Summary
这份手稿描述了一种基于群集的规则间的短半突 (crispr) crispr-cas9 方法, 用于简单而快速地调查多个候选基因在急性髓样白血病 (aml) 细胞增殖中的作用。并行。这种技术是可扩展的, 也可以应用于其他癌症细胞系。
Abstract
基因摄动研究已被广泛用于研究单个基因在 aml 发病机制中的作用。为了实现完全的基因破坏, 这些研究中的许多都利用了复杂的基因敲除模型。虽然这些针对敲除小鼠的研究为研究基因组学与表型的关系提供了一个优雅且久经考验的系统, 但这是一种快速且可扩展的方法, 用于评估在 aml 模型中发挥 aml 细胞增殖或存活作用的候选基因将有助于加速对多个候选基因的平行审讯。最近在基因组编辑技术方面取得的进展大大提高了我们以前所未有的规模执行基因扰动的能力。其中一个基因组编辑系统是基于 crispr-cas9 的方法, 可用于在目标细胞基因组中进行快速有效的改变。crisprs9 介导的基因缺失的易用性和可扩展性使其成为在表型检测中询问大量基因的最有吸引力的技术之一。在这里, 我们提出了一个简单的方法, 使用 crispr/cas9 介导的基因破坏结合高通量流-细胞仪的竞争分析, 以研究基因的作用, 可能发挥重要作用, 在人类的增殖或生存和小鼠 aml 细胞系。
Introduction
在过去的几十年里, 已经有了许多研究工作, 重点是确定关键分子途径在急性髓系白血病 (aml) 发病机制中的贡献。传统上, aml 细胞中的基因破坏是使用有条件的敲除小鼠或短发针 rna (shrna) 进行的。虽然敲除小鼠提供了一个复杂的系统, 用于在时空上控制基因缺失, 而产生基因敲除小鼠则是劳动密集型、耗时且昂贵的。此外, 使用重组策略的基因淘汰也不容易扩展;这些策略并不适合平行地对几个基因进行审讯。在发现 rna 干扰方法以使用小干扰 rna (sirna) 或 shrna 敲除内源性 mrna 后, 许多组开始使用 rna 干扰技术来研究特定基因在 aml 中的作用。由于使用传统的脂质转染方法很难转染小鼠和人的 aml 细胞, 因此大多数研究都使用 lentiv 或逆转录病毒编码的 shrna 来研究 aml 细胞的基因功能。最近发现的聚集定期间隔的短回文重复 (crispr) 和相关的 cas 核酸酶 (crispr-cas9) 使基因靶向技术1、2、3发生了革命性的变化。使用 crispr-cas9, 可以删除、编辑或标记特定的基因或基因组区域, 高效和轻松。基于 crispr-cas9 的基因编辑由于该技术的简单性、有效性和广泛适用性, 目前正在成为研究不同细胞类型中基因组学到表型关系的首选方法。基于 crispr-cas9 的方法也正在成为 aml 中的首选方法, 这不仅是为了询问单个基因, 也是一种针对排列或汇集的基因屏幕中的多个基因的方法, 目的是将多个基因作为潜在的平行调查aml 依赖关系 4,5,6。
在这篇手稿中, 我们描述了一个简单的竞争增长分析, 用于测量基因破坏对 aml 细胞生长的影响, 基于稳定的 crispr-cas9 介导的基因编辑, 然后是高通量流式细胞术。该方法简单、高效, 可扩展到中等吞吐量实验, 用于研究多个基因在反洗钱细胞中的并行作用。
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Protocol
1. 生成具有高稳定性和活性表9表达的 aml 细胞系克隆9
- cas9 慢病毒的生产
- 第0天: 在 dmem 10 毫升中的切片 4x 10 6 293t 细胞, 在生物安全 2级 (bovine) 认证的细胞培养罩中, 用10% 的胎儿牛血清 (fbs) 以及10厘米组织培养盘中的青霉素和 l-谷氨酰胺。将盘子放入37°c 的孵化器中。
- 第1天: 在第1天, 镀金的293t 细胞应融合 70%-80%。下午使用以下协议执行转染。
- 将转染介质、培养基和转染试剂加热至室温。解冻转染所需的所有质粒。
- 将9微克 pspax2、0.9 微克的 pmd2. g 和9微克的 plete-cas9 质粒与500μl 转染介质混合在5毫升管中。
- 在14毫升圆底管中加入 1.7 ml 转染介质。将57μl 转染试剂直接添加到管内的转染介质中, 以避免接触管内壁。
- 轻轻地将整个质粒混合在转染试剂溶液中, 然后轻轻敲击侧管。在室温下将混合物生也就是120-30分钟。同时, 改变种子293t 板的介质。
- 将转染混合向下添加到板上, 轻轻地侧摇晃板, 以实现高效的混合。将板材放入37°c 的孵化器中。
