Summary
Nicel immunoblotting ayirt Histoloji formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örnekleri ilgi bir protein miktarının aracı olarak görüntü analizi ile birleştiğinde doğrulamak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bizim sonuçlar biyomarker proteinler rutin biyopsi örneklerinde göreli miktarı ascertaining için ayirt Histoloji yarar gösterilmektedir.
Abstract
Miktar formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örnekleri ilgi proteinlerin klinik olarak önemli olduğunu ve araştırma uygulamaları. Miktar bir en iyi yöntem doğrudur, geniş bir doğrusal dinamik alanı vardır ve tek tek hücre tiplerinin tanımlanması için izin vermek için örnek yapısal bütünlüğünü korur. Geçerli yöntemleri immünhistokimya (IHC), kütle spektrometresi ve immunoblotting gibi her kategorik kendi doğası nedeniyle bu hükümleri yerine veya örnek homojenize gerekiyor. Alternatif bir yöntem ayirt (Eğer) ve faiz FFPE dokulara protein göreli bereket belirlemek için görüntü analizi öneriyorum. Burada biz bu yöntemi kolayca optimize edilmiştir, geniş dinamik alan verimleri ve nicel immunoblotting altın standart göre doğrusal olarak ölçülebilir göstermektedir. Ayrıca, bu yöntem örnek yapısal bütünlüğünü bakım izni ve tanılama uygulamalarda çok önemli olabilir çeşitli hücre tiplerinin düzeye çıkarılmasını sağlar. Genel olarak, bu FFPE örneklerinde proteinlerin göreli miktar için sağlam bir yöntemdir ve klinik uygun veya ihtiyaçları araştırma için kolayca adapte edilebilir.
Introduction
Proteinler formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku biyopsisi örneklerinde ölçmek için gereken birçok klinik alanda bulunmaktadır. Örneğin, miktar rutin biyopsi örnekleri biyomarker proteinlerin prognoz aydınlatmak ve tedavi kanser hastaları1için bilgilendirmek için kullanılır. Ancak, geçerli yöntemleri genellikle öznel ve doğrulama eksikliği.
İmmünhistokimya (IHC) patoloji laboratuvarlarında rutin olarak kullanılan ve genellikle birincil bir antikor hedef protein yönetmen ve horseradish peroksidaz2gibi enzimatik bir etiketi ile Birleşik bir ikincil antikor bağlıdır. Geleneksel IHC duyarlıdır, yapabilirsiniz dakika kullanımı örnekleri ve dolayısıyla protein ifade ile ilgili histolojik bağlamı içinde değerlendirilmesi erişimine izin verme doku örnekleri morfolojik bütünlüğünü korur. Ancak, IHC tarafından oluşturulan chromogenic sinyal Eksiltici olduğundan, nispeten dar Dinamik Aralık uğrar ve2,3,4çoğullama için sınırlı potansiyel sunmaktadır. Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi (MALDI-MSI) görüntüleme morfolojik bütünlüğünü korur. Ancak, gelişmekte olan bu teknoloji mütevazı morfolojik çözünürlük ile ilişkilidir ve önemli kalibrasyon ve normalleştirme, onun fizibilite rutin klinik kullanım5,6,7için kararlar almanı gerektirir. İmmunoblotting8, kütle spektrometresi9,10,11ve enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA)12, doku örnekleri protein ölçmek için alternatif teknikleri dahil her homojenize ile başladığı, örnek doku lysate. Birincil doku örnekleri türdeş olmayan çok sayıda hücre türleri içerdikleri vardır. Bu nedenle, homojenizasyon örnekleri gerektirecektir teknikleri bir protein miktar kanser hücreleri gibi ilgi belirli hücre nüfus izin vermez.
IHC, olsa gibi küçük ve ilgili FFPE örnekleri ve histolojik bütünlük13tutma izin verir. Ancak, floresan sinyallerini, katkı doğaya teşekkür Eğer birden çok birincil antikorlar ve floresan etiket uygulamaya müsait değil. Böylece, bir protein ilgi nispeten belirli hücreleri veya hücresel kompartmanlarda (örneğin, çekirdek karşı sitoplazma) diğer antikorları kullanılarak tanımlanmış içinde sayısal. Floresan sinyallerini de büyük bir Dinamik Aralık13,14avantajı var. Üstünlük, tekrarlanabilirlik ve çoğullama potansiyelini gösterdiği13,14,15FFPE örnekler için uygulanan olmuştur.
Burada nicel immunoblotting ilgi bir protein göreli bolluk belirlemede bilgisayar destekli görüntü analizi ile birleştiğinde nicel doğası tespit için altın standart olarak kurulan hücre hatları kullanarak nasıl kullanılacağını açıklar FFPE doku örnekleri histolojik bölümlerden. Bu yöntemde biyomarker proteinler klinik biyopsi örnekleri16,17,18ölçmek için çok katmanlı bir yaklaşım başarıyla uygulamış.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Birincil insan doku örnekleri kullanmak için onay Sağlık Bilimleri ve bağlı eğitim hastaneleri Araştırma Etik Kurulu (HSREB) Queen's University elde edildi.
1. hücre kültürünü doku Mikroarray (TMA) bina
- Hasat ve hücreleri yıkayın.
