Summary
Descriviamo l'uso di quantitativi immunoblotting per convalidare l'istologia di immunofluorescenza accoppiato con analisi dell'immagine come mezzo di quantificare una proteina di interesse nei campioni di tessuto formalina-fisse, paraffina (FFPE). I nostri risultati dimostrano l'utilità dell'istologia di immunofluorescenza per accertare la quantità relativa di proteine biomarcatore nei campioni di biopsia di routine.
Abstract
Quantificazione di proteine di interesse nei campioni di tessuto formalina-fisse, paraffina (FFPE) è importante negli studi clinici e applicazioni di ricerca. Un metodo ottimale di quantificazione è accurato, ha un'ampia gamma dinamica lineare e mantiene l'integrità strutturale del campione per consentire per l'identificazione dei tipi di cella singola. Attuali metodi quali immunohistochemistry (IHC), spettrometria di massa e immunoblotting ciascuno non riescono a soddisfare queste stipulazioni dovuto la loro natura categoria o bisogno di omogeneizzare il campione. Come metodo alternativo, proponiamo l'uso di immunofluorescenza (IF) e analisi dell'immagine per determinare l'abbondanza relativa di una proteina di interesse in tessuti FFPE. Qui dimostriamo che questo metodo è facilmente ottimizzato, produce un'ampia gamma dinamica e linearmente quantificabile rispetto il gold standard di immunoblotting quantitativa. Inoltre, questo metodo consente il mantenimento dell'integrità strutturale del campione e per la distinzione dei vari tipi di cellule, che può essere cruciale in applicazioni diagnostiche. Nel complesso, questo è un metodo affidabile per la quantificazione relativa delle proteine in campioni FFPE e può essere facilmente adattato per soddisfare le cliniche o esigenze di ricerca.
Introduction
La necessità di quantificare le proteine nei campioni di biopsia di tessuto (FFPE) da formalina-fisse, paraffina-incastonato esiste in molti campi clinici. Ad esempio, quantificazione delle proteine di biomarcatore negli esemplari di biopsia di routine è usato per delucidare la prognosi e informare il trattamento per cancro pazienti1. Tuttavia, gli attuali metodi sono in genere soggettivi e mancano di convalida.
Immunohistochemistry (IHC) è usato ordinariamente nei laboratori di patologia e generalmente dipende da un anticorpo primario direzionati alla proteina bersaglio e un anticorpo secondario coniugato con un'etichetta enzimatica come rafano perossidasi2. IHC convenzionale è sensibile, può fare uso di minuto campioni e preserva l'integrità morfologica dei campioni di tessuto, permettendo la valutazione dell'espressione della proteina all'interno del contesto istologico pertinente. Tuttavia, perché il segnale cromogenico generato da IHC è sottrattivo, soffre di un intervallo relativamente ristretto di dinamico e offre un potenziale limitato per multiplexing2,3,4. Spettrometria di massa desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI-MSI) di imaging preserva l'integrità morfologica. Tuttavia, questa tecnologia in via di sviluppo è associata con modesta risoluzione morfologiche e richiede notevole calibrazione e normalizzazione, alterando la sua fattibilità per uso clinico sistematico5,6,7. Tecniche alternative per quantificare le proteine nei campioni di tessuto comprendono immunoblotting8, spettrometria di massa9,10,11ed enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) dosaggio12, ogni che comincia con un omogeneizzato lysate del tessuto del campione. Campioni di tessuto primario sono eterogenei, in quanto contengono una moltitudine di tipi di cellule. Di conseguenza, le tecniche che comportano l'omogeneizzazione dei campioni non consentono quantificazione di una proteina in una popolazione particolare cella di interesse come le cellule tumorali.
Come IHC, se è applicabile al piccolo FFPE campioni e consente il mantenimento di integrità istologica13. Tuttavia, grazie alla natura additiva dei segnali di fluorescenza, se è favorevole all'applicazione di molteplici anticorpi primari ed etichette fluorescenti. Così, una proteina di interesse può essere quantificata relativamente all'interno di celle specifiche o compartimenti cellulari (ad esempio, nucleo e citoplasma) definite utilizzando altri anticorpi. Segnali di fluorescenza hanno anche il vantaggio di una maggiore gamma dinamica13,14. La superiorità, la riproducibilità e la potenziale multiplexing di se applicato a campioni FFPE è stata dimostrata13,14,15.
Qui descriviamo l'uso di quantitativi immunoblotting utilizzando linee cellulari stabilizzate come gold standard per accertare la natura quantitativa di se accoppiato con analisi di immagine computerizzata nel determinare l'abbondanza relativa di una proteina di interesse in sezioni istologiche dai campioni di tessuto FFPE. Abbiamo applicato questo metodo con successo in un approccio multiplex per quantificare le proteine biomarcatore in clinica biopsia campioni16,17,18.
