Summary
Komplement komponenten C1q er et Pro-inflammatorisk molekyle, der er stærkt udtrykt i vævs mikromiljøet, som kan interagere med den ekstracellulære matrix. Her beskriver vi en metode til at teste, hvordan C1q bundet til hyaluronsyre påvirker celle vedhæftning.
Abstract
Det er blevet mere og mere påvist, at tumormikromiljøet spiller en aktiv rolle i neoplasi vækst og metastaser. Gennem forskellige veje, kan tumorceller effektivt rekruttere stromale, immun og endotelceller ved at udskille stimulerende faktorer, chemokiner og cytokiner. Disse celler kan til gengæld ændre mikromiljøets signalerings egenskaber ved at frigive vækstfremmende signaler, metabolitter og ekstracellulære matrixkomponenter for at opretholde høj spredning og metastatisk kompetence. I denne sammenhæng, vi identificere, at komplement komponenten C1q, højt udtrykt lokalt ved en række af menneskelige Maligne tumorer, ved interaktion med den ekstracellulære matrix hyaluronsyre, stærkt påvirker adfærden af primære celler isoleret fra menneskelig tumor Prøver. Her beskriver vi en metode til at teste, hvordan C1q bundet til hyaluronsyre (HA) påvirker tumor celle vedhæftning, underliggende det faktum, at de biologiske egenskaber af centrale komponenter i den ekstracellulære matrix (i dette tilfælde HA) kan formes af bioaktive signaler mod tumor Progression.
Introduction
Tumor mikromiljø (TME) påvirker kræft udvikling og progression, da det kan give en eftergivende niche for celle overlevelse, vækst og invasion. Identifikationen af nye nøgleaktører i TME kan være nyttig for opdagelsen af nye molekylære værktøjer til Target terapi. TME omfatter et komplekst og dynamisk netværk af ikke-maligne celler, såsom endotelceller, fibroblaster og celler i immunsystemet, indlejret i den omgivende ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, herunder collagens, lamininer, fibronectiner, proteoglycaner og hyaluronans. Både tumor og ikke-tumorceller syntetisere og udskille ECM komponenter sammen med cytokiner, chemokiner, vækstfaktorer og inflammatoriske og matrix remodeling enzymer, der generelt ændre de fysiske, kemiske og signalering egenskaber af TME. Blandt disse bestanddele, hyaluronsyre (HA) er dukket op for at udøve en afgørende rolle i tumor biologi. På trods af sin enkle kemiske sammensætning, HA, sammen med sine HA-bindende molekyler (hyalvedere), kan modulerangiogenese, immunsystemet reaktionsevne og ECM remodeling i en størrelse og koncentration afhængige måde1.
Komplementsystemet (C) er også en del af den lokale TME, som for nylig har fået øget opmærksomhed. C-systemet omfatter et sæt af opløselige og membran bundne proteiner, der er involveret i den første forsvarslinje mod ikke-selv-celler, uønskede værts elementer og patogener. Funktionelt, C forbinder de to-effektor arme af medfødte og adaptive systemer til at fremme enten direkte celle drab eller montering af en inflammatorisk respons2. C aktivering kan undertrykke tumorvækst, ved at ødelægge kræftceller eller hæmme deres outgrowth, men det er blevet stadig tydeligere, at det kan besidde en tumor-fremme aktivitet ved at opretholde kronisk betændelse, fremme oprettelsen af en immunsuppressiv Milieu, inducerende angiogenese og aktivering af kræftrelaterede signalerings veje3. I denne sammenhæng, C1q, den første anerkendelse molekyle af den klassiske vej af C-systemet er dukket op til at udøve vigtige funktioner i tumoren mikromiljø uafhængigt af C aktivering4. C1q har vist sig at være udtrykt lokalt af en række af menneskelige Maligne tumorer, hvor det kan favorisere kræft celle vedhæftning, migration og spredning i tillæg til angiogenese og metastase5. Interessant C1q interagerer med en stor bestanddel af ECM som HA.
Vi udviklede en teknik til at isolere de primære kræftceller fra tumor massen. Desuden har vi skabt matrixen, som kan stimulere tumor mikromiljø, især samspillet mellem C1q og høj molekylvægt hyaluronsyre. C1q bundet til HA var i stand til at fremkalde vedhæftning af tumorceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vævsprøver fra patienter blev indsamlet efter informeret samtykke efter godkendelse af de etiske overvejelser i det institutionelle Råd på universitetshospitalet i Trieste, Italien.
1. tumor celle isolation og kultur (dag 1)
- Isoler humane Mesotheliom celler fra MPM solide prøver. Vævet skal finjusteres med en fræser for at opnå fragmenter på ca. 2-3 mm2 i størrelse og inkube i 5 ml fordøjelsesvæske, der er sammensat af Hanks ' balanceret salt opløsning (HBSS) suppleret med 0,5 mm ca.2 +/mg2 +, 0,5% trypsin og 50 μg/ml DNase I, natten over ved 4 °C.
