Summary
El componente de complemento C1q es una molécula proinflamatoria altamente expresada en el microambiente tisular que puede interactuar con la matriz extracelular. Aquí, describimos un método para probar cómo C1q unido al ácido hialurónico afecta la adhesión celular.
Abstract
Se ha demostrado cada vez más que el microambiente tumoral desempeña un papel activo en el crecimiento de la neoplasia y la metástasis. A través de diferentes vías, las células tumorales pueden reclutar eficientemente células estromales, inmunes y endoteliales mediante el secreto de factores estimulantes, quimioquinas y citoquinas. A su vez, estas células pueden alterar las propiedades de señalización del microambiente mediante la liberación de señales, metabolitos y componentes de matriz extracelular que promueven el crecimiento para mantener una alta proliferación y competencia metastásica. En este contexto, identificamos que el componente de complemento C1q, altamente expresado localmente por una serie de tumores malignos humanos, al interactuar con la matriz extracelular de ácido hialurónico, afecta fuertemente el comportamiento de las células primarias aisladas del tumor humano Especímenes. Aquí, describimos un método para probar cómo C1q unido al ácido hialurónico (HA) afecta la adhesión de las células tumorales, subyacente al hecho de que las propiedades biológicas de los componentes clave de la matriz extracelular (en este caso HA) pueden ser moldeadas por señales bioactivas hacia el tumor Progresión.
Introduction
El microambiente tumoral (TME) influye en el desarrollo y la progresión del cáncer, ya que puede proporcionar un nicho permisivo para la supervivencia celular, el crecimiento y la invasión. La identificación de nuevos actores clave en TME puede ser útil para el descubrimiento de nuevas herramientas moleculares para la terapia diana. TME incluye una red compleja y dinámica de células no malignas, como células endoteliales, fibroblastos y células del sistema inmunitario, incrustadas en los componentes de la matriz extracelular (ECM) circundantes, incluyendo colágenos, laminines, fibronectinas, proteoglicanos e hialuronanos. Tanto las células tumorales como las no tumorales sintetizan y secretan componentes de ECM junto con citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y enzimas de remodelación inflamatorias y matriciales que alteran en general las propiedades físicas, químicas y de señalización de TME. Entre estos componentes, el ácido hialurónico (HA) ha surgido para ejercer un papel crucial en la biología tumoral. A pesar de su simple composición química, HA, junto con sus moléculas de unión HA (hialadherinas), puede modular la angiogénesis, la capacidad de respuesta del sistema inmune y la remodelación de ECM de una manera dependiente del tamaño y la concentración1.
El sistema de complemento (C) también forma parte del TME local, que recientemente ha recibido una atención cada vez mayor. El sistema C abarca un conjunto de proteínas solubles y unidas a membranaimplicadas en la primera línea de defensa contra las no autocélulas, los elementos huésped no deseados y los patógenos. Funcionalmente, la C une los brazos de dos efectos de los sistemas innatos y adaptativos para promover la matanza directa de células o el montaje de una respuesta inflamatoria2. La activación c puede suprimir el crecimiento tumoral, destruyendo las células cancerosas o inhibiendo su crecimiento, pero se ha vuelto cada vez más claro que puede poseer una actividad que promueve el tumor al sostener la inflamación crónica, promoviendo el establecimiento de un ambiente inmunosupresor, induciendo angiogénesis y activando vías de señalización relacionadas con el cáncer3. En este contexto, C1q, la primera molécula de reconocimiento de la vía clásica del sistema C ha surgido para ejercer importantes funciones en el microambiente tumoral independientemente de la activación C4. C1q ha demostrado ser expresado localmente por una gama de tumores malignos humanos, donde puede favorecer laadhesión de las células cancerosas, la migración y la proliferación, además de la angiogénesis y la metástasis 5. Curiosamente C1q interactúa con un componente importante del ECM como HA.
Desarrollamos una técnica para aislar las células cancerosas primarias de la masa tumoral. Además, creamos la matriz, que puede estimular el microambiente tumoral, particularmente la interacción entre C1q y el ácido hialurónico de alto peso molecular. C1q unido a HA fue capaz de inducir la adhesión de las células tumorales.
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Protocol
Las muestras de tejido de los pacientes fueron recogidas después del consentimiento informado tras la aprobación de las consideraciones éticas por el Consejo Institucional del Hospital Universitario de Trieste, Italia.