Not: Bu protokol üzerinde çeşitli kurulan ölümsüzleştirdi hücre satırları (Örneğin HeLa, Jurkat, RCH-ACV) test edilmiştir.- Bir kez onlar uzanmak yaklaşık % 80'i confluency yapışık hücreleri için yaklaşık 1.3 x 107 hücre hasat. Bu hücre satırı için uygun bir reaktif kullanarak hücre bağlantısını kesin.
Not: Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) yüzey proteinleri aşağılayıcı riskini azaltmak için tripsin üzerinde genellikle tercih edilir. Tripsin kullanıyorsanız, hemen hücreleri hasat sonrası fetal Sığır serum (FBS) kullanarak tripsin etkisiz hale getirin. - Süspansiyon hücreler için yaklaşık 8 x 107 hücreleri günlük-büyüme aşamasında hasat.
- Hasat/müstakil hücreleri 225 x g 50 mL konik tüp içinde 5 min için centrifuging tarafından toplamak.
- Süpernatant dikkatle boşaltmak ve pelet 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) X 10 ml yeniden askıya alma. 225 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak.
Not: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 ' te distile su 1 X PBS oluşmaktadır; pH 7.4 için ayarlayın.
- Bir kez onlar uzanmak yaklaşık % 80'i confluency yapışık hücreleri için yaklaşık 1.3 x 107 hücre hasat. Bu hücre satırı için uygun bir reaktif kullanarak hücre bağlantısını kesin.
- Formalin hücrelerde düzeltmek ve onları cips.
- Hücre Pelet konik tüp içinde 10 mL % 10 tarafsız tampon formalin (NBF) askıya alma.
Not: NBF 1 mL 1 X PBS 9 ml % 37 formaldehit stok çözeltisi sulandrarak hazır olun.
Dikkat: formalin ve formaldehit ele alırken dikkatli olun. Bir duman hood formalin ve formaldehit içeren adımları için kullanın. - Bir rocker (yaklaşık 17 h) gecede oda sıcaklığında 24 rpm'de hücrelerdeyse kuluçkaya.
- Düşük erime noktası özel PBS içinde % 1 çözeltisi (özel 1 mL PBS başına 0,01 g) hazırlayın.
- Özel çözüm hücre satır örnek başına 500 µL yetecek hazırlayın.
- Ara sıra 2-5 min için karıştırma ile bir 80 ° C su banyosu veya sıcak bir blok içinde özel geçiyoruz. Sonra çözünmüş, çözüm sertleşme önlemek için bir 37 ° C su banyosu veya sıcak bir blok içinde tutun.
- Sabit hücrelerden 1.2.2 225 x g., 5 min için centrifuging tarafından adım Pelet süpernatant çıkarın ve 1 x PBS 500 µL hücrelerde resuspend.
- Hücreleri, 290 x g. aspiratı tüm süpernatant 5 min için centrifuging tarafından 1.5 mL microcentrifuge tüp ve Pelet aktarın.
- Hücre Pelet konik tüp içinde 10 mL % 10 tarafsız tampon formalin (NBF) askıya alma.
- Özel hücrelerde döküm.
- ~ 500 µL hücreleri içeren her tüp (1.2.3. adımdaki) % 1'özel çözüm ekleyin. Yumuşak, ama hızlı bir şekilde karıştırmak için bir P-1000 micropipette kullanarak yukarı ve aşağı karışımı pipet.
Not: diyafram büyütmek ve kabarcıklar oluşturan önlemek için pipet ucu ucunu kesti. Çalışan özel çözüm sertleşme önlemek için 37 ° C su banyosu içinde tutun. - Oda sıcaklığında (5-10 dk) sertleşmesine özel hücre çözümü sağlar. NBF her microcentrifuge için bir örnek içeren tüp ve oda sıcaklığında (en fazla 24 saat) katıştırma parafin kadar tutmak % 10 1 mL ekleyin.
- ~ 500 µL hücreleri içeren her tüp (1.2.3. adımdaki) % 1'özel çözüm ekleyin. Yumuşak, ama hızlı bir şekilde karıştırmak için bir P-1000 micropipette kullanarak yukarı ve aşağı karışımı pipet.
- Özel tak parafin gömmek için hazırlayın.
- Örnekten NBF kapalı Aspire edin.
- Bir tıraş bıçağı kullanarak microcentrifuge Tüp tak plastik doku kaset yerleştirmek için hücre fişini çıkarın. % 10'luk kaset depolamak NBF oda sıcaklığında.
- Örnekleri işlemek ya el ile gece veya bir otomatik doku işlemci kullanarak ve parafin içinde standart Histoloji yöntemlerle embed.
Not: Bkz: Fischer ve ark. bir örnek protokolü için 19 . - Kullanarak, özel bir "doku arrayer" enstrüman, yinelenen 0,6 mm göbek parafin blok her hücre satırından ve, satır içinde bir hücreyi satır TMA oluşturmak için bir boş alıcı parafin blok eklemek hasat.
Not: Fedor ve De Marzo20dakikaya açıklananlar gibi standart yöntemleri kullanılmalıdır. - 2-3 ek doku türlerini (örn., bademcik, iki nokta üst üste, testis, vb) pozitif veya negatif denetimleri TMA temsil eden birincil örneklerinden çekirdek dahil. Faiz protein için uygun doku seçin.
- Bir microtome iki histolojik kesitler, yaklaşık 4-6 µm kalınlığında, hücre satırının TMA hazırlamak için kullanın. Histoloji slaytta bölümüne bağlayabilir, Kuru ve (Fedor ve De Marzo20içinde açıklandığı gibi) deparaffinize.
