Summary
Komplement komponenten C1q är en Pro-inflammatorisk molekyl som uttrycks högt i den vävnads mikromiljö som kan interagera med den extracellulära matrisen. Här beskriver vi en metod för att testa hur C1q bunden till hyaluronsyra påverkar cellernas vidhäftning.
Abstract
Det har blivit alltmer visat att tumören mikromiljö spelar en aktiv roll i neoplasi tillväxt och metastaser. Genom olika vägar, kan tumör celler effektivt rekrytera stromal, immun och endotelceller genom att utsöndra stimulatoriska faktorer, chemokiner och cytokiner. I sin tur kan dessa celler ändra signaleringsegenskaper för mikromiljön genom att frigöra tillväxt främjande signaler, metaboliter och extracellulära matrix komponenter för att upprätthålla hög spridning och metastaserande kompetens. I detta sammanhang, vi identifierar att komplement komponenten C1q, högt uttryckt lokalt av en rad mänskliga maligna tumörer, på interagerar med extracellulär matrix hyaluronsyra, påverkar starkt beteendet hos primära celler isolerade från mänsklig tumör Exemplar. Här beskriver vi en metod för att testa hur C1q bunden till hyaluronsyra (HA) påverkar tumör cellernas vidhäftning, underliggande det faktum att de biologiska egenskaperna hos viktiga komponenter i den extracellulära matrisen (i detta fall HA) kan formas av bioaktiva signaler mot tumör Progression.
Introduction
Tumören mikromiljö (TME) påverkar cancer utveckling och progression eftersom det kan ge en tillåtande nisch för cell överlevnad, tillväxt och invasion. Identifieringen av nya nyckel aktörer i TME kan vara till nytta för upptäckten av nya molekyl ära verktyg för mål terapi. TME innehåller ett komplext och dynamiskt nätverk av icke-maligna celler, såsom endotelceller, fibroblaster och celler i immun systemet, inbäddade i den omgivande extracellulära matrix (ECM) komponenter inklusive kollagener, lamininer, fibronectiner, proteoglykaner och hyaluronans. Både tumör och icke-tumör celler syntetisera och utsöndra ECM komponenter tillsammans med cytokiner, chemokines, tillväxtfaktorer och inflammatoriska och Matrix remodeling enzymer som totalt förändrar den fysiska, kemiska och signalering egenskaper TME. Bland dessa bestånds delar, hyaluronsyra (HA) har vuxit fram för att utöva en avgörande roll i tumör bio Logi. Trots sin enkla kemiska sammansättning, HA, tillsammans med dess HA-bindande molekyler (hyaladherins), kan modulera angiogenes, immun systemet lyhördhet och ECM remodeling i en storlek och koncentrations beroende sätt1.
Komplement (C) systemet är också en del av den lokala TME, som nyligen har fått ökad uppmärksamhet. C-systemet omfattar en uppsättning lösliga och membran-bundna proteiner som deltar i den första försvars linjen mot icke-Self-celler, oönskade värd element och patogener. Funktionellt, förbinder C de två effektor armarna av medfödda och adaptiva system för att främja antingen direkt cell dödande eller montering av en inflammatorisk reaktion2. C aktivering kan undertrycka tumör tillväxt, genom att förstöra cancer celler eller hämma deras utväxt, men det har blivit allt tydligare att det kan ha en tumör-främjande verksamhet genom att upprätthålla kronisk inflammation, främja inrättandet av en immunosuppressiv miljö, inducera angiogenes och aktivera cancerrelaterade signal vägar3. I detta sammanhang, C1q, den första erkännande molekylen av den klassiska vägen av C-systemet har uppstått för att utöva viktiga funktioner i tumören mikromiljö oberoende av C aktivering4. C1q har visat sig uttryckas lokalt av en rad mänskliga maligna tumörer, där det kan gynna cancer cell adhesion, migration och proliferation utöver angiogenes och metastaser5. Intressant C1q interagerar med en viktig bestånds del i ECM som HA.
Vi utvecklade en teknik för att isolera de primära cancer cellerna från tumör massan. Dessutom skapade vi matrisen, som kan stimulera tumör mikromiljö, särskilt samspelet mellan C1q och hög molekyl vikt hyaluronsyra. C1q bunden till HA kunde inducera vidhäftning av tumör cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vävnads prov från patienter samlades in efter informerat samtycke efter godkännande av etiska överväganden av institutions styrelsen vid Universitetssjukhuset i Trieste, Italien.
