Summary

Immunotransfert quantitative de lignées cellulaires comme norme pour valider l’Immunofluorescence pour quantifier les biomarqueurs des protéines dans des échantillons de tissus courants

Published: January 07, 2019
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Summary

Nous décrivons l’utilisation d’immunotransfert quantitative pour valider l’histologie immunofluorescence couplée avec l’analyse de l’image comme un moyen de quantifier une protéine d’intérêt dans les échantillons de tissus fixés au formol, paraffine (FFIP). Nos résultats démontrent l’utilité de l’examen histologique immunofluorescence pour déterminer la quantité relative de biomarqueurs protéines dans des échantillons de biopsie systématique.

Abstract

Quantification des protéines d’intérêt dans les échantillons de tissus fixés au formol, paraffine (FFPE) est importante dans les cliniques et les demandes de recherche. Une méthode de quantification optimale est exacte, dispose d’une large gamme dynamique linéaire et maintient l’intégrité structurale de l’échantillon permettant l’identification des types de cellules individuelles. Les méthodes actuelles telles que l’immunohistochimie (IHC), spectrométrie de masse et immunoblotting chacun ne satisfont pas à ces dispositions en raison de leur nature catégorique ou besoin d’homogénéiser l’échantillon. Comme méthode alternative, nous vous proposons l’utilisation de l’immunofluorescence (IF) et analyse d’image pour déterminer l’abondance relative d’une protéine d’intérêt dans les tissus FFIP. Dans les présentes, nous démontrons que cette méthode est facilement optimisée, donne une large gamme dynamique et est quantifiable linéairement par rapport à l’étalon-or d’immunoblotting quantitative. En outre, cette méthode permet le maintien de l’intégrité structurale de l’échantillon et permet la distinction des divers types de cellules, qui peut être crucial dans les applications de diagnostic. Dans l’ensemble, c’est une méthode robuste à la quantification relative de protéines dans des échantillons FFPE et peut être facilement adapté à la fonction clinique ou besoins en recherche.

Introduction

La nécessité de quantifier des protéines dans des échantillons fixés au formol, paraffine de biopsie du tissu (FFIP) existe dans de nombreux domaines cliniques. Par exemple, des protéines de biomarqueurs chez les spécimens de biopsie systématique est employé pour élucider le pronostic et informer le traitement pour le cancer patients1. Cependant, les méthodes actuelles sont généralement subjectives et manquent de validation.

L’immunohistochimie (IHC) est utilisé de manière routinière dans les laboratoires de pathologie et dépend généralement un anticorps primaire dirigé à la protéine cible et un anticorps secondaire conjugué avec une étiquette enzymatique comme la peroxydase de raifort2. IHC conventionnelle est sensible, peut faire utilisation de minute Echantillons et préserve l’intégrité morphologique des échantillons de tissu permettant l’évaluation de l’expression de la protéine dans son contexte histologique pertinente. Cependant, parce que le signal chromogénique généré par IHC est soustractif, il souffre d’une gamme dynamique relativement étroite et offre un potentiel limité pour le multiplexage2,3,4. Spectrométrie de masse à désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-MSI) d’imagerie préserve l’intégrité morphologique. Cependant, ce développement de la technologie est associée à une résolution morphologique modeste et nécessite significative d’étalonnage et de la normalisation, altérant sa faisabilité pour utilisation clinique courante5,6,7. Les autres techniques pour quantifier les protéines dans des échantillons de tissus incluent immunoblotting8, spectrométrie de masse9,10,11et enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)12, chaque de qui commence avec un homogénéisé lysat de tissu de l’échantillon. Des échantillons de tissus primaires sont hétérogènes, car ils contiennent une multitude de types de cellules. Par conséquent, des techniques qui impliquent l’homogénéisation des échantillons ne permettent pas de quantification d’une protéine dans une population de cellules particulières d’intérêt tels que les cellules cancéreuses.

Comme IHC, si s’applique aux petites FFIP Echantillons et permet le maintien de l’intégrité histologique13. Cependant, grâce à la nature additive des signaux fluorescents, si se prête à l’application de plusieurs anticorps primaires et étiquettes fluorescentes. Ainsi, une protéine d’intérêt peut être relativement quantifiée dans des cellules spécifiques ou des compartiments cellulaires (par exemple, noyau et cytoplasme) définies à l’aide d’autres anticorps. Signaux de fluorescence ont aussi l’avantage d’une plus grande gamme dynamique13,14. La supériorité, la reproductibilité et potentiel de multiplexage de si appliquée à des échantillons FFPE a été démontrée13,14,15.

