Summary
يصف لنا استخدام الكمية إيمونوبلوتينج للتحقق من صحة الأنسجة الفلورة مقترنة بتحليل الصورة كوسيلة لتحديد كمية وتين فائدة في عينات الأنسجة (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين. نتائجنا تثبت فائدة علم الأنسجة الفلورة للتحقق من الكمية النسبية للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات خزعة الروتينية.
Abstract
التحديد الكمي للبروتينات ذات الاهتمام في عينات الأنسجة (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين مهم في السريرية وبحوث التطبيقات. طريقة مثلى للقياس الكمي دقيق، ولديها مجموعة واسعة نطاق ديناميكي خطي ويحافظ على وحدة الهيكلية العينة للسماح للتعرف على أنواع الخلايا الفردية. الأساليب الحالية مثل إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) والطيف الكتلي immunoblotting كل تعجز عن الوفاء بهذه الشروط بسبب طبيعتها القاطع أو بحاجة إلى مجانسة العينة. كأسلوب بديل، نقترح استخدام الفلورة (إذا كان) وتحليل الصور لتحديد الوفرة النسبية لبروتين فائدة في الأنسجة FFPE. هنا نظهر أن هذا الأسلوب هو الأمثل بسهولة، وتؤدي دينامية واسعة نطاق، وهو خطيا قابلة للقياس بالمقارنة مع معيار الذهب immunoblotting الكمية. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يسمح بالحفاظ على السلامة الهيكلية للعينة، ويسمح للتمييز من مختلف أنواع الخلايا، التي قد تكون حاسمة في التطبيقات التشخيصية. وعموما، هذا هو وسيلة قوية للتحديد الكمي النسبي للبروتينات في عينات فب ويمكن تكييفها بسهولة لتناسب السريرية أو احتياجات البحوث.
Introduction
الحاجة إلى تحديد كمية البروتينات في عينات خزعة الأنسجة (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين موجود في العديد من المجالات الطبية. على سبيل المثال، يستخدم التقدير الكمي للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات خزعة الروتينية توضيح التوقعات وأبلغ العلاج ل مرضى السرطان1. ومع ذلك، الأساليب الحالية هي عادة ذاتية وتفتقر إلى التحقق من صحة.
تستخدم بشكل روتيني في مختبرات علم الأمراض إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) ويتوقف عموما على جسم الأولية الموجهة في البروتين المستهدف وجسم ثانوي مترافق مع تسمية الانزيمية مثل الفجل البيروكسيديز2. المدينة التقليدية حساسة، يمكن أن تجعل استخدام دقيقة عينات ويحافظ على سلامة المورفولوجية لعينات الأنسجة مما يسمح بتقييم التعبير البروتين ضمن سياقها نسيجية ذات الصلة. ومع ذلك، نظراً للإشارات اللونية التي تم إنشاؤها بواسطة المدينة الاختزالي، يعاني من مجموعة ديناميكية ضيقة نسبيا وإمكانات محدودة للإرسال المتعدد2،،من34. الليزر ساعد مصفوفة التصوير (استخدام-MSI) الطيف الكتلي الامتزاز/التأين يحافظ على سلامة المورفولوجية. بيد أن هذه التكنولوجيا النامية يرتبط بالقرار المورفولوجية متواضعة وتتطلب المعايرة كبيرة والتطبيع وجدواه في الاستخدام السريري الروتيني5،،من67إضعاف. وتشمل تقنيات بديلة تحديد كمية البروتين في عينات الأنسجة immunoblotting8والطيف الكتلي9،،من1011والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا)12، كل من الذي يبدأ المتجانس عينة الأنسجة. عينات الأنسجة الأساسية غير متجانسة في أنها تحتوي على العديد من أنواع الخلايا. ولذلك، لا تسمح التقنيات التي تنطوي على المجانسة العينات التحديد الكمي للبروتين في عدد سكان خلية معينة من الاهتمام مثل الخلايا السرطانية.
مثل المدينة، إذا كان قابلاً للتطبيق على الصغيرة فب عينات ويسمح بالاحتفاظ بسلامة غذائها13. ومع ذلك، بفضل طبيعة المواد المضافة إشارات الأسفار، إذا قابلة لتطبيق متعددة الأجسام الأولية وتسميات الفلورسنت. وهكذا، قد كمياً وتين فائدة نسبيا داخل خلايا معينة أو مقصورات الهاتف الخلوي (على سبيل المثال، نواة مقابل السيتوبلازم) المحددة باستخدام الأجسام المضادة الأخرى. إشارات الأسفار أيضا تتميز أكبر مجموعة ديناميكية13،14. التفوق، وإمكانية تكرار نتائج، والإمكانيات المتنوعة إذا طبقت على عينات فب قد أظهرت13،،من1415.
هذه الوثيقة يصف لنا استخدام الكمية إيمونوبلوتينج باستخدام خطوط الخلايا المحددة كمعيار الذهب للتأكد من طبيعة الكمية إذا اقترنت بتحليل الصور الحاسوب في تحديد الوفرة النسبية لبروتين فائدة في مقاطع نسيجية من عينات الأنسجة FFPE. وقد قمنا بتطبيق هذا الأسلوب بنجاح في اتباع نهج متعدد لقياس العلامات البيولوجية البروتينات في خزعة السريرية عينات16،،من1718.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على موافقة على استخدام عينات الأنسجة البشرية الأساسية من "العلوم الصحية" والتابعة للمستشفيات التعليمية بحوث أخلاقيات المجلس (هسريب) في جامعة كوينز.
1-بناء خط خلية أنسجة ميكرواري (تي أم أية)
- خلايا الحصاد، والمياه والصرف الصحي.
ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول على مختلف خطوط الخلايا مخلدة المنشأة (مثل الحلة، جوركات، RCH-أوستريا).- للخلايا ملتصقة، الحصاد حوالي 1.3 × 107 الخلايا بمجرد أن تصل إلى ما يقرب من 80% كونفلوينسي. فصل الخلايا باستخدام كاشف مناسبة لأن خط الخلية.