- Tumor celle isolation og kultur (dag 2)
- Efter en dag med inkubation anbringes det fordøjet i 30 min i en 37 °C-kuvøse med blid omrystning.
- Nedbrydnings opløsningen udskiftes ved centrifugering (250 x g) med 3 mg/ml kollagenasetype 1 opløst i 5 mL medium 199 med HBSS, og der inkurustes yderligere i 30 minutter ved 37 °c med blid rystning.
- Bloker den enzymatiske reaktion ved tilsætning af 10% varme inaktiveret føtal kvægserum (FBS). Cellerne resuspenderes meget forsigtigt med en 5 mL pipet for at sikre, at de fleste af cellerne frigives fra vævet. Filtrer derefter cellesuspensionen gennem et 100 μm pore filter.
- Frø cellerne i en 12,5 cm2 kolbe og kultur dem ved 37 °c med humane endotheliale celler serum-fri medium (hesf), med 10% FBS og suppleret med EGF (10 ng/ml), grundlæggende FGF (20 ng/ml), og 1% penicillin-streptomycin.
Bemærk: Udskift med frisk medium hver 2-3 dage.
2. HA belægning (dag 1)
- Høj molekylvægt HA (1,5 kDa) resuspenderes i dobbeltdestilleret vand ved en koncentration på 1 mg/mL6.
- Der fortyndes HA stamopløsning til 50 μg/mL i karbonat/bicarbonat buffer (0,1 M, pH 9,6) med blid pipettering.
- Coat 96-brønd pladen med 100 μL fortyndet HA stamopløsning pr. brønd natten over ved 4 °C.
Bemærk: hyaluronsyre var en venlig gave fra professor Ivan Donati, Institut for biovidenskab, universitetet i Trieste7.
3. C1q belægning (dag 2)
- Efter overnattende inkubation aspireret vakuum til de behandlede brønde og vask 96-brønd pladen med 100 μL af Dulbecco's PBS (dPBS) pr. brønd.
- Tillad C1q (25 μg/mL eller forskellige koncentrationer for dosisrespons eksperimenter) eller BSA (som en negativ kontrol) at binde til plastisk immobiliseret-HA ved at inkuere disse proteiner i en koncentration på 25 μg/mL i 100 μL dPBS + 0,5% BSA og 0,7 mM ca2 +/mg2 + . Derefter inkueres natten over ved 4 °C.
- Vakuum Aspirer brøndene og vask 96-brønd pladen med 100 μL/brønd af dPBS.
4. celle mærkning med FAST DiI
- Resuspender 1 x 105 tumorceller i 500 ΜL af dpbs indeholdende 10 μg/ml af det fluorescerende farvestof fast DiI. Der inkurueres i 15 min ved 37 °C i en 5% v/v CO2 -inkubator til mærkning, der blandes manuelt efter 5 minutters intervaller.
- For at fjerne overskydende fast DiI, tilsættes 10 ml dpbs, pipette forsigtigt op og ned, og centrifugeres ved 250 x g i 7 min. opslæb celle pillen i 1 ml humant endotel serumfrit medium indeholdende 0,1% BSA (hesf + 0,1% BSA).
5. Cell vedhæftning på HA/C1q matricer (dag 1)
- Vakuum Aspirer de brønde, der er belagt med de forskellige matrixer (brønde blev overtrukket i trin 3,2).
- Der fordeles 100 μL af den mærkede cellesuspension til de coatede brønde, og pladen inkupereres i 35 min ved 37 °C i 5% v/v CO2 -inkubator.
- Fjern de ikke-klæbende celler ved at aspirere supernatanten. Vask en gang med dPBS, der indeholder 0,5% BSA, 0,7 mM ca2 + og 0,7 mm mg2 +.
- De klæbende celler lyses ved at tilsætte 200 μL/brønd af 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 + 0,1% v/v SDS og straks læse 96-brønd pladen med en fluorescens læser (544 nm, emission 590 nm) ved hjælp af en kalibreringskurve, der genereres ved lysis af et stigende antal mærkede Celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HA er et negativt ladet polysaccharid med høj molekylvægt, som består af gentagne (β, 1-4)-D-glucuronsyre-(β, 1-3)-N-acetyl-l-glucosamin disaccharid enheder (figur 1b)7. Forekomsten af binding af HA på 96-brønd pladen samt effektiviteten af dens immobilisering blev testet ved at drage fordel af biotinylated HA (Bio-HA). Forskellige koncentrationer af bio-HA, der spænder fra 10 μg/mL til 1 mg/mL, blev resuspenderet i 100 mM karbonat/bicarbonat-buffer pH 9,6 og inkuerede natten ved 4 °C.