1. tumör cell isolering och kultur (dag 1)
- Isolera humana mesoteliom celler från MPM fasta prover. Finhacka vävnaden med en fräs för att få fragment av ca 2-3 mm2 i storlek och inkubera i 5 ml mat smältnings lösning bestående av Hanks bal anse rad saltlösning (Hbss) kompletterad med 0,5 mm ca2 +/mg2 +, 0,5% trypsin och 50 μg/ml DNase I, över natten vid 4 ° c.
- Tumör cell isolering och kultur (dag 2)
- Efter övernattning inkubation, placera smält vävnad för 30 min i en 37 ° c inkubator med mild skakning.
- Byt ut mat smältnings lösningen vid centrifugering (250 x g) med 3 mg/ml kollagenas typ 1 upplöst i 5 mL medium 199 med Hbss och ytterligare Inkubera i 30 min vid 37 ° c med skonsam skakning.
- Blockera den enzymatiska reaktionen genom att tillsätta 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS). Omsuspendera cellerna mycket noggrant med en 5 mL Pipettera för att säkerställa att de flesta av cellerna frigörs från vävnaden. Filtrera sedan cell SUS pensionen genom ett 100 μm porfilter.
- Frö cellerna i en 12,5 cm2 kolv och odla dem på 37 ° c med humana endotelceller serum fritt medium (hesf), med 10% FBS och kompletteras med EGF (10 ng/ml), grundläggande fgf (20 ng/ml), och 1% penicillin-streptomycin.
Obs: Ersätt med färskt medium var 2-3 dag.
2. HA-beläggning (dag 1)
- Omsuspendera hög molekyl vikt HA (1,5 kDa) i dubbelt destillerat vatten med koncentrationen 1 mg/mL6.
- Späd HA-lagerlösningen till 50 μg/mL i karbonat/bikarbonatbuffert (0,1 M, pH 9,6) med skonsam pipettering.
- Täck 96-well-plattan med 100 μL utspädd HA-lagerlösning per brunn över natten vid 4 ° c.
Obs: hyaluronsyra var en slags gåva från professor Ivan Donati, Institutionen för livs vetenskaper, University of Trieste7.
3. C1q beläggning (dag 2)
- Efter övernattning inkubation, vakuum aspirera de behandlade brunnar och tvätta 96-well plattan med 100 μL av Dulbecco s PBS (dPBS) per brunn.
- Tillåt C1q (25 μg/mL eller olika koncentrationer för dosresponsexperiment) eller BSA (som en negativ kontroll) för att binda plasten immobilized-HA genom att ruinera dessa proteiner vid en koncentration av 25 μg/mL i 100 μL dPBS + 0,5% BSA och 0,7 mM ca2 +/mg2 + . Inkubera sedan över natten vid 4 ° c.
- Vakuum aspirera brunnar och tvätta 96-brunnen plattan med 100 μL/brunn av dPBS.
4. cell märkning med FAST DiI
- Omsuspendera 1 x 105 tumör celler i 500 ΜL av dpbs innehåll ande 10 μg/ml av det fluorescerande färg ämnet fast DiI. Inkubera i 15 min vid 37 ° c i en 5% v/v CO2 inkubator för märkningen, blanda manuellt efter 5 min intervaller.
- För att avlägsna överskott av FAST DiI, tillsätt 10 mL dpb, Pipettera försiktigt upp och ner, och centrifugera vid 250 x g i 7 min. resuspendera cellpelleten i 1 ml humant endotelialt serum fritt medium innehåll ande 0,1% BSA (hesf + 0,1% BSA).
5. celladhesion på HA/C1q matriser (dag 1)
- Vakuum aspirera brunnar belagda med de olika matrixer (brunnar var belagda i steg 3,2).
- Fördela 100 μL av den märkta cell SUS pensionen till de belagda brunnarna och inkubera plattan för 35 min vid 37 ° c i 5% v/v CO2 inkubator.
- Ta bort de icke-anhängare cellerna genom aspirera supernatanten. Tvätta en gång med dPBS innehåll ande 0,5% BSA, 0,7 mM ca2 + och 0,7 mm mg2 +.
- Lyse de anhängare cellerna genom att tillsätta 200 μL/brunn av 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 + 0,1% v/v SDS och omedelbart läsa 96-brunnen plattan med en fluorescensläsare (544 nm, emission 590 Nm) med hjälp av en kalibrerings kurva som genereras genom Lys av ett ökande antal märkta Celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HA är en negativt laddad hög molekyl vikt polysackanod, som består av upprepande (β, 1-4)-D-glukuronsyra-(β, 1-3)-N-acetyl-D-glukosamin disackarid enheter (figur 1b)7. Förekomsten av bindningen av HA på 96-brunnen plattan samt effektiviteten i dess immobilisering testades dra nytta av biotinylated HA (bio-HA). Olika koncentrationer av bio-HA, alltifrån 10 μg/mL till 1 mg/mL, återsuspenderas i 100 mM karbonat/bikarbonatbuffert pH 9,6 och inkuberas över natten vid 4 ° c.
