Summary
We beschrijven het gebruik van kwantitatieve immunoblotting te valideren immunofluorescentie histologie beeldanalyse wordt gekoppeld als een middel voor het kwantificeren van een proteïne van belang in formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE). Onze resultaten tonen aan dat het nut van immunofluorescentie histologie voor het vaststellen van de relatieve hoeveelheid biomerker eiwitten in routine biopsie monsters.
Abstract
Kwantificering van proteïnen van belang in formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE) is belangrijk in de klinische en onderzoek toepassingen. Een optimale methode voor de kwantificering klopt, heeft een ruime lineaire dynamisch bereik en onderhoudt de structurele integriteit van het monster dat voor de identificatie van individuele celtypes. Huidige methoden zoals immunohistochemistry (IHC) en massaspectrometrie immunoblotting elk niet voldoen aan deze bepalingen als gevolg van hun categoriale aard of moeten het homogeniseren van het monster. Als een alternatieve methode, stellen wij voor het gebruik van Immunofluorescentie (IF) en beeldanalyse te bepalen van de relatieve overvloed aan een proteïne van belang in FFPE weefsels. Hierin aantonen we dat deze methode is eenvoudig geoptimaliseerd, een breed dynamisch bereik levert, en lineair kwantificeerbare ten opzichte van de gouden standaard van kwantitatieve immunoblotting. Bovendien, deze methode maakt het onderhoud van de structurele integriteit van het monster en zorgt voor het onderscheid van verschillende celtypes, die cruciaal zijn in diagnostische toepassingen kunnen zijn. Globaal, dit is een robuuste methodiek voor de relatieve kwantificering van eiwitten in FFPE monsters en kan gemakkelijk aangepast worden aan pak klinische of onderzoekbehoeften.
Introduction
De noodzaak om te kwantificeren van eiwitten in formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) biopsie weefselsteekproeven bestaat in veel klinische gebieden. Kwantificering van biomerker eiwitten in routine biopsie exemplaren wordt bijvoorbeeld gebruikt te verhelderen van prognose en behandeling van kanker patiënten1te informeren. Echter, huidige methoden zijn typisch subjectief en gebrek aan validatie.
Immunohistochemistry (IHC) wordt regelmatig gebruikt in laboratoria van de pathologie en over het algemeen hangt een primair antilichaam gericht op het doel-eiwit en een secundair antilichaam geconjugeerd met een enzymatische label zoals horseradish peroxidase2. Conventionele IHC is gevoelig, kan maken gebruik van minuut monsters en behoudt de morfologische integriteit van weefselmonsters zodoende beoordeling van eiwit expressie binnen zijn relevante histologische context mogelijk te maken. Echter, omdat het chromogenic signaal gegenereerd door IHC subtractieve, het lijdt aan een relatief smalle dynamisch bereik en biedt beperkte mogelijkheden voor multiplexing van2,3,4. Laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie imaging (MALDI-MSI) behoudt morfologische integriteit. Echter deze ontwikkelende technologie wordt geassocieerd met bescheiden morfologische resolutie en vereist significante kalibratie en normalisatie, afbreuk te doen aan de haalbaarheid ervan voor klinische routinegebruik5,6,7. Alternatieve technieken te kwantificeren van eiwit in weefselsteekproeven omvatten immunoblotting8, massaspectrometrie9,10,11, en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)12, elke van die met een gehomogeniseerde begint lysate steekproef weefsel. Primaire weefselsteekproeven zijn heterogene in dat zij een veelheid van soorten cellen bevatten. Daarom, technieken die met zich meebrengen homogenisatie van de monsters niet toegestaan kwantificering van een proteïne in een bepaalde cel bevolking van belang zoals kankercellen.
Zoals IHC, indien van toepassing is op kleine FFPE monsters en het behoud van de integriteit van de histologische13vergunningen. Echter dankzij de additieve aard van fluorescentie signalen, als is vatbaar voor de toepassing van meerdere primaire antilichamen en fluorescerende etiketten. Dus, een proteïne van belang relatief kan worden gekwantificeerd in bepaalde cellen of cellulaire compartimenten (bijvoorbeeld kern versus cytoplasma) gedefinieerd met behulp van andere antistoffen. Fluorescentie signalen hebben ook het voordeel van een groter dynamisch bereik13,14. De superioriteit, de reproduceerbaarheid en de multiplexing potentieel van geweest als toegepast op de FFPE monsters aangetoonde13,14,15.
Hierin beschrijven we het gebruik van kwantitatieve immunoblotting met behulp van bestaande cellijnen als een gouden standaard om na te gaan van de kwantitatieve aard van als in combinatie met de computer-assisted beeldanalyse bij het bepalen van de relatieve overvloed aan een proteïne van belang in histologische secties van FFPE weefselmonsters. Wij hebben deze methode met succes in een multiplex aanpak te kwantificeren biomerker eiwitten in klinische biopsie monsters16,17,18toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Goedkeuring voor het gebruik van primaire menselijk weefselmonsters was verkregen van de Gezondheidswetenschappen en de aangesloten Opleidingsziekenhuizen onderzoek Ethics Board (HSREB) aan de Queen's University.
1. opbouw van een cellijn weefsel Microarray (TMA)
- Oogst en wassen van de cellen.