- 第 2 天 : 轻轻地从转染板上吸出上清液 , 使细胞不会扰或从转染板上脱落。放弃上清液。加入10毫升新鲜的 10% dmem 介质, 轻轻从板材两侧向下滑动, 以避免脱落细胞。
- 第3天: 将含有上清液的病毒慢慢从转染板中收集, 将其放入10厘米的无菌注射器中。上清液收集到注射器后, 将不育的0.45μm 过滤器连接到注射器上, 并将注射器和过滤器固定在新鲜的 15 ml 聚丙烯锥形管上。轻轻地将注射器浸入 15 ml 聚丙烯锥形管中, 通过0.45μm 过滤器将含有上清液的病毒过滤。
- 将病毒调节培养基储存在2毫升的等价物中, 分别在-80°c 的2毫升低温中。
- aml 细胞系的转导
- 第1天: 用无菌磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 将重组人纤维连接蛋白片段库稀释至10μg/ml。在 bsl2 批准的细胞培养罩中, 用10μgml 重组人纤维连接蛋白片段工作溶液的2毫升涂上非组织培养的6厚板。将盘子包裹在保鲜包装中, 以避免蒸发损失, 并在室温下存放一夜。
- 第0天: 解冻含有 cas9 的病毒上清液。在喷孔前完全从包膜板上吸出重组人纤维连接蛋白片段溶液。加入2毫升的病毒调理培养基与 cas9 的盘子, 并在1300xg 旋转 90分钟在35°c。这有助于病毒颗粒附着在喷水井上。
- 同时, 计数要被转移的细胞, 并在一个15毫升聚丙烯锥形管中旋转 2 x10 6细胞。在2毫升的新鲜培养基中吸收上清液并重新悬浮颗粒。
- 喷药后, 将所有病毒上清液从喷药井中取出, 丢弃。来自上清液的逆转录病毒颗粒附着在喷水井的底部。在这口井中, 从上面的步骤中加入 2 x10 6细胞重新悬浮在2毫升培养基中。
- 再次旋转板在 1, 300 x g 非常短暂 (1-2分钟) 足以让细胞在底部沉淀下来。将盘子放回孵化器, 并在井上放置一夜的转导。
- 第1天: 根据细胞密度, 在被转移的细胞中添加更多的培养基, 以避免过度生长。
- 第2天: 由于 pleti-cas9 质粒具有 blasticidin 耐药标记物, 因此在10μgml 剂量下加入 blasticidin, 以转染和未诱导 (对照) molm13 或小鼠 mll-af9 白血病细胞, 以选择 cas9 表达细胞。
请注意:当所有未被转移的对照细胞都被消灭时, 卡西 9-转染的 molm13 或 mll-af9 白血病细胞的选择被认为是完整的。对于 molm13 和 mlal-af9 白血病以外的细胞系, 必须在本实验之前执行剂量反应曲线, 以便使用最佳剂量。在低转导率的情况下, 也可以对病毒上清液进行滴定。
- 高卡斯9表达细胞的克隆选择。
请注意:我们已经注意到, 在一些 aml 细胞系中, 克隆选择可能是没有必要的: 在选定的人群中, 散装 cas9-blasicidin"已经具有很高的基因组编辑效率。在这种情况下, 可以跳过步骤 1.3, 然后进入步骤1.4 来评估 cas9 在散装 cas9-blasticidin aml 细胞中的表达。在进行竞赛检测之前, 评估这些批量 cas9-aml 单元 (步骤 1.5) 的基因编辑效率仍然很重要。我们推测, 单高 cas9 克隆的选择减少了基因组编辑的可变性, 这在测试许多不同的单导轨 rna (sgrna) 时尤其重要。- 使用 bsl2 批准的引擎盖中包含的 facs 分拣器, 分别对单细胞 9-blascidin 和 mll.9 白血病细胞进行选择, 称为 molm13-cas9 和 mlal-af9-cas9 细胞。分选可分为5-10 圆底组织培养, 处理了96孔板。
- 一旦单 molm13-cas9 和 mll-af9-cas9 克隆已被挑选并单独命名, 在培养基中用10μgml 的 blasticidin 扩大10-20 个克隆, 以确保 cas9 表达的维持。
- 免疫印迹法检测稳定的 cas9 蛋白的表达。
- 根据制造商的协议, 使用核提取试剂盒, 对 molm13 和 mll-af9 白血病的所有单酸蛋白选择克隆进行核提取。检查 cas9 蛋白的表达使用抗旗 m2 抗体, 因为 cas9 在 plete-cas9 质粒是连接到 n 端旗表位。
- 将每个核提取物中的50微克总蛋白加载到10% 的 bis-tris 凝胶上, 并以 120 v 的速度运行凝胶, 直到上带完全分离。
- 用5% 的牛奶溶液在 tbst 缓冲液中阻止膜1小时。
- 在4°c 的最终浓度为1μgml 下, 用1:1000 稀释抗旗 m2 抗体对膜进行培养。
