Summary
Le composant de complément C1q est une molécule pro-inflammatoire fortement exprimée dans le microenvironnement de tissu qui peut interagir avec la matrice extracellulaire. Ici, nous décrivons une méthode pour tester comment C1q lié à l'acide hyaluronique affecte l'adhérence cellulaire.
Abstract
Il a été de plus en plus démontré que le microenvironnement de tumeur joue un rôle actif dans la croissance et la métasse de néoplasia. Par différentes voies, les cellules tumorales peuvent recruter efficacement des cellules stromales, immunitaires et endothéliales en sécrétant des facteurs stimulants, des chimiokines et des cytokines. À leur tour, ces cellules peuvent modifier les propriétés de signalisation du microenvironnement en libérant des signaux favorisant la croissance, des métabolites et des composants de matrice extracellulaire pour soutenir une forte prolifération et la compétence métastatique. Dans ce contexte, nous identifions que le composant complémentaire C1q, fortement exprimé localement par une gamme de tumeurs malignes humaines, en interagissant avec l'acide hyaluronique de matrice extracellulaire, affecte fortement le comportement des cellules primaires isolées de la tumeur humaine Spécimens. Ici, nous décrivons une méthode pour tester comment C1q lié à l'acide hyaluronique (HA) affecte l'adhérence de cellules de tumeur, sous-jacente au fait que les propriétés biologiques des composants principaux de la matrice extracellulaire (dans ce cas HA) peuvent être façonnées par des signaux bioactifs vers la tumeur progression.
Introduction
Le microenvironnement de tumeur (TME) influence le développement et la progression de cancer puisqu'il peut fournir une niche permissive pour la survie, la croissance et l'invasion cellulaires. L'identification de nouveaux acteurs clés dans le TME peut être utile pour la découverte de nouveaux outils moléculaires pour la thérapie ciblée. TME comprend un réseau complexe et dynamique de cellules non malignes, telles que les cellules endothéliales, les fibroblastes et les cellules du système immunitaire, intégrées dans les composants de la matrice extracellulaire environnante (ECM), y compris les collagènes, les laminins, les fibronectines, protéoglycanes et hyaluronans. Les cellules tumorales et non tumorales synthétisent et sécrètent des composants ECM ainsi que des cytokines, des chimiokines, des facteurs de croissance et des enzymes inflammatoires et matricielles qui modifient globalement les propriétés physiques, chimiques et de signalisation du TME. Parmi ces constituants, l'acide hyaluronique (HA) a émergé pour exercer un rôle crucial dans la biologie de tumeur. Malgré sa composition chimique simple, HA, avec ses molécules HA-contraignantes (hyaladherins), peut moduler l'angiogenèse, la réactivité du système immunitaire et eCM remodelage d'une manière dépendante de la taille et la concentration1.
Le système de complément (C) fait également partie du TME local, qui a récemment reçu une attention croissante. Le système C englobe un ensemble de protéines solubles et liées à la membrane impliquées dans la première ligne de défense contre les non-autocellules, les éléments hôtes indésirables et les agents pathogènes. Fonctionnellement, le C relie les bras à deux effecteurs des systèmes innés et adaptatifs pour favoriser soit l'abattage direct des cellules, soit le montage d'une réponse inflammatoire2. L'activation de C peut supprimer la croissance de tumeur, en détruisant des cellules cancéreuses ou en inhibant leur excroissance, mais il est devenu de plus en plus clair qu'elle peut posséder une activité de tumeur-promotion en soutenant l'inflammation chronique, favorisant l'établissement d'un milieu immunosuppresseur, induisant l'angiogenèse, et activant les voies de signalisation liées au cancer3. Dans ce contexte, C1q, la première molécule de reconnaissance de la voie classique du système C a émergé pour exercer des fonctions importantes dans le microenvironnement tumoral indépendamment de l'activation C4. C1q a été montré pour être exprimé localement par une gamme de tumeurs malignes humaines, où il peut favoriser l'adhérencede cellules cancéreuses, la migration et la prolifération en plus de l'angiogenèse et la métase 5. Il est intéressant de noter que le C1q interagit avec un constituant important de l'ECM comme l'HA.