2. örnek tarafından ayirt boyama
- Birincil antikor seyreltme optimize edin.
Not: IHC veya Eğer optimizasyonu FFPE doku bölümlerde Kajimura vd gibi için için standart protokoller bulunmaktadır 21. yaklaşım kısa bir bakış burada özetlenen.- 4-5 dilutions üretici yönergelerine tarafından güdümlü faiz protein birincil antikor, hazır olun.
- Protein morfolojik tanınabilir hücre popülasyonlarının ilgi ifade eder bir hayvan veya insan kaynağından kontrol doku tipini belirleyin. Doku bölümlerini hazırlamak ve aşağıdaki gibi standart immünhistokimya yordamı Fedor ve De Marzo20slayt üzerindeki mount.
Not: Gerekli bölüm sayısı birincil antikor dilutions artı fazladan bir sayısıdır. - Bir otomatik veya el ile sistemi immunohistology için kullanıldığında, birincil antikor dilutions adım 2.1.1 her adım 2.1.2 slayttaki sınayın. Birincil antikor uygulamadan ilave slayt atlarsanız, bir negatif kontrol kullanın.
- Boyama işlemi sırasında tüm slaytlar ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) bir nükleer counterstain ve fluorescently etiketli bir ikincil antikor olarak leke. Daha fazla duyarlılık gerekliyse bir HRP (horseradish peroksidaz) kullanın-Birleşik ikincil antikor ve tyramide tabanlı sinyal güçlendirme sistemi (bkz: yığın vd. 13).
Not: birincil antikorlar çoğullama, farklı bir floresan etiket için her protein kullanılır. - Uyarma ve algılama dalga boylarında kullanılan fluorophores uygun kullanarak bir dijital resim dosyasını üretme yeteneğine sahip uygun bir araç kullanarak immunostained slaytlar inceden inceye gözden geçirmek.
- Dijital görüntüleri görebilir ve ampirik olarak sinyal şiddeti arka plan floresans göre en iyi duruma getirir birincil antikor seyreltme seçmek için uygun yazılımı kullanın.
Not: arzu edilirse, bu iyileştirme bir HRP Birleşik ikincil antikor, 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) ve aydınlık alan mikroskobu kullanılarak oluşabilir.
- Hücre kültürünü TMA boyama gerçekleştirin.
- TMA hücre satırıyla (2.1. adımda belirlenen) en iyi duruma getirilmiş birincil antikor seyreltme slayt leke için immunohistology için bir otomatik veya el ile sistemi kullanın. Birincil antikor uygulama ikinci slayttan atlarsanız, bir negatif kontrol kullanın.
- Boyama işlemi sırasında tüm slaytlar ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nükleer bir counterstain olarak ve bir ikincil antikor ve tyramide olduğu gibi adım 2.1.4 leke.
- Uyarma ve algılama dalga boylarında kullanılan fluorophores uygun kullanarak bir dijital resim dosyasını üretme yeteneğine sahip uygun bir araç kullanarak immunostained slaytlar inceden inceye gözden geçirmek.
- Faiz (Yani, sitoplazma karşı çekirdeği) hücresel bölmesinin tanımlamak ve her hücre satırı için Ortalama floresans yoğunluğu (MFI) ölçmek için bir görüntü analiz yazılım paketi kullanın.
Not: Çeşitli yazılım paketleri bu amaç için kullanılan ve birçok yığını ve ark. içinde ele alınmıştır 13.
3. kantitatif Immunoblotting hücre hatları
- Hücre Lysates hazırlayın.
- 2 milyon hücre her hücre satırın 1.1.1-1.1.3 adımlarda açıklandığı gibi hasat.
- Hücreleri aşağı vasıl 650 x g 50 mL konik tüp içinde 5 min için spin. Süpernatant dikkatle boşaltmak.
- Buz gibi PBS 10 mL hücrelerle yıkayın. Buz gibi PBS ve 1.5 mL microcentrifuge tüp transfer 1 ml resuspend. Adım başı olarak 3.1.2 santrifüj kapasitesi, dikkatle boşaltmak ve hücreler buz üzerinde bırakın.
- Soğuk radioimmunoprecipitation (RIPA) lizis arabelleği proteaz inhibitörleri (100 X inhibitörleri RIPA lizis arabellek mL başına 10 µL) ile yaklaşık 200 µL hücrelere ekleme girdap ve 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
Not: Lizis arabellek etkili lizis için gerekli miktarda hücre satırı ile değişir ve ampirik olarak belirlenebilir. RIPA arabellek 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, %1.0 NP-40, % 0.5 sodyum deoxycholate, % 0,1 SDS distile su içinde oluşur. - Nispeten bile immunoblots üzerinde yükleme sağlamak için her lysate Bradford tahlil gibi uygun bir yöntem kullanarak üzerinden 20 µL örnek Toplam protein ölçmek. 6 X Laemmli lizis arabelleği yaklaşık 40 µL kalan (yaklaşık 180 µL) her hücre lysate için ekleyin ve 5 min için bir ısı blok veya su banyoda 100 ° C'de kaynatın.
Not: arabellek 300 mM Tris-HCl (pH 6.8), % 4 (w/v) SDS, % 60 gliserol, % 0.6 (w/v) bromophenol mavi, oluşan 6 X Laemmli 50 mM dithiothreitol (DTT) içinde distile su. - Örnekleri-20 ° c ilâ iki hafta için saklayın.