- 第二天, 用 tbst 缓冲液清洗膜, 用 hrp 共轭抗小鼠二级抗体在1:5000 的稀释 (最终浓度为 0.16μg/ml) 下孵育膜1小时。
- 用 tbst 彻底清洗膜, 并使用 ecl 基板开发印迹。
- 选择3-4 蛋白表达最高的 cas9 克隆体, 由西方印迹观察到, 用于进一步的功能分析 (图 1)。
- 确保在选定的克隆中保持较高的 cas9 活动
- 按照步骤1.1 中的描述, 使用 sgrna 定位人类或小鼠 aavs1 安全港位点, 从 sgrna 编码载体中制备慢病毒上清液。
- 用上述 spsaprna 方法用抗 aavs1 sgrna 慢病毒上清液转移顶部的 cas9 表达 molm13 或 mll-af9 白血病克隆体。选择2.5 微克/普霉素4天。
- 根据制造商的指示, 在普霉素选择后, 使用基因组 dna 提取试剂盒, 从 molm13-cas9 或 mll-af9 白血病克隆中纯化基因组 dna, 并进行相应的野生类型对照。使用50纳克 dna 作为模板, 使用 taq 聚合酶的2倍主混合和表1中列出的 pcr 程序, AAVS1_test_primers 进行 pcr。
- 在2% 琼脂糖凝胶上运行 pcr 产品, 并根据制造商的协议使用凝胶提取试剂盒对268个基对带进行凝胶纯化。桑格使用 AAVS1_target-框架 _ f 引物对凝胶纯化的 pcr 产物进行排序。
- 使用基于 web 的在线工具对 aavs1 编辑的序列和野生类型序列进行比较, 评估编辑效率 (图 2)。
2. 在 aml-cas9 细胞中的 sgrna 克隆和转导
-
sgrna 的中通量克隆
- 使用基于 web 的 crispr 设计软件为感兴趣的基因设计 4–6 sgrna。有一些 crispr 在线设计工具, 如 http://crispr.mit.edu/根据输入 dna 序列生成 sgrna 序列。
- 在带有星号的字段中填写适当的信息。点击目标基因组进行 sgrna 设计。将目标序列粘贴到 "序列" 框中, 然后单击 "提交"按钮。
- 对于克隆在 pKLV2-pgkpuro2abfp-w sgRNA 表达质粒, 在排序前将核苷酸 "cacc" 前置入感觉寡核苷酸和 "aaac" 的反义补充。在一家寡核苷酸合成公司的96孔板上订购预混感和反义寡核苷酸, 标记为寡核苷酸混合物。
请注意:我们已经使用了 pKLV2-pgkpuro2abfp-w 质粒, 它具有 bbsi 限制位点的 sgrna 克隆。在使用其他 sgrna 表达质粒的情况下, 用于 sgrna 寡核苷酸的悬垂需要相应地改变。 - 取一个单独的 u 底部96孔板标记退火板。主混合 1μl t4 pnk, 1μl 的 10倍 t4 dna 结扎缓冲液和6μl 的水, 每次退火反应。
- 在退火板的每口井中加入8μl 的主混合物。在主混合物中加入1μl 的 100μm, 感觉和反义寡核苷酸 (或2μl 的混合感觉反义寡核苷酸)。移液器2-3 轻轻混合好, 简单旋转板, 使混合物到井底。
- 在 pcr 机器上使用以下退火程序: 37°c 时 30分钟, 95°c 时 2分钟 30秒, 0.1°c 的速度缓慢冷却至22°c。退火后, 取一个新的96孔板标记稀释的 OligoMix。在这个板中, 使用多通道移液器稀释上述与水 (1: 200) 反应产生的磷酸化和退火寡核苷酸。
- 消化5微克的 pKLV2-pgkpuro2abfp-w 矢量与1.5 μl 的 bbsi 限制酶 (10, 000 unitss/ml) 在37°c 使用适当的缓冲液 2小时, 使其线性化, 以便以后结扎。
- 取一个新的96孔板标记结扎板, 并添加 20 ng 的 bbsi 消化 pKLV2-pgkpuro2abfp-w 载体到一个井每个所需的 sgrna 结扎。除此之外, 还要从稀释的低聚糖板中加入2μl 的磷酸化、退火寡核苷酸。
- 加入1μl 的 10倍 t4 连接酶缓冲液和1μl 的 t4 dna 连接酶。用多通道移液器轻轻移液器, 在室温下孵育结扎混合物2小时。
请注意:结扎混合物可以存储在-20°c 的转换步骤后。 - 同时, 在结扎步骤结束前10分钟在冰上解冻90μl 的化学能力大肠杆菌细胞。
- 使用多通道移液器, 使 10μl aliquots 的主管细胞成一个单独的96井板的每口井。
- 将连接混合物从步进2.1.8 放入含有合格细胞的井中, 轻轻上下移液器, 在室温下孵育10分钟。
- 将细菌-dna 直接从上述反应混合到含有 lb-agar 的6个井板中, 并含有100μgml 氨基青霉素。对每个转换反应重复此操作。
