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Immunology and Infection

सेल आडंशन को बढ़ावा देने में पूरक प्रोटीन C1Q और Hyaluronic एसिड के बीच परस्पर क्रिया का मूल्यांकन

Published: June 15, 2019 doi: 10.3791/58688
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 2, 3, 3, 2,3, 1
1Department of Life Sciences, University of Trieste, 2Institute for Maternal and Child Health, IRCCS (Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico) Burlo Garofolo, 3Department of Medical, Surgical and Health Science, University of Trieste
* These authors contributed equally

Summary

पूरक घटक C1Q एक समर्थक भड़काऊ अणु अत्यधिक ऊतक microenvironment कि extracellular मैट्रिक्स के साथ बातचीत कर सकते हैं में व्यक्त की है. यहाँ, हम एक विधि का परीक्षण करने के लिए कैसे C1Q hyaluronic एसिड के लिए बाध्य सेल आसंजन प्रभावों का वर्णन.

Abstract

यह तेजी से प्रदर्शन किया गया है कि ट्यूमर microenvironment neoplasia विकास और मेटास्टेसिस में एक सक्रिय भूमिका निभाता है. विभिन्न रास्ते के माध्यम से, ट्यूमर कोशिकाओं कुशलतापूर्वक stimulatory कारकों, chemokines और cytokines स्रावित द्वारा stromal, प्रतिरक्षा और endothelial कोशिकाओं की भर्ती कर सकते हैं. बदले में, इन कोशिकाओं के विकास को बढ़ावा देने के संकेतों को रिहा करके microenvironment के संकेत गुणों को बदल सकते हैं, चयापचयों और extracellular मैट्रिक्स घटकों उच्च प्रसार और metastatic क्षमता को बनाए रखने के लिए. इस संदर्भ में, हम की पहचान है कि पूरक घटक C1Q, अत्यधिक मानव घातक ट्यूमर की एक श्रृंखला द्वारा स्थानीय रूप से व्यक्त की, extracellular मैट्रिक्स hyaluronic एसिड के साथ बातचीत पर, दृढ़ता से मानव ट्यूमर से अलग प्राथमिक कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित करता है नमूनों. यहाँ, हम परीक्षण करने के लिए एक विधि का वर्णन कैसे C1Q hyaluronic एसिड के लिए बाध्य (एचए) ट्यूमर सेल आसंजन को प्रभावित करता है, तथ्य यह है कि extracellular मैट्रिक्स के प्रमुख घटकों के जैविक गुणों अंतर्निहित (इस मामले में हा) ट्यूमर की ओर bioactive संकेतों द्वारा आकार दिया जा सकता है प्रगति.

Introduction

ट्यूमर microenvironment (TME) कैंसर के विकास और प्रगति को प्रभावित करता है क्योंकि यह सेल अस्तित्व, विकास और आक्रमण के लिए एक स्वीकार्य आला प्रदान कर सकते हैं. TME में नए प्रमुख खिलाड़ियों की पहचान लक्ष्य चिकित्सा के लिए नए आणविक उपकरणों की खोज के लिए उपयोगी हो सकता है. TME इस तरह के endothelial कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स और प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं के रूप में गैर घातक कोशिकाओं का एक जटिल और गतिशील नेटवर्क भी शामिल है, कोलेजन सहित आसपास के extracellular मैट्रिक्स (ECM) घटकों में एम्बेडेड, laminins, फाइब्रॉनेक्क्टिन, प्रोटीग्लाइकन और हायलुरोनन्स। ट्यूमर और गैर-ट्यूमर कोशिकाओं दोनों सिंथेसाइज़ और साइटोकिन्स, chemokines, विकास कारकों और भड़काऊ और मैट्रिक्स remodeling एंजाइमों कि समग्र TME के भौतिक, रासायनिक और संकेतन गुणों को बदलने के साथ साथ ECM घटकों स्रावित. इन घटकों में, hyaluronic एसिड (एचए) ट्यूमर जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका लागू करने के लिए उभरा है. अपनी सरल रासायनिक संरचना के बावजूद, हा, एक साथ अपने हा बाध्यकारी अणुओं (hyaladherins) के साथ, angiogenesis,प्रतिरक्षा प्रणाली जवाबदेही और ECM एक आकार और एकाग्रता निर्भर तरीके से remodeling 1 में modulate कर सकते हैं.

