Summary

Efeitos de gosto sinalização Abolishment de proteína na inflamação do intestino em um modelo de Mouse de doença inflamatória intestinal

Published: November 09, 2018
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Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para investigar o efeito da anulação dos genes relacionados com gustação sobre respostas imunes em uma de sódio sulfato de dextrano (DSS)-induzidas pelo modelo de mouse (IBD) de doença inflamatória intestinal.

Abstract

Doença inflamatória intestinal (IBD) é um dos distúrbios gastrointestinais imune-relacionados, incluindo a colite ulcerosa e doença de Crohn, que afeta a qualidade de vida de milhões de pessoas em todo o mundo. IBD os sintomas incluem dor abdominal, diarreia e sangramento retal, que pode resultar de interações entre a microbiota do intestino, componentes de alimentos, células epiteliais intestinais e células do sistema imunológico. É de particular importância para avaliar como cada gene chave expressado nas células epiteliais e imunes intestinais afeta inflamação no cólon. Receptores de sabor acoplado à proteína G, incluindo a subunidade α da proteína G-gustducin e outras proteínas de sinalização, foram encontrados nos intestinos. Aqui, usamos a α-gustducin como representante e descrever um de sódio sulfato de dextrano (DSS)-induzido modelo IBD para avaliar o efeito das mutações génicas gustativa na imunidade da mucosa do intestino e inflamação. Este método combina tecnologia de gene nocaute com o modelo IBD quimicamente induzido e, portanto, pode ser aplicado para avaliar o resultado da anulação do gene gustativa, bem como outros genes que podem exuberate ou diminuir a resposta imune induzida por DSS no cólon. Ratos mutantes são administrados com DSS durante um certo período durante o qual seu peso de corpo, fezes e sangramento retal são monitorados e registrados. Em diferentes momentos durante a administração, alguns ratos são sacrificados, em seguida, os tamanhos e pesos de seus baços e dois-pontos são medidos e tecidos do intestino são recolhidos e tratados para histológica e análises de expressão do gene. Os dados mostram que os resultados de nocaute de α-gustducin em perda de peso excessivo, diarreia, sangramento intestinal, dano tecidual e inflamação vs selvagem-tipo ratos. Desde que a gravidade da inflamação induzida é afectada por estirpes de rato, ambiente de moradia e dieta, otimização da duração de concentração e administração de DSS em um experimento piloto é particularmente importante. Ajustando estes fatores, este método pode ser aplicado para avaliar ambos os efeitos antie pro-inflamatórios.

Introduction

As duas principais formas de doença inflamatória intestinal (IBD), (CD) da doença de Crohn e colite ulcerativa (UC) são caracterizadas por condições inflamatórias remitente ou progressivas crônicas do intestino com etiologia multifatorial1,2 . O desenvolvimento do IBD depende de genéticas, bem como certos fatores ambientais como dieta, uso de antibióticos e importante, infecções patogênicas. No entanto, a etiologia e regulamentares mecanismos moleculares subjacentes IBD não são ainda claras. Daí, numerosos modelos animais quimicamente induzidos de IBD foram construídos e aplicados para delinear a patogênese e mecanismos reguladores e avaliar a eficácia da terapêutica humana3.

Receptores de sabor são receptores de acoplado à proteína G (GPCRs) e são classificados em dois tipos principais: tipo I (T1Rs), e tipo II (T2Rs) que detectam o umami, doce e amargos compostos. Cascatas de sinalização gosto são iniciadas por tastant proteínas de ligação a T1Rs ou T2Rs, ativando a Via G consistindo de α-gustducin e um dímero Gβγ e levando a liberação das subunidades Gβγ. A fracção Gβγ por sua vez estimula a jusante effector enzima fosfolipase C-β2 (PLC-β2). PLC-β2 registrados então hidrolisa fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato dois mensageiros secundários intracelulares [inositol-1, 4,5-triphosphate (IP3) e diacilglicerol] e IP3 liga a e abrir seu canal-receptor IP3 R3, liberando íons de cálcio do retículo endoplasmático. Eventualmente, isto leva para a abertura do canal de íon potencial transiente do receptor Trpm5 e liberação do neurotransmissor ATP para os nervos gustativos4,5,6,7. Ainda, as vias de sinalização dos sabores salgados e amargo são diferentes e independentes de doce, umami e gostos amargos8. Além disso, os componentes de sabor GPCRs e proteínas a jusante existem em vários tecidos extra orais. Estudos recentes indicaram que α-gustducin, o principal componente do sabor de sinalização, encontra-se a ser expressa na mucosa intestinal. Mais estudos são necessários para entender as funções destes gosto sinalização componentes em tecidos extra oral9,10.