Opmerking: Dit protocol is getest op verschillende bestaande vereeuwigd cellijnen (bijvoorbeeld HeLa, Jurkat, RCH-ACV).- Voor Adherente cellen, oogsten ongeveer 1.3 x 107 cellen zodra zij ongeveer 80% confluentie bereiken. Loskoppelen van cellen met behulp van een reagens dat geschikt is voor die cellijn.
Opmerking: Ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) is over het algemeen de voorkeur over trypsine om het risico van vernederende oppervlakte-eiwitten. Als trypsine, neutraliseren de trypsine met behulp van foetale runderserum (FBS) direct na het oogsten van de cellen. - Voor schorsing cellen, oogsten ongeveer 8 x 107 cellen in log-fase van groei.
- De cellen geoogst/uitneembaar verzamelen door centrifugeren gedurende 5 minuten op 225 x g in een conische tube van 50 mL.
- Giet het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 mL, 1 X met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer gedurende 5 minuten op 225 x g en decanteren van de bovendrijvende substantie.
Opmerking: 1 X PBS bestaat uit 137 mM NaCl 2,7 mM KCl, 10 mM nb2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 in gedistilleerd water; Breng de pH op 7.4.
- Voor Adherente cellen, oogsten ongeveer 1.3 x 107 cellen zodra zij ongeveer 80% confluentie bereiken. Loskoppelen van cellen met behulp van een reagens dat geschikt is voor die cellijn.
- Bevestigen van de cellen in formaline- and -pellet hen.
- Suspendeer de pellet cel binnen de conische buis in 10 mL 10% neutraal gebufferde formaline (NBF).
Opmerking: NBF kan bereid worden door verdunnen 1 mL van de stockoplossing 37% formaldehyde in 9 mL 1 X PBS.
Let op: Wees voorzichtig met het hanteren van formaline en formaldehyde. Gebruik een zuurkast voor stappen waarbij formaline en formaldehyde. - Incubeer de cellen op een rocker van 24 toeren per minuut bij kamertemperatuur 's nachts (ongeveer 17 h).
- Bereid een 1%-oplossing van lage smeltpunt agarose in PBS (0,01 g agarose per 1 mL PBS).
- Bereiden genoeg voor 500 µL van agarose oplossing per cel lijn monster.
- Los de agar in een 80 ° C water bad of warmte blok, onder af en toe omzwenken voor 2-5 min. Zodra ontbonden, bewaar deze oplossing in een 37 ° C water bad of warmte blok ter voorkoming van verharding.
- Pellet de vaste cellen uit stap 1.2.2 door centrifugeren gedurende 5 minuten op 225 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 µL van 1 x PBS.
- Breng de cellen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge en pellet door centrifugeren voor 5 min op 290 x g. Aspirate korting op alle van de bovendrijvende substantie.
- Suspendeer de pellet cel binnen de conische buis in 10 mL 10% neutraal gebufferde formaline (NBF).
- Gegoten cellen in agarose.
- Voeg ~ 500 µL van 1% agarose-oplossing (uit stap 1.2.3) aan elke buis met de cellen. Zachtjes, maar snel, Pipetteer mengsel op en neer met behulp van een P-1000 micropipet te mengen.
Opmerking: Is afgesneden van het einde van het uiteinde van de pipet uit te breiden van het diafragma en vermijden van de vorming van luchtbellen. Houd de werkoplossing agarose in het waterbad 37 ° C ter voorkoming van verharding. - Laat de agarose-cell oplossing te verharden (5-10 min) bij kamertemperatuur. Voeg 1 mL 10% NBF aan elke microcentrifuge buis waarin een monster en houden bij kamertemperatuur tot paraffine insluiten (maximaal 24 uur).
- Voeg ~ 500 µL van 1% agarose-oplossing (uit stap 1.2.3) aan elke buis met de cellen. Zachtjes, maar snel, Pipetteer mengsel op en neer met behulp van een P-1000 micropipet te mengen.
- Voorbereiden op de stekker van de agarose paraffine insluiten.
- Gecombineerd uit de NBF uit het monster.
- Verwijder de stekker van de cel met behulp van een scheermesje te snijden de microcentrifuge buis, de stekker in kunststof weefsel cassette plaatsen. Opslaan van cassettes in 10% NBF bij kamertemperatuur.
- Verwerken van de monsters overnachting ofwel handmatig of met behulp van een geautomatiseerde weefsel processor en inbedden in paraffine met behulp van standaard histologie methoden.
Opmerking: Zie Fischer et al. 19 voor een voorbeeld-protocol. - Met behulp van een gespecialiseerde "weefsel arrayer" instrument, oogst dubbele 0.6 mm kernen van de paraffine blokkeren elke cel-regel en voeg ze, in rijen, in een lege ontvangende paraffine blok te creëren een cellijn TMA.
Opmerking: Standaard methoden moeten worden gebruikt zoals die welke beschreven in Fedor en De Marzo20. - Nemen kernen van primaire monsters vertegenwoordigen 2-3 extra weefseltypes (HLA) (bijvoorbeeld tonsillen, dikke darm, testes, etc.) als positieve of negatieve controles in de TMA. Kies weefsels die geschikt voor de proteïne van belang zijn.
- Gebruik een microtoom te bereiden twee histologische secties, ongeveer 4-6 µm dik, voor de cellijn TMA. Monteren van de sectie op een dia histologie, drogen en deparaffinize (zoals beschreven in Fedor en De Marzo20).
2. monster met immunofluorescentie kleuring
- Optimaliseer de verdunning van primair antilichaam.
Opmerking: Standaard protocollen bestaan voor de optimalisatie van IHC of als voor FFPE weefselsecties zoals in Kajimura et al. 21. een beknopt overzicht van de aanpak is hier geschetst.- Maak 4-5 verdunningen van primaire antilichaam aan de proteïne van belang laten leiden door de instructies van de fabrikant.
- Identificatie van een type besturingselement weefsel van een dier of mens bron die uitdrukt van de proteïne van belang in morfologisch herkenbare cel populaties. Bereiden van secties van het weefsel en bevestig ze op een dia na standaard immunohistochemistry procedure zoals in Fedor en De Marzo20.
Opmerking: Het aantal secties vereist is het aantal primaire antilichaam verdunningen plus één extra. - Met behulp van een automatische of handmatige systeem voor immunohistology, testen de primair antilichaam verdunningen uit stap 2.1.1, elk op een dia uit stap 2.1.2. De toepassing van primair antilichaam van de extra dia weglaten en gebruiken als een negatieve controle.
- Tijdens de kleuring vlekken alle dia's met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) als een nucleaire counterstain en een fluorescently tagged secundair antilichaam. Als grotere gevoeligheid vereist is, gebruikt u een HRP (mierikswortelperoxidase)-geconjugeerd secundair antilichaam en systeem van de versterking van de tyramide gebaseerde signaal (Zie Stack et al. 13).
Opmerking: Wanneer multiplexing primaire antilichamen, een verschillende TL label wordt gebruikt voor elk eiwit. - Scannen van immunostained dia's met behulp van een passend instrument zijn geschikt voor het genereren van een digitaal beeld-bestand met behulp van excitatie en detectie golflengten worden de fluorophores die werden gebruikt.
- Juiste software gebruiken om te bekijken de digitale beelden en empirisch Kies het primaire antilichaam verdunning die signaalsterkte ten opzichte van de achtergrond fluorescentie optimaliseert.
Opmerking: Indien gewenst, kan deze optimalisatie optreden met behulp van een HRP-geconjugeerde secundair antilichaam, 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) en helderveld microscopie.
- Uitvoeren als op de cellijn TMA kleuring.
- Een automatische of handmatige systeem voor immunohistology gebruiken om een dia aan van de cellijn TMA met de geoptimaliseerde primair antilichaam verdunning (zoals bepaald in stap 2.1) vlek. De toepassing van primair antilichaam van de tweede dia weglaten en gebruiken als een negatieve controle.
- Tijdens de kleuring vlekken alle dia's met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) als een nucleaire counterstain, en met een secundair antilichaam en tyramide zoals in stap 2.1.4.
- Scannen van immunostained dia's met behulp van een passend instrument zijn geschikt voor het genereren van een digitaal beeld-bestand met behulp van excitatie en detectie golflengten worden de fluorophores die werden gebruikt.
- De softwarepakket van een beeld-analyse gebruiken voor het identificeren van de cellulaire compartiment van belang (dat wil zeggen, cytoplasma versus nucleus) en kwantificeren van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) voor elke regel van de cel.
Opmerking: Verschillende softwarepakketten kunnen worden gebruikt voor dit doel en velen worden besproken in de Stack et al. 13.
3. kwantitatieve Immunoblotting van cellijnen
- Bereiden lysates van cellen.
- Oogst 2 miljoen cellen van elke regel van de cel, zoals beschreven in stappen 1.1.1 aan 1.1.3.
- Spin cellen naar beneden voor 5 min op 650 x g in een conische tube van 50 mL. Giet het supernatant.
- Cellen met 10 mL ijskoud PBS wassen. Resuspendeer in 1 mL ijskoud PBS en transfer naar een 1,5 mL microcentrifuge buis. Per stap 3.1.2 centrifugeren, decanteren en laat cellen op ijs.
- Ongeveer 200 µL van koude radioimmunoprecipitation (RIPA) lysis-buffermengsel met proteaseinhibitors (10 µL van 100 X remmers per mL RIPA lysis-buffermengsel) toevoegen aan de cellen, vortex en incubeer op ijs gedurende 15 minuten.
Nota: Het bedrag van lysis buffer nodig voor lysis van de effectieve varieert per cellijn en empirisch kan worden bepaald. De buffer RIPA is samengesteld uit de 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1.0 NP-40%, 0,5% natrium deoxycholate, 0,1% SDS in gedestilleerd water. - Om ervoor te zorgen zelfs relatief laden op de immunoblots, de totale proteïne in een 20 µL monster uit elke lysate met behulp van een geschikte methode zoals de analyse van Bradford te kwantificeren. Voeg ongeveer 40 µL van 6 X Laemmli lysis buffer naar de rest (ongeveer 180 µL) van elke cel lysate en koken bij 100 ° C in een warmte blok of water bad gedurende 5 minuten.
Opmerking: 6 X Laemmli buffer bestaat uit 300 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% (m/v) SDS, 60% glycerol, 0,6% (m/v) bromophenol blauw, 50 mM dithiothreitol (DTT) in gedestilleerd water. - Het opslaan van de monsters bij-20 ° C voor maximaal twee weken.
- Het uitvoeren van een immunoblot van alle cellen regels om te bepalen welke cel regel heeft de overvloedigste proteïne van belang.
