Summary
補体成分C1qは、細胞外マトリックスと相互作用しうる組織微小環境において高度に発現する炎症性分子である。ここでは、ヒアルロン酸に結合したC1qが細胞接着にどのように影響するかを試験する方法について述述する。
Abstract
腫瘍微小環境が新生物の成長および転移に積極的な役割を果たしていることをますます実証されている。異なる経路を通じて、腫瘍細胞は刺激因子、ケモカインおよびサイトカインを分泌することにより、間質細胞、免疫細胞および内皮細胞を効率的に募集することができる。次に、これらの細胞は、高い増殖および転移能力を維持するために、成長促進シグナル、代謝産物および細胞外マトリックス成分を放出することにより、微小環境のシグナル伝達特性を変化させることができる。この文脈において、我々は、ヒト悪性腫瘍の範囲によって局所的に高く発現する補体成分C1qが、細胞外マトリックスヒアルロン酸と相互作用した場合、ヒト腫瘍から単離された原発細胞の挙動に強く影響を及ぼすことを同定する。標本。ここでは、ヒアルロン酸(HA)に結合したC1qが腫瘍細胞接着にどのように影響するかを調べ、細胞外マトリックスの主要成分(この場合はHA)の生物学的特性が腫瘍に対する生理活性シグナルによって形成できるという事実を基礎とする方法を説明する。進行。
Introduction
腫瘍微小環境(TME)は、細胞の生存、増殖および侵入に寛容なニッチを提供することができるので、癌の発達および進行に影響を与える。TMEにおける新しい主要なプレーヤーの同定は、標的治療のための新しい分子ツールの発見に役立つ可能性がある。TMEは、内皮細胞、線維芽細胞および免疫系の細胞などの非悪性細胞の複雑かつ動的なネットワークを含み、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンを含む周囲の細胞外マトリックス(ECM)成分に埋め込まれ、プロテオグリカンとヒアルロナン。腫瘍細胞と非腫瘍細胞の両方が、サイトカイン、ケモカイン、成長因子および炎症およびマトリックスリモデリング酵素と共にECM成分を合成し、分泌し、TMEの物理的、化学的およびシグナル伝達特性を全体的に変化させます。これらの成分の中で、ヒアルロン酸(HA)は腫瘍生物学において重要な役割を果たすために出現した。その単純な化学組成にもかかわらず、HAは、そのHA結合分子(ヒャラデリン)と共に、血管新生、免疫系応答性およびECMリモデリングを大きさおよび濃度依存的な方法1で調節することができる。
補体(C)システムは、最近注目を集めているローカルTMEの一部でもあります。C系は、非自己細胞、不要な宿主要素および病原体に対する防御の第一行に関与する可溶性および膜結合タンパク質のセットを包含する。機能的には、Cは、直接細胞死または炎症反応2の取り付けを促進するために、先天的および適応系の2エフェクターアームをリンクする。C活性化は、癌細胞を破壊したり、その増殖を阻害することによって腫瘍増殖を抑制することができるが、慢性炎症を持続することにより腫瘍促進活性を有することがますます明らかになってなくなって、免疫抑制milieuは、血管新生を誘導し、癌関連シグナル伝達経路3を活性化する。この文脈において、C1qは、C系の古典的経路の第1認識分子が、C活性化4とは無関係に腫瘍微小環境において重要な機能を発揮するために出現した。C1qは、血管新生および転移に加えて癌細胞の接着、移行および増殖を支持することができるヒト悪性腫瘍の範囲によって局所的に発現することが示されている5。興味深いことに、C1qはHAなどのECMの主要な構成要素と相互作用する。
原発性癌細胞を腫瘍塊から分離する技術を開発した。さらに、腫瘍微小環境、特にC1qと高分子量ヒアルロン酸との相互作用を刺激するマトリックスを作成しました。HAに結合したC1qは、腫瘍細胞の接着を誘導することができた。
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Protocol
患者からの組織サンプルは、イタリアのトリエステ大学病院の機関委員会による倫理的配慮の承認を受けた後、インフォームドコンセントの後に収集されました。
1. 腫瘍細胞の単離と培養(1日目)
- MPM固体標本からヒト中皮腫細胞を単離する。約2-3mm2の断片をカッターで細かくミンチし、ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)で構成された消化溶液の5mLでインキュベートし、0.5mM Ca2+/Mg 2+、0.5%トリプシンおよび50 μg/mLを補充DNase I,4°Cで一晩。
- 腫瘍細胞の単離と培養(2日目)
- 一晩インキュベーションした後、消化した組織を37°Cのインキュベーターに30分間入れ、穏やかな揺れを起こす。
- 遠心分離(250 x g)時の消化液を3mg/mLコラゲナーゼタイプ1をHBSSで中5mLに溶解し、さらに37°Cで30分間インキュベートします。