पूरक (सी) प्रणाली भी स्थानीय TME, जो हाल ही में बढ़ती ध्यान प्राप्त हुआ है का हिस्सा है. सी प्रणाली में गैर-स्व-कोशिकाओं, अवांछित मेजबान तत्वों और रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति में शामिल घुलनशील और झिल्ली से बंधे प्रोटीन का एक सेट शामिल है। कार्यात्मक, सी या तो प्रत्यक्ष सेल हत्या या एक भड़काऊ प्रतिक्रिया2के बढ़ते को बढ़ावा देने के लिए सहज और अनुकूली प्रणालियों के दो प्रभावक हथियार लिंक. सी सक्रियण ट्यूमर के विकास को दबा सकते हैं, कैंसर की कोशिकाओं को नष्ट करने या उनके विकास को बाधित करके, लेकिन यह तेजी से स्पष्ट हो गया है कि यह पुरानी सूजन को बनाए रखने के द्वारा एक ट्यूमर को बढ़ावा देने गतिविधि के अधिकारी कर सकते हैं, एक की स्थापना को बढ़ावा देने इम्यूनोसप्रेसिव वातावरण, एंजियोजेनेसिस को प्रेरित करना, और कैंसर से संबंधित संकेतन पथ3को सक्रिय करना। इस संदर्भ में, सी प्रणाली के शास्त्रीय मार्ग की पहली मान्यता अणु सी 1क्यू, सी सक्रियण4से स्वतंत्र रूप से ट्यूमर microenvironment में महत्वपूर्ण कार्यों को लागू करने के लिए उभरा है। C1Q मानव घातक ट्यूमर की एक श्रृंखला है, जहां यह कैंसर सेल आसंजन, प्रवास और एंजियोजेनेसिस और मेटास्टेसिस5के अलावा प्रसार के पक्ष में कर सकते हैं द्वारा स्थानीय रूप से व्यक्त किया जा करने के लिए दिखाया गया है। दिलचस्प C1Q ऐसे हा के रूप में ECM के एक प्रमुख घटक के साथ सूचना का आदान-पास.

हम ट्यूमर द्रव्यमान से प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक तकनीक विकसित की है। इसके अलावा, हम मैट्रिक्स बनाया है, जो ट्यूमर microenvironment को प्रोत्साहित कर सकते हैं, विशेष रूप से C1Q और उच्च आणविक वजन hyaluronic एसिड के बीच बातचीत. सी 1क्यू एचए के लिए बाध्य ट्यूमर कोशिकाओं के आसंजन को प्रेरित करने में सक्षम था।

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Protocol

ट्रायस्टे, इटली के विश्वविद्यालय अस्पताल के संस्थागत बोर्ड द्वारा नैतिक विचारों के अनुमोदन के बाद सूचित सहमति के बाद रोगियों से ऊतक के नमूने एकत्र किए गए थे।

1. ट्यूमर सेल अलगाव और संस्कृति (दिन 1)

