Summary
보체 성분 C1q는 세포외 기질과 상호 작용할 수 있는 조직 미세환경에서 고도로 발현되는 염증성 분자이다. 여기서, 우리는 C1q가 히알루론산에 결합하여 세포 부착에 미치는 영향을 시험하는 방법을 설명한다.
Abstract
종양 미세 환경이 신생물 성장 및 전이에 적극적인 역할을 한다는 것이 점점 입증되고 있다. 다른 통로를 통해, 종양 세포는 자극 인자, 케모카인 및 사이토카인을 분비하여 기질, 면역 및 내피 세포를 효율적으로 모집 할 수 있습니다. 차례로, 이 세포는 높은 증식 및 전이성 능력을 유지하기 위하여 성장 촉진 신호, 대사 산물 및 세포외 매트릭스 분대를 풀어 놓음으로써 미세 환경의 신호 특성을 바꿀 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 우리는 인간 악성 종양의 범위에 의해 국소적으로 고도로 발현되는 보체 성분 C1q가 세포외 기질 히알루론산과 상호 작용할 때 인간 종양으로부터 분리된 1차 세포의 거동에 강하게 영향을 미친다는 것을 확인합니다. 표본. 여기서, 우리는 C1q가 히알루론산(HA)에 결합하여 종양 세포 부착에 어떻게 영향을 미치는지 테스트하는 방법을 설명하며, 이는 세포외 기질의 주요 성분의 생물학적 특성(이 경우 HA)이 종양을 향한 생리활성 신호에 의해 형성될 수 있다는 사실을 뒷받침하는 것입니다. 진행.
Introduction
종양 미세 환경 (TME)은 세포 생존, 성장 및 침략에 대한 허용 틈새 시장을 제공 할 수 있기 때문에 암 발달 및 진행에 영향을 미칩니다. TME에 있는 새로운 중요한 선수의 확인은 표적 치료를 위한 새로운 분자 공구의 발견을 위해 유용할 지도 모릅니다. TME는 내피 세포, 섬유아세포 및 면역 계통의 세포와 같은 비악성 세포의 복잡하고 동적인 네트워크를 포함하며, 콜라겐, 라미닌, 섬유넥틴을 포함하는 주변 세포외 매트릭스(ECM) 성분에 내장되어 있으며, 프로테오글리칸과 히알루로난을 종양 및 비종양 세포는 사이토카인, 케모카인, 성장 인자 및 TME의 물리적, 화학적 및 신호 특성을 전체적으로 변경하는 염증 및 매트릭스 리모델링 효소와 함께 ECM 구성 요소를 합성하고 분비합니다. 이러한 성분 중, 히알루 론산 (HA) 종양 생물학에 중요 한 역할을 발휘 하기 위해 등장 했다. 그것의 간단한 화학 성분에도 불구하고, HA는, 그것의 HA 결합 분자 (hyaladherins)와 더불어, 크기 및 농도 의존적인 방식으로 혈관신생, 면역 계통 반응성 및 ECM 리모델링을 조절할 수 있다 1.
보체 (C) 시스템은 또한 최근 증가하고있는 로컬 TME의 일부입니다. C 시스템은 비 자기 세포, 원치 않는 숙주 요소 및 병원체에 대한 방어의 첫 번째 라인에 관여하는 수용성 및 막 결합 단백질의 세트를 포함합니다. 기능적으로, C는 선천적이고 적응적인 시스템의 2-이펙터 암을 연결하여 염증 반응의 직접적인 세포 살상 또는 장착을 촉진한다2. C 활성화는 암세포를 파괴하거나 그들의 성장을 억제해서 종양 성장을 억제할 수 있습니다, 그러나 만성 염증을 유지해서 종양 승진시키는 활동을 소유할 수 있다는 것을 점점 더 명확해지고 있습니다, 의 설치를 승진시키는 면역억제군, 혈관신생 유도, 암 관련 신호경로 활성화3. 이러한 맥락에서, C1q, C 시스템의 고전적인 경로의 제1 인식 분자는 C 활성화 4와 독립적으로종양 미세 환경에서 중요한 기능을 발휘하는 것으로 나타났다. C1q는 혈관신생 및 전이 외에 암세포 부착, 이동 및 증식을 선호할 수 있는 다양한 인간 악성 종양에 의해 국소적으로 발현되는 것으로 나타났다5. 흥미롭게도 C1q는 HA와 같은 ECM의 주요 구성 요소와 상호 작용합니다.