Efter omfattande tvättar upptäcktes bio-ha bundet till 96-brunnar plattan med streptividin konjugerat till alkaliskt fosfatas, medan förekomsten av streptividin kvantifierades med hjälp av pNPP (1 mg/ml) som substrat. Läsningen utfördes vid våg längden på 405 nm med hjälp av en ELISA-läsare. Bio-HA kunde binda till en 96-brunn plattan på ett DOS svar sätt (data inte visas); 50 μg/mL valdes som mättnadsplatån och används därför i våra analyser.
Våra tidigare uppgifter visade att C1q kan binda till ett brett spektrum av mål ligander lokaliserade i ECM8. Denna bindning är särskilt stark med HA9. Brunnarna på en mikrotiterplåt täcktes med 50 μg/mL HMW-HA och inkuberades med en ökande koncentration av C1q. Bound C1q visualiserades vid inkubation med anti-C1q polyklonala anti kroppar. C1q är i stånd att binda till hög molekyl vikt HA på ett DOS beroende sätt (figur 1a) och nå den högsta nivån av bindning vid koncentrationen av 50 μg/ml. Efter att ha fastställt att C1q kan binda till HA, undersökte vi innebörden av denna interaktion i att ändra signalering egenskaper ECM och deras konsekvenser i tumör utveckling. I detta syfte upprättade vi ett protokoll till isolerade tumör celler från bioptiska prover som erhållits från drabbade patienter. Primära tumör celler isolerades från vävnadsbiopsi, vilket sammanfattas i figur 2. Förmågan hos tumör celler att interagera med C1q utvärderades genom att utföra en cell adhesionstest med hjälp av olika mat ris kombinationer, som visas i figur 3. Tumör celler färgas med fluorescerande sonden fast DiI och seedade på orörlig ha, ha bunden till C1q eller BSA (används som en negativ kontroll), för 35 min. Om jämfört med HA, beläggningen med HA-Bound-C1q kunde öka mängden av vidhängande primära celler, men inte kan stimulera vidhäftning av tumör cellinjer som vi testade, som visas i den representativa grafen i figur 3.
Figur 1 . Interaktion av C1q med hyaluronsyra. Abindning av C1Q på HMW ha på ett DOS beroende sätt. Uppgifterna uttrycks som medelvärdet av tre oberoende experiment i tre exemplar ± S.E.M. (B) Schematisk representation av C1q-molekylen och av den rekombinanta enkelkedjiga klotformiga regionen. C1q är sammansatt av tre polypeptid kedjor (a, B, C): var och en innehåller en N-Terminal kollagen-liknande sekvens och en C-Terminal globulära gC1q huvudet. (C) kemisk formel av hyaluronsyra, en mycket polymeriserad kedja av glukuronsyra och N-acetylglukosamin. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Summariskt schema av isoleringen och morfologin av tumör celler. Tumör celler isolerades från pleuramesoteliom biopsi prover. Cellerna var seedade i en 12,5 cm2 kolv och odlade i humant endothelial cell serum fritt medium + 10% FBS. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Effekt av C1q på tumör celler vidhäftning. Tumör celler (MES) eller primär mesoteliom cellinjen (msto-211h) var seedade till mikrotiterplattan brunnar pre-belagda med hyaluronsyra (ha), ha bunden till C1q eller till nötkreatur serumalbumin (BSA). I den övre delen av figuren visades den morfologiska aspekten av en representativ primär cellinjen på HA, HA bunden till C1q eller till BSA. Bilder förvärvades via fas kontrast Mikroskop, ursprunglig förstoring: 200x. FAST DiI märkt primära mesoteliom celler eller en mesoteliom cellinjen (msto-211h) tilläts följa mikrotiterplattan brunnar pre-belagda med ha, ha bunden till C1q eller BSA. Uppgifterna uttrycks som medelvärdet av tre oberoende experiment utförda i tre exemplar ± S.E.M. * p < 0,01 vs ha. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en enkel metod för att undersöka hur komplement komponenten C1q, som interagerar med hyaluronsyra, kan modulera beteendet hos primära celler isolerade från mänskliga tumör vävnader. Både HA och C1q är rikligt närvarande i vävnaden mikromiljö både under fysiologiska och sjukdoms tillstånd, deltar i flera cell biologiska processer. Till exempel, C1q har visat sig vara närvarande i mikromiljön av moderkakan där det gynnar extravillous trofoblaster invasion av moderns decidua under placentation8. C1q är också deponeras i sårläkning hud där det främjar angiogenetisk process som krävs för vävnadsregenerering och reparation10. Slutligen, C1q har identifierats i flera olika tumör vävnader4. Hög molekyl vikt HA är en naturlig barriär för angiogenes och proliferation och senaste rönen visade att C1q, förutom sin klassiska roll i komplement aktiveringen, kan fungera som en ECM-molekyl, gynnar cell migration.
