceduren perfusion er brugen af 1 x PBS og 2% PFA, 2,5% GA i 1 x PBS. Løsning diskenheder og perfusion pres kan justeres alt efter dyrearten.
2. efter fiksation
- Placer den udpakkede hjernen i 2% PFA, 2,5% GA i 1 x PBS løsning (samme løsning anvendes til perfuse dyret tidligere). Sikre, at løsningen volumen på mindst 10 x mængden af hjernen. Rotter, læg hjernen i en 50 mL konisk slange med 50 mL af opløsning. Gemme prøven efter fremførelsen i 2-3 dage, rysten let ved 4 ° C.
Bemærk: Hvis prøven i et 50 mL konisk røret, placere den vandret på en orbitalryster vil sikre de bedste resultater. - Efter prøven har været efter fast for længe nok, vaske prøven i dobbeltdestilleret vand (ddH2O), afioniseret vand (diH2O) eller ultrarent vand (Se Tabel af materialer) fire gange de følgende varighed: 1, 1, 1 og 15 min.
Bemærk: For denne protokol, Hedeselskabet2O, diH2O eller ultrarent vand bør være indbyrdes udskiftelige. For enkelhed, vil Hedeselskabet2O blive brugt til at henvise til renset vand fremover.
3. farvning
Forsigtig: For dette trin, foretage alle løsning forberedelser under en hætte når du bruger handsker.
- Forbered mindst 10 x hjernen volumen af farvning løsning. Til rat brains, forberede 50 mL 2% (w/v) osmium dinitrogentetraoxid (OsO4) i ddH2O ved at kombinere 25 mL af stock 4% OsO4 opløsning og 25 mL af Hedeselskabet2O.
Forsigtig: Osmium dinitrogentetraoxid er flygtige og kan forårsage midlertidig blindhed og respiratoriske problemer hvis ikke håndteres korrekt. Kassér alle materialer, kontakte osmium dinitrogentetraoxid i en passende kemisk fare beholder i en sekundær objektbeholder. - Læg hjernen i en ny 50 mL konisk slange og tilføje OsO4 løsning. Hjernen skal begynde at vende brun som OsO4 reagerer med lipider i vævet.
- Luk røret og forsegle det grundigt med paraffin film (Se Tabel af materialer) for at sikre, at det ikke lække under inkubation.
Bemærk: Osmium er flygtige og vil reagere mildt med plast af røret, så forsegling røret korrekt er meget vigtigt. Røret kan være pakket med aluminiumsfolie for ekstra beskyttelse. - Lagre i lukkede rør ved 4 ° C, rystede let på en orbitalryster på 50 rpm i 2 uger. Placer røret horisontalt for at sikre den bedste blanding. Sikre, at prøven fuldt neddykket i opløsningen under omrystning.
Bemærk: Hvis osmium ikke er tilladt at cirkulere løbende, det kan ikke fuldt trænge prøven, så vandret placering på shaker er meget vigtigt.
4. indlejring
- Efter prøven har været inkuberet i OsO4 2 uger, vaske det med ddH2O 5 gange ved stuetemperatur (RT) for de følgende varighed: 1, 1, 1, 15 og 60 min til at fjerne alle de ubundne OsO4 i prøven.
Bemærk: Flere udvekslingerne, herunder de sidste 60 min exchange, er nødvendige for at tillade alle osmium i kredsløbet til diffuse ud. - Vaske prøve med ddH2O i 30 min. ved 4 ° C.
Bemærk: Osmium fortsat kan diffuse ud af prøven, men dens mængde bør være stærkt reduceret fra det forrige trin. - Dehydrere prøven med ethanol til sidst infiltrere det med harpiks. For at dehydrere, erstatte ddH2O med 10-20 mL af de følgende ethanol fortyndinger (for 30 min hver ved 4 ° C): 20% (v/v) ethanol og 80% (v/v) ddH2O; 50% (v/v) ethanol og 50% (v/v) ddH2O; 70% (v/v) ethanol og 30% (v/v) ddH2O; 90% (v/v) ethanol og 10% (v/v) ddH2O; 100% ethanol.
