Summary
Describimos el uso de immunoblotting cuantitativa para validar la histología inmunofluorescencia juntada con análisis de la imagen como medio de cuantificación de la proteína de interés en muestras de tejido formalina-fijo, parafina-encajado (FFPE). Nuestros resultados demuestran la utilidad de la histología de la inmunofluorescencia para determinar la cantidad relativa de proteínas biomarcadoras en muestras de biopsia de rutina.
Abstract
Cuantificación de proteínas de interés en muestras de tejido formalina-fijo, parafina-encajado (FFPE) es importante en clínica y aplicaciones de la investigación. Un método óptimo de cuantificación es preciso, tiene un rango dinámico lineal amplio y mantiene la integridad estructural de la muestra para permitir la identificación de tipos de células individuales. Los métodos actuales como la inmunohistoquímica (IHQ), espectrometría de masas y immunoblotting cada uno no cumplan con estas disposiciones debido a su naturaleza categorial o necesitan homogeneizar la muestra. Como método alternativo, proponemos el uso de inmunofluorescencia (IF) y análisis de imagen para determinar la abundancia relativa de una proteína de interés en los tejidos FFPE. Aquí se demuestra que este método se optimiza fácilmente, produce un amplio rango dinámico y es linealmente cuantificable en comparación con el estándar de oro de immunoblotting cuantitativa. Además, este método permite el mantenimiento de la integridad estructural de la muestra y permite la distinción de varios tipos de células, que puede ser crucial en aplicaciones de diagnóstico. En general, esto es un método robusto para la cuantificación relativa de proteínas en muestras FFPE y puede adaptarse fácilmente para adaptarse a clínica o investigación necesidades.
Introduction
Existe la necesidad de cuantificar proteínas en muestras de biopsia de tejido de (FFPE) de formalina-fijos, parafina-encajado en muchos campos clínicos. Por ejemplo, cuantificación de proteínas biomarcadoras en especímenes de la biopsia de rutina se utiliza para aclarar el pronóstico y tratamiento para pacientes de cáncer1de informar. Sin embargo, los métodos actuales son generalmente subjetivos y carecen de validación.
Inmunohistoquímica (IHC) es utilizado rutinariamente en laboratorios de patología y generalmente depende de un anticuerpo primario contra la proteína diana y un anticuerpo secundario conjugado con una etiqueta enzimática como la peroxidasa de rábano picante2. IHC convencional es sensible, puede hacer uso de minutos de muestras y preserva la integridad morfológica de muestras de tejido, lo que permite la evaluación de la expresión de la proteína dentro de su contexto histológica relevante. Sin embargo, porque la señal cromogénica generada por IHC es sustractiva, se adolece de un relativamente estrecho rango dinámico y ofrece un potencial limitado de multiplexación2,3,4. Espectrometría de masas del desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MSI) la proyección de imagen preserva integridad morfológica. Sin embargo, este desarrollo de la tecnología está asociado con una modesta resolución morfológica y requiere calibración significativo y normalización, de afectar su viabilidad para el uso clínico rutinario5,6,7. Técnicas alternativas para cuantificar proteínas en muestras de tejido son immunoblotting8, espectrometría de masas en9,10,11y enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo12, cada de que comienza con un homogeneizado lisado del tejido de la muestra. Las muestras de tejido primario son heterogéneas que contienen una multitud de tipos celulares. Por lo tanto, técnicas que implican la homogeneización de las muestras no permiten la cuantificación de una proteína en una población celular particular de interés, como las células cancerosas.
Como IHC, si es aplicable a las pequeñas muestras de FFPE y permite la retención de la integridad histológica13. Sin embargo, gracias a la naturaleza aditiva de las señales de fluorescencia, si es favorable a la aplicación de múltiples anticuerpos primarios y etiquetas fluorescentes. Por lo tanto, una proteína de interés se puede cuantificarse relativamente dentro de compartimentos celulares (por ejemplo, núcleo y citoplasma) definidas por medio de otros anticuerpos o de células específicas. Señales de fluorescencia también tienen la ventaja de un mayor rango dinámico13,14. La superioridad, la reproducibilidad y la multiplexación potencial de si se aplica a muestras FFPE ha sido demostrada13,14,15.
Adjunto describimos el uso de immunoblotting cuantitativo utilizando las líneas celulares establecidas como patrón oro para determinar la naturaleza cuantitativa de si junto con análisis de imagen asistida por ordenador para determinar la abundancia relativa de una proteína de interés en secciones histológicas de muestras de tejido FFPE. Hemos aplicado este método con éxito en un enfoque múltiple para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de biopsia clínica16,17,18.
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Protocol
Aprobación de las muestras de tejido humano primario se obtuvo de las Ciencias de la salud y afiliados a hospitales de enseñanza investigación ética Junta (HSREB) en la Universidad de la reina.
1. construcción de una línea celular tejido microarrays (TMA)
- Cosecha y lavado de células.
Nota: Este protocolo ha sido probado en varias líneas celulares inmortalizadas establecidas (por ejemplo, HeLa, Jurkat, RCH-ACV).- Para las células adherentes, cosecha aproximadamente 1.3 x 107 células una vez que alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia. Separar las células mediante un reactivo apropiado para esa línea celular.
Nota: Ácido etilendiaminotetracético (EDTA) se prefiere generalmente encima tripsina para reducir el riesgo de degradar proteínas de la superficie. Si usando tripsina, neutralizar la tripsina con suero bovino fetal (FBS) inmediatamente después de la cosecha de las células. - Para las células de suspensión, de la cosecha aproximadamente 8 x 107 células en fase logarítmica de crecimiento.
- Recoger las células cosechadas/separado por centrifugación durante 5 min a 225 g de x en un tubo cónico de 50 mL.
- Decantar el sobrenadante y Resuspenda el sedimento en 10 mL de 1 X de tampón fosfato salino (PBS). Centrifugar durante 5 min a 225 x g y decantar el sobrenadante.
Nota: 1 X PBS está compuesto por NaCl 137 mM, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 en agua destilada; ajustar el pH a 7,4.
- Para las células adherentes, cosecha aproximadamente 1.3 x 107 células una vez que alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia. Separar las células mediante un reactivo apropiado para esa línea celular.
- Fijar las células en formol y los pellets.
- Suspender el precipitado de células en el tubo cónico en 10 mL de formalina tamponada neutra 10% (NBF).
Nota: NBF se puede preparar diluyendo 1 mL de solución stock de formaldehído al 37% en 9 mL de 1 X PBS.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manejar el formol y formaldehído. Utilice una campana de humos para pasos con formalina y formaldehído. - Incubar las células en un eje de balancín a 24 rpm a temperatura ambiente durante la noche (aproximadamente 17 h).
- Preparar una solución de agarosa de bajo punto de fusión en PBS 1% (0,01 g de agarosa por 1 mL PBS).
- Preparar suficiente para 500 μl de solución de agarosa por muestra de línea celular.
- Disolver la agarosa en un 80 ° C agua calor o baño de bloque, con la mezcla ocasional 2-5 minutos. Una vez disuelto, mantener la solución a 37 ° C calor o baño bloque de agua para prevenir el endurecimiento.
- Pellets de las células fijas de paso 1.2.2 por centrifugación durante 5 min a 225 x g. quitar el sobrenadante y resuspender las células en 500 μl de PBS 1 x.
- Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y de pellets por centrifugación durante 5 min a 290 x g. Aspire todo el sobrenadante.
- Suspender el precipitado de células en el tubo cónico en 10 mL de formalina tamponada neutra 10% (NBF).
- La fundición de las células en agarosa.
- Añadir ~ 500 μl de solución de agarosa al 1% (del paso 1.2.3) a cada tubo que contiene las células. Con suavidad, pero rápidamente, pipetee mezcla arriba y abajo utilizando una micropipeta P-1000 para mezclar.
Nota: Corte el extremo de la punta de la pipeta para agrandar la abertura y evitar la formación de burbujas. Mantener la solución de agarosa de trabajo en el baño de agua de 37 ° C para prevenir el endurecimiento. - Deje que la solución de agarosa-cell harden (5-10 min) a temperatura ambiente. Añadir 1 mL de 10% NBF a cada microcentrífuga del tubo que contiene una muestra y mantener a temperatura ambiente hasta parafina inclusión (hasta 24 h).
- Añadir ~ 500 μl de solución de agarosa al 1% (del paso 1.2.3) a cada tubo que contiene las células. Con suavidad, pero rápidamente, pipetee mezcla arriba y abajo utilizando una micropipeta P-1000 para mezclar.
- El enchufe de agarosa se preparan para inclusión en parafina.
- Aspire de NBF de la muestra.
- Quite el tapón de la celda usando una cuchilla de afeitar para cortar el tubo de microcentrífuga, coloque el tapón de un cassette de plástico tejido. Almacenar cassettes en 10% NBF a temperatura ambiente.
- Procesar las muestras durante la noche ya sea manualmente o utilizando un procesador automatizado de tejido y embed en parafina utilizando métodos estándar de histología.
Nota: Ver Fischer et al. 19 para un protocolo de ejemplo. - Con un especializado instrumento de "arrayer tejido", cosecha duplicados núcleos de 0.6 mm de la parafina bloquean de cada línea celular e insertarlas, en filas, en un bloque de parafina recipiente vacío para crear una línea de celular TMA.
Nota: Puede usarse métodos estándar tales como los descritos en Fedor y De Marzo a20. - Incorporar núcleos de muestras primarias que representa 2-3 tipos de tejido adicional (por ejemplo, la amígdala, colon, los testículos, etc.) como controles positivos o negativos en el TMA. Elegir los tejidos que son apropiados para la proteína de interés.
- Utilizar un micrótomo para preparar cortes histológicos dos, aproximadamente de 4 a 6 μm de espesor, de la línea celular TMA. La sección de montaje en un portaobjetos de histología, secarlo y Desparafinizar (como se describe en Fedor y De Marzo a20).
2. muestra tinción por inmunofluorescencia
- Optimizar la dilución del anticuerpo primario.
Nota: Existen protocolos estándar para la optimización de la IHC o si para las secciones de tejido FFPE como en Kajimura et al. 21. una breve descripción del enfoque se describe aquí.- Preparar diluciones de 4 y 5 de primaria del anticuerpo a la proteína de interés guiados por las instrucciones del fabricante.
- Identificar un tipo de tejido de control de una fuente animal o humano que expresa la proteína de interés en poblaciones de células morfológicamente reconocible. Preparar las secciones del tejido y montaje en un portaobjetos procedimiento de inmunohistoquímica estándar como en Fedor y De Marzo a20.
Nota: El número de secciones requeridas es el número de diluciones del anticuerpo primario más uno extra. - Usar un sistema automatizado o manual por immunohistology, prueba las diluciones del anticuerpo primario 2.1.1 cada paso de una diapositiva en el paso 2.1.2. Omitir la aplicación del anticuerpo primario de la diapositiva extra y utilizarlo como un control negativo.
- Durante el proceso de tinción, tinción todas las diapositivas con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) como una contratinción nuclear y un anticuerpo secundario etiquetado fluorescente. Si se requiere de una mayor sensibilidad, utilizar un HRP (peroxidasa de rábano)-conjugado de anticuerpo secundario y sistema de amplificación de señal basado en tyramide (ver pila et al. 13).
Nota: Cuando multiplexación anticuerpos primarios, se utiliza una etiqueta fluorescente diferente para cada proteína. - Escanear las diapositivas immunostained con un instrumento apropiado capaz de generar un archivo de imagen digital utilizando longitudes de onda de excitación y detección apropiados a los fluoróforos que fueron utilizados.
- Utilizar software apropiado para ver las imágenes digitales y elegir empíricamente la dilución del anticuerpo primario que optimiza la intensidad de la señal con respecto a la fluorescencia del fondo.
Nota: Si lo desea, esta optimización puede ocurrir usando un anticuerpo secundario conjugado con HRP, 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) y microscopía brightfield.
- Realizar si la coloración en la línea celular TMA.
- Utilizar un sistema automatizado o manual por immunohistology manchar una diapositiva de la línea celular TMA con la dilución del anticuerpo primario optimizado (según lo determinado en el paso 2.1). Omitir la aplicación del anticuerpo primario de la segunda diapositiva y usarlo como un control negativo.
- Durante el proceso de tinción, tinción con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) como una contratinción nuclear y con un anticuerpo secundario y tyramide como en el paso 2.1.4 todas las diapositivas.
- Escanear las diapositivas immunostained con un instrumento apropiado capaz de generar un archivo de imagen digital utilizando longitudes de onda de excitación y detección apropiados a los fluoróforos que fueron utilizados.
- Utilice un paquete de software de análisis de imagen para identificar el compartimiento celular de interés (es decir, citoplasma y núcleo) y cuantificar la intensidad de fluorescencia media (IFM) para cada línea celular.
Nota: Varios paquetes de software pueden ser utilizados para este propósito y muchos se discuten en pila et al. 13.
3. cuantitativa Immunoblotting de líneas celulares
- Preparación de lisados de las células.
- Cosecha de 2 millones de células de cada línea celular, como se describe en pasos de 1.1.1 a la 1.1.3.
- Girar las células por 5 min a 650 g de x en un tubo cónico de 50 mL. Decantar el sobrenadante.
- Lavar las células con 10 mL de PBS helado. Resuspender en 1 mL de PBS helado y la transferencia a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrífuga según paso 3.1.2, decantar y dejar las células en hielo.
- Añadir 200 μL de tampón de lisis frío radioinmunoprecipitación (RIPA) con inhibidores de la proteasa (10 μl de los inhibidores de la X 100 por mL de tampón de lisis RIPA) a las células, vortex e incubar en hielo por 15 min.
Nota: La cantidad de tampón de lisis para lisis eficaz varía por línea celular y puede determinarse empíricamente. Almacenador intermediario RIPA se compone de 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0% NP-40, desoxicolato de sodio 0,5%, SDS 0.1% en agua destilada. - Para asegurar carga relativamente incluso sobre los immunoblots, cuantificar las proteínas totales en una muestra de 20 μl de cada lisado usando un método apropiado como el ensayo de Bradford. Añadir aproximadamente 40 μl de tampón de lisis X Laemmli 6 para el resto (aproximadamente 180 μL) de cada lisado celular y hierve a 100 ° C en un baño de bloque o de calor durante 5 minutos.
Nota: 6 X Laemmli buffer se compone de 300 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% (p/v) de SDS, glicerol al 60%, 0.6% (w/v), azul de bromofenol 50 mM Ditiotreitol (DTT) en agua destilada. - Almacenar las muestras a-20 ° C hasta por dos semanas.
- Realizar un immunoblot de todas las líneas de células para determinar qué línea celular tiene la proteína más abundante del interés.
Nota: Siga el procedimiento descrito en Mahmood, T. y Yang, PC. 22, con las siguientes modificaciones.- Alícuota de la célula lisado (preparado en paso 3.1) que contienen 10-50 μg de proteína (dependiendo de la abundancia de la proteína de interés) en tubos de microcentrífuga. Añadir 2,5 μl de Tampón Laemmli X 6 y de tampón de lisis RIPA suficiente para hacer el volumen hasta 15 μl.
- Carga un 5% de apilado y una concentración adecuada de resolver (por ejemplo, 10% para las proteínas entre 15-100 kDa) gel de SDS-PAGE con una escalera de proteína y las muestras del paso 3.2.1. Carga 1 X Laemmli buffer en pocillos vacíos. Ejecute la fuente de alimentación en ajustes apropiados, por lo general 125 V, de 80 minutos o hasta que el tinte de azul de bromofenol alcanza la parte inferior de la placa.
- Realizar a una transferencia de proteína semiseco como se describe en Wiedemann et al. 23.
Nota: para obtener resultados representativos, una membrana de nitrocelulosa (que no necesita ser empapado en metanol), y el tampón de transferencia de frío Bjerrum Nielsen Schafer (BSN) fueron utilizados. Buffer BSN está compuesta por 48 mM de Tris, glicina de 39 mM, 20% de metanol en agua destilada. - Después de la transferencia, utilice una cuchilla de afeitar para cortar la membrana horizontal para separar la parte que contiene la proteína de interés de una proteína de control interno apropiado, como GAPDH.
- Proceder al bloqueo y anticuerpo incubaciones con el amortiguador de bloqueo recomendado por el fabricante de los anticuerpos primarios.
Nota: Las diluciones del anticuerpo primario óptimo pueden variar dramáticamente dependiendo de la sensibilidad y la abundancia de la proteína. Para abajo los resultados representativos, el anticuerpo a la proteína de interés requiere una dilución de 1:1,000 mientras que el control de la GAPDH requiere una dilución de 1:40,000. La dilución de anticuerpos secundarias utilizada fue 1:3, 000. - Después de incubaciones de anticuerpo y el lavado de la membrana, coloque las tiras de membrana en una funda de plástico transparente como una bolsa de sándwich.
- Preparar enchanced de la quimioluminescencia (ECL) mezcla siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilice una pipeta P-1000 para cubrir la membrana con la mezcla de ECL, cerca de la vaina e Incube las tiras de membrana con la mezcla en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1-2 min.
- Coloque la envoltura de la membrana en una plataforma de proyección de imagen digital. Usar de la quimioluminescencia y detección colorimétrico marcador para capturar varias exposiciones de la membrana.
Nota: Tiempos de exposición variará según la cantidad de proteína cargada, abundancia de la proteína diana, afinidad de anticuerpos etc. comienzan con una exposición automática (normalmente unos pocos segundos) y tiempos de exposición de prueba arriba y abajo en incrementos de unos pocos segundos. - Empíricamente, o utilizando el software de análisis de imagen, determinar qué línea de célula expresa la proteína diana.
- Encontrar el rango dinámico lineal de cada anticuerpo primario usando una dilución seriada.
- Realizar pasos 3.2.1-3.2.8 utilizando una serie de diluciones seriadas de la línea celular que expresa la mayor concentración de la proteína diana (identificada en el paso 3.2.9).
- Utilizar software de análisis de imagen como el ImageJ para realizar densitometría ósea en las imágenes de la exposición.
- Por ejemplo, utilizar ImageJ, utilice la herramienta Selección Rectangular para seleccionar el primer carril del gel para cuantificar. Ir a analizar | Geles | Seleccione el primer carril. Usa el ratón para mover el rectángulo resultante sobre el carril siguiente. Ir a analizar | Geles | Seleccione siguiente carril. Varias veces mover el rectángulo en el carril siguiente y seleccione el carril para el resto de los carriles.
- Ir a analizar | Geles | Trama de carriles. Utilice la herramienta de Línea recta para dibujar líneas a través de las bases de cada pico para eliminar ruido de fondo. Utilice la herramienta varita para seleccionar cada pico y recoge la densidad de cada pico, en adelante denominado intensidad de banda, desde la ventana de resultados .
- Uso de la densitometría de salida para crear un diagrama de dispersión de la banda intensidad versus la cantidad de proteína total cargado para cada anticuerpo primario. Usando una línea de mejor ajuste y una inspección visual, determinar la ubicación (rango de intensidad) de la gama dinámica lineal de cada anticuerpo.
- Elegir una concentración de la proteína que genera un valor en el extremo superior de la gama linear a la concentración hacia adelante con todas las líneas de la célula.
Nota: Dado que esta concentración está por debajo del nivel de saturación en la línea celular con la mayor cantidad de esta proteína, no debe existir ningún peligro de sobre exponer las bandas para las otras líneas celulares.
- Realizar un immunoblot usando la concentración de proteína en paso 3.3.4 para todas las líneas celulares y repita los pasos 3.2.1-3.2.8.
- Realizar densitometría ósea en los escaneos digitales como en el paso 3.3.2. Elegir las imágenes de las exposiciones que producen señales dentro de las gamas lineares para cada anticuerpo identificado en el paso 3.3.3.
- Usando las señales de intensidad de la banda de la exposición ideal de 3.4.1, calcular el ratio de intensidad de banda de proteína de la blanco carga intensidad de la banda de control para cada línea celular. Estos valores de relación indican la abundancia relativa de la proteína diana de interés.
- Realizar una prueba de correlación de Pearson (se puede hacer utilizando un paquete de software estadístico) para correlacionar los valores obtenidos del análisis de la imagen del IF tinción (paso 2.2) a los obtenidos de immunoblotting (paso 3.4.2).
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Representative Results
Este protocolo se utiliza para confirmar la capacidad de IF para determinar la cantidad relativa de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 en líneas celulares hechos en bloques de tejido FFPE. Bcl-2 cuantificación selectivamente en las células cancerosas puede dilucidar mecanismos oncogénicos y puede ser útil en el diagnóstico patológico y en informar de las decisiones de manejo clínico24. Más específicamente, Bcl-2 desempeña un papel en el correcto desarrollo del linfocito b y su expresión es comúnmente investigada en el contexto del linfoma25,26,27. Figura 1 describe los pasos involucrados en el protocolo. En un paso de optimización inicial IF, probaron varias diluciones del anticuerpo primario anti-Bcl-2 en el tejido de la amígdala humana utiliza un teñidor automático immunohistology como se describe en el paso 2.1. Figura 2 contiene imágenes de las diapositivas manchadas y escaneada la histología del tejido de la amígdala humana que cada uno recibió una dilución diferentes de anticuerpos. Puede verse que 1:50 es la dilución óptima que dieron señal fuerte y poca fluorescencia de fondo. Esta dilución fue utilizada en la línea celular TMA como se describe en el paso 2.2. El TMA también fue manchado con DAPI para identificar núcleos. Un kit de amplificación de señal basado en tyramide fue utilizado para etiquetar Bcl-2 con un fluoróforo Cy5. Análisis de imagen se utilizan para cuantificar la señal de fluorescencia Cy5 citoplásmica atribuida a Bcl-2 en cada línea celular. Imágenes representativas de la tinción pueden verse en la figura 3. Las líneas de células inmortalizadas elegidas para este experimento incluyen una variedad de líneas de células linfoides, es decir, 697, JeKo-1 Jurkat, RCH-ACV, Granta-519, REH y Raji, además de HeLa, derivado de un carcinoma cervical. Las células HeLa se conocen para expresar Bcl-2 en un nivel muy bajo28.
Basado en un immunoblot inicial de todas las líneas de ocho células, Granta-519 se determinó que la mayor abundancia de Bcl-2 (no mostrado). Diluciones seriadas de la Granta-519 lisado fueron utilizadas en una posterior inmunoblot para encontrar el rango dinámico lineal de las señales GAPDH (control de carga) (Figura 4A) y Bcl-2. Fue expuesto este immunoblot usando el escáner digital para diferentes longitudes de tiempo. Densitometría mediante software de análisis de imagen se utilizó para cuantificar la señal de cada banda, y estos valores se trazaron contra la cantidad de proteína cargada (Figura 4B). Partir de los datos en la Figura 4B-top, el rango dinámico para Bcl-2 en este ensayo se extiende desde una intensidad de la banda de casi cero a 7500 (línea de unidades arbitrarias, azul). Los dos tiempos de exposición más alto forma una cuadrática y no lineal ecuación, lo que sugiere exposición y saturación de la intensidad de la señal. La gama de GAPDH es de 3000 a 6500 (unidades arbitrarias, Figura 4B-inferior). Valores por debajo de 3000 (unidades arbitrarias) cayeron precipitadamente incluso cuando se utiliza un tiempo de exposición relativamente bajos. Una larga exposición claramente se traduce en saturación. De estos gráficos, se determinó que 12 μg sería una cantidad razonable de proteína a la carga cuando realice el immunoblot con todas las líneas de la célula, puesto que esta cantidad de proteína produjo valores de intensidad de Bcl-2 dentro de la gama linear para las células de Granta-519, reduciendo el riesgo de sobreexposición para todas otras líneas celulares.