1. Aislamiento y cultivo de células tumorales (Día 1)
- Aísle las células del mesotelioma humano de las muestras sólidas de MPM. Picar finamente el tejido con un cortador para obtener fragmentos de aproximadamente 2-3 mm2 de tamaño e incubar en 5 ml de solución de digestión compuesta por la Solución De Sal Equilibrada (HBSS) de Hanks complementada con 0,5 mM Ca2+/Mg2+,0,5% de trippsina y 50 g/ml DNase I, durante la noche a 4oC.
- Aislamiento y cultivo de células tumorales (Día 2)
- Después de la incubación durante la noche, coloque el tejido digerido durante 30 minutos en una incubadora de 37 oC con un suave temblor.
- Reemplazar la solución de digestión tras la centrifugación (250 x g) por 3 mg/ml de colagenasa tipo 1 disuelta en 5 ml de Medio 199 con HBSS e incubar durante 30 min a 37oC con agitación suave.
- Bloquear la reacción enzimática añadiendo un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS). Resuspenda las células con mucho cuidado con una pipeta de 5 ml para asegurarque que la mayoría de las células se liberan del tejido. A continuación, filtre la suspensión celular a través de un filtro de poros de 100 m.
- Sofitee las células en un matraz de 12,5 cm2 y escórmelas a 37 oC con células endoteliales humanas de medio libre de suero (HESF), con 10% de FBS y suplementada con EGF (10 ng/ml), FGF básico (20 ng/ml) y 1% penicilina- estreptomicina.
NOTA: Reemplace por un medio fresco cada 2-3 días.
2. Recubrimiento HA (Día 1)
- Resuspender HA de alto peso molecular (1,5 kDa) en agua destilada doble a la concentración de 1 mg/ml6.
- Diluir la solución de material HA a 50 g/ml en tampón de carbonato/bicarbonato (0,1 M, pH 9,6) con pipeteo suave.
- Recubrir la placa de 96 pocillos con 100 ml de solución de material de HA diluido por pocido durante la noche a 4 oC.
NOTA: El ácido hialurónico fue un regalo amable del profesor Ivan Donati, Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de Trieste7.
3. Recubrimiento C1q (Día 2)
- Después de la incubación durante la noche, aspirar los pocillos tratados y lavar la placa de 96 pocillos con 100 ol de PBS de Dulbecco (dPBS) por poca.
- Permitir que C1q (25 g/mL o diferentes concentraciones para experimentos de respuesta a la dosis) o BSA (como control negativo) se una núde a plástico inmovilizado-HA incubando estas proteínas a una concentración de 25 g/ml en 100 éL de dPBS + 0,5% de BSA y 0,7 mM Ca2+/Mg2+ . A continuación, incubar durante la noche a 4oC.
- Aspirar los pozos y lavar la placa de 96 pocillos con 100 ol/pozo de dPBS.
4. Etiquetado de celdas con FAST DiI
- Resuspenda 1 x 105 células tumorales en 500 ml de dPBS que contengan 10 g/ml del tinte fluorescente FAST DiI. Incubar durante 15 min a 37oC en una incubadora de CO2 de 5% v/v para el etiquetado, mezclando manualmente después de 5 min intervalos.
- Para eliminar el exceso de FAST DiI, añadir 10 ml de dPBS, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo, y centrifugar a 250 x g durante 7 min. Resuspender el pellet celular en 1 mL de medio libre de suero endotelial humano que contenga 0,1% de BSA (HESF + 0,1% BSA).
5. Adhesión celular en matrices HA/C1q (Día 1)
- Aspirar los pozos recubiertos con las diferentes matrices (los pozos fueron recubiertos en el paso 3.2).
- Distribuir 100 l de la suspensión celular etiquetada a los pocillos recubiertos e incubar la placa durante 35 min a 37 oC en la incubadora de CO2 de 5% v/v.
- Retire las células no adherentes aspirando el sobrenadante. Lavar una vez con dPBS que contiene 0.5% BSA, 0.7 mM Ca2+ y 0.7 mM Mg2+.
- Lise las células adherentes mediante la adición de 200 l / bien de 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 + 0.1% v / v SDS e inmediatamente leer la placa de 96 pocillos con un lector de fluorescencia (544 nm, emisión 590 nm) utilizando una curva de calibración generada a través de la lisis de un número creciente de etiquetado Células.
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Representative Results
La HA es un polisacárido de alto peso molecular cargado negativamente, que se compone de unidades de disacárido de repetición (1-4)-D-glucurónico-(-,1-3)-N-acetil-D-glucosamina disacárido (Figura1B)7. La aparición de la unión de HA en la placa de 96 pocillos, así como la eficiencia de su inmovilización se probaron aprovechando el HA biotinilado (bio-HA). Las diferentes concentraciones de Bio-HA, que van desde 10 g/ml a 1 mg/ml, se resuspendieron en 100 mM de carbonato/bicarbonato-buffer pH 9.6 e incubaron durante la noche a 4 oC.