- 10%の熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)を加えることによって酵素反応をブロックする。5 mLピペで細胞を非常に慎重に再中断し、細胞のほとんどが組織から放出されることを確認します。次に、100 μmの細孔フィルターを通してセル懸濁液を濾過する。
- 12.5 cm2フラスコで細胞を播種し、ヒト内皮細胞無血清培地(HESF)で37°Cで培養し、10%FBSでEGF(10 ng/mL)、塩基性FGF(20ng/mL)、および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを加えた。
注:2-3日ごとに新鮮な媒体に交換してください。
2. HAコーティング(1日目)
- 1 mg/mL6の濃度で二重蒸留水で高分子量HA(1.5 kDa)を再中断する。
- 穏やかなピペッティングで炭酸塩/重炭酸塩バッファー(0.1M、pH 9.6)で50 μg/mLにHAストック溶液を希釈します。
- 96ウェルプレートを100μLの希釈HAストック溶液で一晩4°Cでコーティングします。
注:ヒアルロン酸は、トリエステ大学生命科学部のイワン・ドナティ教授からの親切な贈り物でした。
3. C1qコーティング(2日目)
- 一晩インキュベーションの後、真空は処理されたウェルを吸引し、井戸あたり100 μLのダルベッコのPBS(dPBS)で96ウェルプレートを洗浄します。
- DPBS + 0.5% BSA および 0.7 mM Ca2+Mg /2+ でこれらのタンパク質を 25 μg/mL の濃度でインキュベートすることにより、C1q (25 μg/mL または用量応答実験用の異なる濃度) または BSA (負の対照として) をプラスチック固定化-HA に結合できるようにします。.その後、4°Cで一晩インキュベートします。
- 真空は井戸を吸引し、dPBSの100 μL/ウェルで96ウェルプレートを洗浄します。
4. FAST DiIによる細胞ラベリング
- 蛍光色素FAST DiIの10 μg/mLを含むdPBSの500 μLの500 μLの腫瘍細胞を再中断する。ラベリング用の5%v/vCO2インキュベーターで37°Cで15分間インキュベートし、5分間隔後に手動で混合する。
- 過剰なFAST DiIを除去するには、dPBSの10 mLを追加し、ピペットを上下に優しく、遠心分離機を250 x gで7分間7分間、0.1%BSAを含むヒト内皮血清フリー培地の1mLで細胞ペレットを再ステーペンする(HESF + 0.1%BSA)。
5. HA/C1qマトリックスの細胞接着(1日目)
- 真空は、異なるマトリックスでコーティングされたウェルを吸引する(ウェルはステップ3.2で被覆された)。
- 標識された細胞懸濁液の100 μLを被覆ウェルに分配し、プレートを37°Cで35分間インキュベートし、5%v/v CO2インキュベーターに入れます。
- 上清を吸引して非付着細胞を除去する。0.5% BSA、0.7 mM Ca2+および 0.7 mM Mg2+を含む dPBS で一度洗浄します。
- 10 mM Tris-HCl、pH 7.4 + 0.1% v/v SDSの200 μL/ウェルを加えて付着細胞をlyseし、蛍光リーダー(544nm、発光590nm)を使用して96ウェルプレートを直ちに読み取り、ラベルの数を増やすリサイジングを通して生成された較正曲線を使用して細胞。
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Representative Results
HAは、繰り返し(β,1-4)-D-グルクロン酸−(β,1-3)-N-アセチル-D-グルコサミン二糖単位(図1B)7を繰り返すことで構成される負の帯電高分子量多糖類である。96ウェルプレート上のHAの結合の発生およびその固定化の効率は、ビオチン化HA(バイオHA)を利用して試験した。10μg/mLから1mg/mLまでのバイオHAの異なる濃度を、100mM炭酸塩/重炭酸塩バッファーpH9.6で再懸濁し、4°Cで一晩インキュベートした。
広範な洗い流しの後、96ウェルプレートに結合したバイオHAをアルカリホスファターゼに結合したストレプトアビジンを用いて検出し、ストレプトアビジンの存在はpNPP(1mg/mL)を基質として定量した。読み取りは、ELISAリーダーを用いて405nmの波長で行った。Bio-HAは、用量応答方式で96ウェルプレートに結合することができた(データは示されていない)。50 μg/mLは飽和高原として選ばれ、アッセイに使用されました。