Un immunoblot segundo de todas las líneas de la célula entonces fue realizado como en el paso 3.4 y puede verse en la figura 5A. Esta mancha fue requerido desde las bandas de blot inicial contenida con una intensidad de la señal fuera del rango lineal. Software de análisis de imagen se utilizó para determinar la intensidad de cada banda en el nuevo blot. Se utilizaron sólo los valores de intensidad que estaban dentro de un rango dinámico determinado por encima. Las flechas a la derecha de la Figura 4B muestran valores representativos de la intensidad que se utilizaron y mostrar donde caben dentro de la gama lineal. La relación Bcl-2:GAPDH entonces se calculó para cada línea celular. Esta relación, junto con la señal de fluorescencia desde si se aprecia en la figura 5B. Una prueba de correlación de Pearson se demostró que los ratios de intensidad de immunoblotting fueron fuertemente y positivamente correlacionados con las lecturas de intensidad desde cuantitativa si (r = 0.983, p < 0.001; ver figura 5).
Evaluar cuantitativamente la cantidad de Bcl-2 demostró para ser particularmente difícil ya que había una amplia gama de expresión de esta proteína en las ocho líneas de celular probado. Utilizando una exposición lo suficientemente largo para capturar la señal de las líneas celulares de expresión de Bcl-2 bajo (> 1 s) hace difícil mantenerse en el rango dinámico de alta líneas celulares expresan Bcl-2. En un intento de cuantificar las bandas débiles producidas por líneas celulares HeLa y Raji, exposición diferentes varias veces, de 0,1 s a 5 s, fueron capturadas para determinar el tiempo de exposición más largo que podría ser utilizado mientras que permanecen en el rango dinámico para las células como Granta -519 (ver figura 6). La naturaleza de esta técnica immunoblotting limita la precisión de la detección de la señal como un ruido de enfoques, sugiriendo que óptimamente se utiliza para cuantificar proteínas que se encuentran en niveles de expresión intermedia a alta.
Figura 1 : Diagrama de flujo de trabajo de protocolo. Inmunofluorescencia (IF) en un microarray de tejido celular línea (TMA) se ejecutó en paralelo a cuantitativa immunoblotting (IB) de la misma línea celular. Las señales de cada línea celular se comparan por correlación de Pearson para validar la capacidad cuantitativa del protocolo IF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Probar y optimizar el protocolo de la inmunofluorescencia (IF). Secciones de amígdala se incubaron con diferentes diluciones del anticuerpo anti-Bcl-2 (1:50, 1: 100 y ningún anticuerpo primario). Las diapositivas se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con HRP, la señal se amplifica utilizando un conjugado de tyramide Cy5 y las diapositivas fueron teñidas con DAPI. Las diapositivas se examinaron 20 X aumentos con filtro establece adecuadas a los picos de máxima excitación/emisión de 350/470 nm y 649/666 nm para DAPI y Cy5, respectivamente. Tiempos de exposición respectivos fueron ms de 160 y 200 ms. del campo de visión se centra en el mismo folículo linfoide, que se espera que Bcl-2 positivas en la zona del manto (periférica) y negativas en el centro germinal (central). La 1:50 dilución dio una señal de fluorescencia específica más fuerte sin aumentar la señal inespecífica por lo tanto fue utilizado como la dilución en el futuro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Inmunofluorescencia (IF) utilizando microarrays (TMA) las secciones tejido de la línea celular. Secciones de la línea celular TMA se toma y se incubaron con un 1:50 dilución de anti-Bcl-2 o con ningún anticuerpo primario. Las diapositivas se incubaron con el anticuerpo secundario, la señal se amplifica utilizando un conjugado de tyramide Cy5 y las diapositivas fueron teñidas con DAPI. Las diapositivas se examinaron 20 X aumentos con filtro establece adecuadas a los picos de máxima excitación/emisión de 350/470 nm y 649/666 nm para DAPI y Cy5, respectivamente. Tiempos de exposición respectivos fueron ms 250 y 625 Sra. estas imágenes representativas indican que la coloración era acertada, y que hay una expresión de la gama de Bcl-2 a través de las líneas celulares. La diapositiva de control negativo de "ningún anticuerpo Bcl-2" no demostró ninguna señal de Cy5, como era de esperar. La imagen representativa es de la línea 697 celular. Un núcleo de tejido hyperplastic de la amígdala en el TMA demuestra un patrón equivalente a la que se muestra en la figura 2. La intensidad de fluorescencia media (IFM) para cada línea celular se determinó mediante la cuantificación de la señal de fluorescencia del Cy5 usando software de análisis de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Determinar el rango dinámico lineal de las señales de inmunoblot (IB). (A) SII de diluciones seriadas de Granta-519 lisado. Cada mancha fue expuesto para