  1. MPM ठोस नमूनों से मानव mesothelioma कोशिकाओं को अलग करें. ठीक से एक कटर के साथ ऊतक कीमा आकार में लगभग 2-3 मिमी2 के टुकड़े प्राप्त करने के लिए और पाचन समाधान के 5 एमएलमें इनक्यूबेट के हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान (HBSS) 0.5 मिमी Ca2 +के साथ पूरक / DNase मैं, रात 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर.
  2. ट्यूमर सेल अलगाव और संस्कृति (दिन 2)
    1. रात भर ऊष्मायन के बाद, 30 मिनट के लिए पचते ऊतक को कोमल मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
    2. अपकेंद्रण (250 x ग्राम) पर पाचन समाधान को 3 मिलीग्राम/एमएल कोलैजानेस प्रकार 1 के साथ बदलें जो मध्यम 199 के 5 एमएल में भंग हो गया है और आगे 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोमल मिलाते हुए।
    3. 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) जोड़कर एंजाइमी प्रतिक्रिया ब्लॉक. यह सुनिश्चित करने के लिए कि अधिकांश कोशिकाएं ऊतक से मुक्त हों, 5 एमएल पाइप के साथ कोशिकाओं को बहुत सावधानी से पुन: निलंबित करें। फिर, एक 100 डिग्री मीटर के छिद्र फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें।
    4. एक 12.5 सेमी2 फ्लास्क में कोशिकाओं बीज और उन्हें मानव endothelial कोशिकाओं सीरम मुक्त माध्यम (HESF) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति, 10% FBS के साथ और EGF के साथ पूरक (10 एनजी /
      नोट: ताजा माध्यम के साथ बदलें हर 2-3 दिन.

2. हा कोटिंग (दिन 1)

  1. उच्च आण्विक भार हा (1.5 केडीए) को डबल आसुत जल में 1 मिलीग्राम/एमएल6की सांद्रता में पुन: स्थापित करें।
  2. डिल्यूट हा स्टॉक समाधान तो 50 g/एमएल कार्बोनेट/बाइकार्बोनेट बफर (0.1 एम, पीएच 9.6) के साथ कोमल पाइपिंग के साथ।
  3. 96-वेल प्लेट को 100 डिग्री सेल्सियस के साथ कोट करें जो कि रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रति पतला हा स्टॉक समाधान है।
    नोट: Hyaluronic एसिड प्रोफेसर इवान Donati, जीवन विज्ञान विभाग, Trieste7विश्वविद्यालय से एक तरह का उपहार था.

3. C1Q कोटिंग (दिन 2)

  1. रात भर ऊष्मायन के बाद, इलाज किए गए कुओं को वैक्यूम करें और 96-वेल प्लेट को 100 डिग्री के साथ धो लें Dulbecco के पीबीएस (डीपीबीएस) प्रति अच्छी तरह से।
  2. सी1क्यू (25 ग्राम/एमएल या खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों के लिए विभिन्न सांद्रता) या बीएसए (एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में) को इन प्रोटीनों को 100 डिग्री सेल्सियस में 25 ग्राम/एमएल की सांद्रता में इन प्रोटीनों को इनक्यूबेट करके प्लास्टिक immobilized-HA को बाइंड करने की अनुमति दें + 0.5% बीएसए और 0.7 एमएम Ca2+/ . फिर रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. वैक्यूम कुओं को प्रेरित करें और 96-वेल प्लेट को 100 डिग्री सेल्सियस/

4. फास्ट DiI के साथ सेल लेबलिंग

  1. 500 डिग्री सेल्सियस में 1 x 105 ट्यूमर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें जिसमें फ्लोरोसेंट डाई फास्ट डिआई के 10 डिग्री/ लेबलिंग के लिए 5% v/v CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट, 5 मिनट के अंतराल के बाद मैन्युअल रूप से मिश्रण।
    1. अतिरिक्त फास्ट DiI को दूर करने के लिए, 10 एमएल डीपीबीएस, पिपेट धीरे ऊपर और नीचे जोड़ें, और 250 x ग्राम पर 7 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। सेल पेलेट को मानव एंडोथेलियल सीरम मुक्त माध्यम के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें जिसमें 0.1% बीएसए (एचईएसएफ + 0.1% बीएसए) शामिल हैं।

5. एचए/सी1क्यू मैट्रिक्स पर सेल आडंशन (दिन 1)