ملاحظة: حمض الإيثيلين (يدتا) المفضل عموما أكثر التربسين للحد من خطر تدهور البروتينات السطحية. في حالة استخدام التربسين، تحييد التربسين استخدام مصل الدم البقري الجنين (FBS) مباشرة بعد الحصاد في الخلايا. - لتعليق الخلايا، الحصاد حوالي 8 × 107 خلايا في السجل-مرحلة النمو.
- جمع الخلايا تحصد/فصل من سينتريفوجينج لمدة 5 دقائق في 225 x ز في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل.
- صب المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 10 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 225 x ز وصب المادة طافية.
ملاحظة: 1 X برنامج تلفزيوني يتكون من 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، 10 مم نا2هبو4، 1.8 مم خ2ص4 في الماء المقطر؛ ضبط pH إلى 7.4.
- للخلايا ملتصقة، الحصاد حوالي 1.3 × 107 الخلايا بمجرد أن تصل إلى ما يقرب من 80% كونفلوينسي. فصل الخلايا باستخدام كاشف مناسبة لأن خط الخلية.
- إصلاح الخلايا في فورمالين وبيليه لهم.
- تعليق بيليه خلية داخل الأنبوبة المخروطية في 10 مل من 10% فورمالين مخزنة محايدة (NBF).
ملاحظة: يمكن تحضير NBF بتمييع 1 مل من 37% فورمالدهيد حل الأسهم في 9 مل من 1 X PBS.
تحذير: استخدام الحذر عند التعامل مع الفورمالين وفورمالدهايد. استخدام غطاء دخان للخطوات التي تنطوي على الفورمالين وفورمالدهايد. - احتضان الخلايا على الروك في 24 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها (حوالي 17 ساعة).
- إعداد حل 1% [اغروس] نقطة انصهار منخفضة في برنامج تلفزيوني (0.01 غرام من [اغروس] كل 1 مل برنامج تلفزيوني).
- تعد كافية بالنسبة 500 ميليلتر من حل [اغروس] كل نموذج خط الخلية.
- يحل [اغروس] في 80 درجة مئوية مياه حمام أو الحرارة كتلة، مع خلط أحياناً لمدة 2-5 دقائق. بمجرد حل، يبقى الحل في 37 درجة مئوية الماء كتلة حمام أو الحرارة لمنع تصلب.
- إزالة المادة طافية بيليه الخلايا الثابتة من خطوة سينتريفوجينج لمدة 5 دقائق في 225 غ. س 1.2.2 وريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x.
- نقل الخلايا إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة وبيليه سينتريفوجينج لمدة 5 دقائق في 290 x زاي Aspirate قبالة كل من المادة طافية.
- تعليق بيليه خلية داخل الأنبوبة المخروطية في 10 مل من 10% فورمالين مخزنة محايدة (NBF).
- تحويل خلايا في [اغروس].
- إضافة ~ 500 ميليلتر من 1% [اغروس] حل (من الخطوة 1.2.3) لكل أنبوبة تحتوي على الخلايا. بلطف ولكن بسرعة، "الماصة؛" خليط صعودا وهبوطاً باستخدام ميكروبيبيتي P-1000 لمزيج.
ملاحظة: قطع نهاية طرف الماصة تكبير الفتحة وتجنب تشكيل فقاعات. يبقى الحل [اغروس] العامل في حمام الماء 37 درجة مئوية لمنع تصلب. - تتيح الحل [اغروس]-خلية تتصلب (5-10 دقيقة) في درجة حرارة الغرفة. أضف 1 مل 10% NBF لكل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة المحتوية على عينة والحفاظ على درجة حرارة الغرفة حتى البارافين التضمين (تصل إلى 24 ساعة).
- إضافة ~ 500 ميليلتر من 1% [اغروس] حل (من الخطوة 1.2.3) لكل أنبوبة تحتوي على الخلايا. بلطف ولكن بسرعة، "الماصة؛" خليط صعودا وهبوطاً باستخدام ميكروبيبيتي P-1000 لمزيج.
- إعداد المكونات [اغروس] لتضمين البارافين.
- نضح قبالة NBF من العينة.
- إزالة المكونات الخلية باستخدام شفرة حلاقة لقطع أنبوب ميكروسينتريفوجي، ضع المكونات في كاسيت النسيج البلاستيكية. تخزين أشرطة الكاسيت في 10% NBF في درجة حرارة الغرفة.
- معالجة العينات بين عشية وضحاها أما يدوياً أو باستخدام معالج نسيج الآلي، وتضمين في شمع البارافين استخدام الأساليب القياسية علم الأنسجة.
ملاحظة: انظر فيشر وآخرون. 19 بروتوكول مثال. - استخدام متخصصة الصك "نسيج أرايير"، والحصاد النوى 0.6 مم مكررة من البارافين كتلة من كل خط الخلية وإدراجها، في الصفوف، في كتلة فارغة بارافين المتلقية من أجل إنشاء خط خلية الجمعية التونسية للأمهات.
ملاحظة: يجب استخدام الأساليب القياسية مثل تلك الموصوفة في فيدور ودي مارزو20. - دمج النوى من العينات الأولية تمثل 2-3 أنواع الأنسجة إضافية (مثلاً، لوزة، القولون، الخصيتين، إلخ) كعناصر إيجابية أو سلبية في الجمعية التونسية للأمهات. اختر الأنسجة المناسبة لبروتين الفائدة.
- استخدم مبضع لإعداد هذين الفرعين النسيجي، تقريبا من 4 إلى 6 ميكرون سميكة، من خط خلية الجمعية التونسية للأمهات. تحميل المقطع على شريحة علم الأنسجة والجاف لأنه ديبارافينيزي (كما هو موضح في فيدور ودي مارزو20).