- 将每个转化反应放入6孔板的单独标记的井中。在每口井中加入大约5-8 个玻璃珠, 并以圆周运动晃动整个6井板8-10 次。
- 用20μl 移液器尖端从每口井中选择1-2 个单一菌落, 并在10厘米的小盘上将其标记成一个精心标记的点, 配有 lb 琼脂和 100 mgml 氨基青霉素。在进入 lb 板后, 只需将用于克隆的尖端喷射到含有 lb-amicitin 的介质中的3毫升, 在一个带有相应细菌克隆编号的14毫升圆底管中。
- 直接发送细菌板与人类 u6 启动子前引物的桑格测序。
- 在克隆 sgrna 的序列确认后, 根据制造商的说明, 使用迷你制备试剂盒对相应的 14 ml 管中的 dna 进行纯化。
- 用分光光度计测量每个小型预浸料的浓度和质量。将每个微型准备剂归一化为 15 ngμμl 和移液器, 形成一个96孔板标记的sgrna 克隆板.
请注意:该板可以储存在-20°c 或直接用于病毒制备。
- 使用基于 web 的 crispr 设计软件为感兴趣的基因设计 4–6 sgrna。有一些 crispr 在线设计工具, 如 http://crispr.mit.edu/根据输入 dna 序列生成 sgrna 序列。
-
sgrna 的病毒产生结构和转导
- 对于96孔格式的 sgrna 慢病毒颗粒的生产, 请遵循广药研究所遗传摄动平台 (gpp 门户网站) 的 "shrna\ sgrnaorf 高通量病毒生产 (96 井)" 协议 (url:http: http: http: http: http: http: http: http: http: http: http:///portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols)。
- 将200μl 的病毒上清液转移到无菌管中, 并立即冻结在-80°c。
- 第1天: 在 bsl2 细胞培养罩中, 用100μl 重组的人纤维连接蛋白片段对96孔板进行了平底非组织培养处理。用保鲜膜包裹盘子, 以避免蒸发损失, 并将其留在板凳上过夜。
- 第0天: 从每口井中取出重组的人纤维连接蛋白片段。在室温下解冻每个 sgrna 的病毒上清液。从每个管中加入50μl 的病毒上清液, 加入到转导板的每一包覆井中。在35°c 下将转导板旋转在 1, 300 x g处90分钟。
- 在喷水感染快结束时, 从培养瓶中计数 molm13-cas9 (克隆 b3) 细胞。在100μl 体积内每口使用 10, 000个细胞。计算所有转导井的细胞, 考虑到死体积。
- 90分钟后, 使用通过倾斜板慢慢调整为50μl 的多通道移液器从所有井中取出上清液。添加100μl 的培养的 molm13-cas9 克隆 b3 细胞到每个井慢慢从边缘滑落。
- 在35°c 下将板旋转在 1, 300 x g处, 5分钟, 让细胞沉淀到底部。将钢板转移到37°c 组织培养等级孵化器。
- 第1天: 在每口含有 sgrna 的油井中添加100μl 的新鲜培养基----molm13 或 cas9-mll-af9 白血病细胞, 使最终的培养基体积为200μl。
3. 竞争增长评估
- 第3天: 流式细胞仪 (流式细胞仪) 检查每口井中含有 bfp 阳性细胞的 sgrna 的百分比。使用细胞活力染料标记和排除死细胞的分析。
- 每次流式细胞仪分析后, 继续用新鲜培养基将一定比例的细胞重新植入新井中, 以避免在检测过程中出现过度生长。
-
每2-3天重复一次流式细胞仪分析, 以检查 bfp 阳性 (bfp + ve) 细胞与 bfp 阴性 (bfp-ve) 相对细胞的相对比例 (图 3)。分析每个时间点的 bfp 阳性细胞的百分比 (使用 flowjo 或类似的 facs 分析软件)。
- 将每个示例的 fcs 文件拖到 flowjo 软件中。双击任何一个示例文件, 并绘制一个点印迹的正向散射 (fsc) 与侧向散射 (ssc) 与 fsc 在 x 轴和 ssc 在 y 轴上。把所有的牢房都门。
- 双击门控单元格, 并将其绘制在 "活力染色" (y 轴上) 与 fsc 高度 (h) 或面积 (a) 点印迹上。将活活力染色阴性 (活) 细胞门。
- 双击门控活单元格, 并在 x 轴上绘制 bfp (y 轴上) 与 fsc (a)。门 bfp + ve 单元。通过将所选示例拖到 "组" 选项卡下的"所有示例"中, 将所有这些门应用于所有示例。