- Hangi hücre kültürünü ilgi en bol protein belirlemek için tüm hücreleri satırlarının bir immunoblot gerçekleştirin.
Not: Mahmud, T. ve Yang, PC konusunda açıklanan yordamı izleyin. 22, aşağıdaki değişiklikler ile.- Aliquot hücre lysate (hazırlanan adım 3.1) içeren 10-50 µg protein (bağlı olarak protein ilgi bereket) microcentrifuge tüpler içine. 6 X Laemmli arabellek ve birimi 15 µL kadar açmak için yeterli RIPA lizis arabellek 2.5 µL ekleyin.
- Yük istifleme %5 ve uygun bir konsantrasyon (Örneğin, proteinler arasında 15-100 kDa için % 10) çözme SDS-sayfa jel bir protein merdiven ve adım 3.2.1 örneklerinden. 1 X Laemmli arabellek boş kuyu yükleyin. Güç kaynağı uygun ayarları genellikle 125 V, 80 dk ya da bromophenol mavi boya alt plaka ulaşıncaya kadar çalıştırın.
- Wiedemann vd içinde açıklandığı gibi bir yarı kuru protein aktarımı gerçekleştirmek 23.
Not: için temsilcisi sonuçları (metanol içinde batırılmış gerekmez) bir nitroselüloz membran, ve soğuk Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) aktarım arabellek kullanılmıştır. BSN arabellek 48 mM Tris, 39 mM glisin, % 20 metanol distile su içinde oluşur. - Aktarımdan sonra yatay olarak GAPDH gibi bir uygun iç kontrol protein dan ilgi protein içeren bölümünü ayırmak için membran kesmek için jilet kullanın.
- Birincil antikorlar üretici tarafından önerilen engelleme tampon kullanarak engelleme ve antikor incubations devam edin.
Not: Optimum birincil antikor dilutions önemli ölçüde protein bereket ve duyarlılık bağlı olarak değişebilir. GAPDH denetim 1:40,000 seyreltme gerekli iken aşağıdaki temsilcisi sonuçları için antikor protein ilgi 1:1,000 seyreltme gerekli. İkincil antikorlar kullanılan seyreltme 1:3, 000 olduğunu. - Antikor incubations ve membran yıkama sonra bir sandviç torbası gibi şeffaf plastik kılıf membran şeritler yerleştirin.
- Üreticinin yönergelerini izleyerek enchanced Kemiluminesan (ECL) karışımı hazırlayın. ECL karışımı ile membran kapak, kılıf kapatın ve 1-2 min için oda sıcaklığında karanlıkta karışımı ile membran şeritler kuluçkaya P-1000 pipet kullanın.
- Membran kılıf bir dijital görüntüleme platformu yerleştirin. Kemiluminesan ve kolorimetrik işaret algılama membran çeşitli pozlama yakalamak için kullanın.
Not: Pozlama süreleri yüklü protein miktarına göre değişir, bolluk hedef protein, bir kaç saniye hareketlerle bir otomatik pozlama (genellikle birkaç saniye) ve test pozlama süreleri üstündeki ve altındaki antikor benzeşme vb başlar. - Ampirik olarak, görüntü analiz yazılımı kullanarak belirlemek hangi hücre kültürünü en hedef protein ifade eder.
- Bir seri dilüsyonu kullanılarak her birincil antikor doğrusal dinamik aralığı bulmak.
- Adımları 3.2.1-3.2.8 gerçekleştirmek (3.2.9 adımda belirlediğiniz) hedef protein en yoğun ifade hücre satırından seri dilutions bir dizi kullanarak.
- Görüntü analiz yazılımı ImageJ gibi Dansitometresi pozlama görüntülerinde gerçekleştirmek için kullanın.
- Örneğin, ImageJ kullanarak, ilk sokağın jel ölçmek için seçmek için Dikdörtgen seçim aracını kullanın. Gidin analiz | Jelleri | İlk Lane seçin. Elde edilen dikdörtgen sonraki lane üzerinde hareket etmek için fareyi kullanın. Gidin analiz | Jelleri | İleri Lane seçin. Art arda gelecek şerit için dikdörtgeni taşımak ve lane şerit geri kalanı için seçin.
- Gidin analiz | Jelleri | Şerit Arsa. Düz çizgi aracı arka plan gürültü çıkarmak için her tepe üsleri arasında çizgiler çizmek için kullanın. Her tepe seçmek için değnek aracını kullanın ve bundan böyle grup yoğunluk sonuçları penceresinden başvurulan her tepe yoğunluğu toplamak.
- Dansitometresi çıkış bant yoğunluk karşı scatterplot toplam protein miktarı her birincil antikor için yüklü oluşturmak için kullanın. En uygun ve görsel denetim bir çizgi kullanarak, her antikor doğrusal dinamik aralığını (yoğunluk aralığı) konumunu belirleyin.
- Tüm hücre hatları ile ilerlemeye konsantrasyon için doğrusal Aralık sonundaki daha yüksek bir değer oluşturur bir protein konsantrasyonu seçin.
Not: Bu konsantrasyonu hücre satırı bu proteinin en büyük miktarda doygunluk düzeyin altında olduğu için olmalıdır tehlikesi yok diğer hücre hatları için bantları açığa üzerinde.
- 3.3.4. adımda tüm hücre satırlarını seçilen protein konsantrasyonu kullanarak bir immunoblot gerçekleştirmek ve adımları 3.2.1-3.2.8 tekrarlayın.