2-عينة تلطيخ من الفلورة
- تحسين تخفيف جسم الأولية.
ملاحظة: توجد البروتوكولات القياسية للاستفادة المثلى من المدينة أو إذا كان لأقسام الأنسجة FFPE كما هو الحال في كاجيمورا et al. 21-لمحة موجزة عن النهج الذي يرد هنا.- إعداد تخفيف 4-5 من جسم الرئيسي لبروتين الفائدة التي تسترشد بإرشادات الشركة المصنعة.
- تحديد نوع عنصر تحكم أنسجة من مصدر الحيوان أو الإنسان الذي يعبر عن البروتين للاهتمام بالسكان خلية شكلياً يمكن التعرف عليه. تعد أجزاء من الأنسجة وجبل لهم على شريحة اتباع الإجراء immunohistochemistry القياسية كما هو الحال في فيدور ودي مارزو20.
ملاحظة: عدد المقاطع المطلوبة هو عدد الأجسام المضادة الأساسي تخفيف زائد واحد إضافي. - استخدام نظام الآلي أو اليدوي إيمونوهيستولوجي، اختبار تخفيف جسم أساسي من الخطوة 2.1.1 كل على شريحة من الخطوة 2.1.2. حذف تطبيق جسم أساسي من الشريحة الإضافية واستخدامها كعنصر سلبي.
- وخلال عملية المصبوغة، وصمة عار كافة الشرائح مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) كونتيرستين نووية وجسم ثانوية المعلمة فلوريسسينتلي. إذا كان مطلوباً بقدر أكبر من الحساسية، استخدام برنامج الصحة الإنجابية (الفجل البيروكسيديز)-مترافق جسم الثانوية ونظام تضخيم الإشارات على أساس تيراميدي (انظر المكدس et al. 13).
ملاحظة: عند الإرسال المتعدد الأجسام الأولية، يتم استخدام تسمية فلورسنت مختلفة لكل البروتين. - مسح الشرائح إيمونوستينيد باستخدام أداة مناسبة قادرة على توليد ملف صور رقمية باستخدام موجات الإثارة والكشف المناسب إلى فلوروفوريس التي تم استخدامها.
- استخدام البرمجيات المناسبة لعرض الصور الرقمية واختر تجريبيا إضعاف جسم الأولية التي يحسن كثافة إشارة بالنسبة إلى الخلفية الفلورية.
ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، هذا التحسين يمكن أن يحدث باستخدام جسم ثانوي مترافق HRP، 3، 3 '--ديامينوبينزيديني (DAB) والفحص المجهري برايتفيلد.
- أداء إذا تلطيخ على خط الخلية الجمعية التونسية للأمهات.
- استخدام نظام تلقائي أو يدوي إيمونوهيستولوجي وصمة عار شريحة خط الخلية الجمعية التونسية للأمهات مع إضعاف جسم الأولية الأمثل (كما هو محدد في الخطوة 2، 1). حذف تطبيق جسم أساسي من الشريحة الثانية واستخدامه كعنصر سلبي.
- وخلال عملية المصبوغة، وصمة عار كافة الشرائح مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) كونتيرستين نووية، وجسم الثانوية وتيراميدي كما هو الحال في الخطوة 2.1.4.
- مسح الشرائح إيمونوستينيد باستخدام أداة مناسبة قادرة على توليد ملف صور رقمية باستخدام موجات الإثارة والكشف المناسب إلى فلوروفوريس التي تم استخدامها.
- استخدام حزمة برامج تحليل صور لتحديد مقصورة الخلوية للفائدة (أي السيتوبلازم مقابل نواة) وقياس كثافة fluorescence يعني (MFI) لكل خط الخلية.
ملاحظة: يمكن استخدام حزم البرامج المختلفة لهذا الغرض وكثير تناقش في المكدس et al. 13.
3-الكمية إيمونوبلوتينج من خطوط الخلايا
- إعداد ليساتيس للخلايا.
- حصاد الخلايا 2 مليون لكل خط الخلية، كما هو موضح في الخطوات 1.1.1 إلى 1.1.3.
- تدور الخلايا إلى الأسفل لمدة 5 دقائق في 650 x ز في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. صب المادة طافية.
- تغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني المثلج. ريسوسبيند في 1 مل من المثلج برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. الطرد المركزي وفقا للخطوة 3.1.2 وصب وترك الخلايا على الجليد.
- إضافة حوالي 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل راديويمونوبريسيبيتيشن الباردة (RIPA) مع مثبطات البروتياز (10 ميليلتر من مثبطات X 100 كل مل من المخزن المؤقت لتحلل ريبا) إلى الخلايا، ودوامه، واحتضان في الثلج لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: يختلف بحسب خط الخلية مبلغ تحلل المخزن المؤقت المطلوب لتحلل فعالة ويمكن تحديده تجريبيا. المخزن المؤقت للمعهد الملكي يتكون من 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم يدتا، 50 مم تريس، 1.0 NP-40%، 0.5% ديوكسيتشولاتي الصوديوم، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% في الماء المقطر. - لضمان تحميل نسبيا حتى في إيمونوبلوتس، قياس مجموع البروتين في عينة 20 ميليلتر من كل استخدام ليستي طريقة مناسبة مثل المقايسة برادفورد. إضافة ميليلتر حوالي 40 X Laemmli 6 تحلل المخزن المؤقت للفترة المتبقية (حوالي 180 ميليلتر) لكل خلية ليساتي ويغلي عند 100 درجة مئوية في حمام كتلة أو الماء حرارة لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: 6 X لايملي المخزن المؤقت يتكون من 300 ملم تريس-HCl (6.8 درجة الحموضة)، 4% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، والغليسيرول 60%، 0.6% (w/v) بروموفينول الأزرق، ديثيوثريتول 50 ملم (DTT) في الماء المقطر. - تخزين العينات في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
- أداء إيمونوبلوت جميع خطوط الخلايا لتحديد خط الخلية التي يحتوي البروتين الأكثر وفرة من الفائدة.