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Protocol
Approvazione di utilizzare campioni di tessuti umani primari è stata ottenuta dalla Health Sciences e affiliati ospedali d'istruzione ricerca etica Board (HSREB) presso l'Università della Regina.
1. costruzione di un linea cellulare Tissue Microarray (TMA)
- Raccogliere e lavare le cellule.
Nota: Questo protocollo è stato testato su varie linee cellulari immortalizzate stabilizzate (per esempio HeLa, Jurkat, RCH-ACV).- Per le celle aderenti, raccolto circa 1.3 x 107 cellule una volta che raggiungono circa confluency di 80%. Staccare le celle utilizzando un reagente appropriato per tale linea cellulare.
Nota: Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) è in genere preferibile tripsina per ridurre il rischio di degradare le proteine di superficie. Se si utilizza tripsina, neutralizzare la tripsina utilizzando siero bovino fetale (FBS) immediatamente dopo la raccolta le cellule. - Per cellule in sospensione, raccolto circa 8 x 107 cellule in ritardo-fase di crescita.
- Raccogliere le cellule raccolte/staccato mediante centrifugazione per 5 min a 225 x g in una provetta conica da 50 mL.
- Decantare il supernatante e risospendere il pellet in 10 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x. Centrifugare per 5 min a 225 x g e decantare il supernatante.
Nota: 1x PBS è composto da 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 in acqua distillata; regolare il pH a 7.4.
- Per le celle aderenti, raccolto circa 1.3 x 107 cellule una volta che raggiungono circa confluency di 80%. Staccare le celle utilizzando un reagente appropriato per tale linea cellulare.
- Fissare le cellule in formalina e appallottolarli.
- Sospendere il pellet cellulare all'interno del tubo conico in 10 mL di formalina 10% neutra tamponata (NBF).
Nota: NBF può essere preparata diluendo 1 mL di soluzione di riserva di formaldeide al 37% in 9 mL di 1X PBS.
Attenzione: Prestare attenzione quando si maneggia la formalina e formaldeide. Utilizzare una cappa aspirante per passaggi riguardanti formalina e formaldeide. - Incubare le cellule su un agitatore meccanico a 24 giri/min a temperatura ambiente durante la notte (circa 17 ore).
- Preparare una soluzione di 1% di agarosio basso punto di fusione in PBS (0,01 g di agarosio per 1 mL di PBS).
- Preparare abbastanza per 500 µ l di soluzione di agarosio per campione linea cellulare.
- Sciogliere l'agarosio in un 80 ° C acqua vasca o calore di blocco, con occasionali di miscelazione per 2-5 min. Una volta sciolto, mantenere la soluzione a 37 ° C acqua vasca o in calore per evitare l'indurimento.
- A pellet le celle fisse da passo 1.2.2 mediante centrifugazione per 5 min a 225 x g. eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 500 µ l di PBS 1X.
- Trasferire le cellule in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e pellet mediante centrifugazione per 5 min a 290 x g. aspirato tutto del surnatante.
- Sospendere il pellet cellulare all'interno del tubo conico in 10 mL di formalina 10% neutra tamponata (NBF).
- Eseguire il cast le cellule in agarosio.
- ~ 500 µ l di soluzione di agarosio 1% (dal punto 1.2.3) in ogni provetta contenente le celle. Delicatamente, ma rapidamente, pipettare miscela su e giù utilizzando una micropipetta P-1000 a mescolare.
Nota: Tagliare l'estremità della punta della pipetta per allargare l'apertura ed evitare la formazione di bollicine. Tenere la soluzione di agarosio di lavoro nel bagno d'acqua di 37 ° C per evitare l'indurimento. - Lasciare la soluzione di agarosio-cella indurire (5-10 min) a temperatura ambiente. Aggiungere 1 mL di 10% NBF per ogni microcentrifuga provetta contenente un campione e tenere a temperatura ambiente fino a (fino a 24 h) di inclusione a paraffina.
- ~ 500 µ l di soluzione di agarosio 1% (dal punto 1.2.3) in ogni provetta contenente le celle. Delicatamente, ma rapidamente, pipettare miscela su e giù utilizzando una micropipetta P-1000 a mescolare.
- Preparare la spina dell'agarosi per inclusione in paraffina.
- Aspirate fuori le NBF dal campione.
- Rimuovere la spina di cella utilizzando una lama di rasoio per tagliare il tubo del microcentrifuge, inserire la spina in cassetta di plastica tessuto. Conservare le cassette a 10% NBF a temperatura ambiente.
- Trattare i campioni durante la notte sia manualmente o utilizzando un processatore automatico e incorporare in cera di paraffina utilizzando metodi standard di istologia.
Nota: Vedere Fischer et al. 19 per un protocollo di esempio. - Utilizzando uno speciale strumento "arrayer tessuto", vendemmia duplicati 0,6-mm anime dalla paraffina bloccano da ogni linea cellulare e inserirli, a righe, in un blocco di paraffina destinatario vuoto al fine di creare una linea cellulare di TMA.
Nota: I metodi Standard devono essere utilizzati come quelli descritti in Fedor e De Marzo20. - Incorporare il core da campioni primari che rappresenta 2-3 tipi di tessuto supplementare (ad es., tonsilla, del colon, testicoli, ecc.) come controlli positivi o negativi in TMA. Scegliere tessuti che sono appropriati per la proteina di interesse.
- Utilizzare un microtomo per preparare due sezioni istologiche, circa 4-6 µm di spessore, della linea cellulare TMA. Montare la sezione in una diapositiva di istologia, asciugarlo e deparaffinizzare (come descritto in Fedor e De Marzo20).
2. campione di colorazione di immunofluorescenza
- Ottimizzare la diluizione dell'anticorpo primario.
Nota: Esistono protocolli Standard per l'ottimizzazione di IHC oppure se per sezioni di tessuto FFPE come in Kajimura et al. 21. una breve panoramica dell'approccio è descritta qui.- Preparare 4-5 diluizioni dell'anticorpo primario alla proteina di interesse guidati dalle istruzioni del produttore.
- Identificare un tipo di tessuto di controllo da un'origine animale o umana che esprime la proteina di interesse in popolazioni di cellule morfologicamente riconoscibile. Preparare le sezioni del tessuto e montarli su una diapositiva procedura immunohistochemistry standard come Fedor e De Marzo20.
Nota: Il numero di sezioni necessarie è il numero di diluizioni di anticorpo primario più uno supplementare. - Utilizzando un sistema automatizzato o manuale per il immunohistology, testare le diluizioni di anticorpo primario dal punto 2.1.1 ogni su una diapositiva dal punto 2.1.2. Omettere l'applicazione dell'anticorpo primario dalla diapositiva supplementare e utilizzarlo come controllo negativo.
- Durante il processo di colorazione, colorare tutti i vetrini con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) come una colorazione nucleare e un anticorpo secondario fluorescente contrassegnato. Se una maggiore sensibilità è necessaria, utilizzare un HRP (perossidasi di rafano)-coniugato anticorpo secondario e sistema di amplificazione del segnale basati su microarray (Vedi Stack et al. 13).
Nota: Quando gli anticorpi primari di multiplexing, un'altra etichetta fluorescente viene utilizzata per ogni proteina. - Scansione le diapositive immunostained con apposito strumento in grado di generare un file di immagine digitale utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione e rilevamento appropriato per i fluorofori utilizzati.
- Utilizzare software appropriato per visualizzare le immagini digitali e scegliere empiricamente la diluizione di anticorpo primario che ottimizza l'intensità del segnale rispetto a fluorescenza di fondo.
Nota: Se lo si desidera, questa ottimizzazione può verificarsi usando un anticorpo secondario coniugato HRP, 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) e microscopia in campo chiaro.
- Eseguire se macchiatura sulla linea cellulare TMA.
- Utilizzare un sistema automatico o manuale per il immunohistology a macchiare una diapositiva della linea cellulare TMA con la diluizione di anticorpo primario ottimizzato (come determinato al punto 2.1). Omettere l'applicazione dell'anticorpo primario dalla seconda diapositiva e utilizzarlo come controllo negativo.
- Durante il processo di colorazione, colorare tutti i vetrini con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) come una colorazione nucleare e con un anticorpo secondario e tyramide come descritto al punto 2.1.4.
- Scansione le diapositive immunostained con apposito strumento in grado di generare un file di immagine digitale utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione e rilevamento appropriato per i fluorofori utilizzati.
- Utilizzare un pacchetto di software di analisi di immagine per identificare il compartimento cellulare di interesse (cioè, citoplasma e nucleo) e quantificare l'intensità media di fluorescenza (MFI) per ogni linea cellulare.
Nota: Vari pacchetti software possono essere utilizzati per questo scopo e molti sono discussi in Stack et al. 13.
3. quantitativo Immunoblotting di linee cellulari
- Preparare lisati di cellule.
- Raccogliere 2 milioni le cellule di ogni linea cellulare, come descritto nei passaggi da 1.1.1 a 1.1.3.
- Selezione celle verso il basso per 5 min a 650 x g in una provetta conica da 50 mL. Decantare il supernatante.
- Lavare le cellule con 10 mL di PBS ghiacciata. Risospendere in 1 mL di PBS ghiacciata e trasferirlo in una provetta di microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare il secondo passaggio 3.1.2, decantare e lasciare celle sul ghiaccio.
- Aggiungere circa 200 µ l di tampone di lisi di radioimmunoprecipitation freddo (RIPA) con inibitori delle proteasi (10 µ l di inibitori di X 100 / mL di tampone di lisi RIPA) alle celle, vortex e incubare in ghiaccio per 15 min.
Nota: La quantità di tampone di lisi necessaria per lisi efficace varia a seconda della linea cellulare e può essere determinata empiricamente. RIPA buffer è composto di 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0% NP-40, 0,5% sodio desossicolato, SDS 0,1% in acqua distillata. - Per garantire il caricamento relativamente anche sui immunoblots, quantificare la proteina totale in un campione di 20 µ l di ciascun lisato utilizzando un metodo appropriato, ad esempio, il saggio di Bradford. Aggiungere circa 40 µ l di tampone di lisi 6 X Laemmli per il resto (circa 180 µ l) di ogni cella lysata e far bollire a 100 ° C in un bagno di acqua o blocco di calore per 5 min.
Nota: 6 X Laemmli buffer è composto di 300 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (p/v) SDS, 60% glicerolo, bromofenolo 0,6% (p/v), 50 mM dithiothreitol (DTT) in acqua distillata. - Conservare i campioni a-20 ° C fino a due settimane.
- Eseguire un immunoblot di tutte le linee di celle per determinare quale linea cellulare è la proteina più abbondante di interesse.
Nota: Seguire la procedura descritta in Mahmood, T. e Yang, PC. 22, con le seguenti modifiche.- In microcentrifuga aliquota cella lysate (preparati in fase 3.1) contenente 10-50 µ g di proteina (a seconda l'abbondanza della proteina di interesse). Aggiungere 2,5 µ l di 6 X Laemmli buffer e buffer di lisi RIPA sufficiente per rendere il volume fino a 15 µ l.
- Caricare un accatastamento del 5% e una concentrazione appropriata risoluzione (ad esempio, 10% per le proteine tra 15-100 kDa) gel di SDS-PAGE con una scaletta di proteina e i campioni dal punto 3.2.1. Caricare 1 X Laemmli buffer nei pozzetti vuoti. Eseguire l'alimentazione alle impostazioni appropriate, in genere 125 V, per 80 min o fino a quando il colorante blu di bromofenolo raggiunge il fondo del piatto.
- Eseguire un trasferimento di proteine semi-secco come descritto in Wiedemann et al. 23.
Nota: per ottenere risultati rappresentativi, una membrana di nitrocellulosa (che non deve necessariamente essere imbevuto di metanolo), e tampone di trasferimento freddo Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) sono stati usati. Buffer di BSN è composto da 48 mM Tris, glicina 39 mM, metanolo 20% in acqua distillata. - Dopo il trasferimento, è possibile utilizzare una lama di rasoio per tagliare la membrana orizzontale per separare la parte contenente la proteina di interesse da una proteina di controllo interno appropriato, ad esempio GAPDH.
- Procedere al blocco e anticorpo incubazioni usando il tampone bloccante raccomandati dal produttore degli anticorpi primari.
Nota: Le diluizioni di anticorpo primario ottimale possono variare notevolmente a seconda della sensibilità e abbondanza di proteine. Per i risultati rappresentativi di seguito, l'anticorpo alla proteina di interesse richiesto una diluizione di 1:1,000 mentre il controllo GAPDH richiesto una diluizione di 1: 40.000. La diluizione di anticorpi secondari utilizzati era 1:3, 000. - Dopo le incubazioni dell'anticorpo e il lavaggio della membrana, posizionare le strisce di membrana in una guaina in plastica trasparente come un sacchetto di sandwich.
- Preparare enchanced miscela di chemiluminescenza (ECL) seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzare una pipetta P-1000 per coprire la membrana con la miscela di ECL, chiudere la guaina e incubare le strisce di membrana con la miscela al buio a temperatura ambiente per 1-2 min.
- Posizionare la guaina di membrana in una piattaforma di imaging digitale. Utilizzare la chemiluminescenza e rilevazione colorimetrica marcatore per acquisire varie esposizioni della membrana.
Nota: I tempi di esposizione variano in base alla quantità di proteina caricata, abbondanza di proteina bersaglio, affinità anticorpale ecc iniziano con un'esposizione automatica (in genere pochi secondi) e tempi di esposizione di prova sopra e sotto da incrementi di pochi secondi. - Empiricamente, o utilizzando software di analisi di immagine, determinare quale linea cellulare esprime più proteina bersaglio.
- Trovare la gamma dinamica lineare di ogni anticorpo primario utilizzando una diluizione seriale.
- Eseguire passaggi 3.2.1-3.2.8 utilizzando una serie di diluizioni seriali dalla linea cellulare che esprime la più alta concentrazione della proteina dell'obiettivo (identificata nel passaggio 3.2.9).
- Utilizzare software di analisi di immagine quali ImageJ per eseguire densitometria sulle immagini di esposizione.
- Ad esempio, utilizzando ImageJ, utilizzare lo strumento di Selezione rettangolare per selezionare il primo vicolo del gel per quantificare. Vai a analizzare | Gel | Selezionare primo Lane. Utilizzare il mouse per spostare il rettangolo risultante alla corsia accanto. Vai a analizzare | Gel | Selezionare Avanti Lane. Ripetutamente spostare il rettangolo alla corsia accanto e scegliere la corsia per il resto delle corsie.