Nous avons développé une technique pour isoler les cellules cancéreuses primaires de la masse tumorale. En outre, nous avons créé la matrice, qui peut stimuler le microenvironnement de tumeur, particulièrement l'interaction entre C1q et acide hyaluronique de poids moléculaire élevé. C1q lié à HA a été en mesure d'induire l'adhérence des cellules tumorales.
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Protocol
Des échantillons de tissus prélevés sur des patients ont été prélevés après consentement éclairé à la suite de l'approbation des considérations éthiques par le conseil institutionnel de l'hôpital universitaire de Trieste, en Italie.
1. Isolement et culture des cellules tumorales (Jour 1)
- Isoler les cellules du mésothéliome humain à partir de spécimens solides MPM. Hacher finement le tissu à l'aide d'un cutter pour obtenir des fragments d'environ 2-3 mm2 de taille et incuber dans 5 mL de solution de digestion composée de Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) complétée par 0,5 mM Ca2/Mg2 ,0,5% trypsine et 50 g/mL DNase I, la nuit à 4 oC.
- Isolement et culture des cellules tumorales (Jour 2)
- Après l'incubation de la nuit, placer le tissu digéré pendant 30 min dans un incubateur de 37 oC avec des secousses douces.
- Remplacer la solution de digestion sur la centrifugation (250 x g)par 3 mg/mL de collagène de type 1 dissous dans 5 mL de Medium 199 avec HBSS et encore incuber pendant 30 min à 37 oC avec des secousses douces.
- Bloquez la réaction enzymatique en ajoutant 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS). Resuspendre les cellules très soigneusement avec un pipet de 5 ml pour s'assurer que la plupart des cellules sont libérées du tissu. Ensuite, filtrez la suspension de la cellule à travers un filtre de 100 m.
- Semer les cellules dans un flacon de 12,5 cm2 et les faire la culture à 37 oC avec un milieu sans sérum de cellules endothéliales humaines (HESF), avec 10 % de FBS et complété par eGF (10 ng/mL), FGF de base (20 ng/mL) et 1 % pénicilline-streptomie.
REMARQUE : Remplacer par un milieu frais tous les 2-3 jours.
2. Revêtement HA (Jour 1)
- Resuspendre le poids moléculaire élevé HA (1,5 kDa) dans de l'eau distillée double à la concentration de 1 mg/mL6.
- Diluer la solution de stock HA à 50 g/mL dans le tampon carbonate/bicarbonate (0,1 M, pH 9,6) avec tuyauterie douce.
- Enrober la plaque de 96 puits de 100 L de solution de bouillon de dilution HA par puits pendant la nuit à 4 oC.
REMARQUE: L'acide hyaluronique a été un cadeau aimable du professeur Ivan Donati, Département des sciences de la vie, Université de Trieste7.
3. Revêtement C1q (Jour 2)
- Après l'incubation de nuit, aspirer sous vide les puits traités et laver la plaque de 96 puits avec 100 L de PBS (dPBS) de Dulbecco par puits.
- Permettre au C1q (25 g/mL ou à différentes concentrations pour des expériences de réponse à la dose) ou BSA (comme un contrôle négatif) de se lier au plastique immobilisé-HA en incuber ces protéines à une concentration de 25 g/mL dans 100 L de dPBS - 0,5% BSA et 0,7 mM Ca2/Mg2 . Puis incuber toute la nuit à 4 oC.
- Aspirez les puits sous vide et lavez la plaque de 96 puits avec 100 L/puits de dPBS.
4. Étiquetage cellulaire avec FAST DiI
- Resuspendre 1 x 105 cellules tumorales dans 500 L de dPBS contenant 10 g/mL du colorant fluorescent FAST DiI. Incuber pendant 15 min à 37 oC dans un incubateur v/v CO2 de 5 % pour l'étiquetage, en mélangeant manuellement après 5 min d'intervalle.