以前のデータは、C1qがECM8にローカライズされた幅広いターゲットリガンドに結合できることを実証した。この結合はHA9で特に強い。マイクロチタープレートのウェルを50μg/mL HMW-HAでコーティングし、C1qの濃度を高めてインキュベートし、抗C1qポリクローナル抗体をインキュベーションした際に可視化した。C1qは、用量依存的な方法で高分子量HAに結合することができ(図1A)、50μg/mLの濃度で結合の最大レベルに達する。C1qがHAに結合できることを確立し、ECMのシグナル伝達特性を改変する上でのこの相互作用の意味と腫瘍発達への影響を調べた。この目的のために、我々は、影響を受けた患者から得られた生細胞標本から腫瘍細胞を単離するプロトコルを確立した。原発性腫瘍細胞を組織生検から単離し、図2に要約した。C1qと相互作用する腫瘍細胞の能力は、図3に示すように、異なるマトリックス組み合わせを用いて細胞接着アッセイを行うことによって評価された。腫瘍細胞を蛍光プローブFAST DiIで染色し、固定化HAに播種し、HAをC1qまたはBSA(陰性対照として使用)に結合し、35分間播種した。HAと比較すると、HA結合-C1qによるコーティングは、一次細胞の付着量を増加させることができたが、我々が試験した腫瘍細胞株の接着を刺激することはできなかった、図3の代表的なグラフに示すように。
図 1.C1qとヒアルロン酸との相互作用(A) 用量依存的方法でのHMW HA上でのC1qの結合。データは、C1q分子および組換え単鎖球状領域の概略表法である三角±S.E.M.(B)における3つの独立した実験の平均として表される。C1qは、3つのポリペプチド鎖(A、B、C):N末端コラーゲン様配列およびC末端球状gC1qヘッドを含む3つのポリペプチド鎖から組み立てられる。(C)ヒアルロン酸の化学式は、グルクロン酸とN-アセチルグルコサミンの高重合鎖である。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.腫瘍細胞の単離および形態の要約スキーム。腫瘍細胞を胸膜生検から単離した。細胞を12.5cm2フラスコに播種し、ヒト内皮細胞血清フリー培地+10%FBSで培養した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.腫瘍細胞接着に対するC1qの効果腫瘍細胞(MES)または原発中皮腫細胞株(MSTO-211H)を、ヒアルロン酸(HA)で予め被覆したミクロチターウェルに播種し、HAをC1qまたはウシ血清アルブミン(BSA)に結合した。図の上部に、HAに付着した1つの代表的な一次細胞株の形態学的側面が示され、HAはC1qまたはBSAに結合した。画像は位相コントラスト顕微鏡を介して取得され、元の倍率:200倍。FAST DiI標識原発中皮腫細胞または中皮腫細胞株(MSTO-211H)をHAで予め被覆したマイクロチターウェルに付着させ、C1qまたはBSAに結合したHAを用いた。データは、三つ三度で行われた3つの独立した実験の平均として表されます ± S.E.M. * p < 0.01 対 HA.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ヒアルロン酸と相互作用する補体成分C1qが、ヒト腫瘍組織から単離された原発細胞の挙動を調節する方法を調べるための簡単な方法を説明する。HAおよびC1qは両方とも生理学的および病理学的条件下で組織微小環境に豊富に存在し、いくつかの細胞生物学的プロセスに関与する。例えば、C1qは胎盤の微小環境に存在することが示されており、胎盤8の間に母性決定権の外陰性栄養芽細胞侵行を支持する。C1qはまた、組織再生および修復10に必要な血管遺伝学的プロセスを促進する創傷治癒皮膚に沈着する。最後に、C1qは、いくつかの異なる腫瘍組織4で同定されている。高分子量HAは血管新生および増殖のための自然な障壁であり、最近の証拠はC1qが補体活性化における古典的な役割に加えて、ECM分子として作用し、細胞移動を好むことを示した。
本研究の新規性は、C1qとHAの結合がHAとの腫瘍細胞の相互作用を強く修飾するという知見に含まれる。このメソッドをセットアップするには、いくつかのチェックポイントが考慮されています。まず、ビオチン化HAを用いて、十分な量のHAが培養物とELISAウェルに結合していることを確認しました。井戸のアルシアンブルー染色は、これらの結果を確認しました(データは示されていません)。インキュベーションは、重炭酸塩バッファーpH9.6で一晩行われ、この手順はHAによるウェルの完全な飽和を保証する(データは示されていない)。