- Dansitometresi adım 3.3.2 olduğu gibi dijital tarama gerçekleştirin. 3.3.3. adımda tanımlanan her antikor için doğrusal aralıklarda sinyalleri verim pozlama görüntüleri seçin.
- 3.4.1 ideal maruziyetin gelen grup yoğunluğu sinyalleri kullanarak, hedef protein grubu yoğunluğu her hücre satırı için Grup yoğunluğunu kontrol yükleme için oranını hesaplamak. Bu oranı değerleri göreli bereket hedef protein ilgi gösterir.
- Pearson korelasyon testi (-ebilmek kılınmak istatistiksel yazılım paketi kullanarak) bu immunoblotting (adım 3.4.2) elde edilen görüntü analizi eğer boyama (adım 2.2) elde edilen değerler ilişkilendirmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eğer yetenek hücre hatlarında FFPE doku bloklar halinde yapılan anti-apoptotik protein Bcl-2 göreli miktarını belirlemek için onaylamak için kullanılan bu protokol. Sayısal Bcl-2 seçmeli olarak'kanser hücrelerinin oncogenic mekanizmaları aydınlatmak ve patolojik tanı ve klinik yönetim kararları24bilgilendirilmesi yararlı olabilir. Daha ayrıntılı olarak, Bcl-2 uygun B-lymphocyte gelişiminde bir rol oynar ve ifadesini sık lenfoma25,26,27bağlamında araştırıldı. Şekil 1 iletişim kuralında ilgili özet bilgiler. Bir ilk Eğer optimizasyon adımda birincil anti-Bcl-2 antikor çeşitli dilutions 2.1. adımda açıklandığı gibi bir otomatik immunohistology stainer kullanarak insan Bademcik dokusu üzerinde test edildi. Şekil 2 her antikor farklı bir seyreltme alınan insan Bademcik dokusu lekeli ve taranan Histoloji slaytlarının resimlerini içerir. O-ebilmek var olmak seen o 1:50 güçlü sinyal ve küçük arka plan floresans vermiştir en uygun seyreltme olduğunu. Bu seyreltme sonra cep telefonda 2.2 adımda anlatıldığı gibi TMA kullanıldı. TMA Ayrıca çekirdeği tanımlamak için DAPI kullanarak lekeli. Bir tyramide tabanlı sinyal güçlendirme kiti Bcl-2 Cy5 fluorophore ile etiketlemek için kullanıldı. Görüntü analizi her hücre satırı, Bcl-2'ye atfedilen sitoplazmik Cy5 floresan sinyal ölçmek için kullanıldı. Boyama temsilcisi görüntüleri Şekil 3' te görülebilir. Bu deneme için seçilen ölümsüzleştirdi hücre hatları türetilmiş lenfoid hücre hatları, yani 697 JeKo-1, Jurkat, RCH-zırhlı muharebe aracı, Granta-519, REH ve Raji, HeLa, serviks Karsinomu türetilmiş yanı sıra çeşitli dahil. HeLa hücreleri çok düşük düzeyde28, Bcl-2 hızlı olduğu bilinmektedir.
Tüm sekiz hücre satırları ilk bir immunoblot üzerinde bağlı olarak, Granta-519 Bcl-2 (gösterilmez) en büyük bereket var kararlıydı. Granta-519 lysate seri dilutions bir sonraki immunoblot Bcl-2 ve GAPDH (denetim yükleniyor) sinyalleri (Şekil 4A) doğrusal dinamik aralığı bulmak için kullanılmıştır. Bu immunoblot zaman değişen uzunlukları için dijital tarayıcı kullanarak maruz kalmış. Görüntü analiz yazılımı kullanarak Dansitometresi sinyal her gruptan ölçmek için kullanılan ve bu değerleri protein yüklü (Şekil 4B) miktarı karşı çizildi. Şekil 4Bverilerden-üst, bu tahlil Bcl-2 için dinamik aralığı yayılan üzerinden neredeyse sıfır 7500 (rasgele birimleri, mavi çizgi) olarak grup yoğunluğunu. İki yüksek pozlama süreleri ikinci dereceden ve non-lineer denklem dozun ton ve doygunluk sinyal şiddeti telkin, uygun. GAPDH 3000 için 6500 aralığıdır (rasgele birimleri, Şekil 4B-alt). 3000 (rasgele adet) altındaki değerler precipitously nispeten düşük çekim hızı kullanırken bile düştü. Uzun pozlama açıkça doygunluk sonuçlanır. Bu grafikler dan bu belirlendi bu 12 µg-cekti var olmak makul bir miktar protein bu protein miktarını azaltarak Granta-519 hücreler için doğrusal Aralık içindeki Bcl-2 yoğunluk değerleri vermiştir bu yana tüm hücre çizgilerle immunoblot işlemi sırasında yüklemek için diğer hücre hatları için overexposure riski.
Tüm hücre satırlarının ikinci bir immunoblot adım 3.4 olduğu gibi o zaman gerçekleştirilmiş ve Şekil 5A' görülebilir. Bu leke beri ilk leke bulunan gruplar doğrusal Aralık dışında bir sinyal şiddeti ile gerekli oldu. Görüntü analiz yazılımı her grupta yeni leke sinyal şiddetini belirlemek için kullanıldı. Yukarıda belirlenen dinamik aralığı içinde olduğunu yoğunluk değerleri kullanılmıştır. Şekil 4B sağındaki okları kullanılan temsilcisi yoğunluk değerleri ve nerede onlar doğrusal Aralık içinde uygun Haritayı gösterir. Bcl oranı-2:GAPDH sonra her hücre satırı için hesaplanmıştır. Eğer floresan sinyalini birlikte bu oran Şekil 5Biçinde görülebilir. Pearson korelasyon testi yoğunluk oranları üzerinden immunoblotting güçlü ve olumlu nicel Eğer gelen yoğunluk okuma ile ilişkili olduğunu göstermiştir (r = 0.983, p < 0,001; Şekil 5Cbakın).