ملاحظة: اتبع الإجراء الموضح في محمود، ت. ويانغ، جهاز كمبيوتر. 22، مع إدخال التعديلات التالية.- الخلية قاسمة ليستي (أعد الخطوة 3.1) التي تحتوي على 10-50 ميكروغرام من البروتين (اعتماداً على وفرة البروتين للفائدة) في أنابيب ميكروسينتريفوجي. إضافة ميليلتر 2.5 6 X لايملي المخزن والمخزن المؤقت لتحلل ريبا كافية جعل حجم ما يصل إلى 15 ميليلتر.
- تحميل 5% التراص و بتركيز مناسب (مثلاً، 10% للبروتينات بين 15-100 كاتشين) حل جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع سلم بروتين والعينات المأخوذة من الخطوة 3.2.1. تحميل المخزن المؤقت X Laemmli 1 إلى الآبار فارغة. تشغيل التيار الكهربائي في الإعدادات المناسبة، عادة 125 الخامس، لمدة 80 دقيقة أو حتى صبغ بروموفينول الأزرق يصل إلى الجزء السفلي من اللوحة.
- إجراء عملية نقل بروتين شبه جاف كما هو موضح في فيدمان et al. 23.
ملاحظة: لنتائج تمثيلية، غشاء النيتروسليلوز (التي لا تحتاج إلى أن تكون غارقة في الميثانول)، واستخدمت بيرم شافر-نيلسن (بي إس) الباردة نقل المخزن المؤقت. المخزن المؤقت بي إس يتكون من 48 مم تريس، 39 مم جليكاين، 20% ميثانول في الماء المقطر. - بعد التحويل، استخدم شفرة حلاقة لقطع الغشاء أفقياً لفصل الجزء الذي يحتوي على بروتين اهتمام بروتين مراقبة داخلية مناسبة، مثل جابده.
- المضي قدما إلى عرقلة وجسم إينكوباتيونس استخدام المخزن المؤقت حظر الذي أوصت به الشركة المصنعة للأجسام المضادة الأولية.
ملاحظة: يمكن أن تختلف جسم الأولية الأمثل تخفيف هائلة اعتماداً على وفرة البروتين وحساسية. للممثل النتائج أدناه، المطلوبة جسم مضاد للبروتين لمصلحة إضعاف 1:1,000 بينما جابده عنصر التحكم المطلوب إضعاف 1:40,000. وكان التخفيف من الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة 1:3، 000. - بعد إينكوبيشنز جسم والغسيل للغشاء، ضع الشرائط الغشاء في غمد بلاستيك الشفاف مثل كيس ساندويتش.
- إعداد الخليط تشيميلومينيسسينسي (القامة) enchanced اتباع إرشادات الشركة المصنعة. استخدام ماصة P-1000 لتغطي الغشاء مع خليط القامة وإغلاق الغمد، واحتضان الشرائط الغشاء مع الخليط في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة.
- ضع غمد الغشاء في منصة تصوير رقمي. استخدام تشيميلومينيسسينسي والكشف عن علامة قياس الألوان لالتقاط التعرض المختلفة للغشاء.
ملاحظة: سوف تختلف أوقات التعرض استناداً إلى الكمية من البروتين تحميل، وفرة بروتين المستهدف، تقارب جسم إلخ تبدأ مع تعرض تلقائي (عادة بضع ثوان)، واختبار التعرض مرات أعلى وأسفل بزيادات لبضع ثوان. - تجريبيا، أو استخدام برنامج تحليل الصور، تحديد خط الخلية التي تعرب عن أهم هدف البروتين.
- البحث عن النطاق الديناميكي الخطي لكل جسم الأولية باستخدام إضعاف مسلسل.
- نفذ الخطوات 3.2.1-3.2.8 باستخدام سلسلة من تخفيف المسلسل من خط الخلية التي تعبر عن تركيز أعلى من البروتين المستهدف (المحددة في الخطوة 3.2.9).
- استخدام برنامج تحليل الصور مثل إيماجيج لإجراء قياس كثافة على الصور التعرض.
- على سبيل المثال، باستخدام إيماجيج، استخدام أداة تحديدات مستطيلة لتحديد لين أول من جل للقياس الكمي. تحليل الذهاب إلى | المواد الهلامية | حدد أول لين. استخدم الماوس لتحريك المستطيل الناتج فوق إلى الممر التالي. تحليل الذهاب إلى | المواد الهلامية | حدد التالي لين. مرارا وتكرارا نقل المستطيل إلى الممر التالي وحدد لين لما تبقى الممرات.
- تحليل الذهاب إلى | المواد الهلامية | ارسم الممرات. استخدام أداة الخط المستقيم لرسم خطوط عبر أسس كل ذروة لإزالة الضوضاء الخلفية. استخدام أداة العصا لتحديد كل ذروة، وجمع كثافة كل الذروة، من الآن فصاعدا يشار إلى كثافة الفرقة، من إطار النتائج .
- استخدام قياس كثافة الناتج لإنشاء سكاتيربلوت للفرقة كثافة مقابل مبلغ إجمالي البروتين تحميلها لكل جسم الأولية. استخدام خط الاحتواء الأفضل والتفتيش البصري، تحديد الموقع (كثافة النطاق) النطاق الديناميكي الخطي لكل جسم.
- اختر تركيز بروتين الذي يقوم بإنشاء قيمة في الطرف الأعلى من النطاق الخطية إلى أن تركيز المضي قدما مع جميع خطوط الخلايا.
ملاحظة: نظراً لهذا التركيز أقل من مستوى التشبع في خط الخلية مع أكبر قدر من هذا البروتين، ينبغي لا خطر على فضح العصابات لخطوط خلية أخرى.
- أداء إيمونوبلوت استخدام تركيز البروتين اخترته في الخطوة رقم 3.3.4 لجميع خطوط الخلايا، وكرر الخطوات 3.2.1-3.2.8.