- Vai a analizzare | Gel | Tracciare corsie. Utilizzare lo strumento Linea retta per disegnare linee attraverso le basi di ogni picco per rimuovere il rumore di fondo. Utilizzare la bacchetta magica per selezionare ogni picco e raccogliere la densità di ogni picco, qui di seguito definita intensità di banda, dalla finestra dei risultati .
- Utilizzare la densitometria uscita per creare un scatterplot della banda intensità contro la quantità di proteine totali caricati per ogni anticorpo primario. Utilizzando una linea di misura migliore e ispezione visiva, determinare la posizione (intervallo di intensità) della gamma dinamica lineare di ciascun anticorpo.
- Scegliere una concentrazione di proteina che genera un valore all'estremità superiore della gamma lineare di essere la concentrazione muovendo in avanti con tutte le linee cellulari.
Nota: Poiché questa concentrazione è inferiore al livello di saturazione nella linea cellulare con la maggiore quantità di questa proteina, non ci dovrebbe essere alcun pericolo di eccessiva frequenza le bande per le altre linee cellulari.
- Eseguire un immunoblot usando la concentrazione di proteina scelta al punto 3.3.4 per tutte le linee cellulari e ripetere i passi 3.2.1-3.2.8.
- Eseguire densitometria nelle scansioni digitali come descritto al punto 3.3.2. Scegli le immagini di esposizioni che producono segnali all'interno delle gamme lineari per ogni anticorpo identificato nel passaggio 3.3.3.
- Utilizzando i segnali di intensità di banda dall'esposizione ideale da 3.4.1, calcolare il rapporto di intensità di banda proteina bersaglio al caricamento di intensità di banda di controllo per ogni linea cellulare. Questi valori di rapporto indicano l'abbondanza relativa della proteina di interesse.
- Eseguire un test di correlazione di Pearson (può essere fatto utilizzando un pacchetto di software statistico) per correlare i valori ottenuti dall'analisi di immagine del se colorazione (punto 2.2) a quelli ottenuti da immunoblotting (punto 3.4.2).
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Representative Results
Questo protocollo è stato usato per confermare la possibilità di se per determinare la quantità relativa della proteina anti-apoptotica Bcl-2 nelle linee cellulari realizzati in blocchi di tessuto FFPE. Bcl-2 quantificare selettivamente nelle cellule tumorali può delucidare i meccanismi oncogenici e può essere utile nella diagnosi patologica e nell'informare le decisioni di gestione clinica24. Più specificamente, Bcl-2 svolge un ruolo nel corretto sviluppo dei linfociti b e la sua espressione è comunemente studiato nel contesto del linfoma25,26,27. Figura 1 illustra i passaggi coinvolti nel protocollo. In un passo di ottimizzazione se iniziale, varie diluizioni dell'anticorpo primario anti-Bcl-2 sono state testate sul tessuto umano tonsilla utilizzando un coloratore automatico immunohistology come descritto al punto 2.1. Figura 2 contiene le immagini delle diapositive macchiati e digitalizzato l'istologia del tessuto umano della tonsilla che ciascuno ha ricevuto una diversa diluizione dell'anticorpo. Si vede che 01:50 è la diluizione ottima che ha reso forte segnale e piccolo fluorescenza di fondo. Questa diluizione è stato poi utilizzata sulla linea cellulare TMA come descritto al punto 2.2. La TMA era anche macchiato utilizzando DAPI per identificare i nuclei. Un kit di amplificazione del segnale basati su microarray è stato usato per etichettare Bcl-2 con un fluoroforo Cy5. Analisi di immagine è stata usata per quantificare il segnale di fluorescenza Cy5 citoplasmico attribuito a Bcl-2 in ogni linea cellulare. Immagini rappresentative della colorazione possono essere visto nella Figura 3. Le linee cellulari immortalizzate scelte per questo esperimento includeva una varietà di linee cellulari derivate da linfoide, vale a dire 697, JeKo-1, Jurkat, RCH-ACV, Granta-519, REH e Ruffo, oltre a HeLa, derivato da un carcinoma cervicale. Le cellule HeLa sono noti per esprimere Bcl-2 a un livello molto basso di28.
