Nous décrivons l’utilisation d’immunotransfert quantitative pour valider l’histologie immunofluorescence couplée avec l’analyse de l’image comme un moyen de quantifier une protéine d’intérêt dans les échantillons de tissus fixés au formol, paraffine (FFIP). Nos résultats démontrent l’utilité de l’examen histologique immunofluorescence pour déterminer la quantité relative de biomarqueurs protéines dans des échantillons de biopsie systématique.
Quantification des protéines d’intérêt dans les échantillons de tissus fixés au formol, paraffine (FFPE) est importante dans les cliniques et les demandes de recherche. Une méthode de quantification optimale est exacte, dispose d’une large gamme dynamique linéaire et maintient l’intégrité structurale de l’échantillon permettant l’identification des types de cellules individuelles. Les méthodes actuelles telles que l’immunohistochimie (IHC), spectrométrie de masse et immunoblotting chacun ne satisfont pas à ces dispositions en raison de leur nature catégorique ou besoin d’homogénéiser l’échantillon. Comme méthode alternative, nous vous proposons l’utilisation de l’immunofluorescence (IF) et analyse d’image pour déterminer l’abondance relative d’une protéine d’intérêt dans les tissus FFIP. Dans les présentes, nous démontrons que cette méthode est facilement optimisée, donne une large gamme dynamique et est quantifiable linéairement par rapport à l’étalon-or d’immunoblotting quantitative. En outre, cette méthode permet le maintien de l’intégrité structurale de l’échantillon et permet la distinction des divers types de cellules, qui peut être crucial dans les applications de diagnostic. Dans l’ensemble, c’est une méthode robuste à la quantification relative de protéines dans des échantillons FFPE et peut être facilement adapté à la fonction clinique ou besoins en recherche.
La nécessité de quantifier des protéines dans des échantillons fixés au formol, paraffine de biopsie du tissu (FFIP) existe dans de nombreux domaines cliniques. Par exemple, des protéines de biomarqueurs chez les spécimens de biopsie systématique est employé pour élucider le pronostic et informer le traitement pour le cancer patients1. Cependant, les méthodes actuelles sont généralement subjectives et manquent de validation.
L’immunohistochimie (IHC) est utilisé de manière routinière dans les laboratoires de pathologie et dépend généralement un anticorps primaire dirigé à la protéine cible et un anticorps secondaire conjugué avec une étiquette enzymatique comme la peroxydase de raifort2. IHC conventionnelle est sensible, peut faire utilisation de minute Echantillons et préserve l’intégrité morphologique des échantillons de tissu permettant l’évaluation de l’expression de la protéine dans son contexte histologique pertinente. Cependant, parce que le signal chromogénique généré par IHC est soustractif, il souffre d’une gamme dynamique relativement étroite et offre un potentiel limité pour le multiplexage2,3,4. Spectrométrie de masse à désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-MSI) d’imagerie préserve l’intégrité morphologique. Cependant, ce développement de la technologie est associée à une résolution morphologique modeste et nécessite significative d’étalonnage et de la normalisation, altérant sa faisabilité pour utilisation clinique courante5,6,7. Les autres techniques pour quantifier les protéines dans des échantillons de tissus incluent immunoblotting8, spectrométrie de masse9,10,11et enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)12, chaque de qui commence avec un homogénéisé lysat de tissu de l’échantillon. Des échantillons de tissus primaires sont hétérogènes, car ils contiennent une multitude de types de cellules. Par conséquent, des techniques qui impliquent l’homogénéisation des échantillons ne permettent pas de quantification d’une protéine dans une population de cellules particulières d’intérêt tels que les cellules cancéreuses.
Comme IHC, si s’applique aux petites FFIP Echantillons et permet le maintien de l’intégrité histologique13. Cependant, grâce à la nature additive des signaux fluorescents, si se prête à l’application de plusieurs anticorps primaires et étiquettes fluorescentes. Ainsi, une protéine d’intérêt peut être relativement quantifiée dans des cellules spécifiques ou des compartiments cellulaires (par exemple, noyau et cytoplasme) définies à l’aide d’autres anticorps. Signaux de fluorescence ont aussi l’avantage d’une plus grande gamme dynamique13,14. La supériorité, la reproductibilité et potentiel de multiplexage de si appliquée à des échantillons FFPE a été démontrée13,14,15.
Ci-après nous décrivent l’utilisation de l’immunotransfert quantitative à l’aide de lignées cellulaires établies comme un étalon-or pour déterminer la nature quantitative de si couplée avec l’analyse d’images assistée par ordinateur pour déterminer l’abondance relative d’une protéine d’intérêt dans coupes histologiques FFIP d’échantillons de tissus. Nous avons appliqué cette méthode avec succès dans une approche multiplexe pour quantifier les protéines biomarqueur dans des échantillons de biopsie clinique16,17,18.
Nous avons décrit une méthode qui utilise immunoblotting quantitative (IB) pour démontrer l’utilité de l’immunofluorescence (IF) pour déterminer l’abondance relative d’une protéine cible dans les échantillons de tissus FFIP. Les méthodes actuelles de quantification des protéines sont limités par leur nature catégorique, comme chromogène IHC2,3, ou par la nécessité d’homogénéiser les échantillons, empêchant l’enquête sur la populatio…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé en partie par le Fredrick Banting et Charles Best Canada Graduate Scholarship (a.m.).
697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |