Analyse af Actomyosin dynamik på lokale cellulære og vævs skalaer ved hjælp af time-lapse film af dyrkede Drosophila ægge kamre

Summary

Denne protokol giver en Fiji-baseret, brugervenlig metode sammen med ligetil instruktioner, der forklarer, hvordan man pålideligt analysere actomyosin adfærd i individuelle celler og buede epiteliale væv. Ingen programmering færdigheder er forpligtet til at følge tutorial; alle trin udføres på en semi-interaktiv måde ved hjælp af den grafiske brugergrænseflade af Fiji og tilhørende plugins.

Abstract

Drosophila umodne æg kaldes ægge kamre, og deres struktur ligner primitive organer, der gennemgår morfologiske ændringer fra en runde til en ellipsoide form under udvikling. Denne udviklingsmæssige proces kaldes oogenesen og er afgørende for at generere funktionelle modne æg til at sikre den næste flue generation. Af disse grunde har ægkamre tjent som en ideel og relevant model til at forstå dyrs orgel udvikling.

Flere in vitro-dyrknings protokoller er blevet udviklet, men der er flere ulemper ved disse protokoller. Den ene indebærer anvendelse af forskellige dækker, der udøver et kunstigt pres på de afbildet æg kamre for at imurre dem og at øge den afbildet erhvervelse flyet af den circumferentielle overflade af de analyserede æg kamre. En sådan fremgangsmåde kan have en negativ indflydelse på adfærden af de tynde actomyosin maskiner, der genererer kraften til at rotere ægkamre omkring deres længere akse.

Således, at overvinde denne begrænsning, vi kultur Drosophila æg kamre frit i medierne for at pålideligt analysere actomyosin maskiner langs omkredsen af ægge kamre. I den første del af protokollen, giver vi en manual beskriver, hvordan man analyserer actomyosin maskiner i en begrænset erhvervelse flyet på den lokale cellulære skala (op til 15 celler). I den anden del af protokollen, giver vi brugerne en ny Fiji-baseret plugin, der giver mulighed for simpel udvinding af et defineret tyndt lag af ægget kamre ' circumferential overflade. Følgende protokol beskriver derefter, hvordan actomyosin-signaler analyseres i vævs skalaen (> 50 celler). Endelig, vi udpege begrænsningerne af disse tilgange på både den lokale cellulære og vævs skalaer og diskutere dens potentielle fremtidige udvikling og mulige applikationer.

Introduction

Den stadige udvikling af nye billeddannelses-og softwareteknologier med anvendelser i biovidenskaben har givet en enorm indflydelse på forståelsen af livets grundlæggende principper. En af de største udfordringer er den pålidelige visualisering af udviklingsmæssige processer i kombination med deres levende billeddannelse i forskellige væv. Væv er dele af organer og organer, og som sådan er flertallet ikke let tilgængelige for billeddannelse. Derfor er protokoller, der tillader deres dissektion og in vitro-dyrkning blevet udviklet med henblik på at visualisere biologiske hændelser, der i tilstrækkelig grad afspejler in vivo-situationen i en levende krop.

I løbet af de seneste årtier, dyrkning og levende billeddannelse af Drosophila ægge kamre, acinar-lignende strukturer, der ligner primitive organer, har bidraget enormt til forståelsen af de grundlæggende principper for primitiv orgel udvikling^{1 , 2 , 3}. i øjeblikket er der flere dyrkning protokoller til rådighed, og deres anvendelse afhænger af erhvervelse tid, celletype, der skal imaged, og deres tilgængelighed (f. eks indre kimcelle vs. ydre somatiske linje)⁴.

Et fælles træk i alle disse dyrkning protokoller er behovet for immobilisering af analyserede æg kamre, der viser en høj kontraktile aktivitet i flydende medier. Den kontraktile aktivitet af ægge kamre er forårsaget hovedsageligt af musklen ark, der dækker en lang række tilsluttede ægkamre^5,6,7. For at opnå en korrekt immobilisering af unge ægkamre er der derfor udviklet forskellige tilgange, som omfatter ægkamre med dæksedler^6,8,9 eller fleksible tæpper^{4, 10} eller indlejring dem i lav-smeltepunkt agopstået^3,11. Disse tilgange er populære, da de også giver mulighed for billeddannelse af en større visuel plan på grund af den subtile fladning af den circumferentielle overflade af ægge kamre.

Men for nylig har det vist sig, at unge ægkamre (etape 1-8) roterer omkring deres forreste-posterior akse⁶ , og at denne vævs bevægelse drives af et fint actomyosin-netværk tæt på den omskiftelige overflade af disse unge ægkamre ¹². derfor kan kunstig ændring af cellulær overflade forårsaget af en subtil udfladning af dette væv have en negativ indvirkning på adfærden af den kraft skabende actomyosin maskiner. Kontra pointet er, at hvis ægkammer vævet ikke er fladtrykt, bliver mikroskopisk billeddannelse af proteiner på ægkammerets circumferentielle overflade endnu mere begrænset af den nedsatte størrelse af anskaffelses planet.

Derfor har vi kombinerede protokoller fra Prasad et al.⁹ og laboratoriet i Celeste Berg^4,10 og yderligere modificeret dem, så der ikke er nogen coverslip/fleksibel tæppe/agantet anvendes i den udviklede metode. Drosophila ægge kamre er frit kultiveret i medierne og protokollen præsenteres her gælder kun inverteret mikroskopi. Der er to dele af protokollen. Den første del er fokuseret på analysen af actomyosin signaler på den lokale cellulære skala (op til 15 celler) i ægge kamre. I den anden del, vi fokuserer på at overvinde de begrænsninger, der er forbundet med en lille erhvervelse fly forårsaget af den frie dyrkning af ægge kamre. I denne forbindelse har vi udviklet en roman Fiji-baseret Computational metode med en semi-interaktiv grafisk brugergrænseflade, der selektivt ekstrakter og udfolder definerede lag af en circumferentiel vævs overflade. Dette efterfølges af en protokol, der beskriver, hvordan man analyserer actomyosin på vævs skalaen (dvs. > 50 celler). Da den selektive ekstraktion af et afgrænset tyndt lag af buet epitelial væv ikke har været let mulig ved hjælp af en klassisk z-stak projektion (figur 1), er denne brugervenlige metode en vigtig forudsætning for en grundig forståelse af opførsel af en tynd (< 1 μm) actomyosin netværk på vævs skalaen i Drosophila ægge kamre.

Hertil kommer, at lette protokollen, vi giver eksempel time-lapse film (TLMs) og prøve filer af fluorescently Tagged nonmuscle konventionel myosin II adfærd (Se supplerende fil 3). Myosin II er et motor protein og repræsenterer den aktive kontraktile del af actomyosin-maskinerne. For at billedet myosin II, vi bruger Drosophila transgene linjer, der indeholder en modificeret lovgivningsmæssig lyskæde af myosin II kaldet mrlc:: gfp (Se tabel over materialer for detaljer)^12,13. For at visualisere cellemembraner er protokollen baseret på kommercielle farvestoffer (Se tabel over materialer). Denne protokol er egnet ikke kun til analyse af små subcellulære mrlc:: gfp signaler¹² men også for enhver lignende størrelse subcellulære partikler omkring ± 300 μM, såsom dem observeret med Life-Act:: gfp^12,14.

Selv om begge disse protokoller er præsenteret ved hjælp in vitro kulturperler Drosophila æg kamre, erhvervelse af actomyosin signaler kan også udføres ved hjælp af andre væv på optimering af de dyrkning medier og afhængigt af tilgængeligheden af enten fluorescently mærkede proteiner med tilsvarende kommercielle farvestoffer eller, for eksempel, mRNA mikroinjektioner for at opnå transitorisk genekspression profiler. På samme måde kan den Fiji-baserede protokol til udvinding af et tyndt lag fra en circumferentiel overflade anvendes mere generelt til ellipsoide og orgel lignende væv.

Protocol

Bemærk: Følgende protokol indeholder instruktioner om, hvordan man analyserer actomyosin på det lokale cellulære og vævs skalaen i Drosophila ægge kamre. Den lokale skala tilgang giver brugerne mulighed for at analysere detaljerede actomyosin adfærd i op til 15 celler pr æg kammer og kræver erhvervelse af tlms for en kort periode (5 – 10 min) ved hjælp af High-Speed Imaging og en omvendt confokale mikroskop. I modsætning hertil giver vævs skalaen brugerne actomyosin information i 50 – 100 celler og kræver erhvervelse af Tlm'er i en længere periode (≥ 30 min) ved brug af lavhastigheds billeddannelse og et inverteret roterende skive mikroskop (Se figur 2 og anbefalede parametre for hver skala i tabel 1). Beslutningen, hvor skalaen til at analysere actomyosin signaler helt afhænger af brugerens videnskabelige spørgsmål. Ledsaget test TLMs bør bidrage til at træffe denne beslutning.

1. lokal cellulær skala (LCS)

Bemærk: At dissekere og billede in vitro kulturperler Drosophila æg kamre, Følg protokollen beskrevet i supplerende fil 1. Hvis du vil analysere erhvervede Tlm'er, skal du fortsætte med følgende protokol. Links til medfølgende test filer af TLMs findes i den supplerende fil 3.

1. Data behandling af TLMs på den lokale cellulære skala (LCS)
   1. Bleach korrektion af TLMs at kompensere for intensitet forfald af fluorescerende etiketter
      1. Sørg for, at en up-to-date Fiji applikation er installeret på computeren bliver brugt ved at følge disse instruktioner: Fiji > åbne en TLM (f. eks. TestMovie1. tif fra den supplerende fil 3).
      2. Opdel farvekanalerne ved at klikke på billede > farve > opdelte kanaler.
      3. Udfør en blege korrektion på begge kanaler ved hjælp af billed > Juster > blege korrektion > simpelt forhold > baggrunds intensitet 0,0.
         Bemærk: Hvis der opnås utilfredsstillende resultater, undersøge hvilke korrektionsmetoder i dette plugin passer bedst (f. eks Brug histogram matching i stedet for en simpel ratio).
   2. Celle segmentering til generering af en celle maske for TLMs
      1. Hvis Fiji ikke allerede er åben, skal du genåbne den (og sørge for, at den er opdateret) efter hjælp > opdatere ≫ anvende ændringer > OK.
      2. Hvis dette ikke allerede er gjort, skal du hente makroen Tissuecellsegmentmovie. IJM (fra http://adm.irbbarcelona.org/MATLAB/TissueCellSegmentMovie.IJM). Træk og slip dette script til Fiji.
      3. Åbn filen med Bleach-korrigeret TLM. TIFF (Se afsnit 1.1.1). Opdel kanalerne i den blege rettede fil ved hjælp af billed > farve > opdelte kanaler.
      4. Kør det uploadede script på den aktive celle membran kanal for den valgte TLM ved at trykke på ikonet Kør i det åbne script. Indstil Gaussisk sløring til 2,500 og celle detekteringsfølsomheden til -1 , og klik på OK. For at få en dejlig celle maske, ikke ændre disse parametre ovenfor. Indstil den estimerede støj tolerance mellem 10 – 20 for Tlm'er, der er erhvervet med 63x-målsætningen, og klik på OK.
         Bemærk: For andre mål kan der være behov for forskellige parametre. Renere baggrunden i en TLM, den lavere anslåede støj tolerance er påkrævet.
      5. En genereret celle maske vises i den analyserede TLM og også i et nyt vindue kaldet Particlestack (G), og Derudover vises et lille vindue kaldet handling påkrævet . Fra celle masken på TLM skal du kun fokusere på celler i midten af TLM og vælge dem, der kan give komplette og veldefinerede konturer i hele TLM.
      6. Hvis udvalgte celler indeholder kunstige/ekstra celle konturer, skal du bruge vinduet Flet værktøj kaldet handling, der kræves i TLM. For sidstnævnte, Følg instruktionerne i vinduet.
         Bemærk: Sørg for, at celle konturer er veldefinerede og svarer til virkelige cellemembraner i en TLM, da enhver upræcision kan påvirke efterfølgende analyser. Yderligere tweaks og ændringer, såsom fjernelse af uønskede celler, kan gøres senere ved hjælp af Surface Manager Tool (beskrevet i afsnit 1.1.3).
      7. Når de valgte celler i midten pænt svarer til den virkelige cellemembraner, gemme ParticleStack som en. TIFF fil følgende fil ≫ gemme som > TIFF.
   3. Indlæsning af den genererede celle maske i Surface Manager
      1. Installer Surface Manager plugin¹⁵ i den brugte Fiji setup. Følg instruktionerne fra Viktorinova et al.¹⁶.
      2. Åbn Surface Manager ved hjælp af Plugins ≫ segmentering ≫ Surface Manager (3D).
         Bemærk: Vinduet Surface Manager viser flere handlingsknapper til højre og et tomt vindue til venstre. Hvis du vil se alle handlingsknapper, kan det være nødvendigt at strække vinduet i højden/bredden. Bemærk, at tidsrammer vises som z-udsnit.
      3. Åbn den tilsvarende ParticleStack. TIFF-fil i Surface Manager ved at klikke på filer > Åbn , og vælg det billede, du vil åbne (f. eks. ParticlesStack1. tif).
      4. I Surface Manager skal du klikke på knappen Læs dispositions billede og indstille jacquard-indekset til 60%.
         Bemærk: Indlæsning af ParticlesStack1. tif-filen kan tage op til flere minutter, afhængigt af computerens processorkraft.
      5. Når den er indlæst, vil hver celle blive tildelt et S-nummer og vises i venstre side af vinduet Surface Manager.
         Bemærk: Hvis du vil vise konturer og cellenavne for alle celler, skal du markere afkrydsningsfelterne Vis alle og Vis etiketter nederst i vinduet Surface Manager. Det anbefales at bruge denne funktion, når celle numrene er blevet kontrolleret for deres korrekthed.
      6. Klik på det første S-nummer; den importerede celle disposition fra ParticlesStack1. tif vises på TLM. Kontroller hvert importeret S-nummer for celle dispositions kvalitet i hele TLM, og fjern uønskede celler, der viser forkerte celle konturer. For at gøre det skal du markere celle dispositionen og klikke på knappen Slet.
         Bemærk: Det er også muligt at korrigere for upræcise celle konturer og tilføje nye celle konturer. Dette er beskrevet i afsnittet diskussion.
      7. Gem alle rettede celler som en RoiSet. zip-fil ved at trykke på knappen Gem på disk .
         Bemærk: Hvis sessionen skal afbrydes, er det muligt at indlæse RoiSet-filen i Surface Manager senere: Åbn en TLM i Fiji (fil > åben) og vælg en TLM. Åbn Surface Manager via Plugins ≫ segmentering ≫ Surface Manager (3D). Indlæs den tilsvarende RoiSet. zip-fil ved at klikke på knappen Indlæs fra disk og vælge den relevante roiset. zip-fil. Dobbelttjek, at de indlæste celle masker svarer til den indlæste TLM.
   4. Korrektion for vævs drift i TLMs
      Bemærk: Under TLMs ' anskaffelsestidspunkt kan der observeres afdrift virkninger på grund af epitelial rotation eller en uønsket bevægelse. I begge tilfælde anbefaler vi at korrigere for enhver drift for at forenkle den manuelle actomyosin analyse senere. Drift korrektion er kun nødvendig for manuel actomyosin analyse. Denne tutorial kræver up-to-date Fiji software med MultiStackReg plugin (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) installeret.
      1. Åbn den blege-korrigerede TLM i Fiji via fil > åbne og vælg Bleach-korrigeret fil oprettet ved hjælp af tutorial nævnt ovenfor.
      2. Opdel kanalerne, og vælg den, der identificerer cellemembranerne via billed > farve > opdelte kanaler.
      3. Brug følgende protokol, når celle konturerne ikke er synligt jævne: Behandl > filtre ≫ Gaussisk sløring. Angiv den til ~ 1 – 2 for en 63x-målsætning, og klik på OK og derefter Ja. Klik på Behandl > binære > Konverter til maske ved hjælp af standardindstillingerne. Klik derefter på OK.
      4. Indlæs MultiStackReg-plugin'et efter Plugins > registrering ≫ multistackreg.
      5. Sørg for, at stak 1 er indstillet til celle membran kanalen, handling 1 er indstillet til Juster, og transformation er indstillet til oversættelse. Markér afkrydsningsfeltet Gem Transformations fil , og klik derefter på OK.
      6. Åbn den valgte TLM, MultiStackReg-plugin'et og den gemte transformerings fil ved hjælp af filen > Åbn , og vælg en TLM. Opdel farvekanalerne ved hjælp af billed > farve > opdelte kanaler.
      7. Indlæs MultiStackReg-plugin'et ved at klikke på Plugins > registrering ≫ multistackreg. Vælg Indlæs Transformations fil som handling 1.
      8. Efterlad transformation som stiv krop , og klik på OK. Vælg den tidligere gemte transformerings fil, og klik på OK igen.
      9. Flet billed kanalerne, og Gem den registrerede TLM som en. TIFF-fil efter billede > farve > flette kanaler. Gem filen ved at klikke på filer ≫ Gem som > TIFF.
         Bemærk: Der er alternative måder at korrigere for en vævs drift i Fiji, nemlig via Plugins > registrering > Stackreg/korrekt 3D drift.
2. Analyse af actomyosin pulser i Surface Manager hos LCS
   Bemærk: Denne protokol trin giver forskerne mulighed for at identificere, om actomyosin pulser er til stede i det analyserede væv og til at forstå den detaljerede adfærd samt direktionalitet af actomyosin signaler.
   1. Åbn Fiji, og sørg for, at en TLM og dens tilsvarende celle maske er åben i Surface Manager.
      Bemærk: Sørg for, at Fiji er installeret og up-to-date, og Surface Manager-plugin'et er installeret (trin 1.1.3.1).
   2. Åbn en TLM med fil > åbne og vælg en TLM at åbne (f. eks., TestMovie1_bleach. tif). Indlæs Surface Manager-plugin'et via Plugins ≫ segmentering ≫ Surface Manager (3D). Indlæs den gemte celle maske, der er oprettet i selvstudiet her (f. eks. ParticlesStack1. tif) via fil > Åbn , og vælg en celle maske (f. eks. ParticlesStack1. tif). Indlæs den tilsvarende interesseregion (ROI, f. eks. TestMovie1_RoiSet. zip). Se figur 3a.
   3. Skift til den kanal af interesse i den valgte TLM.
      Bemærk: For at skelne kanalerne, skal du følge den farvekode, som er angivet omkring TLM.
   4. I Surface Manager skal du klikke på knappen statistik for at få vinduet kaldet gennemsnitlig grå værdi skive for udsnit (figur 3b). Bemærk, at middelværdien/median intensitetsværdierne for actomyosin-signaler i en given analyseret kanal inden for de definerede celle konturer over tid vil blive vist, samt andre parametre relateret til celleområdet og celle form.
      Bemærk: De intensitetsværdier er i arbitraty enheder (A.U.); celleområdet er i pixel og skal konverteres til firkantede mikrometer.
   5. Gem de opnåede værdier som en regnearksfil. Klik på statistikvinduet, fil ≫ Gem som.
      Bemærk: Det er muligt at verificere de opnåede statistiske værdier senere som følger: Åbn den blege korrigerede TLM i Fiji og Open Surface Manager. Indlæs den tilsvarende RoiSet. zip til TLM ved at trykke på knappen Indlæs fra disk og åbne filen. Den gemte maske med celle konturer vil blive uploadet, og navnene på cellerne vises i vinduet til venstre Surface Manager. Klik på statistik knappen for statistiske værdier.
3. Manuel analyse af individuelle subcellulære actomyosin-signaler ved LCS
   Bemærk: Denne protokol kræver mest koncentration og er tidskrævende. Generelt kan en erhvervet TLM være komfortabelt analyseret inden for 1 dag. Dette omfatter ikke tid til fly forberedelse før deres dissektion, dissektion selv, og image erhvervelse.
   1. Åbne en udvalgt, blege-korrigeret og registreret (drift-korrigeret) TLM i en up-to-date Fiji ansøgning. Brug en Bleach-korrigeret og afdrift-korrigeret TLM (f. eks. TestMovie1_bleach_reg. tif) som et test eksempel.
   2. Juster lysstyrken og kontrasten for at se de enkelte actomyosin-signaler ved hjælp af billed > justere > lysstyrke/kontrast.
   3. Juster Tlm'er i samme retning i forhold til vævs-/kropsaksen. I tilfælde af ægkamre, justere den forreste side af ægget kamre altid til venstre for billedet/submovie/TLM før analysen.
   4. Opdel den valgte film i korte 30 s submovies og Time-Project hver af dem. Gem ikke-tids beregnede og tids projicerede under film med tilsvarende navne. Behold den oprindelige kilde.
      Bemærk: Under film kan oprettes fra originale TLMs ved først at slette uønskede rammer via billede > stakke > skive Remover. Definer de udsnit, der skal fjernes, og Angiv intervallet. Transformér til RGB, før udsnitsremoveren bruges, når interval = 1. Til tids projicere en 30 s-under film skal du klikke på billede > stakke > Z-projekt > maksimal intensitet for de definerede rammer (udsnit) og derefter klikke på OK. Spring over hver anden 30 s under film for at undgå at tælle actomyosin signaler 2x i to efterfølgende 30 s under film.
   5. Placer et tids projiceret billede ved siden af den tilsvarende 30 s-under film (figur 4a, B). Identificer signal linjen på den tids projicerede under film. Identificer retningen af actomyosin-signal bevægelsen (0 °-360 °) langs denne linje i den oprindelige under film ved at afspille under filmen manuelt. Brug vinkel værktøjet (i Fiji-bjælken) til manuelt at måleretningen af signal bevægelsen i forhold til den definerede vævs akse eller et lignende tilgængeligt værktøj.
      Bemærk: Fiji arbejder kun på en 0 °-180 ° skala (figur 4c), og en genberegning af de opnåede værdier på en 0 °-360 ° skala er påkrævet. En signal linje svarer til den bane af en actomyosin signal bevægelse over tid.
   6. For at undgå dobbeltarbejde i analysen af actomyosin-signalerne, markeres de analyserede signallinjer inden for cellerne i den tids projicerede under film (figur 4b, D).
   7. Analysér alle udvalgte celler i 30 s-under filmen og Gem de opnåede vinkler.
      Bemærk: Analyser kun subcellulære cytoplasmatiske actomyosin signaler i celler med veldefinerede celle konturer i hele en TLM. Ekskluder individuelle celler med mindre end 15 – 20 detekterede signaler i hele TLM. Ignorer actomyosin signaler, der bevæger sig på tværs af celler på grund af deres ukendte oprindelse. Et eksempel på signal tæller for en analyseret celle i 30 s-under filmen er vist i figur 4d.
   8. Fortsæt indtil alle 30 s-lange under film af en TLM analyseres, og Gem alle målte vinkler af actomyosin signaler af en TLM i en regnearksfil.
   9. Summen af alle målte vinkler over det relevante antal Tlm'er (afhængigt af eksperimentet). Plot procentdelen af retningen af analyserede actomyosin signaler, for eksempel, som et rosen diagram med et interval fra 0 ° til 360 ° med en foretrukken software.
      Bemærk: For at opnå statistisk signifikante resultater anbefales fem til ti uafhængige ægkamre af enhver ægkammer fase, der skal analyseres.

2. vævs skala

Bemærk: At dissekere og billede in vitro kulturperler Drosophila æg kamre, Følg protokollen i supplerende fil 2. For at analysere erhvervede TLMs, Fortsæt med følgende protokol nedenfor. De ledsagede prøvnings filer for Tlm'er anbringes i den supplerende fil 3.

1. Selektiv overflade udvinding af buet epitelial væv
   Bemærk:Denne protokol giver brugerne mulighed for selektivt at udtrække et tyndt lag af actomyosin i et buet epitelial væv over tid. Denne protokol trin er brugervenlig og baseret på en intuitiv grafisk brugerflade. Det er muligt at komfortabelt analysere (uddrag overflade) flere TLMs. use TestMovie2. czi (fraSupplerende fil 3) som en test TLM eksempel.
   1. Åbn et up-to-date Fiji-program (fiji > hjælp ≫ opdatere > anvende ændringer > OK).
   2. Sørg for, at ellipsoid Surface Projection plugin¹⁵ er installeret. Følg Viktorinova et al. ¹⁶.
   3. Åbn en TLM, og eksporter den som en XML/HDF5-fil ved at klikke på Plugins ≫ bigdataviewer > Eksporter aktuelt billede som XML/HDF5-fil.
      Bemærk: Det er nødvendigt at definere en eksportsti. Selve besparelsen kan tage flere minutter og afhænger af TLM-længden.
   4. Åbn den eksporterede fil i ellipsoid Surface Projection ved at klikke på Plugins ≫ bigdataviewer ≫ ellipsoid Surface Projection > Vælg XML-fil.
      Bemærk: Et nyt vindue med sagittale visninger af ægget kammer og en dialog til at vejlede brugeren gennem behandlingen vil blive vist. Du kan finde oplysninger om, hvordan du navigerer i udsnitsvisningen, på https://imagej.net/BigDataViewer.
   5. Dialogvinduet kaldet æggestokke projektion har flere faner. I den første dialog fane, der kaldes afgrænsningsramme, skal du definere x-og y-kanterne på et ægge kammer i TLM sammen med z-bredden af afgrænsningsrammen (dvs. dybden af et z-stak/ægge kammer) og trykke på set (figur 5a).
   6. Hvis du vil definere kanter, skal du trække knapperne ud for x, y og z eller definere nummer koordinaterne i boksene x, y og z. Sørg for, at grænserne er generøse nok til at få den del af ægget kammer af interesse i overfladen udvinding. De udvalgte dele af ægge kammeret er fremhævet med pink.
   7. Skift til fanen med navnet Find blobs i vinduet æggestokke projektion. Definer Sigma og minimal spidsværdi; Tryk derefter på Compute for at identificere actomyosin-signalerne (figur 5b), som vises som grønne blobs. Prøv dette trin igen med forskellige parametre, indtil der er fundet nok pletter (omkring 100).
      Bemærk: Sigma 1 \ u20123 med minimal spidsværdi 20 \ u2012100 fungerer bedst til at identificere actomyosin signaler af scenen-6 til-8 ægge kamre. Identificering af actomyosin signaler er et afgørende skridt og afhænger af signalkvaliteten og dens størrelse. Det er vigtigt at bekræfte den korrekte størrelse af de eksisterende blobs. Ingen synlige grønne pletter/blobs i billedet betyder, at det næste skridt ikke vil fungere. Gennemse de valgte z-planer for at se blobs.
   8. Hvis du vil designe ellipsoide, skal du fortsætte med fanen med navnet Tilpas ellipsoide. Sæt tilfældige prøver til 10.000, udenfor/inde cut-off afstand til 1 \ u201210, og klik derefter på Compute (figur 5c).
      Bemærk: Jo lavere cut-off afstanden, jo mere præcis den ønskede ellipsoide vil være. Efter dette, fanen kaldet projektion vil automatisk åbne og tillader definitionen af overfladen udvinding. Indstillingerne skal optimeres.
   9. Fortsæt med fanen med navnet projektion (figur 5D). Angiv en minimum-og maksimum fremskrivnings afstand (dvs. bredden på det ønskede ellipsoide). Det er nødvendigt at indstille en minimal og maksimal projektion afstand, således at den pink definerede ellipsoide region omfatter hele udvendigt lag af ægge kammeret. Definer udsnitsafstanden (1 anbefales).
      Bemærk: Eksempler på en forkert og optimal ellipsoide pasform, der resulterer i forkerte og optimale projektions parametre, er vist i figur 6a, C. Det tynde circumferentielle lag af interessen kan defineres senere. Sørg for, at den lyserøde region ellipsoide med den definerede bredde på ægge kammeret er synlig, før du trykker på Compute. Det er vigtigt, at den ønskede ellipsoide (Pink enkelt linje) passer fint til den ellipsoide overflade af et ægge kammer for at opnå de bedste resultater. Hvis ellipseformet pasform ikke er god, arrangere forskellige indstillinger indtil den ønskede overflade udvinding er opnået.
      1. Indstil en output bredde (≥ 800) og højde (≥ 400) af ellipsoideet. Sæt fra hvilket tidspunkt, hvor tidspunktet overfladen udvinding skal oprettes (dvs., definere længden af TLM udvinding). Vælg enten en sfærisk eller cylindrisk projektion. Vend Z og Juster Y, hvis det er nødvendigt.
      2. Tryk på Compute for at få en overflade ekstraktion for begge kanaler i nye vinduer kaldet Image. Juster lysstyrken og kontrasten i de opnåede billedvinduer for at kunne se de projicerede actomyosin-signaler ved at klikke på billede > justere > lysstyrke/kontrast.
         Bemærk: Et eksempel på en sammenligning af en projektion, der skyldes en forkert og optimal ellipsoide pasform, er vist i figur 6b, D.
   10. Hvis overfladen udvinding ser godt ud, gemme billederne (begge kanaler separat) som. TIFF. Derudover gemme logfilen vindue til fremtidig reference om, hvordan overfladen af denne særlige ægge kammer blev ekstraheret.
       Bemærk: Dette er især vigtig information, hvis det ekstraherede tynde lag skal returneres til sin oprindelige udfoldet form (kun for udviklere).
   11. Flet kanalerne med en foretrukken farvekode i Fiji.
       Bemærk: Hvis det er nødvendigt, projekt udvalgte z-stak lag med actomyosin signaler. Projektion af udvalgte z-stak lag er påkrævet, når erhvervelsen fokus lidt ændrer sig over tid i en TLM. For de bedste resultater, Projicer højst et til to z-stak lag.
   12. Gem resultaterne som. TIFF-filer.
       Bemærk: Repræsentative eksempler på tynde lag (selektiv basal og apisk overflade), der repræsenterer myosin II (MRLC:: GFP)-signalet fra follikel epitelet i kontrol-og fat2 mutant ægkamre, findes i figur 8.
2. Data behandling af en selektivt ekstraheret vævs overflade
   1. Blegemiddel-korrigere TLMs at kompensere for intensitet forfald af de fluorescerende etiketter.
      1. Åbn Fiji. Åbn en TLM (f. eks. TestMovie2_extraction. tif fra den supplerende fil 3) ved hjælp af filen > åben. Vælg billedet for at åbne det.
      2. Opdel farvekanalerne, og konverter dem til 16-bit billeder, hvis det er nødvendigt, ved at klikke på billede > farve > opdelte kanaler. Konverter kanalerne til 16-bit billeder (fra 32-bit billeder) ved hjælp af billed > type > 16-bit.
      3. Udfør en blege korrektion på begge kanaler ved hjælp af billed > Juster > blege korrektion > simpelt forhold > baggrunds intensitet 0,0.
         Bemærk: Hvis der opnås utilfredsstillende resultater, er det nødvendigt at undersøge hvilke korrektionsmetoder i dette plugin passer bedst (f. eks brug histogram matching i stedet for en simpel ratio).
      4. Flet kanalerne fra de to blege rettede billeder ved at klikke på billede > farve > flette kanaler. Gem det flettede billede som en. TIFF-fil ved at klikke på filer ≫ Gem som > TIFF.
         Bemærk: Juster kontrasten og lysstyrken for kanalerne, hvis det er nødvendigt.
   2. Celle segmentering til generering af en celle maske for TLMs
      1. Hvis Fiji ikke allerede er åben, skal du genåbne den (og sørge for, at den er opdateret ved at klikke på hjælp > opdatering ≫ anvende ændringer > OK).
      2. Hvis dette ikke allerede er gjort, skal du hente makroen TissueCellSegmentMovie. IJM (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. Træk og slip dette script til Fiji. Åbn filen Bleach-korrigeret (f. eks. TestMovie2_bleach. tif fra den supplerende fil 3, se også 2.2.1).
      4. Opdel kanalerne i den Bleach-rettede fil ved at klikke på billede > farve > opdelte kanaler. Juster membran kanalen for at sikre klare celle konturer ved at klikke på billede > justere > lysstyrke/kontrast.
      5. Kør det uploadede script på den aktive celle membran kanal for den valgte TLM ved at trykke på ikonet Kør i det åbne script. Indstil Gaussisk sløring til 1,500. Angiv følsomheden for celle registrering til-1, og klik på OK. Indstil anslået støj tolerance til ~ 8 for tlm'er, der er erhvervet med 40x-målsætningen, og klik på OK.
         Bemærk: For at få en dejlig celle maske, ikke ændre disse parametre ovenfor. For andre mål kan der være behov for forskellige parametre. Renere baggrunden i en TLM, den lavere anslåede støj tolerance er påkrævet.
      6. En genereret celle maske vises i den analyserede TLM og også i et nyt vindue kaldet Particlestack (G). Desuden vises et lille vindue kaldet handling påkrævet . Fra celle masken på TLM skal du kun fokusere på celler i midten af TLM og vælge dem, der kan give komplette og veldefinerede konturer i hele TLM.
      7. Hvis udvalgte celler indeholder kunstige/ekstra celle konturer, skal du bruge vinduet Flet værktøj kaldet handling, der kræves i TLM. For sidstnævnte, Følg instruktionerne i vinduet.
         Bemærk: Sørg for, at celle konturer er veldefinerede og svarer til virkelige cellemembraner i en TLM, da enhver upræcision kan påvirke efterfølgende analyser. Yderligere tweaks og ændringer, såsom fjernelse af uønskede celler, kan gøres senere ved hjælp af Surface Manager Tool (skitseret i tutorial nedenfor).
      8. Når udvalgte celler i midten pænt svarer til den virkelige cellemembraner, gemme ParticleStack som en. TIFF fil følgende fil ≫ gemme som > TIFF. Fortsæt med at udføre indlæsningen af den genererede celle maske og actomyosin-analysen i Surface Manager som tidligere udført i afsnit 1.1.3 og 1,2 (også beskrevet i detaljer i punkt 2.2.3 og 2,3).
   3. Indlæsning af den genererede celle maske i Surface Manager
      1. Hvis Surface Manager-plugin'et allerede er installeret i det anvendte Fiji-setup, skal du fortsætte til trin 2. Hvis ikke, Følg Viktorinova et al.¹⁶. For udviklere, bare kildekoden er også tilgængelig¹⁵.
      2. Åbn Surface Manager ved at klikke på Plugins ≫ segmentering ≫ Surface Manager (3D).
         Bemærk: Vinduet Surface Manager viser flere handlingsknapper til højre og et tomt vindue til venstre. Hvis du vil se alle handlingsknapper, kan det være nødvendigt at strække vinduet i højden/bredden. Bemærk, at tidsrammer vises som z-udsnit.
      3. Åbn den tilsvarende ParticleStack. tif-fil i Surface Manager via fil > Åbn , og vælg det billede, du vil åbne (f. eks. ParticleStack2. tif fra den supplerende fil 3).
      4. I Surface Manager skal du klikke på knappen Læs dispositions billede og indstille jacquard-indekset til 60%.
         Bemærk: Indlæsning af en ParticleStack. tif-fil kan tage op til flere minutter, afhængigt af computerens strømforsyning.
      5. Når den er indlæst, vil hver celle blive tildelt et S-nummer og vises i venstre side af vinduet Surface Manager (figur 7a).
         Bemærk: Hvis du vil vise konturer og cellenavne for alle celler, skal du markere afkrydsningsfelterne Vis alle og Vis etiketter nederst i vinduet Surface Manager. Det anbefales at bruge denne funktion, når celle numrene er blevet kontrolleret for deres korrekthed.
      6. Klik på det første S-nummer; den importerede celle disposition fra ParticleStack. tif vises på TLM. Kontroller hvert importeret S-nummer for celle dispositions kvalitet i hele TLM, og fjern uønskede celler, der viser forkerte celle konturer. For at gøre det skal du markere celle dispositionen og klikke på knappen Slet.
         Bemærk: Det er også muligt at korrigere for upræcise celle konturer og tilføje nye celle konturer. Dette er beskrevet i afsnittet diskussion.
      7. Gem alle rettede celler som en RoiSet. zip-fil ved at trykke på knappen Gem på disk .
         Bemærk: Hvis sessionen skal afbrydes, er det muligt at indlæse RoiSet. zip-filen i Surface Manager senere: Åbn en TLM i Fiji via fil > Åbn , og vælg en TLM. Åbn Surface Manager på følgende måde: Plugins ≫ segmentering ≫ Surface Manager (3D). Indlæs den tilsvarende RoiSet. zip ved at klikke på knappen Indlæs fra disk og vælge den relevante roiset. zip-fil (f. eks. TestMovie2_RoiSet. zip). Dobbelttjek, at de indlæste celle masker svarer til den indlæste TLM.
3. Analyse af actomyosin pulser i Surface Manager
   Bemærk: Åbn Fiji, og sørg for, at en TLM og dens tilsvarende celle maske er åben i Surface Manager. Sørg for at Fiji er installeret og up-to-date og Surface Manager plugin (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) er installeret.
   1. Åbn en TLM med fil > åbne og vælg en TLM at åbne (f. eks., TestMovie2_bleach. tif). Indlæs Surface Manager-plugin'et via Plugins ≫ segmentering ≫ Surface Manager (3D). Indlæs den gemte celle maske, der er oprettet i selvstudiet her (f. eks. ParticlesStack2. tif) via fil > Åbn , og vælg en celle maske (f. eks. ParticlesStack2. tif). Indlæs det tilsvarende ROI (f. eks. TestMovie2_RoiSet. zip).
   2. Skift til den kanal af interesse i den valgte TLM.
      Bemærk: For at skelne mellem kanalerne skal du følge den farvekode, som er angivet omkring TLM.
   3. I Surface Manager skal du klikke på knappen statistik for at få det vindue, som hedder Average Grey Value Slice by Slice (figur 7b). Bemærk, at middelværdien/median intensitetsværdierne for actomyosin-signaler i en given analyseret kanal inden for de definerede celle konturer over tid vil blive vist, samt andre parametre relateret til celleområdet og celle form.
      Bemærk: Intensitetsværdierne er i A.U.; celleområdet er i pixel og skal konverteres til firkantede mikrometer.
   4. Gem de opnåede værdier som en regnearksfil: Klik på statistikvinduet, fil ≫ Gem som.
      Bemærk: Det er muligt at kontrollere de opnåede statistiske værdier senere, som følger. Åbn den blege korrigerede TLM i Fiji. Åbn Surface Manager. Indlæs den tilsvarende RoiSet. zip til TLM ved at trykke på knappen Indlæs fra disk og åbne filen. Den gemte maske med celle konturer vil blive uploadet, og navnene på cellerne vises i vinduet til venstre Surface Manager. Klik på statistik knappen for statistiske værdier.
      Bemærk: Med hensyn til en Manuel analyse af individuelle subcellulære actomyosin signaler, er det ikke muligt at udføre en manuel analyse af subcellulære actomyosin signaler på vævs skalaen. Optimering er nødvendig for analysen af individuelle actomyosin signaler på semi-vævs skalaen, som fremhævet i diskussionsafsnittet.

Representative Results

Denne protokol giver forskerne mulighed for at undersøge adfærden af actomyosin netværk i epitelial væv. Dette er kun muligt, når en detaljeret analyse af actomyosin adfærd på den lokale cellulære skala (et par celler) kombineres med en lignende analyse på vævs skalaen (mange celler). Men, epitel væv er ofte buede og udvinding af et tyndt lag af disse væv var tidligere ikke let muligt, som vist i Drosophila ægge kamre (figur 1). Protokollen præsenteres her giver brugerne enkle instruktioner, der beskriver, hvordan man analyserer actomyosin adfærd på begge disse skalaer (figur 2).

Den første del af denne protokol fokuserer på instruktioner vedrørende analysen af actomyosin pulser ved hjælp af Surface Manager -plugin'et (figur 3). Det beskriver også, hvordan man manuelt analysere individuelle actomyosin adfærd på den lokale cellulære skala (figur 4). Den anden del af denne protokol forklarer, hvordan man udtrækker et tyndt lag epitel vævet ved hjælp af ellipsoide Surface Projection plugin (figur 5 og figur 6). Først da er det muligt at analysere actomyosin pulser på vævs skalaen ved hjælp af Surface Manager -plugin'et (figur 7). Repræsentative resultater og en sammenligning af actomyosin adfærd i roterende kontrol og statiske fat2 mutant Drosophila ægge kamre på den lokale cellulære og vævs skala er vist i figur 8 og i tilsvarende film 1, Movie 2, Movie 3, Movie 4, Movie 5og Movie 6 (for yderligere oplysninger, se figur 8).

Figur 1: selektiv ekstraktion af et tyndt lag af en buet vævs overflade. A) for at opnå tilstrækkelige oplysninger om actomyosin-nettene i det omformede epithelia er det nødvendigt at erhverve en dyb z-stak (lyserød) over størstedelen af et synligt væv som vist for den buede follikel epitelet (grå) af Drosophila ægge kamre. (A ') Men en simpel projektion af en sådan z-stak fører til blanding af hele actomyosin netværk i follikelceller. Myosin II visualiseret med MRLC:: GFP (grøn) viser den stærkt ekspande ende indre (apical) region af follikelceller i en sådan z-projektion og næsten ingen oplysninger fra basal (ydre) side, hvor myosin II viser en stærk planar celle polaritet fænotype, men dens signal intensiteten er lav¹². For at undgå en sådan blanding som vist i panel A 'har vi udviklet et brugervenligt, Fiji-baseret plugin kaldet ellipsoid Surface Projection i bigdata Viewer¹⁸ , der tillader (B) selektiv ekstraktion af et defineret, tyndt lag (Pink ) af actomyosin fra et buet epitel (B ') som vist for MYOSIN II (grøn) i en udvalgt ekstraktion af den basale (ydre) side af follikel epitelet. Sammenlign forskellen i signal af myosin II (MRLC:: GFP) i paneler A ' og B '. Bemærk det planar polariserede mønster af myosin II i panel B '. Celle omridset er i rødt. Den forreste side er til venstre. Scale bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: planar polariseret actomyosin netværk på de lokale cellulære og vævs skalaer. Billeddannelse af actomyosin i forskellige skalaer gør det muligt at analysere forskellige tal af epiteliale celler, nemlig (a) op til 15 celler i den lokale celle skala og (B) 50-100 celler i vævs skalaen i follikel epitelet af kulturperler Drosophila ægge kamre. Nonmuscle myosin II visualiseres med MRLC:: GFP (grøn) og genotype af den anvendte transgene linje er angivet i tabellen over materialer. Celle omridset er i magenta. Den forreste side er til venstre. Skala stænger = 5 μm (A); 50 μm (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: et eksempel på analysen af myosin II pulser i Surface Manager på den lokale cellulære skala. A) en partikel stak indlæses i Surface Manager. Bemærk, at alle identificerede celler i TLM vises i vinduet Surface Manager. Det er vigtigt at slette alle uønskede eller ufuldstændige celler i en TLM. B) statistikker, der er indhentet på MYOSIN II (mrlc:: gfp) for udvalgte celler vises i vinduet med navnet gennemsnitlig grå værdi skive for udsnit i Surface Manager. MRLC:: GFP vises med grønt, mens cellernes membraner er røde. Den forreste side er til venstre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: et eksempel på manuel analyse af individuelle myosin II-signaler i den lokale celle skala. (A) en udvalgt 30 s-lang under film er placeret ved siden af (B) dens tids projektion. Bemærk, at ved tids fremskrivningen viser myosin II (MRLC:: GFP) længere forløbs linjer (Se panel B) i individuelle celler end i en individuel tidsramme (Se panel A). Individuelle linjer i celler skal analyseres for deres vinkel retning i forhold til den forreste-posterior akse af ægge kamre. (C) Bemærk, at Fiji ikke måler 0 °-360 °, men kun 0 °-180 ° for signaler, der peger opad og 0 °-179 ° for signaler, der peger nedad. Vær opmærksom på, at 0 ° er atypisk placeret til højre for et analyseret billede. D) på grundlag af disse oplysninger skal linjer, der bevæger sig med (op i pink) eller mod (ned i gult) retningen af epitel rotationen i et bestemt ægge kammer skal lodret for at identificere, om der findes symmetri brud på analyserede signaler i en celle og derefter for flere celler i det analyserede væv. MRLC:: GFP vises med grønt, mens cellernes membraner er røde. Den forreste side er til venstre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: et eksempel på at generere en ellipsoide pasform på vævs skalaen. For at passe en ellipsoide på et ægge kammer ved hjælp af ellipsoide Surface Projection plugin i Bigdata Viewer, er det nødvendigt at definere (a) en afgrænsningsramme, der omfatter størstedelen af det scannede væv. Dernæst er det vigtigt (B) at identificere signal prikker, som er en forudsætning for en optimal ellipsoide fit generation. (C) når ellipsoide pasform ikke er optimal og ikke pænt omgiver et ægge kammer, dette resulterer i (D) dårlig vævs laget udvinding. Se ekstraktionen og senere projektion resultater i figur 6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: sammenligning af en forkert og optimal ellipsoide pasform og tilsvarende overflade projektioner. (A) når ellipsoide ikke er monteret korrekt, (B) den endelige overflade projektion vil ikke give fuldstændige signal data i det tynde lag af det analyserede væv. (C) når den er monteret optimalt, garanterer den imidlertid en lige signaldetektering af et tyndt lag i vævet. (D) Bemærk, at den optimale overflade projektion indeholder flere tynde lag som en overflade-projekteret z-stak over tid, som kan adskilles efterfølgende som vist i figur 8. Myosin II-signaler (MRLC:: GFP, White) og membran signaler (hvide) fusioneres først før projektionen ( A og C), men på selve overflade projektion adskilles disse kanaler (Se fremskrivninger af myosin II i paneler B og D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: et eksempel på analysen af myosin II pulser i overflade styring på vævs skalaen. A) en partikel stak indlæses i Surface Manager. Bemærk, at alle identificerede celler i TLM vises i vinduet Surface Manager. Det er vigtigt at slette alle uønskede eller ufuldstændige celler i en TLM. B) statistikker opnået på MYOSIN II (mrlc:: gfp) impulser (gennemsnit eller median) for udvalgte celler over tid vises i vinduet med navnet gennemsnitlig grå værdi skive for udsnit i Surface Manager. Bemærk, at stærkere myosin II-prikker kan påvirke den endelige måling af iboende myosin II-intensitet. Dette skyldes det problem, at disse myosin II-prikker kan forekomme at migrere ud over celle dispositionen, hvor der er en forkert celle dispositions definition i den genererede celle maske. MRLC:: GFP vises med grønt, mens cellernes membraner er røde. Den forreste side er på toppen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8: Repræsentative resultater af et myosin II-netværk i Drosophila follikel epitelet. Repræsentative eksempler på dynamisk myosin II (mrlc:: gfp) adfærd (A og B) på den lokale cellulære skala og (C-F) på vævs skalaen for kontrol og fat2 mutant Drosophila ægge kamre. Se tabel over materialer for detaljerede oplysninger om brugte genotyper. Bemærk, at MRLC:: GFP-signaler (grøn) bevæger sig vinkelret på den forreste-posterior (AP) akse af kontrol ægkamre. Denne polaritet går tabt i fat2 mutant ægge kamre og fører til Anisotropisk myosin II impulser/svingninger¹². Ved manuel analyse af små MRLC:: GFP signaler (~ 300 μm) og kvantificering af deres kantede retningsbestemt bevægelse som beskrevet i protokollen, symmetri brydning af MRLC:: GFP signaler kan observeres med en præference mod retningen af epitelial rotation i et analyseret ægkammer¹² (figur 4). Tilsvarende film er: panel A = film 1, panel B = film 2, panel C = film 3, panel D = film 4, panel E = film 5, og panel F = Movie 6. Celle konturer vises i magenta. Den forreste side er til venstre. Skala stænger = 5 μm (A og B) og 50 μm (C-F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Anbefalede parametre for kort tids High-Speed Imaging på den lokale cellulære skala:
I.	Væv af interesse frit placeret i dyrkningsmediet (dvs. ingen følgesedler, fleksible tæpper osv.)
Ii.	63x vand mål med numerisk blænde > = 1,3
Iii.	Inverteret Konfokal mikroskop
Iv.	Enkelt plan
V.	6-12 s tidsintervaller
Vi.	5-10 minutter TLMs
Vii.	Krav til data lagring pr. TLM op til 100MB
Anbefalede parametre for langtids scanning af lav hastighed i vævs skalaen:
I.	Væv af interesse frit placeret i dyrkningsmediet (dvs. ingen følgesedler, fleksible tæpper osv.)
Ii.	40x vand mål og numerisk blænde > = 1,3
Iii.	Inverteret roterende skive mikroskop
Iv.	z-stakke at erhverve ca. halvdelen af et ægge kammer
V.	60 s tidsintervaller
Vi.	Mindst 30 minutter TLMs
Vii.	Krav til data lagring ca. 1GB

Tabel 1: anbefalede billedbehandlings parametre.

Movie 1: repræsentativ dynamisk opførsel af myosin II (MRLC:: GFP) på cellulær skala i en kontrol Drosophila æg kammer. Bemærk, at MRLC:: GFP (grøn) foretrækker at bevæge sig vinkelret på AP-aksen i ægkamrene. Celle konturer er i magenta. Basal udsigt. Den forreste side er til venstre. Skala bar = 5 μm. Klik her for at se denne video. Højreklik for at downloade.

Movie 2: repræsentativ dynamisk opførsel af myosin II (MRLC:: GFP) på cellulær skala i et Fat2 mutant Drosophila ægge kammer. Bemærk, at MRLC:: GFP pulser (grøn) og er ikke længere planar justeret vinkelret på AP-aksen af statiske ægge kamre. Celle konturer er i magenta. Basal udsigt. Den forreste side er til venstre. Skala bar = 5 μm. Klik her for at se denne video. Højreklik for at downloade.

Movie 3: repræsentativ dynamisk opførsel af basal myosin II (MRLC:: GFP) på vævs skalaen i en kontrol Drosophila ægge kammer. Bemærk, at kun en tynd basal (ydre) MRLC:: GFP lag ekstraheres fra næsten halvdelen af follikel epitelet i et ægge kammer. MRLC:: GFP er i grøn og celle konturer er i magenta. Bemærk forskellen i detaljeringsgraden af den opnåede MRLC:: GFP signal adfærd her (repræsenterer vævs skala) i forhold til film 1 (der repræsenterer cellulær skala). Den forreste side er til venstre. Scale bar = 50 μm. Klik her for at se denne video. Højreklik for at downloade.

Movie 4: Repræsentativ dynamisk opførsel af basal myosin II (MRLC:: GFP) på vævs skalaen i et Fat2 mutant Drosophila ægge kammer. Bemærk, at MRLC:: GFP (grøn) pulserer kraftigt på basal siden af næsten halvdelen af follikel epitelet i et fat2 mutant ægge kammer og undlader at generere den synkroniserede kraft, der kræves for at fremme epitelial rotation. Celle konturer er i magenta. Den forreste side er til venstre. Scale bar = 50 μm. Klik her for at se denne video. Højreklik for at downloade.

Movie 5: Repræsentativ dynamisk opførsel af apikale myosin II (mrlc:: gfp) på vævs skalaen i en kontrol Drosophila ægge kammer. Kun en tynd mrlc:: gfp lag ekstraheres fra den apikale (indre) side af næsten halvdelen af follikel epitelet i et ægge kammer. Bemærk, at mrlc:: gfp (med grøn) viser en anden dynamisk opførsel her på den apikale side sammenlignet med den basale side af follikel epitelet (som vist i film 3). Celle konturer er i magenta. Den forreste side er til venstre. Scale bar = 50 μm. Klik her for at se denne video. Højreklik for at downloade.

Movie 6: repræsentativ dynamisk opførsel af apikale myosin II (mrlc:: gfp) på vævs skalaen i et Fat2 mutant Drosophila ægge kammer. Ændret dynamisk opførsel af MRLC:: GFP (grøn) ekstraheret fra et tyndt apisk område på næsten halvdelen af follikel epitelet i et statisk fat2 mutant ægge kammer. Celle konturer er i magenta. Den forreste side er til venstre. Scale bar = 50 μm. Klik her for at se denne video. Højreklik for at downloade.