- إجراء قياس كثافة على بالأشعة الرقمية كما هو الحال في الخطوة 3.3.2. اختيار الصور التعرض التي تعطي إشارات ضمن النطاقات الخطي لكل جسم المحددة في الخطوة 3.3.3.
- استخدام إشارات كثافة الفرقة من التعرض المثالي من 3.4.1، حساب نسبة كثافة الفرقة البروتين المستهدف لتحميل التحكم الفرقة كثافة لكل خط الخلية. تشير هذه القيم نسبة إلى الوفرة النسبية للبروتين المستهدف للفائدة.
- إجراء اختبار ارتباط بيرسون (يمكن القيام به باستخدام حزمة برامج إحصائية) للربط بين القيم التي تم الحصول عليها من تحليل الصور إذا المصبوغة (الخطوة 2، 2) لتلك التي تم الحصول عليها من إيمونوبلوتينج (الخطوة 3.4.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان استخدام هذا البروتوكول لتأكيد قدرة IF لتحديد الكمية النسبية لمكافحة أبوبتوتيك البروتين Bcl-2 في خطوط الخلايا إلى كتل الأنسجة FFPE. ويمكن توضيح آليات النمطان Bcl-2 تحديد بشكل انتقائي في الخلايا السرطانية ويمكن أن تكون مفيدة في تشخيص المرضية وإبلاغ قرارات الإدارة السريرية24. وبشكل أكثر تحديداً، Bcl-2 يلعب دوراً في التنمية بليمفوسيتي السليمة والتعبير عن عادة التحقيق في سياق لمفوما25،،من2627. الشكل 1 يبين الخطوات التي تنطوي عليها في البروتوكول. في خطوة الأمثل إذا كانت أولية، تم اختبار تخفيف مختلف من الأجسام المضادة-Bcl-2 الابتدائي على الأنسجة البشرية لوزة استخدام الملطخ إيمونوهيستولوجي الآلي كما هو موضح في الخطوة 2، 1. الشكل 2 يحتوي على صور الشرائح الأنسجة الملون وتم مسحها ضوئياً من الأنسجة البشرية لوزة تلقي كل إضعاف مختلفة من الأجسام المضادة. ويمكن ملاحظة أن 01:50 هو تمييع المثلى التي أسفرت عن إشارة قوية وقليلاً الخلفية الفلورية. ثم استخدم هذا التخفيف على خط الخلية الجمعية التونسية للأمهات كما هو موضح في الخطوة 2، 2. وكان الملون الجمعية التونسية للأمهات أيضا استخدام DAPI للتعرف على نواة. مجموعة تضخيم إشارات على أساس تيراميدي استخدمت لتسمية Bcl-2 مع فلوروفوري Cy5. تحليل الصور استخدمت لقياس الإشارات Cy5 fluorescence هيولى نسبت Bcl-2 في كل خط الخلية. الصور التمثيلية لتلطيخ يتبين في الشكل 3. خطوط خلية مخلدة المختارة لهذه التجربة شملت مجموعة متنوعة من الخلية اللمفاوية المشتقة من خطوط، هي: 697، جيكو-1، جوركات، RCH-أوستريا، Granta-519، والريح، وراجي، بالإضافة إلى الحلة، المستمدة من سرطان عنق الرحم. خلايا هيلا معروفة للتعبير عن Bcl-2 في مستوى منخفض جداً28.
استناداً إيمونوبلوت أولية لكل خلية ثمانية خطوط، مصممة Granta-519 أن يكون أعظم وفرة Bcl-2 (غير معروضة). تخفيف المسلسل من ليستي Granta-519 استخدمت في immunoblot لاحقة للبحث عن النطاق الديناميكي الخطي Bcl-2 والإشارات جابده (تحميل عنصر التحكم) (الشكل 4 أ). تعرضت هذه إيمونوبلوت استخدام الماسح الضوئي الرقمي لفترات متفاوتة من الزمن. قياس كثافة استخدام برنامج تحليل الصور واستخدمت لقياس الإشارة من كل فرقة، وتم رسم هذه القيم مقابل الكمية من البروتين المحمل (الشكل 4 باء). من البيانات في الشكل 4 باء-أعلى، يمتد النطاق الديناميكي ل Bcl-2 في هذا التحليل من كثافة فرقة ما يقرب من الصفر إلى 7500 (خط وحدات التعسفي، الأزرق). صالح مرتين التعرض أعلى من الدرجة الثانية وغير-معادلة خطية، مما يوحي بالتعرض المفرط والتشبع من شدة الإشارات. نطاق جابده من 3000 إلى 6500 (وحدات التعسفي، و الشكل 4B-أسفل). قيم أقل من 3000 (وحدات التعسفي) انخفض فجأة حتى عند استخدام وقت تعرض منخفضة نسبيا. وضوح نتائج تعرض لفترة طويلة في التشبع. من هذه الرسوم البيانية، اتضح أن 12 ميكروغرام ستكون كمية معقولة من البروتين لتحميل عند تنفيذ إيمونوبلوت مع جميع خطوط الخلايا، حيث أسفرت هذه الكمية من البروتين Bcl-2 شدة قيم داخل النطاق الخطي للخلايا Granta-519، والحد من خطر التعرض المفرط لجميع خطوط الخلايا الأخرى.