- 单击"表编辑器" 以创建所有示例的分析表。将 bfp + ve计数从一个示例拖到表中, 然后单击"表编辑器" 中的"显示"按钮, 创建所有示例的批处理报告, 其中包含一个显示 bfp + ve单元格百分比的表。将表另存为 xls。
- 计算活细胞群中 bfp 阳性细胞的比例增加或下降, 并将这一比例与对照 sgrna (如荧光素酶、拼接酶或 gfp sgrna) 中 bfp 阳性细胞的比率进行比较。
- 绘制不同 sgrna 的 bfp 阳性细胞的比率, 包括感兴趣的基因以及以第3天为基线的对照。
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Representative Results
在我们的研究中, 我们首先转移了包含 mll-af9 病毒编码卡西-乳酸病毒质粒的 mll-af9 移位的 molm13 人 aml 细胞系。在我们手中, 散装未分类的 molm13-cas9 细胞没有显示出高水平的 cas9 表达的西方印迹, 也没有表现良好, 当检测有效的基因编辑使用上述方法7。因此, 我们开始建立单细胞克隆体, 只选择西方印迹所看到的高水平 cas9 克隆体 (图 1)。我们选择了2个不同的克隆, 并将它们转换为 sgrna, 目标是 aavs1 安全港位置中的一个站点, 如前面所述。利用从 puromyc5-casm1-aavs1 sgrna 克隆中提取的基因组 dna, 我们使用跨越 aavs1 sgrna 切割位点的引物进行了 pcr, 并对每个 molm13 克隆的10个分离菌落中的 268 bp pcr 产物进行了测序。在与亲本序列对齐后, 我们发现 molm13-cas9 克隆 b3 和 mll-af9-cas9 克隆8的效率为 100% (未显示数据)。然后, 我们选择了这些克隆显示高 cas9 介导的基因组编辑能力为我们的 sgrna 竞争检测。在进行这些研究的同时, tide8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) 或 ice (https://ice.synthego.com/#/) 等不同群体开发了基于网络的工具, 用于快速测试 sanger 序列的基因组编辑效率。这些工具使评估基因组编辑效率变得极其简单且经济高效, 而无需克隆单个片段并对多个克隆进行排序。因此, 应首先使用这些方法测试大面积 cas9 表达细胞的基因组编辑效率。在基因组编辑效率较高的情况下, 不需要单细胞克隆。另外, 如果像我们的研究中所看到的那样, 需要单细胞克隆, 这些基于网络的突变频率估计工具提供了一种更快的方法来并行测试几个克隆。
对于 sgrna 克隆, 我们利用 sgrna 克隆质粒 pKLV2 pgkpuro2abfp-w, 它含有一种蓝色荧光蛋白 (bfp) 来跟踪 sgrna 转移的细胞和 rna 聚合酶 iii-heii-heii 驱动的人 u6 启动子, 它推动了克隆的 sgrna 与示踪剂 rna (示踪 rna) 支架一起。我们利用这个系统克隆了 2 sgrna, 目标是 DOT1L, 这种蛋白质已知在基因表达的表观遗传调控中发挥着重要作用。DOT1L 是一种组化甲基转移酶, 在目标基因9,10处沉积单甲基化、二甲基化和三甲基化。研究表明, d不久1l 在 ml 融合癌基因驱动的 aml 中发挥着重要作用。因此, 使用 crispr-cas9 的 DOT1L 敲除预计将导致显著损害小鼠 mll-af9 白血病细胞增殖, 与先前的研究11,12,13, 14一致。我们使用了两个针对 aavs1 安全港位点的 sgrna, 它位于 ppp1r12c 基因的内嵌中。在本网站产生基因组改变的 sgrna 不太可能对 ml-白血病细胞系的增殖能力产生任何影响。作为一种阳性对照, 我们克隆了针对 dna 复制相关基因 rpa3 的 sgrna。rpa3 是一种泛必需的基因, 已被证明对几个 aml 细胞系4、15、16 的增殖很重要。因此, 抗 rpa3 sgrna 在 aml 细胞中表现出强烈的抗增殖作用, 通常用作阳性对照。在抗 aavs1 和抗 rpa3 sgrna 质粒诱导后, 我们每2-3天测定 bfp + ve sgrna 转染细胞与 bfp-ve 细胞的相对比例 (图 3)。通过上述协议, molm13 或 mll.9 aml 细胞的转导使我们的病毒制剂的转导效率达到 60-70%, 使剩余的30-40% 细胞未被转导或 bfp-ve 进入每口井。这样就可以研究同一井中野生类型细胞的基因组编辑细胞的相对增殖。以 sgrna 转移细胞比例的增加或减少为指标, 反映了 sgrna 介导的基因缺失在 molm13-cas9 细胞中的功能效应。如果你感兴趣的基因对测试 aml 细胞的增殖很重要, 那么 sgrna 介导的对这个基因的破坏将导致表达 bfp + ve 细胞的 sgrna 相对减少, 而在检测过程中,而 sgrna 的目标是荧光素酶、gfp 或非必要基因将随着时间的推移保留 bfp + ve/-ve 比。