Basato su un immunoblot iniziale di tutte le linee di otto cellule, Granta-519 era determinato ad avere la più grande abbondanza di Bcl-2 (non illustrato). Diluizioni seriali del lisato di Granta-519 sono stati utilizzati in un successivo immunoblot per trovare la gamma dinamica lineare dei segnali GAPDH (controllo di carico) (Figura 4A) e Bcl-2. Questo immunoblot è stato esposto utilizzando lo scanner digitale per diversi periodi di tempo. Densitometria utilizzando software di analisi di immagine è stata utilizzata per quantificare il segnale da ogni banda, e questi valori sono stati tracciati contro la quantità di proteina caricata (Figura 4B). Dai dati in Figura 4B-top, la gamma dinamica per Bcl-2 in questo saggio si estende da un'intensità di banda pari a quasi zero a 7500 (linea unità arbitrarie, blu). I due tempi di esposizione più alti montare un quadratica ed equazione non lineare, suggerendo la sovraesposizione e la saturazione dell'intensità del segnale. L'intervallo per GAPDH è da 3000 a 6500 (unità arbitrarie, Figura 4B-inferiore). Valori inferiori a 3000 (unità arbitrarie) è sceso precipitosamente anche quando si utilizza un tempo di esposizione relativamente bassi. Una lunga esposizione chiaramente risultati in saturazione. Da questi grafici, è stato determinato che µ g 12 sarebbe una ragionevole quantità di proteine da caricare quando si esegue il immunoblot con tutte le linee cellulari, producono questa quantità di proteina Bcl-2 valori di intensità all'interno della gamma lineare per le celle di Granta-519, riducendo il rischio di sovraesposizione per tutte le altre linee cellulari.
Un secondo immunoblot di tutte le linee cellulari allora è stato effettuato come descritto al punto 3.4 e può essere visto in Figura 5A. Questa macchia è stato richiesta dalle bande di macchia iniziale contenuta con un'intensità di segnale fuori della gamma lineare. Software di analisi di immagine è stato utilizzato per determinare l'intensità del segnale di ciascuna banda nella macchia di nuova. Sono stati utilizzati solo i valori di intensità che erano all'interno delle gamme dinamiche determinate sopra. Le frecce sulla destra della Figura 4B dimostrano i valori di intensità rappresentativi che sono stati utilizzati e Vedi dove si inseriscono all'interno della gamma lineare. Il rapporto di Bcl-2:GAPDH è stato quindi calcolato per ogni linea cellulare. Questo rapporto, insieme al segnale di fluorescenza da se può essere visto in figura 5B. Un test di correlazione di Pearson ha dimostrato che i rapporti di intensità da immunoblotting erano fortemente e positivamente correlati con le letture di intensità da se quantitativa (r = 0,983, p < 0,001; Vedi Figura 5).
Valutare quantitativamente l'importo di Bcl-2 ha dimostrato di essere particolarmente difficile in quanto c'era una vasta gamma di espressione di questa proteina attraverso otto linee cellulari testati. Usando un'esposizione abbastanza a lungo per catturare il segnale delle linee cellulari che esprimono Bcl-2 basse (> 1 s) rendeva difficile rimanere nell'intervallo dinamico per alte linee cellulari che esprimono Bcl-2. Nel tentativo di quantificare le fasce deboli prodotte da linee cellulari come HeLa e Ruffo, i tempi di esposizione diverso diversi, da 0.1 s a 5 s, sono stati catturati per determinare il tempo di esposizione più lungo che potrebbe essere utilizzato pur rimanendo nella gamma dinamica per le celle come Granta -519 (vedere la Figura 6). La natura di questa tecnica immunoblotting limita la precisione del rilevamento del segnale come un rumore di approcci, suggerendo in modo ottimale permette di quantificare le proteine che si trovano a livelli intermedi di alta espressione.
Figura 1 : Diagramma di flusso di lavoro di protocollo. Immunofluorescenza (IF) su un cellulare linea tissue microarray (TMA) è stato eseguito in parallelo con quantitativi immunoblotting (IB) delle varietà di cellula stessa. Di correlazione di Pearson per convalidare la capacità quantitativa del protocollo se vengono confrontati i segnali da ogni linea cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Test e ottimizzazione del protocollo di immunofluorescenza (IF). Sezioni della tonsilla sono state incubate con varie diluizioni di anticorpo anti-Bcl-2 (01:50, 1: 100 e nessun anticorpo primario). Le diapositive sono state incubate con anticorpo secondario coniugato HRP, il segnale è stato amplificato usando un coniugato di microarray-Cy5 e le diapositive sono state macchiate con DAPI. Le diapositive sono state scannerizzate a 20 X ingrandimento utilizzando filtro imposta appropriata per i picchi di massima eccitazione/emissione di 350/470 nm e 649/666 nm per DAPI e Cy5, rispettivamente. Tempi di esposizione rispettivi erano 160 ms e 200 ms. il campo di vista è centrato sopra lo stesso follicolo linfoide, che dovrebbe essere di Bcl-2 negativi nel centro germinale (centrale) e positivi nella zona del mantello (periferico). Il 01:50 diluizione ha dato un segnale di fluorescenza