una variedad de tiempos para encontrar el rango dinámico lineal. (B) intensidad de la banda para Bcl-2 (arriba) y GAPDH (parte inferior) versus cantidad de proteína total cargado para IB en (A). Intensidad de la banda fueron cuantificados usando el software de análisis de imagen ImageJ. Para Bcl-2 (arriba), las señales seguían siendo lineales en toda la gama de intensidades de banda cuando un tiempo de exposición bajo (exp.) (0,2 s) fue utilizados (intensidades de 0 7.200) apoyada por el coeficiente de correlación de Pearson (valor r) de 0.994 (p < 0,001), pero no para una mayor tiempos de exposición de 1 s y 2 min. Para GAPDH (parte inferior), los datos seguían siendo lineales por encima de una intensidad de 3000 (unidades arbitrarias) para bajo (0,2 s) y medio (2.2 s) tiempos de exposición como apoyado por los valores r de Pearson de 0.994 (p < 0,001) y 0.992 (p < 0,001), respectivamente, pero no para una exposición de tiempo () 7 s). Las flechas a la derecha indican la intensidad de la banda de la línea de celulares específicas identificada por el immunoblot en la figura 5A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Cuantitativa immunoblotting (IB) de líneas celulares inmortalizadas y comparación para inmunofluorescencia (IF). IB (A) de todas las líneas celulares. 12 μg de proteínas totales se cargó en cada pozo. (B) IB y si señal de intensidades para cada línea celular. La señal de IB es el cociente de Bcl-intensidad de banda 2:GAPDH de la mancha en (A) como cuantificados mediante ImageJ. La señal de IF es la intensidad de fluorescencia de cada base de línea la célula de la TMA (figura 3) según lo determinado por análisis de imagen. (C) diagrama de dispersión de si señal versus IB señal. Cada punto de datos representa una línea celular determinada. Los dos métodos producen resultados linealmente correlacionadas con un valor de r de Pearson de 0.984 (p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Encontrar el tiempo de exposición óptima para immunoblotting cuantitativa (IB). IB de todas las líneas celulares se muestra. 12 microgramos de proteína fueron cargados en cada pozo. Para cada IB, diferentes tiempos de exposición se utilizaron para capturar una imagen donde todas las bandas permanecían dentro de la gama dinámica lineal. Los tiempos de exposición de las tiras de Bcl-2 y GAPDH respectivamente fueron: (A) 0.1 s y 0.1 s, (B) 1 s y 0,2 s y (C) 5 5 paneles s. A y C y s mostrar ejemplos de exposiciones donde al menos algunas de las bandas en el blot eran demasiado débiles o demasiado fuerte, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos descrito un método que hace uso de immunoblotting cuantitativa (IB) para demostrar la utilidad de la inmunofluorescencia (IF) para determinar la abundancia relativa de una proteína diana en muestras de tejido FFPE. Métodos de cuantificación de proteínas actuales están limitados por su naturaleza categorial, como cromógeno IHC2,3, o por la necesidad de homogeneizar las muestras, prevención de la investigación sobre las poblaciones de la célula y estructura de la muestra, tales como con IB y espectrometría de masas8,9,10,11. IF cuantitativa puede trascender estas limitaciones si el método es validado y aplicado con cuidado. Comparando las lecturas de IF a iIF cuantitativa de líneas celulares inmortalizadas, hemos sido capaces de validar la naturaleza semi cuantitativa del enfoque IF.
Las muestras de tejido primario de pacientes o animales de experimentación son heterogéneas que contienen múltiples tipos de células. La aplicación de varios anticuerpos primarios adentro múltiplex si permite la cuantificación de uno o más de proteínas de interés en tipos celulares específicos o células compartimentos4,13. La optimización y aplicación de multiplex IF está fuera del alcance de este artículo pero se describe en los siguientes artículos16,17,18,29. La filosofía amplia es poblaciones celulares de etiqueta y cuantificar solamente la proteína de interés en el compartimiento de la celda deseada, por ejemplo núcleo o citoplasma, en el tipo celular deseado. Una vez que ha verificado la naturaleza cuantitativa de IF con un anticuerpo particular IB cuantitativo, el protocolo puede transferirse para permitir la cuantificación de la proteína rápida, alto rendimiento en muestras clínicas. Aplicaciones clínicas generalmente requieren la determinación de la abundancia relativa más que absoluta, de la proteína. Sin embargo, el enfoque de IF es posible formalmente cuantitativo si es necesario. Por ejemplo, una solución que contiene recombinante purificado Proteína Bcl-2 podría estar preparada y había cuantificada mediante un método bioquímico estándar. Diluciones seriadas podrían evaluarse entonces IB cuantitativa y una curva estándar generada para estimar el contenido absoluto de proteína por la célula en cada línea celular.