- Forberede acetone/harpiks fortyndinger som følger.
- Forberede 100 mL af harpiksen for indlejring (Se Tabel af materialer) ifølge producentens anvisninger.
- For at gøre 33% (v/v) harpiks - 67% acetone løsning, hældes 15 mL af harpiksen i en 50 mL konisk slange og der tilsættes 30 mL 100% glas-destilleret acetone.
- For at gøre 50% (v/v) harpiks - 50% acetone, hæld 22,5 mL af harpiksen i en 50 mL konisk slange og tilføje 22,5 mL 100% glas-destilleret acetone.
- For at gøre 67% (v/v) harpiks - 33% acetone løsning, hældes 30 mL af harpiksen i en 50 mL konisk slange og der tilsættes 15 mL 100% glas-destilleret acetone.
- Bruge den resterende 32,5 mL af harpiks som den første løsning af 100% resin nedenfor.
- Begynde harpiks infiltration proces ved at flytte prøven gennem 10-20 mL af de følgende acetone og acetone/harpiks fortyndinger: 100% acetone i 30 min. ved 4 ° C; 100% acetone i 30 min. ved 4 ° C; og 100% acetone i 30 min. ved stuetemperatur (RT).
Bemærk: Resten af infiltration proces vil finde sted på RT. - Fordyb prøven i 33% (v/v) harpiks 67% acetone for 3 h i RT, så 50% (v/v) harpiks - 50% acetone for 3 h i RT, 67% (v/v) harpiks 33% acetone for 3 h i RT, og 100% resin i 12 timer ved RT.
- Gøre en frisk 50 mL parti af harpiks efter vejledningen på flasken. Overføre prøven til den beholder, hvori det vil blive helbredt (fx., engangs formene beskrevet i Tabel af materialer). Indgyde prøven med friske 100% resin i 4 timer på RT.
Bemærk: Hvis frisk harpiks ikke bruges, harpiks, der lavede den forrige dag vil begynde at hærde for tidligt, og prøven vil være svært at manipulere. - Degas prøven i et vakuum ovn i 15 min. ved 45 ° C.
Bemærk: Dette trin vil hjælpe med at fjerne nogen fanget luftbobler i prøven, men det er ikke-væsentlige og påvirker ikke kvaliteten af dataene. - Endelig helbrede prøven i en ovn i 48 timer ved 60 ° C.
5. mikro-CT
- Når prøven er blevet helbredt, skrælle den disponible mug og scanne den med micro-CT maskine.
Bemærk: Afhængigt af maskinen anvendes, vil indstillingerne være anderledes. For scanneren bruges af de forfattere, der er anført i Tabel af materialer, de anbefalede indstillinger er 130 kV, 135 µA med en 0,1 mm kobber filter og molybdæn kilde, et 1 sekund eksponering, og et gennemsnit på 4 frames per projektion. Dog skal eksperimentatorer kalibrere scanneren individuelt, da mange faktorer påvirker optimale indstillinger under en session. - Når scanningen er afsluttet, rekonstruere eksemplet med de anbefalede parametre for den eksperimentatoren scanner/software kombination på en computer med scannersoftwaren.
- Endelig, visualisere og analysere den rekonstruerede digital volumen benytter den eksperimentatoren software valg (Se Tabel af materialer for eksempler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Traditionelt, hjerner er i snit og farves med henblik på at kvantificere læsioner og Find elektroder, men denne metode er fejlbehæftet, arbejdskrævende, og kræver typisk vurdering af resultaterne. Ved at forberede hele hjerner for micro-CT billeddannelse, sandsynligheden for at beskadige prøverne er stærkt reduceret, funktioner af interesse kan analyseres i forbindelse med hele hjernen og metoden egner sig til parallel behandling af mange prøver, betydeligt fremskynde prøveforberedelse.