- Pour éliminer l'excès exEX DiI, ajouter 10 mL de dPBS, pipette doucement de haut en bas, et centrifugeuse à 250 x g pendant 7 min. Resuspendre le granule de cellules dans 1 mL de milieu humain endothélial libre contenant 0,1% BSA (HESF - 0,1% BSA).
5. Adhérence cellulaire sur les matrices HA/C1q (Jour 1)
- Aspirateur aspirateur les puits enduits des différentes matrices (les puits ont été enduits à l'étape 3.2).
- Distribuer 100 L de la suspension cellulaire étiquetée aux puits enduits et incuber la plaque pendant 35 min à 37 oC dans l'incubateur v/v CO2 à 5 %.
- Enlever les cellules non adhérentes en aspirant le supernatant. Laver une fois avec dPBS contenant 0,5% BSA, 0.7 mM Ca2 et 0.7 mM Mg2.
- Lyse les cellules adhérentes en ajoutant 200 L/puits de 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 - 0.1% v/v SDS et lire immédiatement la plaque de 96 puits avec un lecteur de fluorescence (544 nm, émission 590 nm) en utilisant une courbe d'étalonnage générée par la lyse d'un nombre croissant de étiquetés Cellules.
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Representative Results
L'HA est un polysaccharide à poids moléculaire élevé chargé négativement, qui est composé de répéter (1-4) -Acide glucuronique-(1-3)-N-acétyl-D-glucosamine unités de disaccharide (figure 1B)7. L'occurrence de la liaison de L'HA sur la plaque de 96 puits ainsi que l'efficacité de son immobilisation ont été testées en tirant parti de l'HA biotinylated (bio-HA). Différentes concentrations de Bio-HA, allant de 10 g/mL à 1 mg/mL, ont été re-suspendues dans 100 mM de carbonate/bicarbonate-tampon pH 9.6 et incubées pendant la nuit à 4 'C.
Après de longs lavages, la bio-HA liée à la plaque de 96 puits a été détectée à l'aide de streptavidin conjugué à la phosphatase alcaline, tandis que la présence de streptavidin a été quantifiée à l'aide de pNPP (1 mg/mL) comme substrat. La lecture a été effectuée à la longueur d'onde de 405 nm à l'aide d'un lecteur ELISA. Bio-HA a été en mesure de se lier à une plaque de 96 puits d'une manière de réponse à la dose (données non montrées); 50 g/mL ont été choisis comme plateau de saturation et donc utilisés dans nos essais.
Nos données antérieures ont démontré que le C1q est capable de se lier à un large éventail de ligands cibles localisés dans l'ECM8. Cette liaison est particulièrement forte avec HA9. Les puits d'une plaque de microtiter ont été enduits de 50 g/mL HMW-HA et incubés avec une concentration croissante de C1q. Bound C1q a été visualisé lors de l'incubation avec des anticorps polyclonaux anti-C1q. C1q est capable de se lier à un poids moléculaire élevé HA d'une manière dépendante de la dose (figure 1A), atteignant le niveau maximum de liaison à la concentration de 50 g/mL. Après avoir établi que C1q peut se lier à HA, nous avons étudié l'implication de cette interaction en modifiant les propriétés de signalisation de l'ECM et leurs implications dans le développement de tumeur. À cet effet, nous avons établi un protocole pour isoler les cellules tumorales à partir de spécimens bioptiques obtenus à partir de patients atteints. Les cellules tumorales primaires ont été isolées de la biopsie de tissu, comme résumé dans la figure2. La capacité des cellules tumorales d'interagir avec Le C1q a été évaluée en effectuant un analyse d'adhérence cellulaire à l'aide de différentes combinaisons de matrices, comme le montre la figure 3. Les cellules tumorales ont été tachées avec la sonde fluorescente FAST DiI et ensemoir sur HA immobilisée, HA liée à C1q ou à BSA (utilisé comme un contrôle négatif), pendant 35 min. Si on le compare à l'HA, le revêtement avec HA-bound-C1q a été en mesure d'augmenter la quantité de cellules primaires adhérantes, mais n'est pas en mesure de stimuler l'adhérence des lignées cellulaires tumorales que nous avons testé, comme le montre le graphique représentatif dans la figure 3.