specifica più forte senza aumentare il segnale aspecifico pertanto è stato usato come la diluizione andando avanti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Immunofluorescenza (IF) utilizzando cella linea tissue microarray (TMA) sezioni. Sezioni della linea cellulare TMA sono state prese e incubati con un 01:50 diluizione di anti-Bcl-2 o con nessun anticorpo primario. Le diapositive sono state incubate con l'anticorpo secondario, il segnale è stato amplificato usando un coniugato di microarray-Cy5 e le diapositive sono state macchiate con DAPI. Le diapositive sono state scannerizzate a 20 X ingrandimento utilizzando filtro imposta appropriata per i picchi di massima eccitazione/emissione di 350/470 nm e 649/666 nm per DAPI e Cy5, rispettivamente. Tempi di esposizione rispettivi sono stati 250 ms e 625 ms. queste immagini rappresentative indicano che la colorazione è stata completata e che c'è una gamma di Bcl-2 espressione attraverso le linee cellulari. Il vetrino di controllo negativo "nessun anticorpo di Bcl-2" non hanno dimostrato alcun segnale di Cy5, come previsto. L'immagine rappresentativa è dalla linea 697 cellulare. Un nucleo di tessuto hyperplastic tonsilla incluso il TMA dimostra un modello equivalente a quella mostrata nella Figura 2. L'intensità media di fluorescenza (MFI) per ogni linea cellulare è stata determinata attraverso la quantificazione del segnale di fluorescenza di Cy5 utilizzando software di analisi di immagine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Determinare la dinamica lineare dei segnali immunoblot (IB). (A) IBs di diluizioni seriali del lisato Granta-519. Ogni macchia è stato esposto per svariate volte per trovare la gamma dinamica lineare. (B) intensità di banda per Bcl-2 (in alto) e GAPDH (in basso) versus quantità di proteine totali caricati per IB in (A). Intensità di banda sono stati quantificati utilizzando il software di analisi di immagine ImageJ. Per Bcl-2 (in alto), i segnali sono rimasto lineari su tutta la gamma di intensità di banda quando un tempo di esposizione basso (exp) (0.2 s) è stata usata (intensità da 0-7.200) supportato dal coefficiente di correlazione di Pearson, un (valore r) di 0,994 (p < 0,001), ma non per una maggiore tempi di esposizione di 1 s e 2 min. Per GAPDH (in basso), i dati è rimasto lineari sopra un'intensità di 3000 (unità arbitrarie) per basso (0.2 s) e medie (2.2 s) tempi di esposizione come supportato da valori r di Pearson di 0,994 (p < 0,001) e 0,992 (p < 0,001), rispettivamente, ma non per un'elevata esposizione tempo ( 7 s). Frecce a destra indicano l'intensità di banda per la linea di celle specifico identificata da immunoblot in Figura 5A. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Quantitative immunoblotting (IB) di linee cellulari immortalizzate e confronto di immunofluorescenza (IF). IB (A) di tutte le linee cellulari. 12 µ g di proteina totale è stata caricata in ogni pozzetto. (B) IB e se segnale di intensità per ogni linea cellulare. Il segnale di IB è il rapporto di Bcl-2:GAPDH intensità di banda dalla macchia in (A) come quantificato dal ImageJ. Il segnale IF è l'intensità di fluorescenza di ogni core di linea cellulare su TMA (Figura 3) come determinato mediante analisi d'immagine. (C), Scatterplot d'IF segnale contro IB segnale. Ogni punto dati rappresenta una linea determinata cella. I due metodi prodotto risultati linearmente correlati con un valore di r di Pearson di 0.984 (p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Trovare il tempo di esposizione ottimale per quantitativi immunoblotting (IB). Viene visualizzata la finestra di IB di tutte le linee cellulari. Dodici microgrammi di proteine sono stati caricati in ciascun pozzetto. Per ogni IB, diversi tempi di esposizione sono stati utilizzati per catturare un'immagine dove tutte le bande è rimasto all'interno della gamma dinamica lineare. I tempi di esposizione delle strisce di Bcl-2 e GAPDH sono stati rispettivamente: (A) 0,1 s e 0.1 s, (B) 1 s e 0,2 s e (C) 5 s e 5 pannelli s. A e C sono riportati esempi delle esposizioni dove almeno alcune delle bands della macchia erano troppo debole o troppo forte, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo descritto un metodo che fa uso di quantitativi immunoblotting (IB) per dimostrare l'utilità di immunofluorescenza (IF) per accertare l'abbondanza relativa di una proteina dell'obiettivo nei campioni di tessuto FFPE. Attuali metodi di quantificazione della proteina sono limitati nella loro natura categorica, come cromogenico IHC2,3, o dalla necessità di omogeneizzare campioni, impedendo di indagine nelle popolazioni delle cellule e la struttura del campione, come con IB e spettrometria di massa8,9,10,11. Se quantitativa possono trascendere queste limitazioni, se il metodo è convalidato e applicato con attenzione. Confrontando le letture se per iIF quantitativa delle linee cellulari immortalizzate, siamo stati in grado di convalidare la natura semi-quantitativa dell'approccio se.