Metoden omfatter fire hovedtrin: (1) farvning en perfused hjerne med osmium dinitrogentetraoxid, (2) indlejring hjernen i harpiks, (3) imaging hjernen med en mikro-CT-scanneren, og (4) analysere de resulterende digital volumen (figur 1). I denne artikel, er kun trin 1-3 beskrevet, som trin 4 (analyse) varierer betydeligt afhængigt af specifikke behov for projektet.
I traditionelle skæring hvor en skæring orientering skal være valgt på forhånd, den deraf følgende digitale volumen fra denne metode kan manipuleres i tre dimensioner og næsten skåret i enhver orientering (figur 2a-2b). Brugeren kan også scanne en underafdeling af prøven med en højere opløsning, hvis det ønskes, såsom den olfaktoriske pære af en rotte hjerne, hvor nervefibre og individuelle glomeruli er synlige (fig. 2c). Metoden er også bredt anvendelig til små dyr hjerner. Du kan kontrollere dette ved blev en zebrafinke hjerne udarbejdet ved hjælp af den samme protokol benyttes til rotte hjerner og resulterede i en vellykket digital volumen (figur 2e). Scanning elektronmikroskopi (SEM) af en prøve forberedt til micro-CT bekræftet at væv ikke er beskadiget op til en størrelsesorden i opløsning ud over mikro-CT opløsning (figur 2d). Dog skal det bemærkes, at der var betydelig ultrastrukturelle skade, hvilket gør denne teknik uegnet til elektronmikroskopi (EM).
Teknikken kan bruges til at finde overflade læsioner (figur 3) og læsioner dybt inde i hjernen (figur 4). Teknikken tillader også lokalisering af fælles Tetroder i situ, elektrolytisk læsioner, elektrode spor af tilstrækkelig diameter, triode arrays in situ, og silicium sonder i situ (figur 5).
Mislykket præparater omfatter ufuldstændig mineralisering af det væv, der kan også opstå hvis forkert buffere anvendes (figur 6). Hvis eneste overfladen funktioner er nødvendige, for eksempel, kan så overflade-kun farvning af prøven dog tilstrækkelig til eksperimentatoren.
Figur 1 : Metode oversigt. Oversigt over de trin, der kræves for at udarbejde og analysere en hel hjerne ved hjælp af micro-CT billeddannelse. Figur anvendes med tilladelse fra forfatterne13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Kapaciteter af læsion karakterisering gennem mikro-CT billeddannelse. (en) Manipulatable 3D volumen og (b) virtuelle skiver (13,9 µm voxels) på vilkårlige retningslinjer fra en mikro-CT-scanning af en lang-Evans rotte. (c) lugtekolben scannet med højere opløsning (4.9 µm voxels) afslører glomeruli (hvid pilespids) og individuelle nervefibre (blå pilespids). (d) Scanning elektron mikroskop (SEM) billede (10 nm/pixel) af den visuelle cortex af en rotte hjerne forberedt til micro-CT billeddannelse. (e) zebrafinke (Taeniopygia guttata) hjerne forberedt til micro-CT billeddannelse; 3D volumen og 2D skiver (5,6 µm voxels) i den koronale, vandret, og sagittale fly. Figur anvendes med tilladelse fra forfatterne13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Visuel cortex læsion karakterisering ved hjælp af mikro-CT. (en) 3D visualisering af en rotte hjernen lesioned i den visuelle cortex med quinolinsyre syre. Panelet til venstre viser læsion volumen i forbindelse med hjernen (hjerne lidt gennemsigtige at give visuel adgang til læsion). Højre panel viser isoleret læsion volumen. (b) 2D skiver af læsion i koronale, vandret og sagittale fly (12,8 µm voxels). De top 3 paneler vise afsnittene unsegmented, og de nederste 3 paneler vise sektioner med overlejres læsion annotation. Denne læsion var manuelt