우리는 종양 질량에서 1 차적인 암세포를 격리하는 기술을 개발했습니다. 또한, 우리는 종양 미세 환경, 특히 C1q와 높은 분자량 히알루 론산 사이의 상호 작용을 자극 할 수있는 매트릭스를 만들었습니다. HA에 결합된 C1q는 종양 세포의 부착을 유도할 수 있었다.
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Protocol
환자로부터의 조직 샘플은 이탈리아 트리에스테 대학 병원의 기관 위원회의 윤리적 고려 사항의 승인 후 통보 된 동의 후 수집되었다.
1. 종양 세포 격리 및 배양 (1 일째)
- MPM 고체 표본으로부터 인간 중피종 세포를 분리합니다. 0.5 mM Ca2+/ Mg2+, 0.5 % 트립신 및 50 μg / mL로 보충 된 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)으로 구성된 소화 용액 5 mL에서 약 2-3mm2의 조각을 얻기 위해 커터로 조직을 미세하게 다진다. DNase I, 4 °C에서 하룻밤.
- 종양 세포 분리 및 배양 (2일째)
- 하룻밤 배양 후, 소화된 조직을 37°C 인큐베이터에 부드럽게 흔들어 놓고 30분 동안 놓는다.
- 원심분리 시 소화 용액 (250 x g)을 중간 크기 199의 5 mL에 용해 된 3 mg / mL 콜라게 나아제 유형 1로 HBSS로 교체하고 37 °C에서 30 분 동안 더 배양하십시오.
- 10% 열 불활성화 태아 소 혈청 (FBS)를 추가 하 여 효소 반응을 차단 합니다. 세포의 대부분이 조직에서 방출되도록 하기 위해 5 mL 파이펫으로 세포를 매우 신중하게 다시 중단하십시오. 이어서, 100 μm 기공 필터를 통해 세포 현탁액을 걸러내다.
- 세포를 12.5 cm2 플라스크에서 종자하고 인간 내피 세포혈청이 없는 배지(HESF)를 사용하여 37°C에서 배양하고, 10% FBS로, EGF(10 ng/mL), 기본 FGF(20 ng/mL), 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충하였다.
참고: 2-3일마다 신선한 매체로 교체하세요.
2. HA 코팅 (1 일차)
- 1 mg / mL6의농도에서 이중 증류수에서 고분자 HA (1.5 kDa)를 다시 일시 중단하십시오.
- 부드러운 파이펫팅으로 탄산염/중탄산염 완충액(0.1M, pH 9.6)에서 HA 스톡 용액을 50 μg/mL로 희석합니다.
- 96-웰 플레이트를 4°C에서 하룻밤 동안 100 μL의 희석 HA 스톡 용액으로 코팅합니다.
참고 : 히알루 론산은 트리에스테대학 생명과학학과 이반 도나티 교수의 친절한 선물이었다 7 .
3. C1q 코팅 (2일차)
- 하룻밤 배양 후, 진공 처리 된 우물을 흡인하고 잘 당 덜베코의 PBS (dPBS)의 100 μL로 96 웰 플레이트를 세척합니다.
- C1q (25 μg / mL 또는 투여 반응 실험을위한 다른 농도) 또는 BSA (음성 대조군)가 dPBS + 0.5 % BSA 및 0.7 mM Ca + 0.7m Ca + 0.7 mM + 0.7 mMCa+0.7 μS의 농도에서 25 μg / mL의 농도로 이러한 단백질을 배양하여 플라스틱 고정 HA에 결합하도록 허용하십시오. . 그런 다음 4 °C에서 밤새 배양합니다.
- 우물을 진공 흡인하고 dPBS의 100 μL / 웰로 96 웰 플레이트를 세척하십시오.
4. FAST DiI로 셀 라벨링
- 형광염 FAST DiI의 10 μg/mL를 함유하는 dPBS 의 500 μL에서 1 x 105 종양 세포를 재중단한다. 라벨링을 위해 5% v/v CO2 인큐베이터에서 37°C에서 15분 동안 인큐베이팅하고, 5분 간격 후에 수동으로 혼합한다.