Bcl-2 miktarı kantitatif değerlendirilmesi gibi sekiz test hücre hatları arasında geniş bir ifade bu proteinin özellikle zor olduğu ortaya çıktı. Düşük Bcl-2-ifade hücre hatları sinyal yakalamak için yeterince uzun bir pozlama kullanarak (> 1 s) yüksek Bcl-2-ifade hücre hatları için dinamik aralığında kalmak zorlaştırdı. Bir girişim HeLa ve Raji gibi hücre hatları tarafından üretilen hafif bantları ölçmek için birkaç farklı pozlama kez, 0.1 5'e s s, kameranın dinamik alanı hücreleri Granta gibi için kalan süre kullanılabilir en uzun pozlama süresi belirlemek için ele geçirildi -519 (bkz. Şekil 6). Bu immunoblotting teknik doğası olarak en iyi şekilde yüksek ara ifade düzeylerinde bulunan proteinler ölçmek için kullanılan düşündüren bir yaklaşımlar gürültü sinyali algılama doğruluğunu sınırlar.
Resim 1 : Protokolü iş akışı diyagramı. Ayirt (Eğer) bir hücre satırı doku Mikroarray (TMA) üzerinde paralel aynı hücre hatları nicel immunoblotting (IB) olarak çalıştırıldı. Her hücre satırı gelen sinyalleri Eğer Protokolü nicel yeteneğini doğrulamak için Pearson korelasyon tarafından karşılaştırılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Test ve ayirt (Eğer) iletişim kuralı en iyi duruma getirme. Bademcik bölümlerini anti-Bcl-2 antikor (1:50, 1: 100 ve hiçbir birincil antikor) farklı dilutions ile inkübe. Slaytları HRP Birleşik ikincil antikor ile inkübe, sinyal tyramide-Cy5 eşlenik kullanılarak güçlendirilmiş ve slaytlar ile DAPI lekeli. Slaytları tarandı 20 X büyütme filtresini kullanarak 350/470 maksimal uyarma/emisyon doruklarına uygun ayarlar nm ve 649/666 nm DAPI ve Cy5, anılan sıraya göre. 200 Bayan görüş alanı Bcl-2 olması beklenen aynı lenfoid folikül üzerinde ortalanmış ve ilgili pozlama süreleri edildi 160 ms (merkez) germinal Merkez içinde negatif ve pozitif (çevresel) manto bölgesinde. 1:50 seyreltme ezelî artan nonspesifik sinyal daha güçlü bir belirli floresans sinyal verdi bu nedenle bu ileriye seyreltme kullanıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : (Hücre satırı doku Mikroarray (TMA) bölümleri kullanıyorsanız) ayirt. Hücre kültürünü TMA bölümlerini almış ve 1:50 ile inkübe seyreltme hiçbir birincil antikor ile ya da anti-Bcl-2. Slaytları ikincil antikor ile inkübe, sinyal tyramide-Cy5 eşlenik kullanılarak güçlendirilmiş ve slaytlar ile DAPI lekeli. Slaytları tarandı 20 X büyütme filtresini kullanarak 350/470 maksimal uyarma/emisyon doruklarına uygun ayarlar nm ve 649/666 nm DAPI ve Cy5, anılan sıraya göre. İlgili pozlama zamanlardı 250 ms ve 625 Bayan temsilcisi bu görüntüleri göstermek boyama başarılı oldu ve hücre sınırları içinde bir aralığı Bcl-2 ifade olduğunu. "Hiçbir Bcl-2 antikor" negatif kontrol slayt herhangi bir Cy5 sinyal beklendiği gibi göstermek değil. 697 hücre satırından temsilcisi görüntüdür. Bir çekirdek hyperplastic Bademcik dokusu TMA dahil Şekil 2' de gösterilen için eşdeğer bir desen gösterir. Her hücre satırı için Ortalama floresans yoğunluğu (MFI) görüntü analiz yazılımı kullanarak Cy5 floresan sinyal miktarının tarafından tespit edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : İmmunoblot (IB) sinyalleri doğrusal dinamik aralığını belirleme. Granta-519 lysate seri dilutions(a)IBS. Her leke kez doğrusal dinamik aralığı bulmak için çeşitli için maruz kalmış. (B) grubu yoğunluğu Bcl-2 (üst) ve GAPDH (alt) karşı toplam protein miktarı için yüklü IB (a) için. Grup yoğunluklarda görüntü analiz yazılımı ImageJ kullanarak sayısal. Bcl-2 (üst), sinyalleri grup yoğunluklarını düşük pozlama (exp.) süresi zaman aralığı doğrusal kaldı (0,2 s) kullanılan (yoğunluklarda) 0-7200 üzerinden bir Pearson korelasyon katsayısı (r değeri) tarafından desteklenen 0.994 (p < 0.001), ama için değil gibiydi daha büyük pozlama süreleri 1 s ve 2 dak. GAPDH (alt) için veri doğrusal 3000 (rasgele adet) düşük bir yoğunluk yukarıda kaldı (0,2 s) ve Orta (2,2 s) pozlama süreleri olarak sırasıyla 0.994 (p < 0.001) ve 0.992 (p < 0.001), Pearson'ın değerleri r tarafından desteklenen, ancak değil yüksek bir pozlama için zaman () 7 s). Oklar sağdaki Şekil 5Aimmunoblot üzerinden tanımlanan belirli hücre satırı için Grup yoğunluk gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Sayısal