使用2个单独的抗 rpa3 sgrna, 我们观察到 bfp + ve 细胞的百分比与 bfp-ve 未被诱导的对应细胞相比有了显著下降。相反, 抗 aavs1 sgrna 表达 bfp 细胞的百分比随着时间的推移保持相对稳定, 表明 aavs1 靶向对 molm13 细胞的增殖没有影响 (图 4a)。同样, 在小鼠 mll-af9-cas9 细胞中, 我们测试了 sgrna 针对 rhodopsin (rho1) 的效果, 眼睛色素沉着基因作为负对照, dot1l, 这是一种表观遗传调节剂, 已知随着时间的推移会导致 mll-af9 白血病细胞的增殖。.在这项研究中, bfp + ve 小鼠 mll-af9-cas9 细胞与2个单独的抗 d直-1l sgrna 相比, 随着时间的推移显示出显著的和渐进的损失, 与 bfp-ve sgrna 非转移的细胞 (图 4b)。相比之下, 抗罗得 1 sgrna 的比例随着时间的推移保持相对不变。这些结果证明了 mll-af9 表达小鼠白血病细胞的脆弱性, dot1l 耗尽, 证实了先前公布的结果。
图 1: 代表性西方印迹结果显示不同的 cas9 级别.用抗旗抗体对 cas9 诱导的 molm13 aml 细胞系单细胞克隆进行了鞭毛虫-cas9 表达水平的研究。选择了显示出最高表达的 cas9 的克隆进行进一步研究。用 cas9 表达质粒转染 hek293-t 细胞作为阳性对照, 以 cas9 非转染的 molm13 细胞为阴性对照。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: ice 分析评估的 dot1l 位点基因组编辑的代表性分析.利用 ice 分析对以 dot1l sgrna 靶点为中心的 pcr 放大器进行了 sanger 测序和分析。将 sgdot1l 序列 (橙色线) 与非靶向 dna 序列 (绿线) 进行比较, 可以证明 sgrna 靶点周围的 sgdot1l 靶向细胞的编辑效率很高。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 建议方法的原理图工作流.sgrna 克隆于 sgrna 表达载体中, 共表达一种荧光蛋白, 如 bfp。目标细胞以30-60% 的转导率被转化, 然后每2-3天进行流动细胞化检查。如图所示, 针对 aml 细胞增殖所需基因的 sgrna 将显示出相对枯竭。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 人类和鼠标 aml 细胞中的竞争检测的代表性结果.结果显示 rpa3 诱导的 molm13-cas9 克隆 b3 细胞在统计上显著逐步下降。相比之下, 针对 aavs1 站点的 sgrna 没有任何效果。(b) 针对 dot1l 的 sgrna 显示出竞争扩散显著和逐步下降, 而针对 rhodopsin (rhho) 的 sgrna 则是显著和逐步下降的。*p > 0.05。** p < 0.05。误差线表示平均值 (sd) 的标准偏差。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 协议的概述.(a) 时间为在生产 cas9 病毒和 sgrna 克隆的每一个步骤描述。在生成具有稳定 cas9 表达式的 aml 细胞系单个克隆时, 可以进行 sgrna 的设计和克隆。(b) 显示了用谷细胞仪转导 aml 细胞系和利用流式细胞仪进行有竞争力生长的一般协议。请点击这里查看此图的较大版本.
| 周期 | 周期的持续时间 | 温度 |
| 1 | 2分钟 | 95°c |
| 35 | 30秒 | 95°c |
| 30秒 | 55°c | |
| 30秒 | 72°c | |
| 1 | 5分钟 | 72°c |
| 按住 | 无限 | 4°c |
表1:pcr 程序的 aavs1 位点扩增从基因组 dna.pcr 程序用于从基因组 dna 中扩增 aavs1 位点, 用于检测 cas9 表达克隆中 cas9 的切割效率。
补充文件: sgrna 寡核苷酸序列.请点击此处下载此文件.