  1. वैक्यूम विभिन्न मैट्रिक्स के साथ लेपित कुओं aspirate (वेल्स चरण 3.2 में लेपित थे).
  2. लेपित कुओं को लेबल किए गए सेल निलंबन के 100 डिग्री एल वितरित करें और प्लेट को 35 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में 5% v/v CO2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  3. सुपरनेंट को प्रेरित करके गैर-अनुकूल कोशिकाओं को निकालें। 0.5% बीएसए, 0.7 एमएम सीए2 + और 0.7 एमएम एमजी2 +युक्त डी पी बीएसबी के साथ एक बार धो लें।
  4. 10 एमएम ट्रास-एचसीएल, पीएच 7.4 + 0.1% v/v SDS के 200 $L/well जोड़कर अनुलग्न कोशिकाओं को Lyse करें और तुरंत एक फ्लोरोसेंट रीडर (544 एनएम, उत्सर्जन 590 एनएम) के साथ 96-वेल प्लेट पढ़ें लेबल की बढ़ती हुई वक्र के माध्यम से उत्पन्न अंशांकन वक्र का उपयोग कर कक्षों.

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Representative Results

हा एक नकारात्मक आरोप लगाया उच्च आणविक वजन polysaccharide है, जो दोहराने से बना है (जेड, 1-4)-डी-ग्लूकुरोनिक एसिड-(जेड, 1-3)-N-acetyl-D-glucosamine disaccharide इकाइयों (चित्र 1B)7. 96-वेल प्लेट पर एचए की बाइंडिंग की घटना के साथ-साथ इसके स्थिरीकरण की दक्षता का परीक्षण बायोटिनलेटिड हा (बायो-एचए) का लाभ उठाते हुए किया गया था। जैव-एचए की विभिन्न सांद्रता, 10 ग्राम/एमएल से लेकर 1 मिलीग्राम/एमएल तक, 100 एम एम कार्बोनेट/बाइकार्बोनेट-बफर पीएच 9.6 में पुन: निलंबित कर दी गई थी और रात को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था।

व्यापक washes के बाद, जैव-एचए 96-वेल्स प्लेट करने के लिए बाध्य क्षारीय फॉस्फेटके के लिए संयुग्मी का उपयोग कर पाया गया था, जबकि स्ट्रेप्टाविडिन की उपस्थिति एक सब्सट्रेट के रूप में पीपीपी (1 मिलीग्राम/एमएल) का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई थी। पढ़ने के 405 एनएम की तरंगदैर्ध्य में एक ELISA पाठक का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था. जैव-HA एक खुराक प्रतिक्रिया तरीके से एक 96-वेल प्लेट के लिए बाध्य करने में सक्षम था (डेटा नहीं दिखाया गया); 50 ग्राम/एमएल एक संतृप्ति पठार के रूप में चुना गया था और इसलिए हमारे परख में इस्तेमाल किया.

हमारे पिछले आंकड़ों से पता चलता है कि C1Q लक्ष्य ligands की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए बाध्य करने में सक्षम है ECM8में स्थानीयकृत . यह बंधन विशेष रूप से एचए9के साथ मजबूत है . माइक्रोटिटर प्लेट के कुओं को 50 ग्राम/एमएल एचएमडब्ल्यू-एचए के साथ लेपित किया गया था और सी1क्यू की बढ़ती एकाग्रता के साथ इनक्यूटेड किया गया था। बाउंड सी1क्यू को एंटी-सी1क्यू पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन पर कल्पना की गई थी। C1Q उच्च आण्विक भार के लिए एक खुराक निर्भर तरीके से हा बाँध करने में सक्षम है (चित्र 1A), 50g/mL की सांद्रता में बंधन के अधिकतम स्तर तक पहुँचने. स्थापित करने के बाद कि C1Q हा करने के लिए बाध्य कर सकते हैं, हम ECM के संकेत गुण और ट्यूमर के विकास में उनके प्रभाव को संशोधित करने में इस बातचीत के निहितार्थ की जांच की. इस उद्देश्य के लिए, हम प्रभावित रोगियों से प्राप्त bioptic नमूनों से ट्यूमर कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की। प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं ऊतक बायोप्सी से अलग थे, के रूप में चित्र 2में संक्षेप. सी1क्यू के साथ बातचीत करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता का मूल्यांकन विभिन्न मैट्रिक्स संयोजनों का उपयोग करके सेल आसंजन परख करके किया गया था, जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है। ट्यूमर कोशिकाओं फ्लोरोसेंट जांच फास्ट DiI के साथ दाग रहे थे और स्थिर हा पर बीज, हा C1Q करने के लिए या बीएसए के लिए बाध्य (एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया), 35 मिनट के लिए. यदि HA की तुलना में, HA-बाउंड-C1Q के साथ कोटिंग प्राथमिक कोशिकाओं का पता लगाने की मात्रा में वृद्धि करने में सक्षम था, लेकिन ट्यूमर सेल लाइनों है कि हम परीक्षण के आसंजन को प्रोत्साहित करने में सक्षम नहीं है, के रूप में चित्र 3में प्रतिनिधि ग्राफ में दिखाया गया है.