immunoblotting (IB) ölümsüzleştirdi hücre satırları ve karşılaştırma için ayirt (IF). (A)IB tüm hücre hatları. Toplam protein 12 µg her kuyuya yüklendi. (B) IB ve eğer yoğunluklarda her hücre satırı için sinyal. IB sinyal Bcl oranıdır-2:GAPDH grup yoğunluk (A) ImageJ tarafından sayısal olarak blot üzerinden. Eğer sinyal TMA (Şekil 3) her hücre satırı çekirdeğini floresan yoğunluğu görüntü analizi tarafından belirlendiği gibi geliyor. (C) Eğer Scatterplot sinyal karşı IB sinyal. Her veri noktası bir belli bir hücre satır temsil eder. İki yöntem 0,984 (p < 0.001) Pearson r değeri ile doğrusal olarak ilişkili sonuçlar üretti. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Sayısal immunoblotting (IB) için en uygun pozlama süresi bulma. Tüm hücre satırlarının IB gösterilir. On İki mikrogram protein her kuyuya doluydu. Her IB için çeşitli pozlama süreleri bir yansımasını yakalamak için nerede kaldı bütün grupları doğrusal dinamik aralığı içinde kullanılmıştır. Bcl-2 ve GAPDH şeritler pozlama zamanlarında sırasıyla vardı: (A) 0.1 s ve 0.1 s, (B) 1 s ve 0,2 s ve (C) 5 s ve A ve C 5 s. panelleri göstermek Etkilenmeler örnekleri nerede en azından bazı grup üzerinde leke çok zayıf ya da çok güçlü, anılan sıraya göre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir yöntem tarif var nicel immunoblotting (IB) ayirt (Eğer) yardımcı programı göstermek için bir hedef protein FFPE doku örneklerinde göreli bolluk ascertaining için yararlandığına. Geçerli protein miktar yöntemleri chromogenic IHC2,3gibi kategorik doğaları gereği veya örnekleri gibi örnek nüfus yapısı ve hücre içine soruşturma önlenmesi, homojenize gerektiğinden sınırlıdır IB ve kütle spektrometresi8,9,10,11. Yöntem doğrulanmış ve dikkatli bir şekilde uygulanan nicel Eğer bu sınırlamalar aşabilir. Eğer okumayı nicel IIF ölümsüzleştirdi hücre hatları için karşılaştırarak, biz Eğer yaklaşım yarı kantitatif doğası doğrulamak başardık.
Birincil doku örnekleri hastalar veya deneysel hayvan türdeş olmayan birden çok hücre türleri içerdikleri vardır. Birkaç birincil antikorlar multiplex Eğer uygulama belirli hücre tipleri veya hücre bölmeler4,13ilgi bir veya daha fazla protein miktar izin verir. En iyi duruma getirme ve multiplex Eğer uygulanması bu makalenin kapsamı dışındadır ama aşağıdaki belgeleri16,17,18,29sıraladı. Geniş felsefe etiket hücre popülasyonlarının için olduğunu ve yalnızca istediğiniz hücre bölmesi, örneğin çekirdeği veya istenilen hücreye sitoplazma ilgi protein ölçmek. Bir kez Eğer nicel doğa ile belirli bir antikor nicel IB tarafından doğrulandı, iletişim kuralı izin vermek için hızlı, yüksek üretilen iş protein miktar klinik örneklerinde upscaled. Klinik uygulamalar genellikle göreli yerine mutlak, protein bereket belirlenmesi gerektirir. Ancak, Eğer yaklaşım gerekirse resmen nicel yapılabilir. Örneğin, saflaştırılmış rekombinant Bcl-2 protein içeren bir çözüm hazırlanmış ve biyokimyasal için standart bir yol kullanarak sayılabilir. Seri dilutions sonra nicel IB tarafından değerlendirilecektir ve her hücre satırındaki hücre başına mutlak protein içeriği tahmin etmek için standart bir eğri oluşturulur.
Biz bizim Eğer Protokolü biyopsi örnekleri de novo diffüz büyük B hücreli lenfoma 66 durumlarda temsil eden TMA bölümlerine uygulanır. Bizim sonuçları kabul edilebilir koş koş tekrarlanabilirlik gösterdi (Pearson r = 0.837) ve subjektif görsel Puanlama tarafından belirlenen "Bcl-2 pozitif" durumu arasında beklenen, güçlü Derneği geleneksel IHC ve yükseltilmiş ifade tespit Eğer objektif tarafından (p < 0.001). Ayrıca, Bcl-2 bereket eğer tarafından korelasyon Bcl-2 mRNA bolluk içinde aynı örnekleri ile (Spearman ρ 0,69, p < 0,001 =) ve kopya numarası kazançlar BCL2 gen bulunan olgularda önemli ölçüde daha fazla (p 0.042 =) ya da BCL2 translocation IGH odağı için (p = 0,004), floresans in situ hibridizasyon tarafından belirlendiği gibi. Biz durumlarda ayrı bir kohort eşdeğer sonuçlar elde. Bu bulgular Bcl-2 göreli bolluk içinde rutin FFPE numuneler belirlemek için geçerli yöntemi olarak eğer destekleyen ek kanıt sağlar. Eğer birkaç diğer biyomarker proteinler birincil örnekleri arasında ölçmek için kullanımı olmuştur daha önce açıklanan16,17.