- 여분의 FAST DiI를 제거하려면, dPBS 10 mL을 추가하고, 부드럽게 위아래로 피펫을 추가하고, 7 분 동안 250 x g에서 원심 분리기를. 0.1 % BSA (HESF + 0.1 % BSA)를 포함하는 인간 내피 혈청 무료 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
5. HA/C1q 행렬에 대한 세포 접착 (1일차)
- 진공 은 상이한 매트릭스로 코팅된 웰을 흡인한다(웰은 3.2단계에서 코팅되었다).
- 표지된 셀 현탁액의 100 μL을 코팅된 웰에 분배하고 5% v/vCO2 인큐베이터에서 37°C에서 35분 동안 플레이트를 배양한다.
- 상급체를 흡입하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 0.5% BSA, 0.7 mM Ca2+ 및 0.7 mM Mg2+를포함하는 dPBS로 한 번 씻으십시오.
- 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 + 0.1 % v /v SDS의 200 μL / well을 추가하여 부착 세포를 용해시키고 형광 판독기 (544 nm, 방출 590 nm)로 96 웰 플레이트를 즉시 판독하여 라벨 수가 증가하는 것을 통해 생성된 교정 곡선을 사용하여 부착 된 라벨수를 통해 발생했습니다. 셀.
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Representative Results
HA는 음전하고분자다당류이며, 이는 반복(β,1-4)-D-글루쿠론산-(β,1-3)-N-아세틸-D-글루코사민 난당류 단위(도1B)로구성된다. 96웰 플레이트상에서 HA의 결합의 발생뿐만 아니라 그 고정화의 효율은 생체화 HA(bio-HA)를 이용하여 시험하였다. 10 μg/mL에서 1 mg/mL에 이르는 다양한 Bio-HA 농도를 100 mM 탄산염/중탄산염 버퍼 pH 9.6에서 다시 중단하고 4°C에서 밤새 배양하였다.
광범위한 세차 후, 96웰 플레이트에 결합된 바이오-HA는 알칼리성 인산염에 컨쥬게이션된 스트렙타비딘을 사용하여 검출되었고, 스트렙타비딘의 존재는 pNPP(1 mg/mL)를 기판으로 사용하여 정량화되었다. 판독은 ELISA 리더를 사용하여 405 nm의 파장에서 수행되었다. 바이오-HA는 투여 량 반응 방식으로 96 웰 플레이트에 결합할 수 있었다(데이터는 도시되지 않음); 50 μg/mL은 포화 고원으로 선택되어 우리의 검정에 사용되었습니다.
우리의 이전 데이터는 C1q가 ECM8에현지화된 광범위한 표적 리간드에 결합할 수 있음을 입증했습니다. 이 바인딩은 HA9에서특히 강합니다. 마이크로티터 플레이트의 웰을 50 μg/mL HMW-HA로 코팅하고 C1q. 바운드 C1q의 증가 농도로 배양하여 항 C1q 폴리클로날 항체로 배양시 시각화하였다. C1q는 50 μg/mL의 농도에서최대 결합 수준에 도달하는 용량 의존적 방식으로 높은 분자량 HA에 결합할 수 있다(그림 1A). C1q가 HA에 결합할 수 있다는 것을 확립한 후, 우리는 ECM의 신호 특성과 종양 발달에 미치는 영향을 수정하는 데 이 상호 작용의 의미를 조사했습니다. 이 목적을 위해, 우리는 영향 받은 환자에게서 장악된 bioptic 견본에서 종양 세포를 격리하는 프로토콜을 설치했습니다. 일차 종양 세포는 도2에 요약된 바와 같이 조직 생검으로부터 단리되었다. C1q와 상호작용하는 종양 세포의 능력은 도3에 도시된 바와 같이 상이한 매트릭스 조합을 사용하여 세포 부착 분석기를 수행함으로써 평가되었다. 종양 세포는 형광 프로브 FAST DiI로 염색하고 고정화 HA상에 시드하였고, HA는 C1q 또는 BSA(음성 대조군으로 사용됨)에 35분 동안 결합하였다. HA와 비교하면, HA-바운드-C1q를 가진 코팅은 1차 세포의 부착량을 증가시킬 수 있었지만, 도3의 대표적인 그래프에 나타난 바와 같이 우리가 시험한 종양 세포주의 부착을 자극할 수 없었다.