Figure 1 . Interaction de C1q avec l'acide hyaluronique. (A) Liaison de C1q sur HMW HA d'une manière dépendante de la dose. Les données sont exprimées comme la moyenne de trois expériences indépendantes dans le triplement - S.E.M. (B) Représentation schématique de la molécule C1q et de la région globulaire à chaîne unique recombinante. C1q est assemblé à partir de trois chaînes polypeptides (A, B, C) chacune contenant une séquence de collagène N-terminal et une tête gC1q globulaire C-terminal. (C) Formule chimique d'acide hyaluronique, une chaîne hautement polymérisée d'acide glucuronique et de N-acétylglucosamine. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 . Schéma sommaire de l'isolement et de la morphologie des cellules tumorales. Des cellules de tumeur ont été isolées des spécimens pleural de biopsie. Les cellules ont été ensemoir dans un flacon de 12,5 cm2 et cultivées dans le sérum à cellules endothéliales humaines moyen libre - 10% FBS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 . Effet de C1q sur l'adhérence des cellules tumorales. Les cellules tumorales (MES) ou la lignée cellulaire du mésothéliome primaire (MSTO-211H) ont été ensemeres dans des puits microtiter pré-enduits d'acide hyaluronique (HA), ha lié à C1q ou à l'albumine de sérum bovin (BSA). Dans la partie supérieure de la figure, l'aspect morphologique d'une lignée cellulaire primaire représentative a adhéré à L'HA, à l'HA liée au C1q ou au BSA. Les images ont été acquises par microscope de phase-contraste, grossissement original : 200x. Fast DiI étiquetés cellules de mésothéliome primaire ou une lignée cellulaire de mésothéliome (MSTO-211H) ont été autorisés à adhérer aux puits de microtiter pré-enduits avec HA, HA lié à C1q ou à BSA. Les données sont exprimées comme moyen de trois expériences indépendantes effectuées dans des triplicates - S.E.M. - p'lt; 0,01 vs HA. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous décrivons une méthode facile pour étudier comment le composant de complément C1q, interagissant avec l'acide hyaluronique, est capable de moduler le comportement des cellules primaires isolées des tissus tumoraux humains. Les deux HA et C1q sont abondamment présents dans le microenvironnement tissulaire à la fois dans des conditions physiologiques et pathologiques, participant à plusieurs processus biologiques cellulaires. Par exemple, C1q a été montré pour être présent dans le microenvironnement du placenta où il favorise l'invasionextravillous de trophoblast de la decidua maternelle pendant la placentation 8. C1q est également déposé dans la peau cicatrisation où il favorise le processus angiogénétique nécessaire pour la régénération des tissus et la réparation10. Enfin, C1q a été identifié dans plusieurs tissus tumoraux différents4. Le poids moléculaire élevé HA est une barrière naturelle pour l'angiogenèse et la prolifération et des preuves récentes ont prouvé que C1q, outre son rôle classique dans l'activation de complément, est capable d'agir en tant que molécule d'ECM, favorisant la migration cellulaire.
La nouveauté de ce travail consiste à trouver que la liaison de C1q à HA modifie fortement l'interaction des cellules tumorales avec HA. Pour mettre en place cette méthode, plusieurs points de contrôle ont été envisagés. Tout d'abord, nous nous sommes assurés qu'une quantité suffisante d'HA était liée au plastique de la culture et aux puits ELISA à l'aide de l'HA biotinylated. La coloration bleue alciienne des puits a confirmé ces résultats (données non montrées). L'incubation a été effectuée pendant la nuit dans le tampon de bicarbonate, pH 9.6, et cette procédure assure la saturation complète des puits par HA (données non montrées).