Discussion

Kritiske trin og fejlfinding for dissektion og dyrkning af ægkamre

Hvis alt for mange fluer er placeret i et lille hætteglas, kan flue maden blive mudret efter 2 – 3 dage på grund af omfattende mængder af fodring larver og voksne fluer at blive fanget i flue mad. I et sådant tilfælde, flip resten af disse fluer i et nyt hætteglas med frisk mad og downsize deres antal. Især udelukke kvinder, der sad fast i maden.

Schneider mix (SM) skal tilberedes på forhånd og kan opbevares ved 4 °C i ~ 14 dage. Vær opmærksom på, at en ældre blanding kan indeholde krystaller, der kan beskadige overfladen af ægge kamre. Bland altid SM med frisk tilsat insulin og giv det tilstrækkelig tid til at nå stuetemperatur. Dette beskytter ægge kamre mod kuldechok, som kan have en negativ indvirkning på væksten af mikrotubuler og planar tilpasningen af cytoskelettet (som det ses i den udviklende Drosophila fløj¹⁹).

Ægge kamre og udvalgte ovarioler er meget skrøbelige og kan på grund af deres lille størrelse flyde i SMI (SM med insulin). Det anbefales at lade dem spontant synke i SMI. De også ofte holde sig til dissektion pincet/kaktus værktøj. I et sådant tilfælde, lad dem frigøre sig fra dissektion enheder ved forsigtigt at flytte dem i SMI. Undgå at klemme og røre dem direkte på alle tidspunkter. Hvis det er nødvendigt, udelukke disse æg kamre/ovarioler fra den yderligere protokol.

Som en dissektion stereoskop er ikke pålidelig til identifikation af beskadigede ægge kamre/ovarioler, ægge kamre/ovarioler bør kontrolleres ved hjælp af en cellmask eller FM 4-64 farvestof under en confocal/spinning disk mikroskop. Beskadigede ægge kamre viser ekstrem farve i forhold til en ubeskadiget ægge kammer væv baggrund. Aldrig erhverve en TLM med stærke farvestof patches.

Kritiske trin og fejlfinding for in vitro Live imaging af ægge kamre

Hvis frit placerede ægge kamre i SMI stadig flytte, kontrollere igen under Konfokal mikroskop for at se, om der stadig er nogen overset rester af muskelark og snavs flyder i SMI. Fjern dem, og prøv igen. Af ægkamrene bør 90% være stabile og immobile under efterfølgende billeddannelse.

For at sikre, at et valgt ægge kammer/ovariole er stabilt, skal du bruge High-Speed Imaging (6 s intervaller) i 1 min. ustabile ægge kamre ville flytte på dette punkt. Det anbefales dog at se hele tidsforskudt optagelse for at være i stand til forsigtigt at korrigere en potentiel uventet bevægelse af det afbildet ægge kammer. Dette kan gøres ved at flytte den mikroskopiske fase/tabel, som holder Petri skålen med de dyrkede ægge kamre/ovarioler, til den oprindelige position, således at ægget kammer af interessen er igen i den imaged, fokuseret vindue.

Stop billeddannelse, hvis der opstår en pludselig og uventet bevægelse af det afbildet ægge kammer. Kontroller den stødabsorbering af mikroskopet bordet, og undgå at gå rundt i nærheden af mikroskopet i løbet af erhvervelses tiden, da dette kan resultere i afbrydelse af billedet erhvervelse på grund af de vibrationer forårsaget.

Hvis cellemembranen farve ikke er synlig efter 30 min og den anvendte laser linje er korrekt, tilføje mere af farvestoffet og øge dens koncentration for den næste erhvervelse.

Hvis actomyosin-signalerne ser ud til at være sløret, skal du kontrollere NA af det anvendte mål. En NA lavere end 1,3 vil reducere billedkvaliteten. Derudover skal du sørge for, at brugt nedsænkning olie er blevet anvendt korrekt til vand 63x mål. Tilføj eller Udskift den, hvis det er nødvendigt.

Hvis ægkamrene krymper, og de observerede cellemembraner deformer, kontrollere, om låget er korrekt lukket. Hvis låget mangler eller ikke er korrekt lukket, kan ægkamrene tørre ud på grund af SMI-fordampning over erhvervelses tiden.

Hvis rotationen af ægget kamre bremser eller stopper, mindske laser effekt. Hvis et hul vises i ægge kammeret, er det blevet brændt af laseren. Reducer laser strømmen.

Hvis actomyosin signaler blegemiddel efter 2 min under TLM erhvervelse, reducere laser strøm og øge signal forstærkning i mikroskop software.

Når en TLM af follikel epitelet i et ægge kammer er erhvervet, anbefales det at undgå billeddannelse igen i samme vævs område i dette ægge kammer. Men da ægkamre roterer omkring deres AP-akse, er det muligt at gentage erhvervelsen af en TLM ved hjælp af dette ubeskadigede ægkammer efter ca. 30 min. Mens billeddannelse follikel epitelet i et ægge kammer, andre ægge kamre vil ikke blive bleget/beskadiget, selv om de er placeret i samme ovariole eller i en anden ovariole i SMI.

Hvis alle disse krav er opfyldt, bør procentdelen af de succes inddelte ægkamre være ca. 90% – 100% for trin 6 – 8, circa 50% – 60% for trin 3 – 5 og circa 20% – 30% for trin 1 – 2. Fiasko skyldes primært flytning af ægge kamre eller skader på dem under deres dissektion/manipulation.

Kritiske trin og fejlfinding i forbindelse med databehandling

Under masken generation ved hjælp af den medfølgende script i Fiji, kan det ske, at der er en masse genererede celle konturer, der ikke afspejler de faktiske cellemembraner i en TLM. Dette er ofte forårsaget af høj baggrundsstøj, især når farvestoffer til pletter cellemembraner anvendes. I et sådant tilfælde, for at undgå den kedelige korrektion af uønskede celle konturer i den genererede maske, køre segmentering igen og indstille parametrene til den bedste pasform. Dette kan gøres ved at justere den anslåede støj tolerance parameter.

Når du indlæser en af de ParticleStack. tif-filer, der indeholder celle konturer i Surface Manager, skaleres indlæsningstiden lineært med antallet af celle konturer og kan tage flere minutter. Hvis indlæsningen er afbrudt eller forkert, skal du gentage den. Sørg for, at uploadvinduet er i fokus, og at der ikke bruges andre programmer.

Nogle gange skal en celle kontur korrigeres i nogle rammer; i så fald skal du bruge pensel knappen. Tegn den korrekte celle kontur i en bestemt ramme ved at trække musen rundt om cellemembranen. Flyt til en anden ramme i TLM, og vend derefter tilbage til tidsrammen med rettelsen: den forkerte celle kontur skal nu udskiftes. Gå derefter igen til næste billede for at rette det. Pensel værktøjet skifter nu til Slettetilstand. Hvis det er nødvendigt, kan du rette konturerne i de næste tidsrammer ved at skubbe den eksisterende celle kontur og derefter trykke på knappen + Tilføj for at oprette en ny celle kontur. Slet det gamle S-nummer fra vinduet Surface Manager, og Omdøb den nye celle kontur ved at trykke på knappen Omdøb , hvis det er nødvendigt.

Hvis der mangler en hel vigtig celle i en TLM, skal du oprette en ny maske disposition ved at trykke på Fjern markeringen > polygon. Opret en ny celle kontur i den første ramme af TLM ved at klikke langs cellemembranen. Gå derefter til den sidste ramme i TLM, og gør det samme for den valgte celle. Ved at køre filmen i tid, vil celle konturer blive interpoleret. Ret med pensel værktøjet, hvis det er nødvendigt. Når du er færdig, skal du trykke på knappen + Tilføj og omdøbe celle dispositionen ved at trykke på knappen Omdøb . Jo flere point/Klik for at oprette en ny celle kontur, jo bedre interpolation virker.

Udover epitel rotation, tlms er undertiden påvirket af uønsket bevægelse. Derfor anbefales det at korrigere for sådanne væv drift i disse TLMs. Ved at gøre det, TLMs er også korrigeret for epitelial rotation af ægge kamre, og cellemembraner bliver stive. Dette gør den manuelle analyse af actomyosin signaler lettere. En sådan fremgangsmåde gør det dog ikke muligt for forskerne at skelne mellem, om de observerede actomyosin-signaler bevæger sig eller er statiske i forhold til cellemembranen. Hvis en sondring mellem statiske og aktive bevægelser af actomyosin-signalerne er målet for en sådan analyse, bør der ikke foretages nogen korrektion af vævs drift. Vi fandt, at størstedelen af actomyosin signaler aktivt bevæge sig i forhold til cellemembranen og kun en mindre del af dem synes statisk.