Opmerking: De procedure beschreven in Mahmood, T. en Yang, PC. 22, met de volgende wijzigingen.- Aliquot cel lysate (bereid in stap 3.1) met 10-50 µg eiwit (afhankelijk van de overvloed van de proteïne van belang) tot microcentrifuge buizen. Voeg 2.5 µL van 6 X Laemmli buffer en voldoende RIPA lysis-buffermengsel om het volume tot 15 µL.
- Een 5% stapelen en een geschikte concentratie oplossen (bijvoorbeeld10% voor eiwitten tussen 15-100 kDa) laden SDS-pagina gel met een eiwit-ladder methode en de monsters uit stap 3.2.1. Laden 1 X Laemmli buffer in lege wells. Voer de voeding op de juiste instellingen, meestal voor de 125 V, 80 min of totdat de bromophenol blauwe kleurstof de bodem van de plaat bereikt.
- Een semi-droge eiwit overdraagt, zoals beschreven in Wiedemann et al. 23.
Opmerking: voor de representatieve resultaten, een membraan van het nitrocellulose (dat hoeft niet te worden gedrenkt in methanol), en koude Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) overdracht buffer werden gebruikt. BSN buffer is samengesteld uit 48 mM Tris, 39 mM glycine, 20% methanol in gedestilleerd water. - Na overdracht, gebruik een scheermesje te snijden het membraan horizontaal van elkaar te scheiden van het gedeelte met de proteïne van belang van een passende interne controle eiwitten, zoals GAPDH.
- Ga verder met blokkeren en het antilichaam incubations met behulp van de buffer met blokkerend aanbevolen door de fabrikant van de primaire antilichamen.
Opmerking: Optimale primair antilichaam verdunningen kunnen sterk variëren afhankelijk van eiwit overvloed en gevoeligheid. Voor de representatieve resultaten hieronder vereist het antilichaam aan de proteïne van belang een verdunning van 1:1,000 terwijl het besturingselement GAPDH een verdunning van 1:40,000 vereist. De verdunning van secundaire antilichamen gebruikt was 1:3, 000. - Na het antilichaam incubations en wassen van het membraan, plaats u de membraan-strips in een doorzichtige plastic omhulsel zoals een sandwich zak.
- Bereiden verrukken chemiluminescentie (ECL) mengsel volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik een pipet P-1000 te dekken van het membraan met het ECL mengsel, sluit u de schede en Incubeer de membraan stroken met het mengsel in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1-2 minuten.
- Plaats het omhulsel van het membraan in een digitale imaging platform. Chemoluminescentie en colorimetrische marker detectie gebruiken om vast te leggen van de verschillende posities van het membraan.
Opmerking: Blootstelling tijden zullen variëren, afhankelijk van de hoeveelheid eiwit geladen, overvloed van doel eiwit, affiniteit van het antilichaam etc. beginnen met een automatische belichting (meestal een paar seconden), en test belichtingstijden boven en onder met stappen van een paar seconden. - Empirisch, of met behulp van de software van de analyse van de afbeelding, bepalen welke cellijn brengt de meest doel-eiwit.
- De lineaire dynamische waaier van elke primair antilichaam dat met behulp van een seriële verdunning vinden.
- Uitvoeren van de stappen 3.2.1-3.2.8 met behulp van een aantal seriële verdunningen van de cellijn die spreekt van de hoogste concentratie van het eiwit van de doelgroep (geïdentificeerd in stap 3.2.9).
- Gebruikt afbeelding analysesoftware zoals ImageJ densitometrie uitvoeren op de beelden van de blootstelling.
- Bijvoorbeeld ImageJ, gebruiken het gereedschap Rechthoekige selecties te selecteren van de eerste baan van de gel te kwantificeren. Ga naar analyseren | Gels | Selecteer eerste Lane. De muis gebruiken om de resulterende rechthoek naar de volgende baan. Ga naar analyseren | Gels | Selecteer volgende Lane. Herhaaldelijk de rechthoek verplaatsen naar de volgende baan en selecteer de baan voor de rest van de rijstroken.
- Ga naar analyseren | Gels | Plot rijstroken. Gebruik de Rechte lijn -tool om lijnen te tekenen over de basis van elke piek achtergrondgeluiden verwijderen. Het gereedschap toverstaf Selecteer elke piek, en het verzamelen van de dichtheid van elke piek, voortaan aangeduid als band intensiteit, vanuit het venster resultaten .
- Gebruik de uitgang maken een scatterplot van de band intensiteit ten opzichte van het bedrag van de totale proteïne geladen voor elke primair antilichaam densitometrie. Met behulp van een regel van de beste pasvorm en visuele inspectie, bepalen de locatie (intensiteit bereik) van het lineaire dynamische bereik van elke antilichaam.
- Kies een eiwitconcentratie die een waarde op het hogere eind van het lineaire bereik genereert als de concentratie vooruit met alle cellijnen.
Opmerking: Aangezien deze concentratie lager dan het verzadigingsniveau in de cellijn met de grootste hoeveelheid van dit eiwit is, moet er geen gevaar van over bloot van de bands voor de andere cellijnen.
- Uitvoeren van een immunoblot met behulp van de eiwitconcentratie gekozen in stap 3.3.4 voor alle cellijnen en herhaalt u stappen 3.2.1-3.2.8.