Figure 1
चित्र 1 . hyaluronic एसिड के साथ C1Q की बातचीत. (ए) एक खुराक निर्भर तरीके से एचएमडब्ल्यू एचए पर C1Q का बंधन। ये आंकड़े तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य के रूप में व्यक्त किए जाते हैं - एस.ई.एम. (ठ) सी1क्यू अणु के योजनाबद्ध निरूपण तथा पुनः संयोजक एकल शृंखला गोलाकार क्षेत्र के। C1Q तीन पॉलीपेप्टाइड चेन(ए, बी,सी) से इकट्ठा किया जाता है: प्रत्येक जिसमें एन-टर्मिनल कोलेजन की तरह अनुक्रम और एक सी-टर्मिनल ग्लोबुलर जीसी 1क्यू सिर होता है। (ग) हायलूरोनिक अम्ल का रासायनिक सूत्र, ग्लूकुरोनिक अम्ल की अत्यधिक बहुलक श्रृंखला तथा एन-ऐसीटिलग्लूकोसामाइन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . ट्यूमर कोशिकाओं के अलगाव और आकृति विज्ञान की सारांश योजना। ट्यूमर कोशिकाओं फुफ्फुस बायोप्सी नमूनों से अलग किया गया. कोशिकाओं को एक 12.5 सेमी2 फ्लास्क में वरीयता प्राप्त और मानव Endothelial सेल सीरम फ्री मीडियम + 10% FBS में सुसंस्कृत थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 3
चित्र 3 . ट्यूमर कोशिकाओं आसंजन पर C1Q का प्रभाव. ट्यूमर कोशिकाओं (एमईएस) या प्राथमिक mesothelioma सेल लाइन (MSTO-211H) microtiter कुओं के लिए बीज थे hyaluronic एसिड (HA) के साथ पूर्व लेपित, हा C1Q करने के लिए बाध्य या गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA). आंकड़ा के ऊपरी भाग में, एक प्रतिनिधि प्राथमिक सेल लाइन के रूपात्मक पहलू हा का पालन किया, हा C1Q करने के लिए बाध्य या बीएसए को दिखाया गया था. छवियाँ चरण विपरीत माइक्रोस्कोप, मूल आवर्धन: 200x के माध्यम से प्राप्त किए गए थे. फास्ट DiI लेबल प्राथमिक mesothelioma कोशिकाओं या एक mesothelioma सेल लाइन (MSTO-211H) microtiter कुओं के साथ पूर्व लेपित का पालन करने की अनुमति दी गई थी हा, हा C1Q या बीएसए के लिए बाध्य. डेटा तीन स्वतंत्र तीन स्वतंत्र प्रयोग के मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं triples में किया - S.E.M. * p और lt; 0.01 बनाम हा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हम कैसे पूरक घटक C1Q की जांच करने के लिए एक आसान विधि का वर्णन, hyaluronic एसिड के साथ बातचीत, मानव ट्यूमर ऊतकों से अलग प्राथमिक कोशिकाओं के व्यवहार को व्यवस्थित करने में सक्षम है. दोनों HA और C1Q प्रचुर मात्रा में शारीरिक और रोग की स्थिति के तहत ऊतक microenvironment में मौजूद हैं, कई सेल जैविक प्रक्रियाओं के लिए भाग लेने. उदाहरण के लिए, सी 1क्यू को प्लेसेंटा के सूक्ष्म पर्यावरण में उपस्थित दिखाया गया है जहां यह प्लेसेंटेशन8के दौरान मातृ डेसीडुआ के असाधारण ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण के पक्ष में है। C1Q भी घाव चिकित्सा त्वचा में जमा है, जहां यह ऊतक पुनर्जनन और मरम्मत10के लिए आवश्यक angiogenetic प्रक्रिया को बढ़ावा . अंत में, C1Q कई अलग अलग ट्यूमर ऊतकोंमेंपहचान की गई है 4. उच्च आणविक वजन हा एंजियोजेनेसिस और प्रसार के लिए एक प्राकृतिक बाधा है और हाल ही में सबूत से पता चला कि C1Q, पूरक सक्रियण में अपनी शास्त्रीय भूमिका के अलावा, एक ECM अणु के रूप में कार्य करने में सक्षम है, सेल प्रवास के पक्ष में.