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Discussion
在这篇手稿中, 我们描述了一个详细的协议, 用于进行基于 crispr-cas9 的竞争生长检测, 以研究候选基因在 aml 细胞系中的作用, 使用流式细胞仪在人/小鼠 aml 细胞中的作用 (图 5)。该分析的目的是在中等吞吐量的范围内, 确定基因缺失对维持两到三周反洗钱细胞增殖的影响。需要认真遵循一些关键步骤, 以促进扩大所述议定书的规模。在 cas9 慢病毒的生产中, 有必要通过0.45μm 过滤器对病毒条件培养基进行过滤, 以避免将293t 细胞携带到含有上清液的病毒中。在喷水感染过程中, 用保鲜膜或副乳包裹喷水感染板有助于避免离心过程中的潜在污染。然而, 在将被喷孔的钢板放回组织培养孵化器之前, 应将包装取出。为了提高编辑效率, 评估 cas9 表示克隆非常重要。低基因组编辑效率的克隆反映出 cas9 活性不足, 可能影响实验的成功率。在我们的实验中, 我们首先转换人类 aml cas9 克隆与 sgrna 针对 aavs1 位点, 并对它们的基因组 dna 进行排序, 以提高编辑效率。可以使用在线网络工具 (如 tide8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) 或 ice (https://ice.synthego.com/#/) 来评估 aavs1 编辑和野生类型序列的比较。这些程序将可能编辑过的 pcr 片段的 sanger 序列跟踪与未经编辑的野生类型或引用序列进行比较, 并估计更改的频率。这是一种快速评估由测试 sgrna 带来的突变变化的方法, 这是衡量细胞 cas9 活性的指标。或者, 可以将 pcr 产品克隆为 pcr 克隆质粒 (如 topo 钝性克隆载体), 然后对各个菌落进行 sanger 测序, 通过每个克隆的序列对齐来评估基因组编辑效率。野生类型。我们更喜欢前一种方法, 因为与克隆方法相比, 它更容易、更具成本效益。通常情况下, 在绝大多数有序克隆中, 在 sgrna 切割位点或周围发现基对变化 (如点突变、indels等) 表明存在高度活跃的 cas9。因此, 我们分别选择了 molm13 或 ml-af9 白血病克隆 b3 和 8, 具有最高的编辑效率进行进一步的实验。
我们设计了针对协议中提到的不同基因的 sgrna, 使用 http://crispr.mit.edu/, 这是一个基于网络的软件, 给出了一个 sgrna 列表。建议从列表中选择得分最高的 sgrna, 以消除那些预测的目标外效果的 sgrna。设计的 sgrna 可以使用任何已发布的协议 (如 (http://www.addgene.org/67974/) 网站上的协议进行克隆。感觉和反义寡核苷酸首先是磷酸化和退火, 按照步进2.1.5。在37°c 的第一步是重要的磷酸化寡核苷酸与 t4 激酶和随后的 pcr 周期是重要的退火的感觉和反义寡核苷酸到 dna。在 sgrna 克隆载体中含有荧光蛋白是非常重要的, 这对于跟踪 sgrna 在以后的检测中被转移的细胞至关重要。sgrna 克隆是扩大与96井板在所有步骤, 包括退火和结扎。对于结扎, 也可以使用干净的 pcr 微管条, 因为它们与多通道移液器兼容。如果需要转换更大的 sgrna 克隆, 则可以使用96孔板, 其中10μl 的合格细胞在每口井中预先被复制, 并在-80°c 下冷冻, 以加快整个过程。电镀结扎反应的目的是选择个别菌落, 这在96孔的形式下很难执行。因此, 对于细菌转化, 可伸缩性略有损失。不过, 即使是从整个96孔板镀化转化反应, 整个项目总共只需要 16个6孔板。在下一步从转化板中挑选菌落时, 必须小心。在贴有标签的地方划伤一个群体时, 一定要确保这个地方与其他地方明显隔离。用一个黑暗的永久标记标记在 petri 培养皿底部标记一个方形网格, 有助于防止细菌克隆的交叉污染。