- Densitometrie op de digitale scans zoals in stap 3.3.2 uitvoeren. Kies de beelden van de posities die signalen binnen de lineaire bereiken voor elke antilichaam die geïdentificeerd in stap 3.3.3 opleveren.
- Met behulp van de band intensiteit signalen van de ideale posities van 3.4.1, berekenen de verhouding van doel de intensiteit van de band van de eiwitten voor het laden van de controle-intensiteit van de band voor elke regel van de cel. Deze verhouding-waarden geven aan de relatieve abundantie van de doel-proteïne van belang.
- Het uitvoeren van een Pearson correlatie test (kan worden gedaan met behulp van een statistische softwarepakket) te correleren de waarden, verkregen uit beeldanalyse van de kleuring als (stap 2.2) aan die verkregen immunoblotting (stap 3.4.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol werd gebruikt voor het bevestigen van het vermogen van als om te bepalen van de relatieve hoeveelheid van het anti-apoptotic eiwit Bcl-2 in cellijnen FFPE weefsel blokken verfilmd. Quantifying Bcl-2 selectief in kankercellen oncogene mechanismen kan verhelderen en nuttig kan zijn in de pathologische diagnose en voorlichtingstaak ten aanzien van klinische behandeling besluiten24. Meer in het bijzonder, Bcl-2 speelt een rol in goede lymfocyt ontwikkeling en haar expressie is vaak onderzocht in het kader van lymfoom25,26,27. Figuur 1 beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het protocol. In een eerste stap voor de optimalisering van de IF, werden verschillende verdunningen van het primaire antilichaam anti-Bcl-2 getest op menselijke tonsillen weefsel met behulp van een geautomatiseerde immunohistology stainer zoals beschreven in stap 2.1. Figuur 2 bevat beelden van de histologie gebeitst en gescande dia's van menselijke tonsillen weefsel dat elk een verschillende verdunning van antilichaam ontvangen. Het kan worden gezien dat 1:50 is de optimale verdunning die sterk signaal en weinig achtergrond fluorescentie opgeleverd. Deze verdunning werd vervolgens gebruikt op de cellijn TMA zoals beschreven in stap 2.2. De TMA was ook gekleurd met behulp van de DAPI te identificeren kernen. Een tyramide gebaseerde signaal versterking kit werd gebruikt voor het label van Bcl-2 met een Cy5 fluorophore. Beeldanalyse werd gebruikt voor het kwantificeren van de cytoplasmatische Cy5 fluorescentie signaal toegeschreven aan Bcl-2 in elke cel-regel. Representatieve beelden van de kleuring kunnen worden gezien in Figuur 3. De vereeuwigd cellijnen gekozen voor dit experiment inbegrepen een scala aan lymfoïde-afgeleide cellijnen, namelijk 697, JeKo-1, Jurkat, RCH-ACV, Granta-519, REH en Raji, naast HeLa, afgeleid van een cervicale carcinoom. De HeLa cellen is bekend dat het betuigen van Bcl-2 op een zeer laag niveau28.
Op basis van een eerste immunoblot van alle acht cellijnen, werd Granta-519 vastgesteld dat de grootste overvloed van Bcl-2 (niet afgebeeld). Seriële verdunningen van de Granta-519 lysate werden gebruikt in een latere immunoblot te vinden van het lineaire dynamische bereik van de Bcl-2 en GAPDH (laden controle) signalen (figuur 4A). Deze immunoblot werd blootgesteld met behulp van de digitale scanner voor verschillende lengtes van tijd. Densitometrie met behulp van de software van de analyse van de afbeelding te kwantificeren van het signaal van elke band werd gebruikt, en deze waarden werden uitgezet tegen de hoeveelheid eiwit geladen (figuur 4B). Uit de gegevens in figuur 4B-top, het dynamisch bereik voor Bcl-2 in deze test omvat van de intensiteit van een band van bijna nul tot 7500 (willekeurige eenheden, blauwe lijn). De twee hogere belichtingstijden passen een kwadratisch en niet-lineaire vergelijking, suggereren overbelichting en verzadiging van de signaalsterkte. Het bereik voor de GAPDH is van 3000 tot 6500 (willekeurige eenheden, figuur 4B-bodem). De waarden onder 3000 (willekeurige eenheden) gedaald plotsklaps zelfs bij het gebruik van een relatief lage blootstellingstijd. Een lange blootstelling leidt duidelijk tot verzadiging. Uit deze grafieken, werd vastgesteld dat 12 µg zou een redelijke hoeveelheid eiwitten om te laden bij het uitvoeren van de immunoblot met alle cellijnen, aangezien deze hoeveelheid eiwit intensiteitswaarden van de Bcl-2 binnen het lineaire bereik voor de cellen van Granta-519 leverde, verminderen het risico van overmatige blootstelling voor alle andere cellijnen.