La deuxième étape a été de lier C1q à HA. La liaison de C1q à HA a été réalisée à un pH physiologique (7,4) et en présence de Ca2 . Pour cette raison, nous avons utilisé un tampon dPBS-BSA avec des ions bivalents. Nous avons d'abord effectué une expérience de réponse à la dose afin d'identifier et de choisir la quantité optimale de C1q qui peut être trouvé attaché à HA. Bien que dans notre courbe dose-réponse, nous n'ayons pas atteint exactement le plateau, nous avons utilisé la concentration de 25 g/mL pour être plus proche de la concentration physiologique de C1q libre, considérant que la quantité de C1q normalement présente dans le sérum est de 75-150 g/mL. Il a été calculé que le sérum C1q libre de C1r et C1est d'environ 10%-20% du complexe C111. C1q est connu pour sa capacité à lier les polyanions, il a été défini comme une molécule de reconnaissance de modèle de charge et HA est un polymère linéaire chargé négativement des unités répétitives de (,1-4)-D-acide glucuronique-(1,1-3)-N-acétyl-D-glucosamine12, 13. Pour cette raison, nous avons étudié cette forte interaction non covalente. Nos observations ont indiqué que les cellules de tumeur sentent la différence entre HA et HA lié au C1q. Les cellules semblent être plus étalées par rapport à la cellule adhérant à HA seul. Nous avons observé que cet effet n'est pas médié par C1q soluble, indiquant que cette modification de l'adhérence cellulaire dépend de l'interaction de C1q avec HA, probablement en raison d'un changement conformationnel de la molécule de complément en raison de la liaison.
Nous voulons souligner l'importance de l'utilisation des cellules primaires comme modèles in vitro du comportement tumoral pour les expériences d'adhérence, puisque nous remarquons une forte différence dans la capacité d'adhérence entre les cellules primaires par rapport à plusieurs lignées cellulaires, comme le montre dans Figure 3. Un modèle alternatif et très intéressant pour évaluer les propriétés biologiques de HA est l'utilisation de modèles 3D d'échafaudage hydrogel HA. Cet échafaudage avec l'incorporation de molécules biologiques peut être utilisé pour l'évaluation des signaux bioactifs et pour plusieurs applications dans la médecine régénérative14. Le modèle que nous proposons dans cette étude est une méthode plus facile, plus rapide et moins coûteuse pour l'évaluation des réponses cellulaires à une combinaison de stimuli, et il peut être considéré comme une première étape pour la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans ce genre de interaction.
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Disclosures
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l'absence de relations commerciales ou financières qui pourraient être interprétées comme un conflit d'intérêts potentiel.
Acknowledgments
Nous remercions Ivan Donati pour la fourniture de HA, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (Département de gynécologie de l'IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italie) et Andrea Romano (Unité Clinique Opérationnelle d'Anatomie et d'Histologie Pathologique, Hôpital Cattinara, Trieste, Italie ) pour la collecte d'échantillons de tissus. Nous remercions également Nicolo Morosini pour l'aide dans la préparation vidéo et Alex Coppola, la voix. Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut pour la santé maternelle et infantile, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italie (RC20/16) et Fondazione Cassa di Risparmio Trieste à R.Bulla.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm pore filter | BD Falcon | 352360 | |
| Amphotericin B solution (fungizone) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| basic FGF | Immunological Sciences | GRF-15595 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fibronectin | Roche | 11051407001 | |
| Flask for cell culture | Corning | 430639 | Sterile, vented |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone |
| High molecular weight hyaluronic acid | Kind gift by Prof. Ivan Donati | ||
| Human endothelial serum free medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11111-044 | Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and 1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich) |
| Magnesium Chloride | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Medium 199 with Hank’s salt | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Time-lapse microscopy | Nikon | Imaging System BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
References
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