一旦 sgrna 结构的小准备准备好了, 病毒就可以以96孔的形式制造出来。在这一吞吐量水平下, 过滤含有上清液的200μl 病毒是不切实际的。因此, 病毒上清液至少应在一夜之间冷冻, 以避免任何293t 细胞被携带到上清液中的交叉污染。它还可以储存在50μl 的 aliquots 无菌 pcr 管条中, 以避免上清液的冻结解冻。此外, 这些病毒条件上清液被用于转移 aml 细胞。如果观察到病毒转导的低滴度, 那么在不同的感染多样性 (moi) 下确定病毒滴度和检测转染可能很重要, 以确保40-60%转导率。本文详细介绍了病毒滴度的测定和 moi 的计算。在竞争分析中, 如协议第3步所述, 在分析 bfp 与非 bfp 比的同时, 排除不可行的细胞以防止虚假的人工制品从自动荧光中产生是非常重要的。在 facs 的时候, 在分析测试样品之前, 强烈建议使用 bfp 负控制和 bfp 阳性控制来精确设置电压。在每个重新电镀时间点, 要重新电镀的细胞的体积取决于给定时间点的细胞浓度。我们通常会将每个时间点的总计200μl 重新镀成具有180μl 新鲜介质的新鲜井。强烈建议在重新电镀前, 通过上下轻轻移液彻底混合细胞。通常情况下, 我们已经观察到, 检测需要在15-20天内进行, 以注意到 bfp + ve-ve 比率的强烈变化, 尽管这在基因之间有所不同。
这种实验设置非常适合在多个 aml 细胞系中并行测试多个基因, 以快速识别候选基因在 aml 细胞存活或增殖中的作用。这里描述的竞争性增殖检测的一个警告是, 它不考虑潜在的细胞外在因素, 如基因靶向细胞的副分泌信号事件, 这些事件可能会影响同一口井内的非目标细胞群。尽管这可能是罕见的情况, 但在进行这种检测时, 应铭记这一因素。尽管我们使用 aml 作为本手稿中描述的基于 crispr-cas9 的竞争检测的示例, 但这种方法可用于任何癌细胞系, 以并行识别多个基因的作用。使用 crispr-cas9 与使用 rna 干扰进行基因敲除相比, 基因删除有各种优点。首先, 与通常表现出广泛的靶向 mrna 抑制的 shrna 不同, sgrna 与 cas9 核酸酶效应结合在一起, 完全敲除目标基因。这可能会导致更戏剧性和一致的表型与基于 crispr-cas9 的方法, 即使必须提醒, 个别 sgrna 以及 shrna 的靶向效率可能会有很大的差异。
与传统的增殖检测相比, 基于流式细胞仪的竞争检测具有几个优点, 即镀膜数固定数量的细胞来测量基因摄动细胞的相对增殖活性。一个优点是, 细胞的相对增殖活性可以很容易和快速地测量流动细胞法几天, 绕过需要细胞计数在每个电镀步骤。这在测试针对多个基因的大量候选 sgrna 时很有用, 因为计算所有的井很麻烦, 可能会导致不准确。与基于 atp 的细胞生长测量检测不同, 流动细胞仪可以在活细胞采样上进行, 这使得这种方法有助于长期分析。这在表观遗传调节器等因素的研究中尤其有益, 这些因素可能对 aml 细胞的增殖表现出后期作用, 可能需要长期检测。其次, 同一井内存在非转染细胞, 可以得到很好控制的细胞群, 可以用来确定检测的基线。第三, 在96孔格式的设置中, 几乎可以使用多通道移液器进行检测, 从而大大加快了从克隆 sgrna 到病毒制备以及最终对其进行流动细胞学测量评估的整个过程。荧光。
这里描述的方法可以有效地扩展, 以便在排列的屏幕上并行研究多达 96 sgrna。假设每个基因 4-6 sgrna, 因此这种方法可用于至少16-24 基因的平行快速审讯。在基因数量较多的情况下, 例如需要在 aml 细胞中审讯的整个分子通路, 基于 crispr-cas9 的集合屏幕将更有用。
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Disclosures
a. j. d. 是 a2a 药品 (新泽西) 和萨尔戈特治疗 (圣地亚哥) 的顾问。其他作者没有要声明的冲突。
Acknowledgments
pcw-cas9 质粒是 eric lander & david sabatini (adgene 质粒 # 50661) 和来自 yusa 实验室的 pklv2-U6gRNA5(BbsI) pgkpuro2abfp-w 质粒 (adusa 基因质粒 #67974) 赠送的礼物。我们要感谢 sbp 医疗发现研究所的流式细胞仪核心在流量分析和分类方面的及时帮助。我们要感谢塔塔夫人纪念基金会对 a. d. 的支持。我们还要感谢以下资金来源的支持: nhh/nci p30 c03030199 癌症中心赞助的赠款、v 基金会和圣地亚哥 nci 癌症中心 (c3) #PTC2017to。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
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