इस काम की नवीनता को खोजने में शामिल है कि C1Q के बंधन HA करने के लिए दृढ़ता से हा के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की बातचीत को संशोधित. इस विधि को स्थापित करने के लिए कई चौकियों पर विचार किया गया है। सबसे पहले, हमने यह सुनिश्चित किया कि हा की पर्याप्त मात्रा जैव-किशोरी का उपयोग करके संस्कृति और एलिसा कुओं के प्लास्टिक से बंधी हुई है। कुओं के Alcian नीले धुंधला इन परिणामों की पुष्टि की (डेटा नहीं दिखाया). ऊष्मायन बाइकार्बोनेट बफर, पीएच 9.6 में रात भर किया गया है, और इस प्रक्रिया को सुनिश्चित करने के लिए एचए द्वारा कुओं की पूरी संतृप्ति (डेटा नहीं दिखाया गया है)।

दूसरा कदम C1Q HA करने के लिए बाध्य करने के लिए किया गया था। C1Q की बाइंडिंग को एचए के लिए एक शारीरिक पीएच (7.4) और Ca2 +की उपस्थिति में किया गया है। इस कारण से, हमने द्विसंयोजक आयनों के साथ एक डी पी बी एस-बीएसए बफर का उपयोग किया। हम शुरू में एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग किया क्रम में पहचान करने के लिए और C1Q है कि HA से जुड़ी पाया जा सकता है की इष्टतम राशि का चयन. यद्यपि हमारी खुराक-प्रतिक्रिया वक्र में हम बिल्कुल पठार तक नहीं पहुँच पाए, हमने मुक्त C1Q की शारीरिक सांद्रता के करीब होने के लिए 25 g/mL की सांद्रता का उपयोग किया, यह देखते हुए कि सीरम में सामान्य रूप से मौजूद C1Q की मात्रा 75-150 g/mL है। यह गणना की गई है कि सीरम C1Q C1r और C1s से मुक्त के बारे में है 10%-20% C1 जटिल11. C1Q polyanions बाध्य करने की क्षमता के लिए जाना जाता है, यह एक आरोप पैटर्न मान्यता अणु के रूप में परिभाषित किया गया है और हा की दोहरा इकाइयों के एक नकारात्मक आरोप रैखिक बहुलक है ($,1-4)-D-glucuronic एसिड-जेड,1-3)-N-acetyl-D-glucosamine12, 13इस कारण से, हमने इस प्रबल गैर-सहसंयोजक अन्योन्यक्रिया की जांच की। हमारी टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि ट्यूमर कोशिकाओं को एचए और हा के बीच अंतर को सी1क्यू तक ही आगया है। अकेले HA का उपयोग करने वाले सेल की तुलना में कोशिकाएं अधिक प्रसार-आउट प्रतीत होती हैं। हमने देखा कि यह प्रभाव घुलनशील C1Q द्वारा मध्यस्थता नहीं है, यह दर्शाता है कि सेल आसंजन में यह संशोधन एचए के साथ C1Q की बातचीत पर निर्भर करता है, शायद बाइंडिंग के परिणामस्वरूप पूरक अणु के एक अनुरूप परिवर्तन के कारण।