Efter omfattende skylninger blev bio-HA bundet til 96-Wells plade detekteret ved hjælp af streptavidin konjugeret til alkalisk fosfatase, mens tilstedeværelsen af streptavidin blev kvantificeret ved hjælp af pNPP (1 mg/mL) som substrat. Læsningen blev udført ved bølgelængden på 405 nm ved hjælp af en ELISA-læser. Bio-HA var i stand til at binde til en 96-brønd plade i en dosisrespons måde (data ikke vist); 50 μg/mL blev valgt som et mætnings plateau og blev derfor anvendt i vores assays.
Vores tidligere data viste, at C1q er i stand til at binde til en bred vifte af Target ligander lokaliseret i ECM8. Denne binding er særlig stærk med HA9. Brøndene på en mikrotiterplade blev belagt med 50 μg/mL HMW-HA og inkuperet med stigende koncentration af C1q. bundet C1q blev visualiseret ved inkubation med anti-C1q polyklonale antistoffer. C1q er i stand til at binde til høj molekylvægt HA i en dosisafhængig måde (figur 1a), der når den maksimale bindingsgrad ved koncentrationen på 50 μg/ml. Efter at have fastslået, at C1q kan binde til HA, vi undersøgt konsekvenserne af denne interaktion i at ændre signalering egenskaber af ECM og deres konsekvenser i tumor udvikling. Til dette formål etablerede vi en protokol til isolerede tumorceller fra bioptiske prøver fra de berørte patienter. Primære tumorceller blev isoleret fra vævs biopsi, som opsummeret i figur 2. Evnen af tumorceller til at interagere med C1q blev evalueret ved at udføre en celle vedhæftning assay ved hjælp af forskellige matrix kombinationer, som vist i figur 3. Tumor celler blev plettet med fluorescerende sonde FAST DiI og seedede på immobiliseret HA, HA bundet til C1q eller BSA (anvendes som en negativ kontrol), for 35 min. Hvis sammenlignet med HA, belægningen med HA-Bound-C1q var i stand til at øge mængden af vedhængende primære celler, men er ikke i stand til at stimulere vedhæftning af tumorcellelinjer, som vi testede, som vist i den repræsentative graf i figur 3.
Figur 1 . Interaktion af C1q med hyaluronsyre. A) binding af C1Q på HMW ha på en dosisafhængig måde. Dataene udtrykkes som gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter i triplicat ± S.E.M. (B) skematisk repræsentation af C1q molekyle og af den rekombinante enkelt kæde kugleformet region. C1q er samlet fra tre polypeptidkæder (a, B, C): hver indeholder en N-terminal kollagen-lignende sekvens og en C-Terminal kugleformet gC1q hoved. C) kemisk formel af hyaluronsyre, en meget polymeriseret kæde af glucuronsyre og N-acetylglucosamin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Resumé ordning af isolation og morfologi af tumorceller. Tumor celler blev isoleret fra pleural biopsiprøver. Cellerne blev seedet i en 12,5 cm2 kolbe og kultiveret i humant Endothelial celle serum frit medium + 10% FBS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Effekt af C1q på tumorceller vedhæftning. Tumor celler (MES) eller primær Mesotheliom cellelinje (msto-211h) blev seedet til mikrotiter brønde præ-belagt med hyaluronsyre (ha), ha bundet til C1q eller til bovin serumalbumin (BSA). I den øvre del af figuren, den morfologiske aspekt af en repræsentativ primær cellelinje overholdt HA, HA bundet til C1q eller BSA blev vist. Billeder blev anskaffet via fasekontrast mikroskop, original forstørrelse: 200x. FAST DiI mærket primære Mesotheliom celler eller en Mesotheliom cellelinje (msto-211h) fik lov til at overholde mikrotiter brønde præ-belagt med ha, ha bundet til C1q eller BSA. Dataene udtrykkes som gennemsnit af tre uafhængige eksperimenter udført i triplicater ± S.E.M. * p < 0,01 vs HA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en nem metode til at undersøge, hvordan komplement komponenten C1q, interagere med hyaluronsyre, er i stand til at moduere opførsel af primærceller isoleret fra humant tumor væv. Både HA og C1q er rigeligt til stede i vævet mikromiljø både under fysiologiske og patologiske betingelser, der deltager i flere celle biologiske processer. For eksempel har C1q vist sig at være til stede i mikromiljøet af placenta, hvor det favoriserer ekstrvillous trofoblast invasion af moderen lærk under placentation8. C1q er også deponeret i sårheling hud, hvor det fremmer den angiogenetiske proces, der kræves til vævsregenerering og reparation10. Endelig, C1q er blevet identificeret i flere forskellige tumor væv4. Høj molekylvægt HA er en naturlig barriere for angiogenese og proliferation og nylige beviser viste, at C1q, ud over sin klassiske rolle i komplementaktivering, er i stand til at fungere som et ECM molekyle, favoriserer celle migration.