kommenteret i den koronale orientering hver 2 skiver. Diskenheden blev derefter oprettet gennem interpolation. Figur anvendes med tilladelse fra forfatterne13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: sammenligning af dorso-lateral striatum læsion karakterisering ved hjælp af micro-CT og histologi. (en) sagittale, vandret, og koronale udsigt over venstre halvdel af "hjernen 1" behandles for micro-CT billeddannelse (13,5 µm voxels). De top 3 paneler viser unsegmented sektioner, og bunden 3 paneler viser kommenteret læsion på de samme strækninger. Læsionen var manuelt segmenteres i sagittale flyet hver 2 sektioner og efterfølgende interpoleret. (b) nærmeste tilsvarende koronale del af højre halvdel af "hjernen 1" behandles histologisk for lysmikroskopi. Paneler (c, d) er de samme (a, b), men svarer til "hjerne 2". Hjerne 2 læsion var manuelt segmenteres i den koronale fly hver 8 sektioner. (e) læsion karakterisering af histologi-behandlet lige halvdele af hjerner 1 (mørk grå) og 2 (lys grå). Numre i (b, d, e) under panelerne svarer til positioner i forhold til bregma. (f) læsion karakterisering af venstre halvdel af hjernen 1 behandles for mikro-CT. Den første panel viser den isoleret læsion. De anden og tredje paneler viser læsion i forbindelse med hjernen fra to synspunkter. (g) samme som (f) men tilsvarende hjerne 2. (h) en maske af læsioner i (f, g) illustrerer kapacitet til sammenligning af læsion karakterisering med digital hjerne diskenheder. Læsion i (f) blev registreret til læsion i (g), og begge er vist i forbindelse med den venstre halvdel af hjernen 2. Figur anvendes med tilladelse fra forfatterne13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Elektrode lokalisering gennem mikro-CT billeddannelse. (en) enkelt triode venstre i situ (14,0 µm voxels). Øverste venstre panel: max intensitet projektion af virtuelle koronale afsnit viser placeringen af en nichrome triode rejser gennem den visuelle cortex i corpus callosum af en rotte; øverst til højre: nærbillede af et billede vises i det øverste venstre panel af (en) (hvide rektangel). Nederst til venstre: sagittal; nederst til højre: vandret visninger af implanteret elektrode (hvid pil angiver placeringen af triode). (b) elektrolytiske læsion og elektrode-sporet i den forreste område af en rotte hjerne (13.9 µm voxels). Øverst til venstre: 3D-gengivelse af en hjerne med den elektrolytiske læsion segmenteres ud (hvid pil, der angiver lilla læsion); øverst til højre: koronale. Nederst til venstre: sagittal; nederst til højre: vandret sektioner der angiver elektrolytisk læsion (hvide pile) produceret med en 75 µm diameter Wolfram elektrode. Derudover er nogle metal deponeret af elektrode på retraktion synlige langs sporet i den sagittal udsigt (hvid pilespidser). (c) 16-triode implantat tilbage i situ i den forreste cortex af en rotte hjerne. Øverst til venstre: 3D-gengivelse af en hele hjernen med en 16-triode array venstre implanteret; øverst til højre: koronale. Nederst til venstre: sagittal; nederst til højre: vandret sektioner med angivelse af en 16-triode implantat (8.9 µm voxels). (d) silicium sonde (10 mm skaft, 32 sites) tilbage i situ rejser gennem posterior cortex, hippocampus og subkortikale strukturer (13,9 µm voxels). Øverst til venstre: 3D-gengivelse af en hele hjernen med en segmenteret silicium sonde (hvid pil angiver grønne sonde); øverst til højre: koronale. Nederst til venstre: sagittal; nederst til højre: vandret