وأجرى بعد ذلك كما هو الحال في الخطوة 3.4 إيمونوبلوت ثانية لجميع خطوط الخلايا ويتبين في الشكل 5A. وكان هذا وصمة عار المطلوبة منذ عصابات وصمة عار الأولية الواردة بكثافة إشارة خارج النطاق الخطي. برمجيات تحليل الصورة استخدمت لتحديد كثافة إشارة كل الفرقة في اسطوانة جديدة. واستخدمت فقط قيم الكثافة التي كانت ضمن النطاقات الحيوي المحدد أعلاه. الأسهم الموجودة على يمين الشكل 4B تثبت قيم الكثافة التمثيلية التي تم استخدامها وإظهار حيث أنها تدخل ضمن نطاق خطي. نسبة Bcl-ثم تم حساب 2:GAPDH لكل خط الخلية. هذه النسبة، جنبا إلى جنب مع إشارة الأسفار من إذا كان يتبين في الشكل 5B. اختبار ارتباط بيرسون تبين أن نسب كثافة من إيمونوبلوتينج كانت يرتبط ارتباطاً قويا وإيجابياً مع قراءات الكثافة من الكمية إذا (r = 0.983، ف < 0.001؛ انظر الشكل 5).
الكمية تقدير مبلغ Bcl-2 أثبت أن تكون صعبة للغاية نظراً لوجود طائفة واسعة من التعبير عن هذا البروتين عبر خطوط الخلية اختبار ثمانية. استخدام تعرض لفترة طويلة بما يكفي لالتقاط الإشارات انخفاض Bcl-2-وإذ يعرب عن خطوط الخلية (> 1 s) تجعل من الصعب على البقاء في النطاق الديناميكي لخطوط الخلايا Bcl-2-وإذ يعرب عن ارتفاع. في محاولة لقياس العصابات الباهتة التي تنتجها خطوط الخلية مثل الحلة وراجي، مرات عدة التعرض مختلفة، من 0.1 s إلى 5 ق، تم القبض على تحديد وقت التعرض أطول يمكن استخدامها في حين تبقى في النطاق الديناميكي للخلايا مثل Granta -519 (انظر الشكل 6). طبيعة هذا الأسلوب immunoblotting يحد من دقة الكشف عن إشارة كأحد النهج الضوضاء، مما يوحي باستخدامه على النحو الأمثل تحديد كمية البروتينات التي عثر عليها في مستويات التعبير متوسطة إلى عالية.
الشكل 1 : مخطط سير العمل البروتوكول. تم تشغيل الفلورة (إذا كان) في ميكرواري أنسجة خط خلية (تي أم أية) بالتوازي مع الكمية immunoblotting (IB) من خطوط الخلية نفسها. إشارات من كل خط الخلية مقارنة بارتباط بيرسون للتحقق من صحة قدرة البروتوكول إذا كانت الكمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : اختبار وتحسين بروتوكول الفلورة (إذا كان)- كانت أبواب لوزة المحتضنة مع تخفيف مختلفة من الأجسام المضادة-Bcl-2 (01:50, 1: 100، ولا جسم الأولية). كانت المحتضنة الشرائح مع جسم الثانوي HRP مترافق وتم تضخيم الإشارة المتقارن تيراميدي-Cy5 استخدام الشرائح كانت ملطخة DAPI. تم مسح الشرائح في 20 X التكبير باستخدام عامل تصفية مجموعات مناسبة إلى قمم الإثارة القصوى/الانبعاثات من 350/470 نانومتر و 649/666 نانومتر DAPI و Cy5، على التوالي. أوقات التعرض لكل منها 160 مرض التصلب العصبي المتعدد والسيدة 200 مجال الرؤية يتم توسيط عبر المسام اللمفاوية نفسه، الذي من المتوقع أن يكون Bcl-2 سلبية في مركز جيرمنال (وسط) وإيجابية في منطقة عباءة (الطرفية). 01:50 تمييع أعطى إشارة محددة fluorescence أقوى دون زيادة الإشارة غير محدد ولذلك تم استخدامه تمييع تسير إلى الأمام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الفلورة (إذا) استخدام خط الخلية الأنسجة ميكرواري (تي أم أية) المقاطع. مقاطع خط الخلية الجمعية التونسية للأمهات، والمحتضنة مع 01:50 إضعاف لمكافحة-Bcl-2 أو مع لا جسم الأولية. كانت المحتضنة الشرائح مع الجسم المضاد الثانوي وتم تضخيم الإشارة المتقارن تيراميدي-Cy5 استخدام الشرائح كانت ملطخة DAPI. تم مسح الشرائح في 20 X التكبير باستخدام عامل تصفية مجموعات مناسبة إلى قمم الإثارة القصوى/الانبعاثات من 350/470 نانومتر و 649/666 نانومتر DAPI و Cy5، على التوالي. كانت أوقات التعرض لكل منها 250 ms و 625 السيدة هذه الصور تمثيلية تشير إلى أن تلطيخ كانت ناجحة، وأن هناك تعبير مجموعة Bcl-2 عبر خطوط الخلية. الشريحة التحكم السلبي "لا جسم Bcl-2" لم تثبت أي إشارة Cy5، كما هو متوقع. صورة الممثل من خط خلية 697. مجموعة أساسية أنسجة لوزة (hyperplastic) وشملت على الجمعية التونسية للأمهات يدل على نمط مكافئ لذلك هو مبين في الشكل 2. الأسفار متوسط الكثافة (MFI) لكل خط الخلية مصممة بالتحديد الكمي لإشارة الأسفار Cy5 استخدام برنامج تحليل الصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : تحديد النطاق الديناميكي الخطي من إشارات إيمونوبلوت (IB)- (أ) IBs لتخفيف المسلسل من Granta-519 ليساتي. وقد تعرض كل وصمة عار لعدة مرات للبحث عن النطاق الديناميكي الخطي. (ب) كثافة الفرقة Bcl-2 (أعلى) وجابده (أسفل) مقابل مبلغ من مجموع البروتين المحملة ل IB في (ألف). كانت كمياً الفرقة كثافات استخدام برمجيات تحليل الصورة إيماجيج. Bcl-2 (أعلى)، ما زالت الإشارات الخطية في كامل نطاق كثافات الفرقة عند وقت التعرض المنخفضة ([ااكسب]) (0.2 s) كان المستخدمة (كثافة من 0-7,200) التي تدعمها معامل الارتباط بيرسون (قيمة r) 0.994 (ف < 0.001)، ولكن ليس من أجل زيادة أوقات التعرض ل s 1 و 2 دقيقة. جابده (أسفل)، ظلت البيانات الخطية أعلى كثافة 3000 (وحدات التعسفي) لمنخفضة (0.2 s) والمتوسطة (2.2 s) التعرض مرات تدعمها قيم r بيرسون 0.994 (ف < 0.001) و 0.992 (ف < 0.001)، على التوالي، ولكن ليس عن تعرض عالية مرة ( 7 s). تشير الأسهم على اليمين إلى كثافة الفرقة لخط خلية معينة حددت من إيمونوبلوت في الشكل 5A. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : كمية immunoblotting (IB) من خطوط الخلايا مخلدة والمقارنة إلى الفلورة (إذا كان)- (أ) المكتب الدولي لجميع خطوط الخلايا. تم تحميل كل بئر 12 ميكروغرام من البروتين الكلي. IB (ب) وإذا كانت إشارة كثافات لكل خط الخلية. إشارة IB هو نسبة Bcl-كثافة الفرقة 2:GAPDH من وصمة عار في (أ) حسب الكمية التي إيماجيج. إشارة إذا هو شدة الأسفار كل نواة خط الخلية على الجمعية التونسية للأمهات (الشكل 3) كما يحدده تحليل الصور. (ج) إشارة "سكاتيربلوت إذا" مقابل IB إشارة. وتمثل كل نقطة بيانات خط خلية معينة. الطريقتين نتائج مرتبطة خطيا مع قيمة r بيرسون من 0.984 (ف < 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : العثور على وقت التعرض الأمثل لكمية immunoblotting (IB)- ويرد IB من جميع خطوط الخلايا. تم تحميل ميكروغرام اثنا عشر من البروتين في كل بئر. لكل IB، استخدمت عدة مرات التعرض لالتقاط صورة حيث ظلت جميع العصابات داخل النطاق الديناميكي الخطي. أوقات التعرض للشرائط Bcl-2 وجابده كانت على التوالي: (أ) 0.1 s و 0.1 s، (ب) 1 s و 0.2 s، و (ج) 5 s ولوحات س. 5 ألف و جيم إظهار أمثلة لحالات التعرض فيها على الأقل بعض الفرق على وصمة عار كانت باهتة جداً أو أيضا قوية، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد قمنا بوصف أسلوب الذي يجعل من استخدام الكمية immunoblotting (IB) لإثبات جدوى الفلورة (إذا كان) للتحقق من الوفرة النسبية للبروتين المستهدف في عينات الأنسجة FFPE. أساليب القياس الكمي البروتين الحالية محدودة بطبيعتها القاطعة، مثل المدينة اللونية2،3، أو بالحاجة إلى مجانسة عينات، ومنع التحقيق في نموذج الهيكل وخلية السكان، مثل مع IB والكتلي8،9،،من1011. إذا كانت الكمية يمكن أن تتجاوز هذه القيود إذا هو التحقق من صحة الأسلوب وتطبيقه بعناية. بمقارنة قراءات إذا إلى iIF الكمية من خطوط الخلايا مخلدة، تمكنا من التحقق من طبيعة النهج إذا شبه كمي.
عينات الأنسجة الأولية من المرضى أو الحيوانات التجريبية غير متجانسة في أنها تحتوي على أنواع متعددة من الخلايا. يسمح تطبيق عدة أجسام الأولية في تعدد الإرسال إذا كان التحديد الكمي للبروتينات واحد أو أكثر من الاهتمام بأنواع محددة من الخلايا أو الخلايا المقصورات4،13. بالتحسين وتطبيق متعدد إذا هو خارج نطاق هذه المقالة لكن يرد بالتالي أوراق16،17،،من1829. فلسفة واسعة للسكان خلية التسمية وفقط تحديد كمية بروتين الفائدة في حجرة الخلايا المطلوب، على سبيل المثال الأنوية أو السيتوبلازم، في نوع الخلايا المطلوب. بمجرد تم التحقق من طبيعة إذا كانت الكمية بجسم معين ب IB الكمية، يمكن رفع درجة البروتوكول للسماح لتقدير البروتين السريع، الفائق في العينات السريرية. التطبيقات السريرية عموما تتطلب تحديد وفرة البروتين النسبي، بدلاً من أن تكون مطلقة،. ومع ذلك، يمكن إجراء هذا النهج إذا رسميا الكمية إذا لزم الأمر. على سبيل المثال، يمكن إعداد محلول يحتوي على المؤتلف تنقية البروتين Bcl-2 وكمياً باستخدام أسلوب قياسي بيوكيميائية. يمكن ثم تقييم تخفيف التسلسلي بواسطة IB الكمية وإنشاء منحنى قياسي لتقدير محتوى البروتين المطلق كل خلية في كل خط الخلية.
ونحن تطبيق البروتوكول إذا كان لدينا فروع الجمعية التونسية للأمهات تمثل عينات خزعة من 66 حالة نوفو دي منتشر كبير ب-الخلية اللمفاوية. أظهرت لنا نتائج مقبولة في إمكانية تكرار نتائج التشغيل لتشغيل (r بيرسون = 0.837) والرابطة القوية المتوقعة، وبين مركز "Bcl-2-إيجابية" يحدده ذاتيا في التهديف البصرية للمدينة التقليدية والتعبير مرتفعة تحدد موضوعيا بحالة (ف < 0.001). وعلاوة على ذلك، وفرة Bcl-2 قبل إذا ارتبط مع Bcl-2 مرناً وفرة في عينات نفس (سبيرمان ρ = 0.69، ف < 0.001) وكان أكبر بكثير في الحالات مع المكاسب نسخ عدد من الجينات BCL2 (p = 0.042) أو نقل جسد BCL2 على محور فائق (p = 0.004)، على نحو ما يحدده fluorescence في الموقع التهجين. حصلنا على نتائج ما يعادل في مجموعة منفصلة من الحالات. هذه النتائج التي توصل إليها تقديم أدلة إضافية تدعم إذا كوسيلة صالحة لتحديد الوفرة النسبية ل Bcl-2 في عينات FFPE الروتينية. وقد تم استخدام IF لتحديد عدة بروتينات العلامات البيولوجية الأخرى في العينات الأولية الموصوفة سابقا16،17.