Bu protokol optimizasyon iki kat işlemidir. Öncelikle, Eğer kullanılan birincil antikorlar ile optimize edilmiş olması gerekir (adım 2.1). Ticari antikorlar genellikle önermek dilutions ile birlikte bir seyreltme ya da yukarıdaki iki ve bunun altındaki bir başlangıç noktası olarak kullanılması gerektiğini IHC iletişim kuralları için (Yani, 1: 100 tavsiye, ekleyerek 1:50 ve 1:150). Eğer performans ve slayt tarama sonra hangi seyreltme "en iyi" olduğunu belirleme arka plan floresans artırmadan en parlak sinyali üretir birincil antikor seyreltme tanımlamak için görsel denetim üzerine kuruludur. İkinci aşamada en iyi duruma getirme için her grup doğrusal aralığı (adım 3.4) korumuş immunoblot yüklemek için protein miktarı seçtiğiniz içerir. Bunu sağlamak için bir immunoblot hedef protein en büyük zenginliği ifade eder hücre satırının seri dilüsyonu kullanılarak gerçekleştirilir. Burada, Grup yoğunluklarda karşı protein miktarı üzerinden sinyal doğrusal kalır yoğunluğu aralıkları belirlemek için çizilebilir. Bu Aralık en bol hedef protein ile hücre doğrultusunda kurulan bu yana, protein belirli bir miktar için daha düşük sinyalleri diğer hücre hatları ortaya çıkarır. Tüm hücre hatları (adım 3.4) bir immunoblot için taşırken, seyreltme serisi bu yüklemek için bir protein miktar dozun doğrusal Aralık ötesinde riski çalıştırmadan güçlü sinyaller verecektir bildirmek için kullanılır.
Bu iletişim kuralı faydaları rağmen bir miktar doğrulama yöntemi olarak immunoblotting kullanımı onun kusur vardır. Birincil endişe ifade örnekleri arasında çeşitli proteinler için geniş ürün yelpazesi etrafında döner. Biraz örnek protein diğerlerinden daha büyük bir ölçüde ilgi ifade edersek tüm örneklerini doğrusal bir aralığı sınırları içinde tutmak zor olabilir. Yukarıda gösterilen temsilcisi sonuçlarda aşırı (yüksek ve düşük) her ikisi de doğrusal dinamik aralığı (Şekil 6) içinde nerede bir görüntü elde etmek için farklı Etkilenmeler ele geçirildi. Daha fazla Şekil 5B HeLa ve Jurkat hücrelerinde görülen sinyalleri ya en düşük olası Eğer sinyal bu sistem için gösterebilir veya IB sinyalleri doğrusal algılama alt ulaştınız beklenenden sınırlamak ve daha az doğru. Her iki durumda da bu bu değerler o mesafeden daha az bu sistemde doğru olması muhtemeldir ve teknik orta - için son derece-proteinlerin için en uygun olduğunu gösterir. Ayrıca, ikincil antikorlar HRP Birleşik kullanımı IHC2,3ile ilgili olarak daha önce anlatıldığı gibi nicel amaçlar için en uygun değil. Fluorescently tagged ikincil antikorlar için immunoblot kullanarak gerçekten doğrusal nicel30,31, ancak, HRP Birleşik kullanılarak elde 0,984 Pearson r değeri ise daha sağlam bir onay sağlayacak Yukarıdaki Protokolü ikincil antikor geçerli amaçlar için yeterli. Olası eksiklikler gibi autofluorescence ve şoklama değişir Eğer ile ilişkili tek tek Laboratuvar araçları, uygulamaları ve doku türü dayanan ve çeşitli önlemler32,33tarafından en aza indirilebilir. Autofluorescence temsilcisi sonuçlarında çok az miktarda antikor örnek Şekil 3Bcl-2 yok görülebilir, ancak bu miktar ile karşılaştırıldığında kalan Eğer saçmadır sinyalleri.
Doğru bir şekilde ölçmek proteinler FFPE doku örnekleri dan ilgi gerek klinik ilgilidir ve araştırma amaçlı birçok biyolojik alanları arasında. Burada sunulan Protokolü FFPE doku bölümlerinde nicel Eğer kullanımı özetliyor ve yarı kantitatif doğası ölümsüzleştirdi hücre hatları immunoblotting tarafından doğrular. Bu yöntem miktar arasında geniş bir dinamik alan, aynı zamanda birçok diğer miktar yöntemleri3,8,11korunmaz doku örneği yapısal bütünlüğünü bakım sağlar. Ayrıca, bu iletişim kuralı kolayca uyarlanabilir ve araştırma ve klinik ayarları, özellikle kanser ile ilgili araştırma ve prognoz için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser kısmen Fredrick Banting ve Charles en iyi Kanada Yüksek Lisans Bursu (A.M.) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | - | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | - | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | - | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | - | For densitometry analysis |
References
- Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
- Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
- Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
- Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
- Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging? Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
- Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
- Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
- AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
- Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
- Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
- Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
- Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
- Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
- Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
- Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
- Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
- The Human Protein Atlas BCL2. , https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).