2 番目の手順は、C1q を HA にバインドする方法です。HAへのC1qの結合は、生理学的pH(7.4)およびCa2+の存在下で行われた。このため、二価イオンを含むdPBS-BSAバッファーを用いて用いた。HAに付着しているC1qの最適な量を同定し、選択するために、最初に用量応答実験を行った。我々の用量応答曲線では正確に高原に達しませんでしたが、血清中に通常存在するC1qの量が75-150 μg/mLであることを考慮して、25 μg/mLの濃度をフリーC1qの生理学的濃度に近づけるために使用しました。C1rおよびC1sから無血清C1qはC1複合体11の約10%〜20%であると計算されている。C1qは、ポリアニオンを結合する能力のために知られており、それは電荷パターン認識分子として定義されており、HAは(β,1-4)-D-グルクロン酸-(β,1-3)-N-アセチル-D-グルコサミン12の繰り返し単位の負の帯電線形ポリマーであり、また、13.このため、我々はこの強い非共同相互作用を調査した。我々の観察は、腫瘍細胞がC1qに結合したHAとHAの違いを感知することを示した。HA単独に付着した細胞と比較すると、細胞はより広がっているように見える。我々は、この効果が可溶性C1qによって媒介されないことを観察し、細胞接着におけるこの修飾は、おそらく結合の結果として補体分子の立体構造変化に起因する、HAとのC1qの相互作用に依存することを示す。
我々は、いくつかの細胞株と比較して一次細胞間の接着能力に大きな違いが見えるので、接着実験のための腫瘍行動のインビトロモデルとしての一次細胞の使用の重要性を強調したい。図 3.HAの生物学的特性を評価するための代替的で非常に興味深いモデルは、HAヒドロゲル足場の3Dモデルの使用である。生体分子を組み込んだこの足場は、生理活性信号の評価および再生医療14における複数の用途に用いることができる。本研究で提案するモデルは、刺激の組み合わせに対する細胞応答の評価をより簡単かつ迅速かつ安価に行う方法であり、この種の分子機構を理解するための第一歩と考えることができる。相互 作用。
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Disclosures
著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または財政的な関係がない場合に行われたと宣言している。
Acknowledgments
私たちは、HA、レオナルド・アマディオ、ガブリエラ・ジト(IRCCS「ブロ・ガロフォロ」、トリエステ、イタリア)とアンドレア・ロマーノ(解剖学と病理学の手術臨床ユニット、カティナラ病院、トリエステ、イタリアの婦人科の部門)を提供するためのイワン・ドナティに感謝します)を使用して、組織サンプルコレクションを行います。また、ニコロ・モロシーニがビデオの準備とアレックス・コッポラの声に助けをしてくれたことに感謝します。この研究は、母子保健研究所、IRCCS「ブロ・ガロフォロ」、トリエステ、イタリア(RC20/16)、フォンダジオーネ・カッサ・ディ・リスパルミオ・トリエステからR.Bullaへの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm pore filter | BD Falcon | 352360 | |
| Amphotericin B solution (fungizone) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| basic FGF | Immunological Sciences | GRF-15595 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fibronectin | Roche | 11051407001 | |
| Flask for cell culture | Corning | 430639 | Sterile, vented |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone |
| High molecular weight hyaluronic acid | Kind gift by Prof. Ivan Donati | ||
| Human endothelial serum free medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11111-044 | Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and 1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich) |
| Magnesium Chloride | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Medium 199 with Hank’s salt | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Time-lapse microscopy | Nikon | Imaging System BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
References
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