Een tweede immunoblot van alle cellijnen vervolgens werd uitgevoerd zoals in stap 3.4 en kan worden gezien in figuur 5A. Deze vlek was sinds de eerste vlek bevatte bands met een signaalsterkte buiten het lineaire bereik nodig. De software van de analyse van de afbeelding werd gebruikt om te bepalen van de signaalsterkte van elke band in de nieuwe vlek. Alleen de intensiteitswaarden die binnen het dynamische bereik bepaald waren boven werden gebruikt. De pijlen aan de rechterkant van de figuur 4B tonen representatieve intensiteitswaarden die werden gebruikt en Toon waar ze binnen het lineaire bereik passen. De verhouding van Bcl-2:GAPDH werd vervolgens berekend voor elke regel van de cel. Deze verhouding, samen met het signaal van de fluorescentie van als te zien in figuur 5B. Een Pearson correlatie test aangetoond dat de verhoudingen van de intensiteit van immunoblotting waren sterk en positief gecorreleerd met de lezingen van de intensiteit van kwantitatieve als (r = 0.983, p < 0.001; Zie figuur 5C).
Kwantitatieve beoordeling van het bedrag van Bcl-2 bleek bijzonder moeilijk want er een breed scala van expressie van dit proteïne over de acht geteste cellijnen was. Met behulp van een lang genoeg blootstelling te vangen het signaal van de lage Bcl-2-uiten cellijnen (> 1 s) maakte het moeilijk om te blijven in het dynamische bereik voor de hoge Bcl-2-uiten cellijnen. In een poging om het kwantificeren van de zwakke banden geproduceerd door cellijnen zoals HeLa en Raji, diverse verschillende blootstelling tijden, van 0,1 s tot 5 s, werden gevangen genomen om te bepalen van de langste belichtingstijd dat kan worden gebruikt terwijl het blijven in het dynamische bereik voor cellen zoals Granta -519 (Zie Figuur 6). De aard van deze techniek immunoblotting beperkt de nauwkeurigheid van signaal detectie als één benaderingen lawaai, suggereren dat optimaal wordt gebruikt voor het kwantificeren van eiwitten gevonden meningsuiting intermediair op hoog niveau.
Figuur 1 : Protocol Werkstroomdiagram. Immunofluorescentie (IF) op een cel lijn weefsel microarray (TMA) werd uitgevoerd in parallel aan kwantitatieve immunoblotting (IB) van de dezelfde cellijnen. Signalen van elke cellijn met elkaar worden vergeleken Pearson correlatie met het valideren van de kwantitatieve capaciteit van het als protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Testen en optimaliseren van het protocol van de immunofluorescentie (IF). Secties van de tonsillen werden geïncubeerd met verschillende verdunningen van het antilichaam van de anti-Bcl-2 (1:50, 1:100 en geen primair antilichaam). De dia's werden geïncubeerd met HRP-geconjugeerde secundair antilichaam, het signaal werd versterkt met behulp van een tyramide-Cy5 conjugaat en de dia's werden gekleurd met DAPI. De dia's werden gescand op 20 X vergroting met filter ingesteld worden op de toppen van de maximale excitatie/emissie van 350/470 nm en 649/666 nm voor DAPI en Cy5, respectievelijk. Respectieve belichtingstijden waren 160 ms en 200 ms. het gezichtsveld is gecentreerd over de dezelfde lymfoïde follikel, die naar verwachting worden Bcl-2 in de (centrale) germinal center negatief en positief in de (perifere) mantel-zone. De 1:50 verdunning gaf een sterkere specifieke fluorescentie-signaal zonder verhoging van het niet-specifieke signaal werd dus het gebruikt als de verdunning gaan vooruit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Immunofluorescentie (IF) met behulp van cel baanvakken weefsel microarray (TMA). Secties van de cellijn TMA werden gegrepen en geïncubeerd met een 1:50 verdunning van anti-Bcl-2 of met geen primair antilichaam. De dia's werden geïncubeerd met secundair antilichaam, het signaal werd versterkt met behulp van een tyramide-Cy5 conjugaat en de dia's werden gekleurd met DAPI. De dia's werden gescand op 20 X vergroting met filter ingesteld worden op de toppen van de maximale excitatie/emissie van 350/470 nm en 649/666 nm voor DAPI en Cy5, respectievelijk. Respectieve belichtingstijden waren 250 ms en 625 ms. deze representatieve beelden aangeven dat kleuring succesvol was, en dat er een bereik van Bcl-2 uitdrukking over de cellijnen. De "geen Bcl-2 antilichaam" negatieve controle dia heeft niet aangetoond dat elke Cy5 signaal, zoals verwacht. De representatieve beeld is van de 697 cellijn. Een kern van hyperplastische tonsillen weefsel opgenomen op de TMA toont een gelijkwaardig patroon weergegeven in Figuur 2. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) voor elke cellijn werd bepaald door het kwantificeren van de Cy5 fluorescentie signaal met behulp van de software van de analyse van de afbeelding. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Bepalen van de lineaire dynamisch bereik van de signalen van de immunoblot (IB). (A) IBs seriële verdunningen van Granta-519 lysate. Elke vlek was blootgesteld voor allerlei tijden te vinden van de lineaire dynamisch bereik. (B) Band intensiteit voor Bcl-2 (boven) en GAPDH (onder) versus hoeveelheid totaal eiwit geladen voor IB in (A). Band intensiteiten werden gekwantificeerd aan de hand van de afbeelding analysesoftware ImageJ. Voor Bcl-2 (boven), bleef de signalen in het hele assortiment van band intensiteiten wanneer een laag belichtingstijd (exp.) lineaire (0,2 s) werd gebruikt (intensiteiten van 0-7200) wordt ondersteund door de een Pearson correlatiecoëfficiënt (r-waarde) van 0.994 (p < 0.001), maar niet voor grotere blootstelling tijden van 1 s en 2 min. GAPDH (onder), bleef de gegevens lineaire boven een intensiteit van 3000 (willekeurige eenheden) voor lage (0,2 s) en medium (2.2 s) belichtingstijden als ondersteund door Pearson's r-waarden voor 0.994 (p < 0.001) en 0.992 (p < 0.001), respectievelijk, maar niet voor een hoge blootstelling tijd () 7 s). Pijlen aan de rechterkant geven aan de intensiteit van de band voor de specifieke cellijn van de immunoblot figuur5a geïdentificeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Kwantitatieve immunoblotting (IB) van vereeuwigd cellijnen en vergelijking met immunofluorescentie (IF). (A) IB van alle cellijnen. 12 µg totaal eiwit werd in elk putje geladen. (B) IB en als signaal intensiteiten voor elke regel van de cel. Het IB-signaal is de verhouding van Bcl-2:GAPDH band intensiteit van de vlek in (A) zoals gekwantificeerd door ImageJ. Het als signaal is de intensiteit van de fluorescentie van elke cel lijn core op de TMA (Figuur 3), zoals bepaald door beeldanalyse. (C) Scatterplot van als signaal versus IB signaal. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een bepaalde cel-regel. De twee methoden geproduceerd lineair gecorreleerde resultaten met een Pearson r waarde van 0.984 (p < 0,001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Het vinden van de optimale belichtingstijd voor kwantitatieve immunoblotting (IB). IB van alle cellijnen wordt weergegeven. Twaalf microgram eiwit waren geladen in elk putje. Voor elke IB, werden verschillende belichtingstijden gebruikt om een afbeelding hebt vastgelegd waar alle bands bleef binnen de lineaire dynamisch bereik. De belichtingstijden van de Bcl-2 en GAPDH strips werden respectievelijk: (A) 0,1 s en 0,1 s, (B) 1 s en 0,2 s, en (C) 5 s en 5 s. panelen A en C tonen voorbeelden van posities waar in ieder geval sommige van de bands op de vlek te vaag waren of te sterke, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij hebben een methode beschreven dat maakt gebruik van kwantitatieve immunoblotting (IB) om aan te tonen het nut van Immunofluorescentie (IF) voor het vaststellen van de relatieve overvloed van een doel-eiwitten in FFPE weefselmonsters. Huidige eiwit kwantificering methoden worden beperkt door hun categorische aard, zoals chromogenic IHC2,3, of door de noodzaak om het homogeniseren van monsters, voorkomen van onderzoek naar de monster-structuur en cel populaties, zoals met IB en massaspectrometrie8,9,10,11. Kwantitatieve als kan deze beperkingen overstijgen, als de methode wordt gevalideerd en zorgvuldig toegepast. Door het vergelijken van de uitlezingen als aan kwantitatieve iIF van vereeuwigd cellijnen, konden we voor het valideren van de semi-kwantitatieve aard van de IF-aanpak.
Primaire weefselmonsters van patiënten of proefdieren zijn heterogene omdat ze meerdere celtypes bevatten. De toepassing van verschillende primaire antilichamen in multiplex als toelaat het kwantificeren van een of meer proteïnen van belang in specifieke celtypes of cel compartimenten4,13. De optimalisatie en toepassing van multiplex als valt buiten het bestek van dit artikel maar wordt beschreven in de volgende papieren16,17,18,29. De globale filosofie is om de label-cel populaties en alleen het kwantificeren van de proteïne van belang in de gewenste cel compartiment, bijvoorbeeld kernen of cytoplasma, in de gewenste celtype. Zodra de kwantitatieve aard als met een bepaald antilichaam is geverifieerd door kwantitatieve IB, kan het protocol worden opgeschaalde zodat voor snelle, hoge-doorvoer eiwit kwantificering in klinische monsters. Klinische toepassingen vereisen in het algemeen de bepaling van de relatieve, in plaats van absolute, eiwit overvloed. Echter kan de aanpak als formeel kwantitatieve indien nodig worden gemaakt. Bijvoorbeeld een oplossing met gezuiverde recombinant eiwit van Bcl-2 kan worden voorbereid en gekwantificeerd aan de hand van een biochemische standaardmethode. Seriële verdunningen kunnen vervolgens worden geëvalueerd door kwantitatieve IB en een standaard curve gegenereerd te schatten het absolute eiwitgehalte per cel in elke cel-regel.
Wij ons als protocol toegepast op TMA secties vertegenwoordigen biopsie monsters van 66 gevallen van DOVO diffuus grote B-cel lymfoom. Onze resultaten aangetoond aanvaardbaar run-to-run reproduceerbaarheid (Pearson r = 0.837) en de verwachte, sterke associatie tussen "Bcl-2-positieve" status bepaald subjectief door visuele scoren van conventionele IHC en verhoogde expressie bepaald objectief door IF (p < 0,001). Bovendien, Bcl-2 overvloed door als gecorreleerd met Bcl-2 mRNA overvloed in de dezelfde monsters (Spearman ρ = 0,69, p < 0.001) en was significant groter in gevallen met nummer winsten van de kopie van het BCL2 gen (p = 0.042) of translocatie van BCL2 aan de IGH locus (p = 0.004), zoals bepaald door fluorescentie in situ hybridisatie. Wij verkregen gelijkwaardige resultaten in een aparte cohort van gevallen. Deze bevindingen geven extra bewijs dat al als een geldige methode ondersteunt voor het bepalen van de relatieve overvloed van Bcl-2 in de routine FFPE exemplaren. Het gebruik van IF te kwantificeren van verschillende andere biomerker eiwitten in primaire monsters geweest eerder beschreven16,17.