Después de lavados extensos, se detectó bio-HA unido a la placa de 96 pocillos utilizando estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina, mientras que la presencia de estreptavidina se cuantificó utilizando pNPP (1 mg/ml) como sustrato. La lectura se realizó a la longitud de onda de 405 nm utilizando un lector ELISA. Bio-HA fue capaz de unirse a una placa de 96 pocillos de una manera de respuesta a la dosis (datos no mostrados); 50 g/ml fue elegido como meseta de saturación y por lo tanto utilizado en nuestros ensayos.
Nuestros datos anteriores demostraron que C1q es capaz de enlazara auna amplia gama de ligandos objetivo localizados en el ECM 8. Esta encuadernación es particularmente fuerte con HA9. Los pozos de una placa de microtíter fueron recubiertos con 50 g/ml de HMW-HA e incubados con una concentración creciente de C1q. Bound C1q se visualizaron tras la incubación con anticuerpos policlonales anti-C1q. C1q es capaz de unirse a HA de alto peso molecular de una manera dependiente de la dosis (Figura1A),alcanzando el nivel máximo de unión a la concentración de 50 g/ml. Después de haber establecido que C1q puede unirse a HA, investigamos la implicación de esta interacción en la modificación de las propiedades de señalización del ECM y sus implicaciones en el desarrollo del tumor. Para ello, establecimos un protocolo para aislar las células tumorales a partir de muestras biópticas obtenidas de pacientes afectados. Las células tumorales primarias se aislaron a partir de la biopsia de tejido, como se resume en la Figura2. La capacidad de las células tumorales para interactuar con C1q se evaluó realizando un ensayo de adhesión celular utilizando diferentes combinaciones de matriz, como se muestra en la Figura3. Las células tumorales se teñieron con la sonda fluorescente FAST DiI y se sembraron sobre HA inmovilizado, HA unida a C1q o a BSA (utilizada como control negativo), durante 35 minutos. Si se compara con HA, el recubrimiento con HA-bound-C1q fue capaz de aumentar la cantidad de células primarias adheridos, pero no es capaz de estimular la adhesión de las líneas celulares tumorales que probamos, como se muestra en el gráfico representativo de la Figura3.
Figura 1 . Interacción de C1q con ácido hialurónico. (A) Unión de C1q en HMW HA de manera dependiente de la dosis. Los datos se expresan como la media de tres experimentos independientes en triplicado - S.E.M. (B) Representación esquemática de la molécula C1q y de la región globular de cadena única recombinante. C1q se ensambla a partir de tres cadenas de polipéptidos (A, B, C): cada una contiene una secuencia de colágeno N-terminal y una cabeza globular gC1q terminal C. (C) Fórmula química de ácido hialurónico, una cadena altamente polimerizada de ácido glucurónico y N-acetilglucosamina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Esquema resumido del aislamiento y morfología de las células tumorales. Las células tumorales se aislaron de las muestras de biopsia pleural. Las células fueron sembradas en un matraz de 12,5 cm2 y cultivadas en Suero Celular Endotelial Humano Medio Libre + 10% FBS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Efecto de C1q en la adhesión de las células tumorales. Las células tumorales (MES) o la línea celular primaria del mesotelioma (MSTO-211H) fueron sembradas a pozos microtíteres recubiertos previamente con ácido hialurónico (HA), HA unido a C1q o a albúmina sérica bovina (BSA). En la parte superior de la figura, se mostró el aspecto morfológico de una línea celular primaria representativa adherida a HA, HA enlazada a C1q o a BSA. Las imágenes se adquirieron a través de un microscopio de contraste de fase, aumento original: 200x. Se permitió que las células primarias de mesotelioma etiquetadas con FAST DiI o una línea celular de mesotelioma (MSTO-211H) se adhirieran a pozos de microtíter pre-recubiertos con HA, HA unidos a C1q o a BSA. Los datos se expresan como la media de tres experimentos independientes realizados en triplicados : S.E.M. * p < 0.01 vs HA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Describimos un método fácil para investigar cómo el componente de complemento C1q, interactuando con el ácido hialurónico, es capaz de modular el comportamiento de las células primarias aisladas de los tejidos tumorales humanos. Tanto HA como C1q están abundantemente presentes en el microambiente tisular tanto en condiciones fisiológicas como patológicas, participando en varios procesos biológicos celulares. Por ejemplo, se ha demostrado que C1q está presente en el microambiente de la placenta, donde favorece la invasión extravillous de trofoblasto de la decidua materna durante la placentación8. C1q también se deposita en la piel cicatrizante de heridas donde fomenta el proceso angiogenético necesario para la regeneración y reparación de tejidos10. Finalmente, C1q se ha identificado en varios tejidos tumorales diferentes4. La HA de alto peso molecular es una barrera natural para la angiogénesis y la proliferación y la evidencia reciente demostró que C1q, además de su papel clásico en la activación del complemento, es capaz de actuar como una molécula de ECM, favoreciendo la migración celular.