udsigt over en silicium sonde i hjernen. Derudover er referencested på silicium sonden synlige i afsnittene koronal og sagittal (spidsen af hvide pile). Figur anvendes med tilladelse fra forfatterne13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Effekt af osmium dinitrogentetraoxid opløsningsmiddel på osmium penetration. (en) venstre panel: rotte hjernen inkuberes i osmium dinitrogentetraoxid i ddH2O i 1 uge. Højre panel: rotte hjernen inkuberes i osmium dinitrogentetraoxid i ddH2O i 2 uger. (b) to rat brains inkuberes i osmium dinitrogentetraoxid i natrium cacodylate buffer i 6 uger. Figur anvendes med tilladelse fra forfatterne13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Følgende er kritisk trin i protokollen: for det første brug af en kombination af PFA og GA perfuse dyret og efterfølgende post løse hjernen var altafgørende for at opnå overensstemmelse fuld osmium penetration af væv. Selv om vi ikke teste dette eksplicit, er en plausibel forklaring, at PFA fiksering er reversibel15, GA fiksering er ikke reversibel16,17. Fordi en to-ugers inkubation i osmium dinitrogentetraoxid er nødvendig for fuld infiltration af væv, er det muligt, at PFA i indre af hjernen diffunderer ud og væv nedbrydes under farvning. Osmium ikke kan således bevare de indre strukturer.
Brugen af vandige osmium, i modsætning til osmium opløst i en buffer (dvs. natrium cacodylate), var absolut nødvendige for at sikre fuld væv penetration af osmium. Selv efter en 6 ugers inkubation, osmium opløst i natrium cacodylate infiltrere ikke vævet fuldstændigt og syntes at støde en diffusionsspærre (figur 6). Osmium er ekstremt reaktiv til lipider og troede at binde dem i cellemembraner18,19,20. Hvis væv ikke er tilstrækkeligt permeabilized, som kan være tilfældet med en blid buffer som natrium cacodylate, det er muligt at cellemembraner kan mætte med osmium og sterically forhindre flere osmium spreder ind i vævet. Vi hypotesen, at vand som opløsningsmiddel for osmium fungerer som en lys vaskemiddel og permeabilizes væv tilstrækkeligt til at tillade dybe diffusion ind i vævet.
Hvis eksperimentatorer forbereder en mindre hjerne, som en mus, kan inkubationstiden i osmium sandsynligvis blive reduceret. Ligeledes, at inkubationstiden skal øges i større prøver. Dette kan blive testet for at bestemme den minimale tid for konsekvent farvning i en hjerne, der er forskellige i størrelse end en rotte. Hvis eksperimentatorer støder på problemer med fuld osmium infiltration, bruger de sandsynlige problemer ikke både PFA og GA under perfusion og efter fiksering, ikke bruger vand som opløsningsmiddel for osmium (som beskrevet ovenfor), og utilstrækkelig agitation under osmium inkubation. Vi fandt, for eksempel, at når inkubere i 50 mL, koniske rør lægge rørene på deres side (i modsætning til lodret på en indehaveren), fylde dem med pletten og placere dem på en orbitalryster på 50 rpm for den hele inkubation periode sikres korrekt infiltration.
Denne metode er begrænset på flere måder. Først, forberedelsen ikke bevarer ultrastruktur meget godt, så det ikke bør anvendes til elektronmikroskopi. Denne metode kan ikke kombineres med nogen yderligere histologi eller immunfluorescens. Opløsningen af den digitale volumen bestemmes af stikprøvens størrelse (mindre prøver kan scannes ved højere opløsninger) og af geometri af scanner, hvis den bygger på geometriske forstørrelse; Undersektioner af prøven kan scannes ved højere opløsninger, hvis det ønskes.