Optimalisatie van dit protocol is een tweeledig proces. Eerste, als met de primaire antilichamen die gebruikt moet worden geoptimaliseerd (stap 2.1). Commerciële antilichamen vaak suggereren verdunningen voor IHC protocollen die moeten worden gebruikt als uitgangspunt samen met een verdunning of twee hierboven en hieronder dit (dat wil zeggen, indien 1:100 aanbevolen, voeg 1:50 en 1:150). Na het uitvoeren van de IF en de dia scannen, om te bepalen welke verdunning is "optimale" met zich meebrengt visuele inspectie ter identificatie van de primair antilichaam verdunning die de helderste signaal genereert zonder verhoging van fluorescentie van de achtergrond. De tweede fase van de optimalisatie omvat het kiezen van de hoeveelheid eiwitten om te laden voor de immunoblot om ervoor te zorgen dat elke band blijft in het lineaire bereik (stap 3.4). Om hiervoor te zorgen, wordt een immunoblot uitgevoerd met behulp van een seriële verdunning van de cellijn die de grootste overvloed aan target eiwit uitdrukt. Hiervandaan kan de band intensiteiten versus eiwit bedrag te bepalen van de intensiteit bereiken waardoor het signaal lineaire blijft worden uitgezet. Aangezien dit bereik is gevestigd in de cellijn met de meest voorkomende doelstelling eiwit, voor een bepaalde hoeveelheid eiwit zal alle andere cellijnen opleveren lagere signalen. Bij het verplaatsen naar een immunoblot van alle cellijnen (stap 3.4), wordt de verdunningsreeks gebruikt om te informeren een eiwit bedrag te laden die sterke signalen zonder het risico van overmatige blootstelling buiten het lineaire bereik zal opleveren.
Ondanks de voordelen van dit protocol, het gebruik van immunoblotting als een kwantificering verificatiemethode heeft haar tekortkomingen. De primaire zorg draait rond het grote bereik van meningsuiting voor verschillende eiwitten tussen exemplaren. Het kan moeilijk zijn om alle monsters binnen de grenzen van een lineaire reeks houden als sommige monsters express de proteïne van belang zijn voor een veel grotere mate dan anderen. In de representatieve resultaten hierboven, verschillende belichtingen gevangengenomen om een beeld te krijgen waar de extremes (hoog en laag) zijn beide binnen de lineaire dynamische bereik (Figuur 6). De groter dan verwachte als signalen gezien voor de HeLa en Jurkat cellen in figuur 5B kunnen duiden op beide de laagste mogelijke als signaal voor dit systeem, of dat de IB-signalen hebben bereikte de bodem van de lineaire detectie beperken en zijn minder nauwkeurig. Hoe dan ook, dit geeft aan dat als de waarden in dat bereik zijn minder waarschijnlijk worden nauwkeurig in dit systeem, en dat de techniek is optimaal voor de middellange - tot hoog-uitgedrukt eiwitten. Bovendien is het gebruik van secundaire antilichamen HRP-geconjugeerde is niet optimaal voor kwantitatieve doeleinden, zoals eerder is besproken met betrekking tot IHC2,3. Met behulp van fluorescently tagged secundaire antilichamen voor de immunoblot zou bieden een meer robuuste bevestiging dat het als is inderdaad lineair kwantitatieve30,31, echter de Pearson r waarde van 0.984 die zijn verkregen met behulp van de HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen in het bovenstaande protocol was voldoende voor de huidige toepassing. Mogelijke tekortkomingen gekoppeld als, zoals autofluorescence en blussen variëren gebaseerd op individuele laboratorium instrumentatie, praktijken en weefseltype, en kunnen worden geminimaliseerd door diverse preventieve maatregelen32,33. Een zeer kleine hoeveelheid autofluorescence in de representatieve resultaten in geen enkel monster Antilichaam Bcl-2 in Figuur 3kan worden gezien, maar dit bedrag is triviaal in vergelijking met de resterende als signalen.
De noodzaak om proteïnen van belang van weefselmonsters van de FFPE nauwkeurig te kwantificeren heeft betrekking op klinische en doeleinden onderzoek over vele biologische velden. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van kwantitatieve als op FFPE weefselsecties en valideert de semi-kwantitatieve aard door immunoblotting van vereeuwigd cellijnen. Met deze methode kunt kwantificering over een breed dynamisch bereik, evenals het behoud van de structurele integriteit van het monster van weefsel, is niet bewaard gebleven in vele andere kwantificering methoden3,8,11. Bovendien, dit protocol is eenvoudig aan te passen en kan worden toegepast in onderzoek en klinische instellingen, met name voor kanker-onderzoek en prognose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de Fredrick Banting en Charles Best Canada Graduate beurs (A.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | - | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | - | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | - | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | - | For densitometry analysis |
References
- Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
- Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
- Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
- Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
- Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging? Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
- Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
- Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
- AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
- Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
- Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
- Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
- Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
- Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
- Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
- Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
- Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
- The Human Protein Atlas BCL2. , https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).