La novedad de este trabajo consiste en el hallazgo de que la unión de C1q a HA modifica fuertemente la interacción de las células tumorales con HA. Para configurar este método se han tenido en cuenta varios puntos de control. En primer lugar, nos aseguramos de que una cantidad suficiente de HA estaba ligada al plástico de cultivo y pozos ELISA utilizando HA biotinilado. La tinción azul alciana de los pozos confirmó estos resultados (datos no mostrados). La incubación se ha realizado durante la noche en tampón de bicarbonato, pH 9.6, y este procedimiento asegura la saturación completa de los pozos por HA (datos no mostrados).
El segundo paso fue enlazar C1q a HA. La unión de C1q a HA se ha realizado a un pH fisiológico (7.4) y en presencia de Ca2+. Por esta razón, utilizamos un búfer dPBS-BSA con iones bivalentes. Inicialmente realizamos un experimento de respuesta a la dosis con el fin de identificar y elegir la cantidad óptima de C1q que se puede encontrar unido a HA. Aunque en nuestra curva dosis-respuesta no llegamos exactamente a la meseta, utilizamos la concentración de 25 g/ml para estar más cerca de la concentración fisiológica de C1q libre, teniendo en cuenta que la cantidad de C1q normalmente presente en el suero es de 75-150 g/ml. Se ha calculado que el suero C1q libre de C1r y C1s es aproximadamente 10%-20% del complejo C111. C1q es conocido por su capacidad para unir polianiones, se ha definido como una molécula de reconocimiento de patrón de carga y HA es un polímero lineal cargado negativamente de unidades repetitivas de (1-4)-ácido glucurónico D-(,1-3)-N-acetil-D-glucosamina12, 13. Por esta razón, investigamos esta fuerte interacción no covalente. Nuestras observaciones indicaron que las células tumorales detectan la diferencia entre HA y HA unidas a C1q. Las celdas parecen estar más extendidas si se comparan con la celda que se adhiere a HA sola. Observamos que este efecto no está mediado por C1q soluble, lo que indica que esta modificación en la adhesión celular depende de la interacción de C1q con HA, probablemente debido a un cambio de conformación de la molécula de complemento como consecuencia de la unión.
Queremos destacar la importancia del uso de células primarias como modelos in vitro de comportamiento tumoral para los experimentos de adhesión, ya que notamos una fuerte diferencia en la capacidad de adhesión entre células primarias en comparación con varias líneas celulares, como se muestra en Figura 3. Un modelo alternativo y muy interesante para evaluar las propiedades biológicas de HA es el uso de modelos 3D de andamio de hidrogel HA. Este andamio con la incorporación de moléculas biológicas se puede utilizar para la evaluación de señales bioactivas y para varias aplicaciones en la medicina regenerativa14. El modelo que proponemos en este estudio es un método más fácil, más rápido y más barato para la evaluación de las respuestas celulares a una combinación de estímulos, y puede considerarse como un primer paso para la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en este tipo de Interacción.
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Disclosures
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Ivan Donati por proporcionar ha, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (Departamento de Ginecología de IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italia) y Andrea Romano (Unidad Clínica Operativa de Anatomía e Histología Patológica, Hospital Cattinara, Trieste, Italia ) para la recogida de muestras de tejido. Agradecemos también a Nicolá Morosini por la ayuda en la preparación del video y a Alex Coppola, la voz. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto de Salud Maternoinfantil, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italia (RC20/16) y Fondazione Cassa di Risparmio Trieste a R.Bulla.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm pore filter | BD Falcon | 352360 | |
| Amphotericin B solution (fungizone) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| basic FGF | Immunological Sciences | GRF-15595 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fibronectin | Roche | 11051407001 | |
| Flask for cell culture | Corning | 430639 | Sterile, vented |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone |
| High molecular weight hyaluronic acid | Kind gift by Prof. Ivan Donati | ||
| Human endothelial serum free medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11111-044 | Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and 1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich) |
| Magnesium Chloride | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Medium 199 with Hank’s salt | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Time-lapse microscopy | Nikon | Imaging System BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
References
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