Ci-après nous décrivent l’utilisation de l’immunotransfert quantitative à l’aide de lignées cellulaires établies comme un étalon-or pour déterminer la nature quantitative de si couplée avec l’analyse d’images assistée par ordinateur pour déterminer l’abondance relative d’une protéine d’intérêt dans coupes histologiques FFIP d’échantillons de tissus. Nous avons appliqué cette méthode avec succès dans une approche multiplexe pour quantifier les protéines biomarqueur dans des échantillons de biopsie clinique16,17,18.

Protocol

Autorisation d’utiliser des échantillons de tissus humains primaires a été obtenue de la Health Sciences et affilié hôpitaux d’enseignement recherche Ethics Board (HSREB) à l’Université Queen. 1. construction d’un lignée cellulaire tissu Microarray (TMA) Récolter et laver les cellules.Remarque : Ce protocole a été testé sur plusieurs lignes de cellules immortalisées (p. ex. HeLa, Jurkat, RCH-ACV). Pour les cellules adhérentes, récolter env…

Representative Results

Ce protocole a été utilisé pour confirmer la capacité de IF pour déterminer la quantité relative de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 dans les lignées cellulaires à confectionner des blocs de tissus FFIP. Quantification de Bcl-2 sélectivement dans les cellules cancéreuses peut élucider les mécanismes oncogènes et peut être utile dans le diagnostic pathologique et en informant des décisions de prise en charge clinique24. Plus précisément, Bcl-2 jo…

Discussion

Nous avons décrit une méthode qui utilise immunoblotting quantitative (IB) pour démontrer l’utilité de l’immunofluorescence (IF) pour déterminer l’abondance relative d’une protéine cible dans les échantillons de tissus FFIP. Les méthodes actuelles de quantification des protéines sont limités par leur nature catégorique, comme chromogène IHC2,3, ou par la nécessité d’homogénéiser les échantillons, empêchant l’enquête sur la populatio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé en partie par le Fredrick Banting et Charles Best Canada Graduate Scholarship (a.m.).

Materials

697 DSMZ ACC 42 Cell line
JeKo-1 ATCC CRL-3006 Cell line
Jurkat ATCC TIB-152 Cell line
RCH-ACV DSMZ ACC 548 Cell line
Granta-519 DSMZ ACC 342 Cell line
REH DSMZ ACC 22 Cell line
Raji ATCC CCL-86 Cell line
HeLa ATCC CCL-2 Cell line
Trypsin/EDTA solution Invitrogen R001100 For detaching adhesive cells
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Inc. 81150 To neutralize trypsin
Neutral Buffered Formalin Protocol 245-684 For fixing cell pellets
UltraPure low melting point agarose Invitrogen 15517-022 For casting cell pellets
Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 Dako (Agilent) cat#: M088729-2, RRID: 2064429 To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786
Ventana Discovery XT Roche For automation of immunofluorescence staining
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) Dako (Agilent) K4000 For immunofluorescence signal amplification
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) Dako (Agilent) K4002 For immunofluorescence signal amplification
Cyanine 5 tyramide reagent Perkin Elmer NEL745001KT For immunofluorescence signal amplification
Aperio ImageScope Leica Biosystems To view scanned slides
HALO image analysis software Indica Labs For quantification of immunofluorescence
Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) Thermo Scientific 1862209 To add to RIPA buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioShop EDT001 For RIPA buffer
NP-40 BDH Limited 56009 For RIPA buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 For RIPA buffer
Glycerol FisherBiotech BP229 For Laemlli buffer
Bromophenol blue BioShop BRO777 For Laemlli buffer
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad 161-0611 For Laemlli buffer
Bovine serum albumin (BSA) BioShop ALB001 For immunoblot washes
Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) Bio-Rad 161-0374 For running protein gel
Filter paper (Extra thick blot paper) Bio-Rad 1703969 For blotting transfer
Nitrocellulose membrane Bio-Rad 162-0115 For blotting transfer
Trans-blot SD semi-dry transfer cell Bio-Rad 1703940 For semi-dry transfer
Skim milk powder (Nonfat dry milk) Cell Signaling Technology 9999S For blocking buffer
Tween 20 BioShop TWN510 For wash buffer
GAPDH rabbit monoclonal antibody Epitomics 2251-1 Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)
Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody abcam cat#: ab6789, RRID: AB_955439 Secondary antibody for immunoblot
Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody abcam cat#: ab6721, RRID: AB_955447 Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)
Clarity Western ECL substrates Bio-Rad 1705060 For immunoblot signal detection
Amersham Imager 600 GE Healthcare Life Sciences 29083461 For immunoblot signal detection
ImageJ software Freeware, NIH For densitometry analysis

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Cite This Article
Moore, A. M., Boudreau, L. R., Virk, S., LeBrun, D. P. Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples. J. Vis. Exp. (143), e58735, doi:10.3791/58735 (2019).

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