Det nye ved dette arbejde består i konstateringen af, at bindingen af C1q til HA stærkt ændre samspillet mellem tumorceller med HA. For at oprette denne metode er der blevet taget hensyn til flere kontrolpunkter. Først og fremmest sørgede vi for, at en tilstrækkelig mængde HA var bundet til plastik af kultur og ELISA brønde ved hjælp af biotinylated HA. Den Alkiske blå farvning af brøndene bekræftede disse resultater (data ikke vist). Inkubationen er blevet udført natten over i bikarbonat buffer, pH 9,6, og denne procedure sikrer fuldstændig mætning af brøndene ved HA (data ikke vist).
Det andet trin var at binde C1q til HA. Bindingen af C1q til HA er udført ved en fysiologisk pH (7,4) og ved tilstedeværelse af ca2 +. Af denne grund brugte vi en dPBS-BSA buffer med bivalente ioner. Vi har i første omgang udført en dosisrespons eksperiment for at identificere og vælge den optimale mængde af C1q, der kan findes knyttet til HA. Selv i vores dosis-respons kurve vi ikke nåede præcis plateauet, vi brugte koncentrationen af 25 μg/mL at være tættere på den fysiologiske koncentration af frie C1q, i betragtning af, at mængden af C1q normalt til stede i serum er 75-150 μg/mL. Det er blevet beregnet, at serum C1q fri for C1r og C1s er omkring 10%-20% af C1-komplekset11. C1q er kendt for sin evne til at binde polyanioner, det er blevet defineret som en ladning mønster anerkendelse molekyle og HA er en negativt ladet lineær polymer af gentagne enheder af (β, 1-4)-D-glucuronsyre-(β, 1-3)-N-acetyl-D-glucosamin12, 13. af denne grund, vi undersøgt denne stærke ikke-kovalente interaktion. Vores observationer indikerede, at tumorceller fornemmer forskellen mellem HA og HA bundet til C1q. Cellerne synes at være mere spredt ud, hvis sammenlignet med cellen klæber til HA alene. Vi bemærkede, at denne effekt ikke er medieret af opløselige C1q, hvilket indikerer, at denne ændring i celle vedhæftning er afhængig af samspillet mellem C1q med HA, sandsynligvis på grund af en konformationel ændring af komplement molekylet som følge af bindingen.
Vi ønsker at understrege vigtigheden af brugen af primære celler som in vitro-modeller af tumor adfærd for vedhæftning eksperimenter, da vi bemærker en stærk forskel i vedhæftningsevne mellem primære celler i forhold til flere cellelinjer, som vist i Figur 3. En alternativ og meget interessant model til at vurdere de biologiske egenskaber af HA er brugen af 3D-modeller af HA hydrogel stillads. Dette stillads med inkorporering af biologiske molekyler kan anvendes til evaluering af bioaktive signaler og til flere anvendelser i det total lægemiddel14. Den model, som vi foreslår i denne undersøgelse er en lettere, hurtigere og billigere metode til evaluering af cellulære reaktioner på en kombination af stimuli, og det kan betragtes som et første skridt for forståelsen af de molekylære mekanismer, der er involveret i denne form for Interaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle relationer, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Ivan Donati for levering af HA, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (Department of Gynaecology af IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italien) og Andrea Romano (operative kliniske enhed for anatomi og patologisk histologi, Cattinara Hospital, Trieste, Italien ) til indsamling af vævsprøver. Vi takker også Nicolò Morosini for hjælp i video forberedelse og Alex Coppola, stemmen. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Instituttet for mødres og børns sundhed, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italien (RC20/16) og Fondazione Cassa di Risparmio Trieste til R. Bulla.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm pore filter | BD Falcon | 352360 | |
| Amphotericin B solution (fungizone) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| basic FGF | Immunological Sciences | GRF-15595 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fibronectin | Roche | 11051407001 | |
| Flask for cell culture | Corning | 430639 | Sterile, vented |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone |
| High molecular weight hyaluronic acid | Kind gift by Prof. Ivan Donati | ||
| Human endothelial serum free medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11111-044 | Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and 1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich) |
| Magnesium Chloride | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Medium 199 with Hank’s salt | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Time-lapse microscopy | Nikon | Imaging System BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
References
- Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
- Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
- Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346 (2016).
- Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23 (2015).
- Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
- Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
- Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
- Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559 (2017).
- Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
- Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38 (2012).
- Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
- Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
- Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).