O método descrito aqui é usado para caracterizar as funções das proteínas de sinalização gustativas, expressadas em tecidos extra orais. Combinamos uma linha de rato transgénico desenvolvida para delinear as cascatas de sinalização no paladar com o modelo de colite induzida quimicamente. Em grande parte devido à sua simplicidade processual e patológicas semelhanças com colite ulcerosa humana, o dextran sulfato de sódio (DSS)-induzido IBD modelo tem sido mais amplamente utilizado entre colite induzida quimicamente vários modelos11. Neste estudo, usamos camundongos deficientes em α-gustducin como uma linha representativa do mouse para revelar novas funções de α-gustducin na imunidade da mucosa do intestino e inflamação 1) analisando as alterações morfológicas no tecido e 2) diferenças na expressão de análise do citocinas relacionadas à inflamação no cólon. Esse método pode ser usado para quantitativamente e qualitativamente determinar as contribuições das proteínas de sinalização gustativas (e outras proteínas expressadas no intestino) dano tecidual e inflamação intestinal, quando o rato geneticamente modificado linhas para os genes da juros estão disponíveis. Vantagens deste método estão permitindo que os usuários obter dados integrados resultantes de ações de ambos os químicos DSS e deficiência do gene de interesse. Esse método pode ser melhorado para aumentar a sua sensibilidade e revelar alterações intestinais sutis a nível celular e molecular.

Protocol

Todos os experimentos envolvendo ratos foram revistos e aprovados pelo cuidado de Animal institucional e comissões da Universidade de Zhejiang do uso. É aconselhável usar equipamento de protecção adequado antes de executar este protocolo. 1. preparação dos ratos e DSS Manter os ratos do KO (α-gustducin- / -) e idade-, sexo- e corpo peso-combinadas selvagem-tipo controle (α-gustducin+ +) camundongos C57BL/6 individualmente em gaiolas limpas.Nota: Os …

Representative Results

Foi estabelecido um procedimento IBD DSS-induzida pela administração de 3% DSS em água potável para α-gustducin-nocaute (KO) e ratos de tipo selvagem (WT). Em comparação com camundongos WT, os ratos nocaute exibiram colite mais grave com perda de peso excessivo, diarreia e sangramento intestinal (Figura 1). Após a administração de DSS um dia 7, as diferenças na integridade do tecido foram analisadas usando H & E mancha como o método histológico, …

Discussion

Este método pode ser empregado para quantitativamente determinar o efeito das mutações de genes específicos gustativas na inflamação em um modelo do rato do IBD induzida em DSS. Para aproveitar ao máximo, indução ideal do IBD é um passo fundamental. O desenvolvimento da colite é afetado por vários fatores, incluindo a cepa de rato, ambiente de moradia, microflora intestinal, bem como os genes de interesse. Recomenda-se realizar um experimento piloto com um pequeno número de ratos para testar diferentes doses…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado por concessões do nacional ciências naturais Fundação da China (81671016, 31471008 e 31661143030) e o National Institutes of Health (DC010012, DC015819) e pela Fundação Siyuan.

Materials

Antibody
CD45 BD Biosciences 550539
CD3 BD Biosciences 555273
B220 BD Biosciences 550286
CD11b BD Biosciences 550282
Ly6G BD Biosciences 551459
Reagent
Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) MP Biomedicals 2160110
Streptavidin-HRP complex BD Pharmingen 551011
H&E Staining Kit BBI Life Sciences E607318
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sangon Biotech B548117
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) Roche 4913850001
MMLV Reverse Transcriptase, GPR Clontech,TaKaRa 639574
TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit  TaKaRa 9767
BD 10 ml Syringe BD Biosciences 309604
Instruments and equipment
balance
scissors 
forceps
centrifuge
qPCR machine
staining jars
Software
Imag-Pro Plus  Media Cybernetics, Inc. 

References

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Cite This Article
Du, Y., Liu, Q., Luo, X., Zhao, D., Xue, J., Feng, P., Margolskee, R. F., Wang, H., Huang, L. Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model. J. Vis. Exp. (141), e58668, doi:10.3791/58668 (2018).

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