الأمثل لهذا البروتوكول عملية مزدوجة. أولاً، إذا يجب أن يكون الأمثل مع الأجسام المضادة الأولية المستخدمة (الخطوة 2، 1). توحي الأجسام المضادة التجارية عادة تخفيف للبروتوكولات المدينة التي ينبغي أن تستخدم كنقطة انطلاق إلى جانب إضعاف أو اثنين أعلاه وأدناه هذا (أي، إذا أوصى 1: 100، إضافة 01:50 و 1:150). بعد إجراء IF ومسح الشريحة، عند تحديد أي تمييع "الأمثل" يستلزم الفحص البصري التعرف على إضعاف جسم الأساسي الذي يولد إشارة ألمع دون زيادة الأسفار الخلفية. المرحلة الثانية من التحسين ينطوي على اختيار كمية البروتين لتحميل إيمونوبلوت لضمان كل الفرقة لا يزال في نطاق الخطي (الخطوة 3، 4). ولضمان ذلك، تتم إيمونوبلوت استخدام مسلسل إضعاف خط الخلية التي تعرب عن وفرة أكبر من البروتين المستهدف. من هنا، يمكن رسم كثافات الفرقة مقابل كمية البروتين تحديد نطاقات كثافة من خلالها ما زالت الإشارة خطية. منذ إنشاء هذا النطاق في خط الخلية مع البروتين الهدف الأكثر وفرة، سيحقق جميع خطوط الخلايا الأخرى لكمية معينة من البروتين إشارات أقل. عند الانتقال إلى إيمونوبلوت لجميع خطوط الخلايا (الخطوة 3، 4)، يتم استخدام سلسلة إضعاف لتبلغ كمية بروتين لتحميل التي سوف تعطي إشارات قوية دون خطر التعرض المفرط خارج النطاق الخطي.
على الرغم من فوائد هذا البروتوكول، باستخدام إيمونوبلوتينج كوسيلة تحقق الكمي قصورها. الشاغل الرئيسي يدور حول طائفة واسعة من التعبير عن مختلف البروتينات بين العينات. قد يكون من الصعب إبقاء جميع العينات في حدود مجموعة الخطي إذا كان بعض نماذج التعبير عن البروتين للاهتمام بدرجة أكبر بكثير من غيرها. في نتائج تمثيلية الموضح أعلاه، تم القبض على التعرض متفاوتة للحصول على صورة فيها المتطرفة (العالية والمنخفضة) سواء داخل النطاق الديناميكي الخطي (الشكل 6). أكبر مما كان متوقعا إذا إشارات ينظر لخلايا هيلا وجوركات في الشكل 5B قد يشير إلى أما أدنى ممكن إذا كان إشارة لهذا النظام، أو أن الإشارات IB قد وصلت إلى الجزء السفلي من الكشف عن خطي الحد وهي أقل دقة. في كلتا الحالتين، وهذا يشير إلى أنه إذا كانت القيم في هذا النطاق أقل احتمالاً لأن تكون دقيقة في هذا النظام، وهذا الأسلوب الأمثل للبروتينات المتوسطة-للغاية-وأعرب عن. بالإضافة إلى ذلك، استخدام الأجسام المضادة الثانوية مترافق HRP ليس الحل الأمثل لأغراض الكمية، كما نوقش في وقت سابق فيما يتعلق بالمدينة2،3. باستخدام المعلمة فلوريسسينتلي الأجسام المضادة الثانوية immunoblot سيوفر تأكيدا أقوى أن إذا كان هو الواقع خطيا الكمية30،31، إلا أن قيمة r بيرسون 0.984 التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج الصحة الإنجابية-مترافق وكان الأجسام المضادة الثانوية في البروتوكول أعلاه يكفي للأغراض الحالية. أوجه القصور المحتملة المرتبطة إذا، مثل أوتوفلوريسسينسي وتبريد تختلف استناداً إلى الأجهزة المعملية الفردية والممارسات ونوع النسيج، ويمكن التقليل من قبل مختلف التدابير الوقائية32،33. يمكن رؤية كمية صغيرة جداً من أوتوفلوريسسينسي في النتائج الممثلة في عينة جسم Bcl-2 لا في الشكل 3، ولكن هذا المبلغ تافهة بالمقارنة مع IF المتبقية إشارات.
الحاجة إلى قياس دقة البروتينات ذات الاهتمام من عينات الأنسجة FFPE تتصل السريرية وأغراض البحث عبر العديد من المجالات البيولوجية. يحدد استخدام الكمية ولو على أقسام الأنسجة FFPE البروتوكول المعروضة هنا والتحقق من طبيعته شبه كمي قبل إيمونوبلوتينج خطوط الخلايا مخلدة. يسمح هذا الأسلوب الكمي عبر مجموعة واسعة نطاق ديناميكي، فضلا عن الحفاظ على السلامة الهيكلية لعينات الأنسجة، التي لا يتم الاحتفاظ في العديد من الأخرى الكمي أساليب3،،من811. بالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكول قابل للتكيف بسهولة ويمكن تطبيقها في البحوث وإعدادات السريرية، خاصة بالنسبة للبحوث المتعلقة بالسرطان والتشخيص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل جزئيا فردريك بانتنغ وتشارلز أفضل كندا الدراسات العليا المنح الدراسية (صباحا).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | - | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | - | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | - | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | - | For densitometry analysis |
References
- Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
- Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
- Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
- Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
- Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging? Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
- Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
- Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
- AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
- Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
- Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
- Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
- Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
- Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
- Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
- Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
- Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
- The Human Protein Atlas BCL2. , https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).