그림 1 . 히알루 론산과 C1q의 상호 작용. (A) HMW HA에 대한 C1q의 결합을 투여량 의존적 방식으로. 데이터는 C1q 분자 및 재조합 단일 사슬 구형 영역의 세가지 독립적 인 실험의 평균으로 표현된다 ± S.E.M. (B) 회로도 표현. C1q는 3개의 폴리펩티드 사슬(A,B,C)으로부터 조립된다: 각각 N-말단 콜라겐 유사 서열 및 C-말단 구형 gC1q 헤드를 함유한다. (C) 글루쿠로닉산과 N-아세틸루코사민의 고분자 사슬인 히알루론산의 화학식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 . 종양 세포의 격리 및 형태학의 요약 계획. 종양 세포는 흉막 생검 표본으로부터 분리되었다. 세포를 12.5cm2 플라스크에서 시드하고 인간 내피 세포 혈청 자유 배지 + 10% FBS에서 배양하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 . 종양 세포 접착에 대한 C1q의 효과. 종양 세포(MES) 또는 원발성 중피종 세포주(MSTO-211H)를 히알루론산(HA)으로 미리 코팅한 마이크로티터 웰에 시드하였고, HA는 C1q 또는 소 혈청 알부민(BSA)에 결합하였다. 도면의 상부에서, 하나의 대표적인 1차 세포주 들의 형태학적 양상이 HA에 부착되었고, HA는 C1q 또는 BSA에 결합하여 나타내어 졌다. 이미지는 위상 대비 현미경, 원래 배율을 통해 획득되었다 : 200x. FAST DiI 표지된 1차 중피종 세포 또는 중피종 세포주(MSTO-211H)는 Ha, HA로 미리 코팅된 마이크로티터 웰을 C1q 또는 BSA에 결합하여 부착하도록 허용하였다. 데이터는 ± S.E.M. * p< 0.01 대 HA에서 수행된 3개의 독립적인 실험의 평균으로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 히알루론산과 상호 작용하는 보체 성분 C1q가 어떻게 인간 종양 조직으로부터 분리된 1차 세포의 거동을 조절할 수 있는지 를 조사하는 쉬운 방법을 설명합니다. HA와 C1q는 모두 생리적 및 병리학적 조건 하에서 조직 미세 환경에 풍부하게 존재하며, 여러 세포 생물학적 과정에 참여한다. 예를 들어, C1q는 태반 8 동안 모계 데시두아의 엑스트라풀루스 트로포블라스트 침공을 선호하는 태반의미세환경 내에 존재하는 것으로 나타났다. C1q는 또한 조직 재생 및 수리 에 필요한 혈관 유전 적 과정을 육성 상처 치유 피부에 증착10. 마지막으로, C1q는 몇몇 다른 종양조직에서 확인되었습니다 4. 고분자량 HA는 혈관신생 및 증식에 대한 자연적인 장벽이며, 최근의 증거에 따르면 C1q는 보체 활성화에 있어 고전적인 역할 외에 ECM 분자로서 작용할 수 있으며 세포 이동을 선호합니다.
이 작업의 신규성은 HA에 대한 C1q의 결합이 HA와 종양 세포의 상호작용을 강하게 변형한다는 것을 발견하는 것으로 구성된다. 이 메서드를 설정하려면 여러 검사점이 고려되었습니다. 우선, 우리는 충분한 양의 HA가 생체 화 HA를 사용하여 배양 및 ELISA 우물의 플라스틱에 결합되도록 했습니다. 웰의 알시안 청색 염색은 이러한 결과를 확인하였다(데이터는 도시되지 않음). 배양은 중탄산염 완충제, pH 9.6에서 하룻밤 동안 수행되었으며, 이 절차는 HA에 의한 웰의 완전한 포화를 보장한다(데이터는 도시되지 않음).