Aplicamos nuestro protocolo IF a secciones TMA que representan las muestras de biopsia de 66 casos de linfoma difuso de células B grandes de novo . Nuestros resultados demostraron aceptable reproducibilidad de la prueba a prueba (r de Pearson = 0.837) y la asociación entre Estado "Bcl-2-positivo" determinado subjetivamente por una puntuación visual esperada, fuerte de IHC convencional y elevada expresión determinada objetivamente por IF (p < 0,001). Además, abundancia de Bcl-2 por IF correlacionada con la abundancia de ARNm de Bcl-2 en las mismas muestras (Spearman ρ = 0.69, p < 0.001) y fue significativamente mayor en casos con aumento número de copia del gen BCL2 (p = 0,042) o translocación de BCL2 del para el locus IGH (p = 0.004), según lo determinado por hibridación en situ de la fluorescencia. Se obtuvieron resultados equivalentes en una cohorte independiente de los casos. Estos resultados proporcionan evidencia adicional que apoya si como un método válido para determinar la abundancia relativa de Bcl-2 en muestras FFPE rutina. El uso de IF para cuantificar varias otras proteínas biomarcadoras en muestras de primarias ha sido descrito previamente16,17.
La optimización de este protocolo es un proceso doble. Primero, si con los anticuerpos primarios utilizados debe ser optimizada (paso 2.1). Anticuerpos comerciales comúnmente sugieren diluciones para protocolos IHC que deben utilizarse como punto de partida junto con una dilución o dos por encima y por debajo de esto (es decir, si se recomienda 1: 100, añadir 1:50 y 1: 150). Después de realizar el IF y análisis de la diapositiva, determinar qué dilución es «óptimo» implica una inspección visual para identificar la dilución del anticuerpo primario que genera la señal más brillante sin aumentar la fluorescencia del fondo. La segunda etapa de optimización implica elegir la cantidad de proteína a la carga para que el immunoblot para que cada banda se mantiene en el rango lineal (paso 3.4). Para ello, se realiza un immunoblot usando una dilución seriada de la línea celular que expresa la mayor abundancia de la proteína diana. Desde aquí, se puede trazar la banda intensidades versus proteína cantidad para determinar los rangos de intensidad a través del cual la señal permanece lineal. Ya que este rango se establece en la línea de la célula con la proteína más abundante de la Diana, para una cantidad dada de proteína todas otras líneas celulares dará señales más bajas. Al mudarse a un immunoblot de todas las líneas celulares (paso 3.4), la serie de dilución se utiliza para informar a una cantidad de proteína para la carga producirá fuertes señales sin correr el riesgo de exposición más allá del rango lineal.
A pesar de las ventajas de este protocolo, el uso de immunoblotting como un método de verificación de cuantificación tiene sus deficiencias. La principal preocupación gira en torno a la amplia gama de expresión de diversas proteínas entre muestras. Puede ser difícil mantener todas las muestras dentro de los límites de un rango lineal si algunas muestras expresan la proteína de interés en mucho mayor grado que otros. En los resultados representativos que se muestra arriba, fueron capturadas diferentes exposiciones para conseguir una imagen donde los extremos (alta y baja) están dentro del rango dinámico lineal (figura 6). Mayor de lo esperado si las señales de las células HeLa y Jurkat figura 5B pueden indicar ya sea la menor posible IF señal para este sistema, o IB señales han llegado a la parte inferior del límite de detección lineal y son menos precisas. De cualquier manera, esto indica que si los valores en ese intervalo son menos propensos a ser exacto en este sistema, y la técnica es óptima para proteínas de mediana a altamente-expresados. Además, el uso de anticuerpos secundarios HRP-conjugado no es óptimo para fines cuantitativos, como comentamos anteriormente con respecto a IHC2,3. Usando los anticuerpos secundarios fluorescencia etiquetados por el immunoblot proporcionaría una confirmación más sólida que el si es efectivamente lineal cuantitativa30,31, sin embargo, el valor de r de Pearson de 0.984 obtenida usando el conjugado-HRP anticuerpos secundarios en el protocolo anterior fue suficiente para los propósitos actuales. Posibles deficiencias asociadas con IF, como Autofluorescencia y amortiguamiento varían basan en instrumentación de laboratorio individual, prácticas y tipo de tejido y pueden ser minimizadas por diversas medidas preventivas32,33. Se aprecia una muy pequeña cantidad de Autofluorescencia en el resultados representativos en ninguna muestra de anticuerpo Bcl-2 en la figura 3, sin embargo esta cantidad es trivial en comparación con lo restantes IF señales.
La necesidad de cuantificar con precisión las proteínas de interés de las muestras de tejido FFPE pertenece a la clínica y con fines de investigación en muchos campos biológicos. El protocolo que presentamos describe el uso de IF cuantitativa en secciones de tejido FFPE y valida su naturaleza semi-cuantitativa immunoblotting de líneas celulares inmortalizadas. Este método permite la cuantificación a través de un amplio rango dinámico, así como el mantenimiento de la integridad estructural de la muestra de tejido, que no se conserva en muchas otras cuantificación métodos3,8,11. Además, este protocolo es fácilmente adaptable y puede ser aplicado en la investigación y contextos clínicos, especialmente para investigación relacionada con el cáncer y el pronóstico.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado parcialmente por el Fredrick Banting y Charles Best Canadá postgrado becas (A.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | - | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | - | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | - | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | - | For densitometry analysis |
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