En ny metode kombinerer elektronmikroskopi-stil væv behandling med micro-CT billeddannelse til kvantificering læsioner og lokalisering af elektroder i små dyr hjerner er blevet præsenteret. Denne metode er velsagtens mindre besværligt, kræver mindre ekspertise og giver målbare resultater lettere end den nuværende guld standard for skæring og farvning en hjerne. Forskere har tidligere beskrevet en protokol for selv osmium penetration i mus hjerner, der er beregnet til at bevare ultrastruktur for elektronmikroskopi21,22. Denne protokol, er imidlertid ganske kompliceret. I denne undersøgelse, forfatterne har til formål at udvikle en meget enklere metode til micro-CT billeddannelse snarere end Elektron Mikroskopi. Der har været andre undersøgelser gælder mikro-CT billeddannelse hjerne til forskellige formål. En tidligere undersøgelse i kaniner og mus brugt micro-CT for at finde tumorer og andre abnormiteter23. Denne undersøgelse gjorde brug af proprietære MR-kontrastmidler, men forskerne gjorde forudsige mikro-CT potentielle anvendelighed i læsion undersøgelser. En anden undersøgelse i mus med henblik på at finde brutto morfologiske forskelle for et stof skærmen involveret farvning af musen hjerner med jod i kraniet, men forfatterne står ujævn væv svind og har valgt for at integrere vævet i en hydrogel24. Andre studier i mus har til formål at finde cerebral bundløs misdannelser, en forstyrrelse af unormalt store og uregelmæssige kapillærer, og har gjort brug af osmium dinitrogentetraoxid og vandig jod som pletter; imidlertid blev disse udføres i meget små prøver (fritliggende mus hindbrains) end beskrevet her25,26,27. Alternative metoder til at generere 3D hjerne diskenheder er µMRI28 og høj opløsning episkopiske mikroskopi31. Opløsningen på µMRI er fattigere (~ 25 µm voxels for lignende prøver28), og teknikken er dyrere23,30. Høj opløsning episkopiske mikroskopi også står over for udfordringer: at det er en destruktiv teknik, og en blok-ansigt apparater giver hele-hjerne skæring skulle produceres. Arbejde præsenteres her udvider også tidligere bestræbelser på at finde elektroder i hjernen med røntgenstråler32,33,34 af indfange begge elektrode og omkringliggende væv. Desuden teknikken giver mulighed for at lokalisere enkelt elektroder, triode arrays, elektrolytisk læsioner, elektrode spor og silicium sonder.
En værdifuld fremtidige retning ville oprettelsen af en "gennemsnitlig hjerne" atlas som kunne læsion undersøgelser Co registreret for at standardisere læsion placering og størrelse kvantificering. Denne metode kan også udvides til andre model og ikke-model organismer, som eksemplificeret af dens umiddelbare anvendelse til zebrafinke hjernen (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Greg Lin og Arthur McClelland for deres ekspertise med micro-CT maskine, David Richmond og Hunter Elliott på billedet og Data analyse kerne (IDAC) på Harvard Medical School for deres billedbehandling rådgivning, og William Liberti på Boston Universitet for allernådigst giver en zebrafinke hjerne. Dette arbejde blev udført delvist på Center for nanoskala systemer (CNS), medlem af den nationale nanoteknologi koordineret infrastruktur netværk (NNCI), som støttes af National Science Foundation under NSF award no. 1541959. CNS er en del af Harvard University. Dette arbejde blev støttet af Richard og Susan Smith Family Foundation og IARPA (kontrakt #D16PC00002). S.B.E.W. blev støttet af stipendier fra Human Frontier Science Program (HFSP; LT000514/2014) og den europæiske molekylærbiologiske organisation (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. blev støttet af National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Program (GRFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1x PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
References
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
- Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
- Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
- Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
- Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
- Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
- Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
- Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
- Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
- Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
- Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
- Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
- Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
- Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
- Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
- Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
- Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
- Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
- Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
- Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
- Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
- Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
- Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
- Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
- Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
- Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
- Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
- Fu, T. -M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).