हम आसंजन प्रयोगों के लिए ट्यूमर व्यवहार के इन विट्रो मॉडल के रूप में प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग के महत्व पर जोर देना चाहते हैं, क्योंकि हम कई सेल लाइनों की तुलना में प्राथमिक कोशिकाओं के बीच आसंजन क्षमता में एक मजबूत अंतर नोटिस, जैसा कि में दिखाया गया है चित्र 3| एक वैकल्पिक और बहुत ही दिलचस्प मॉडल हा के जैविक गुणों का मूल्यांकन करने के लिए हा hydrogel पाड़ के 3 डी मॉडल का उपयोग है. जैविक अणुओं के समावेश के साथ इस पाड़ जैव सक्रिय संकेतों के मूल्यांकन के लिए और पुनर्योजी चिकित्सा में कई अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकताहै 14. मॉडल है कि हम इस अध्ययन में प्रस्ताव उत्तेजनाओं का एक संयोजन के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए एक आसान, तेज और सस्ता तरीका है, और यह आणविक इस तरह में शामिल तंत्र की समझ के लिए एक पहला कदम के रूप में माना जा सकता है बातचीत.

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों है कि ब्याज की एक संभावित संघर्ष के रूप में लगाया जा सकता है की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया.

Acknowledgments

हम हा, लियोनार्डो Amadio, गैब्रिएला जिटो (IRCCS के स्त्री रोग विभाग "Burlo Garofolo", Trieste, इटली) और एंड्रिया रोमानो (एनाटॉमी और पैथोलॉजिकल हिस्टोलॉजी, कैटिनारा अस्पताल, Trieste, इटली की ऑपरेटिव नैदानिक इकाई) प्रदान करने के लिए इवान Donati धन्यवाद ) ऊतक नमूना संग्रह के लिए. हम भी वीडियो तैयार करने में मदद के लिए Nicol] Morosini धन्यवाद और एलेक्स Coppola, आवाज. इस काम को मातृ और बाल स्वास्थ्य के लिए संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, इटली (RC20/16) और Fondazione Casa di Risparmio Trieste R.Bulla के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µm pore filter BD Falcon 352360
Amphotericin B solution (fungizone) Sigma-Aldrich  1397-89-3
basic FGF Immunological Sciences GRF-15595
Calcium Chloride Sigma-Aldrich  C-4901
Collagenase type I Worthington Biochemical Corporation, DBA MX1D12644
D-Glucose Sigma-Aldrich  50-99-7
DNase I  Roche 10 104 159 001
EDTA Sigma-Aldrich  60-00-4
EGF Immunological Sciences GRF-10544
FAST DiI Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific D7756
Fetal bovine serum Gibco,  Thermo Fisher Scientific 10270-106
Fibronectin Roche 11051407001
Flask for cell culture Corning 430639 Sterile, vented
Gentamicin solution Sigma-Aldrich  G1397-10ML
Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS)  Sigma-Aldrich  H6648 Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone
High molecular weight hyaluronic acid Kind gift by Prof. Ivan Donati
Human endothelial serum free medium  Gibco,  Thermo Fisher Scientific 11111-044 Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and  1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich)
Magnesium Chloride Carlo Erba 13446-18-9
Medium 199 with Hank’s salt Sigma-Aldrich  M7653
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich  P0781
Time-lapse microscopy  Nikon  Imaging System BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA Reader Flow Labs
Trypsin Sigma-Aldrich  T4674

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 148 पूरक प्रणाली सी 1क्यू एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स Hyaluronic एसिड सेल आसंजन ट्यूमर कोशिकाओं
सेल आडंशन को बढ़ावा देने में पूरक प्रोटीन C1Q और Hyaluronic एसिड के बीच परस्पर क्रिया का मूल्यांकन
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Vidergar, R., Agostinis, C., Zacchi, … More

Vidergar, R., Agostinis, C., Zacchi, P., Mangogna, A., Bossi, F., Zanconati, F., Confalonieri, M., Ricci, G., Bulla, R. Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion. J. Vis. Exp. (148), e58688, doi:10.3791/58688 (2019).

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