두 번째 단계는 C1q를 HA에 결합하는 것이었습니다. C1q 에서 HA의 결합은 생리적 pH(7.4)와 Ca2+의존재 하에서 수행되었다. 이러한 이유로, 우리는 이중 이온dPBS-BSA 버퍼를 사용했다. 우리는 HA에 부착된 것을 발견할 수 있는 C1q의 최적 양을 식별하고 선택하기 위해 처음에 투여량 반응 실험을 수행하였다. 우리의 복용량 응답 곡선에서 우리는 정확하게 고원에 도달하지 않았지만, 우리는 혈청에 일반적으로 존재하는 C1q의 양이 75-150 μg / mL임을 고려하여 25 μg / mL의 농도를 자유 C1q의 생리적 농도에 더 가깝게 사용했습니다. C1r 및 C1s로부터 무첨가혈청C1q가 C1 단지11의약 10%-20%인 것으로 계산되었다. C1q는 폴리아니언을 결합하는 능력으로 알려져 있으며, 전하 패턴 인식 분자및 HA는 반복 단위의 음전하 선형 중합체(β,1-4)-D-글루쿠론산-(β,1-3)--N-아세틸-D-글루코사민(12)이다. 13. 이러한 이유로, 우리는이 강력한 비 공유 상호 작용을 조사했다. 우리의 관측은 종양 세포가 C1q에 묶인 HA와 HA의 차이를 감지한다는 것을 표시했습니다. 세포는 HA 단독에 고수하는 세포에 비교되는 경우에 더 퍼지는 것처럼 보입니다. 우리는 이 효력이 수용성 C1q에 의해 매개되지 않는다는 것을 관찰했습니다, 세포 접착에 있는 이 수정은 결합의 결과로 보체 분자의 형태 변경 때문에 HA와 C1q의 상호 작용에 의존한다는 것을 나타내는.
우리는 접착 실험을 위한 종양 행동의 시험관 내 모형으로 1 차적인 세포의 사용의 중요성을 강조하고 싶습니다, 우리는 몇몇 세포주에 비교된 1 차적인 세포 사이 유착 능력에 있는 강한 다름을 주의하기 때문에, 에 도시된 것과 같이 그림 3. HA의 생물학적 특성을 평가하는 대안적이고 매우 흥미로운 모델은 HA 하이드로겔 스캐폴드의 3D 모델의 사용이다. 생물학적 분자의 혼입이 있는 이러한 스캐폴드는 생리활성 신호의 평가 및 재생의학(14)의여러 용도에 사용될 수 있다. 이 연구에서 제안하는 모델은 자극의 조합에 대한 세포 반응평가를 위한 더 쉽고 빠르며 저렴한 방법이며, 이러한 종류의 분자 메커니즘을 이해하는 첫 번째 단계로 간주될 수 있습니다. 상호 작용.
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Disclosures
저자는 연구가 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 인 관계가없는 상태에서 수행되었다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 HA, 레오나르도 아마디오, 가브리엘라 지토 (IRCCS "Burlo Garofolo", 트리에스테, 이탈리아의 부인과)와 안드레아 로마노 (해부학 및 병리학 조직학의 수술 임상 단위, 카티나라 병원, 트리에스테, 이탈리아의 제공에 대한 이반 도나티에게 감사드립니다. )을 조직 샘플 수집용으로 하였다. 우리는 비디오 준비와 알렉스 코폴라, 목소리의 도움 니콜로 모로시니도 감사합니다. 이 작품은 산모와 아동 건강 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다, IRCCS "Burlo Garofolo", 트리에스테, 이탈리아 (RC20/16) 및 폰다지오네 카사 디 리스파르미오 트리에스테 R.Bulla.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm pore filter | BD Falcon | 352360 | |
| Amphotericin B solution (fungizone) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| basic FGF | Immunological Sciences | GRF-15595 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fibronectin | Roche | 11051407001 | |
| Flask for cell culture | Corning | 430639 | Sterile, vented |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone |
| High molecular weight hyaluronic acid | Kind gift by Prof. Ivan Donati | ||
| Human endothelial serum free medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11111-044 | Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and 1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich) |
| Magnesium Chloride | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Medium 199 with Hank’s salt | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Time-lapse microscopy | Nikon | Imaging System BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
References
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