Nyheten i detta arbete består i konstaterandet att bindningen av C1q till HA starkt ändra samspelet mellan tumör celler med HA. För att ställa in denna metod flera kontroll punkter har beaktats. Först och främst såg vi till att en tillräcklig mängd hektar var bunden till plast av kultur och ELISA-brunnar med biotinylated HA. Den Alcian blå färgning av brunnarna bekräftade dessa resultat (data visas inte). Inkubationen har utförts över natten i bikarbonatbuffert, pH 9,6, och detta förfarande säkerställa fullständig mättnad av brunnarna med HA (data visas inte).
Det andra steget var att binda C1q till HA. Bindningen av C1q till HA har utförts vid ett Fysiologiskt pH (7,4) och i närvaro av ca2 +. Av denna anledning använde vi en dPBS-BSA buffert med bivalent joner. Vi utförde initialt ett DOS svar experiment för att identifiera och välja den optimala mängden C1q som kan hittas bifogas HA. Även i vår dos-responskurva vi inte nådde exakt platå, vi använde koncentrationen av 25 μg/mL för att vara närmare den fysiologiska koncentrationen av fria C1q, med tanke på att den mängd C1q som normalt finns i serumet är 75-150 μg/mL. Det har beräknats att serum C1q fritt från C1r och C1s är ca 10%-20% av C1-komplex11. C1q är känd för sin förmåga att binda polyanoner, det har definierats som en avgift mönster erkännande molekyl och HA är en negativt laddad linjär polymer av upprepande enheter av (β, 1-4)-D-glukuronsyra-(β, 1-3)-N-acetyl-D-glukosamin12, 13. av denna anledning undersökte vi denna starka icke-kovalent interaktion. Våra observationer indikerade att tumör celler känner skillnaden mellan HA och HA bunden till C1q. Cellerna verkar vara mer utspridda om de jämförs med den cell som ansluter sig till HA ensam. Vi observerade att denna effekt inte förmedlas av lösliga C1q, vilket tyder på att denna modifiering i celladhesion är beroende av samspelet mellan C1q och HA, troligen på grund av en kon Formations förändring av komplement molekylen som en följd av bindningen.
Vi vill betona vikten av användning av primära celler som in vitro-modeller av tumör beteende för vidhäftnings experiment, eftersom vi märker en stark skillnad i vidhäftnings förmågan mellan primära celler jämfört med flera cellinjer, som visas i I figur 3. En alternativ och mycket intressant modell för att utvärdera de biologiska egenskaperna hos HA är användningen av 3D-modeller av HA hydrogel byggnads ställning. Denna ställning med införlivandet av biologiska molekyler kan användas för utvärdering av bioaktiva signaler och för flera tillämpningar i regenerativ medicin14. Den modell som vi föreslår i denna studie är en enklare, snabbare och billigare metod för utvärdering av cellulära svar på en kombination av stimuli, och det kan betraktas som ett första steg för förståelsen av de molekyl ära mekanismer som är inblandade i denna typ av Interaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella förhållanden som skulle kunna uppfattas som en potentiell intresse konflikt.
Acknowledgments
Vi tackar Ivan Donati för att ge av HA, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (Institutionen för gynekologi av IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italien) och Andrea Romano (operativa kliniska enheten för anatomi och patologisk histologi, Cattinara Hospital, Trieste, Italien ) för insamling av vävnads prov. Vi tackar också Nicolò Morosini för hjälp i video förberedelse och Alex Coppola, rösten. Detta arbete stöddes av bidrag från Institutet för mödra-och Barna vård, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italien (RC20/16) och Fondazione Cassa di Risparmio Trieste till R. bulla.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm pore filter | BD Falcon | 352360 | |
| Amphotericin B solution (fungizone) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| basic FGF | Immunological Sciences | GRF-15595 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fibronectin | Roche | 11051407001 | |
| Flask for cell culture | Corning | 430639 | Sterile, vented |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone |
| High molecular weight hyaluronic acid | Kind gift by Prof. Ivan Donati | ||
| Human endothelial serum free medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11111-044 | Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and 1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich) |
| Magnesium Chloride | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Medium 199 with Hank’s salt | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Time-lapse microscopy | Nikon | Imaging System BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
References
- Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
- Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
- Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346 (2016).
- Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23 (2015).
- Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
- Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
- Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
- Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559 (2017).
- Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
- Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38 (2012).
- Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
- Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
- Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).