Kritiske trin og fejlfinding til analyse af subcellulære actomyosin signaler

Hvis de genererede statistikker indeholder afvigende værdier, skal du sikre dig, at eventuelle ekstremt lave eller høje tal i forhold til hele datasættet virkelig afspejler adfærden i cellen og ikke er artefakter. Dette kan gøres ved at identificere den celle, der indeholder afvigende værdier, og kontrollere celle dispositions kvaliteten på det tidspunkt, hvor den lave/høje værdi blev målt. Sådanne ekstreme værdier skyldes ofte defekte celle konturer, der fejlagtigt måler en del af en anden celle. Dette kan være særligt tydeligt, når store blobs interfererer med celle omridset af en tilstødende celle. I et sådant tilfælde er det afgørende at korrigere celle konturer og gentage målingen.

For at gøre kvantificeringen lettere skal du analysere signalerne i en bestemt celle flade og fortsætte én efter én, indtil alle celler analyseres i en under film. Resultaterne af manuel analyse af subcellulære actomyosin signaler kan ikke vise symmetri bryde i en celle og en bestemt ægge kammer. Vi oplevede, at actomyosin ikke klart bryder symmetri i forhold til vævs bevægelsen i < 10% af de roterende ægkamre (trin 6 – 8). Denne procentdel øges omkring stadie 4¹². Vi fandt også, at der ikke er nogen forskel, om 5 min eller 10 min analyseres i identifikationen af den foretrukne retning af actomyosin signal bevægelse i et æg kammer¹².

Kritiske trin og fejlfinding for selektiv udvinding af actomyosin signaler fra buede væv

Den forkerte størrelse af blobs (identificerede signaler) vil resultere i ingen blobs og programmet vil fryse i næste trin. I dette tilfælde, tvinge-quit Fiji og nyligt genstarte plugin ellipsoid overflade projektion. Gør det samme, når programmet ikke reagerer efter at have trykket på Compute. Dette er ofte et tegn på, at der er valgt uegnede parametre.

Hvis der er for mange blobs og/hvis de er koncentreret mod den ene side af det analyserede ægge kammer, dette kan påvirke den designede ellipsoide og ikke give den korrekte pasform til ægget kammeret. Gå tilbage til blob identifikation og forsøge at arrangere deres størrelse i kombination med x-, y-og z-aksen udvælgelse af ægget kammer. En manglende evne til at generere en god ellipsoide pasform opstår også ofte, når der anvendes uegnede afskærings afstandsindstillinger.

De opnåede fremskrivninger kan undertiden Se fejl fokuseret, eller måske den opnåede z flyet faktisk bevæger sig mellem cellelag nær overfladen af ægget kammer. Dette er normalt et tegn på en dårligt passende ellipsoide, hvor en region af ellipsoideet er sat for langt fra ægge kammeret. Prøv at montere ellipsoideen, så den bevarer den samme afstand fra ægkammerets omkreds.

Metodens begrænsninger og nye tilgange

Denne frie dyrkning af ægge kamre udelader den subtile udfladning af et ægkammer overflade. Til dette formål, denne metode har sine fordele og ulemper. Når du bruger confokal mikroskopi, giver det brugere med høj opløsning og High-Speed Imaging, der pålideligt afdækker actomyosin adfærd i celler ved omkredsen af ægge kamre for en kort periode (5 – 10 min). Men ved at gøre det, det begrænser størrelsen af et enkelt fly, der kan afbildet med Konfokal mikroskopi over tid. Generelt er det muligt at billede op til ~ 15 celler pr ægge kammer i etaper 6-8, men kun om to celler i ægge kamre i etaper 1-5. Derfor har vi defineret denne metode her som kun egnet til den lokale cellulære skala.

For at overvinde disse Størrelsesgrænser, der er forårsaget af den begrænsede størrelse af et enkelt Konfokal plan, har vi udviklet en alternativ Fiji-baseret tilgang kaldet ellipsoide overflade projektion, til brug på vævs skalaen. Dette kombinerer roterende disk mikroskopi med en semi-interaktiv overflade udvinding af ægge kamre på vævs skalaen. På denne måde, actomyosin signaler kan opnås på samme tid for mere end 50 –-100 celler fra en analyseret æg kammer. Det er vigtigt at bemærke, at denne tilgang genererer meget store datasæt af de erhvervede data (~ Giga bytes), har en lavere opløsning (det bruger en 40x vs. en 63x mål), og giver også en langsommere billeddannelse hastighed (det tager ~ 60 s at scanne gennem halvdelen af vævet af et æg Cham [trin 6 – 8] og som sådan er det 10x langsommere end den begrænsede confokale plane metode).

Sammenlignet med andre eksisterende software til udvinding af lagdelte projektioner fra parametriserede overflader, er det plugin udviklet til denne protokol fokuseret på brugervenlighed og interaktiv visuel feedback på hvert trin i processen. Andre værktøjer, såsom MATLAB-baserede ImSaNE²⁰, der anvendes af Chen et al.²¹, fokuserer på håndtering af en bred vifte af parametriserede og ikke-parametriserede overflade modeller og forskellige projektions metoder. For eksempel kræver ImSaNE, at data skal forbehandles og justeres på en bestemt måde og delvist kræver eksterne værktøjer i mellem trin. I modsætning hertil, plugin præsenteret her håndterer enhver 3D/4D/5D billede (sekvens), der kan åbnes i Fiji uden ekstern forbehandling. Selvom ImSaNE er meget konfigurerbar (programmerbar) ved at redigere MATLAB-scripts, giver vi et minimalt sæt af muligheder i én arbejdsgang, der er skræddersyet til det specifikke problem, som diskuteres her. Hvert trin i den interaktive arbejdsproces giver resultater, der umiddelbart kan inspiceres og justeres, hvis det er nødvendigt.

Beslutningen om, hvilken af disse Imaging tilgange, den lokale cellulære eller væv skala, er det bedste for et bestemt eksperiment, afhænger udelukkende af det videnskabelige spørgsmål, der skal besvares (dvs. højere vs. lavere opløsning; kort vs. lang erhvervelse tid). Et godt kompromis mellem disse to skalaer kunne være at kombinere begge tilgange, og dermed få billeddannelse af actomyosin signaler på semi-vævs skala (dvs., 20 – 30 celler). Dette kræver en roterende skive mikroskop, en vand 63x linse med NA ≥ 1,3, og etablerede z-stack indstillinger for 20 – 30 celler i et ægge kammer. Denne meget lavvandede z-stack (i modsætning til z-stakken kræves for erhvervelse af den ene halvdel af et æg kammer) giver mulighed for hurtigere scanning af under 60 s. Den tid, der er opnået her, kan bruges enten til gentagen z-stack erhvervelse til at fremskynde billeddannelse eller til en prøve opsving (tid interleaves) mellem individuelle z-stakke. Med sidstnævnte kan der opnås en længere erhvervelses periode (> 30 min.) af Tlm'er af roterende ægkamre. Denne semi-vævs tilgang garanterer en tilstrækkelig opløsning til actomyosin signaler og billeddannelse af flere celler på samme tid over længere tidsperioder.

Fremtidige applikationer og visioner

Begge beskrevne metoder (på lokalt celle-og vævs skala) giver en enkel og billig tilgang (bortset fra mikroskop anordninger) med begrænsede bivirkninger på actomyosin-netværket og kan implementeres og let vedtages for andre dissekeret animalsk væv. Den eneste forudsætning her er en eksisterende dyrkning protokol i en Petri skål for en buet væv af interesse, tilgængelige transgener, og markører eller mærkning metoder.

I kombination med lysplade Fluorescens mikroskopi²², er det også muligt at afbilde actomyosin maskiner i Toto (dvs. billedet den komplette ydre omkreds overflade af Drosophila ægkamre samtidig og derefter efterfølgende udfolde ved hjælp af plugin ellipsoid overflade udvinding). Der er dog nogle få begrænsninger, der skal løses med hensyn til egnethed til højhastigheds billeder af actomyosin-signaler, nemlig 1) indlejring af ægkamre i et lavpunkts Smelteanlæg eller deres stikning til en kapillar under billeddannelse; II) en lav numerisk blænde af brugte vand linser, der ikke giver tilstrækkelig actomyosin signal opløsning; III) den ekstra tid, der er nødvendig for at erhverve flere vinkler af ægge kamre, som forhindrer High-Speed Imaging.

Med henblik herpå er det forudsigeligt, at den detaljerede analyse af actomyosin-maskinerne i fremtiden vil gøre det muligt at foretage en bedre anvendelse af mikroskop parametre såsom den hastighed, der skal scannes gennem epitel vævet og forbedringen af de anvendte mikroskopiske linser. lovende høj opløsning resultater, der skal opnås på vævet og i Toto skala over lange perioder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	[+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin
Fetal Bovine Serum	Sigma	F135	Heat inactivated
Insulin Solution Human	Sigma	I9278
50 mL Falcon tubes	Eppendorf		sterile
Millex-GV filter	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (cell membrane dye)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (cell membrane dye)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Depression dissection slide	Fisher Scientific	12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope	e.g. Zeiss		Stemi SV 6
Inverted confocal microscope	e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope	e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass	e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder	Hammacher	9160020
Cactus spine	Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C			For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.