Campioni di tessuto primario da pazienti o animali da esperimento sono eterogenei, in quanto contengono più tipi di cellule. L'applicazione di parecchi anticorpi primari in multiplex se lo consente la quantificazione di una o più proteine di interesse in tipi cellulari specifici o cella scomparti4,13. L'ottimizzazione e applicazione di multiplex se esula dall'ambito di questo articolo, ma è descritta nel seguente carte16,17,18,29. La filosofia ampia è quello di popolazioni di cellule di etichetta e solo quantificare la proteina di interesse nel compartimento cella desiderata, ad esempio i nuclei o citoplasma, nel tipo di cella desiderata. Una volta la natura quantitativa di se con un anticorpo specifico è stata verificata da IB quantitativa, il protocollo possa essere migliorato per consentire la quantificazione della proteina rapida, ad alta produttività in campioni clinici. Applicazioni cliniche in genere richiedono la determinazione dell'abbondanza relativa piuttosto che assoluta, della proteina. Tuttavia, l'approccio di se può essere reso formalmente quantitativo se necessario. Ad esempio, una soluzione contenente ricombinante purificato proteina Bcl-2 potrà essere preparata e quantificati tramite un metodo standard di biochimico. Diluizioni seriali potrebbero quindi essere valutati da IB quantitativa e generare una curva standard per stimare il contenuto proteico assoluto per ogni cella in ogni linea cellulare.
Abbiamo applicato il nostro protocollo se alle sezioni TMA che rappresenta i campioni di biopsia da 66 casi di de novo grande linfoma diffuso della B-cellula. I nostri risultati hanno dimostrato accettabile-Assay riproducibilità (Pearson r = 0,837) e l'atteso, forte associazione tra lo stato di "Bcl-2-positive" determinato soggettivamente da segnare visivo di IHC convenzionale ed elevata espressione determinata obiettivamente da IF (p < 0,001). Inoltre, abbondanza di Bcl-2 da IF correlato con abbondanza di mRNA di Bcl-2 negli stessi campioni (Spearman ρ = 0,69, p < 0,001) ed era significativamente maggiore nei casi con guadagni di numero di copia del gene BCL2 (p = 0,042) o la traslocazione di BCL2 per il locus IGH (p = 0,004), come determinato dall'ibridazione in situ di fluorescenza. Abbiamo ottenuto risultati equivalenti in un gruppo separato di casi. Questi risultati forniscono la prova supplementare che supporta se come un valido metodo per determinare l'abbondanza relativa di Bcl-2 in esemplari FFPE sistematici. L'utilizzo di IF per quantificare parecchie altre proteine di biomarcatore in campioni elementari è stato descritto in precedenza16,17.
Ottimizzazione di questo protocollo è un processo duplice. In primo luogo, se con gli anticorpi primari utilizzati devono essere ottimizzati (punto 2.1). Gli anticorpi commerciali comunemente suggeriscono diluizioni per protocolli IHC che devono essere utilizzati come punto di partenza insieme con una diluizione o due di sopra e di sotto di questo (ovvero, se consigliato 1: 100, aggiungere 01:50 e 1: 150). Dopo l'esecuzione il se e scansione della diapositiva, determinare quale diluizione è "ottimale" comporta l'ispezione visiva per individuare la diluizione di anticorpo primario che genera il segnale più brillante senza aumentare la fluorescenza di fondo. La seconda fase di ottimizzazione implica la scelta della quantità di proteine da caricare per immunoblot garantire che ogni banda rimane nella gamma lineare (punto 3.4). A tal fine, un immunoblot viene eseguita utilizzando una diluizione seriale della linea cellulare che esprime la più grande abbondanza di proteina bersaglio. Da qui, la band intensità contro proteina quantità possa essere tracciata per determinare gli intervalli di intensità attraverso il quale il segnale rimane lineare. Poiché questo intervallo è stabilito nella linea cellulare con la proteina più abbondante di destinazione, per una data quantità di proteina tutte le altre linee cellulari produrrà segnali inferiori. Quando si passa a un immunoblot di tutte le linee cellulari (punto 3.4), la serie di diluizione viene utilizzata per informare una quantità di proteina per caricare che produrrà segnali forti senza correre il rischio di sovraesposizione di là della gamma lineare.
Nonostante i benefici del presente protocollo, l'uso di immunoblotting come metodo di verifica quantificazione ha i suoi difetti. La preoccupazione principale ruota attorno all'ampia gamma di espressione per varie proteine tra esemplari. Può essere difficile mantenere tutti i campioni entro i limiti di una gamma lineare se alcuni campioni esprimono la proteina di interesse in misura molto maggiore rispetto ad altri. Nei risultati della rappresentativi illustrati in precedenza, diverse esposizioni furono catturate per ottenere un'immagine in cui gli estremi (alti e Bassi) sono entrambi all'interno della gamma dinamica lineare (Figura 6). Il maggiore del previsto se segnali visti per le cellule HeLa e Jurkat in figura 5B possono indicare sia il più basso possibile segnale IF per questo sistema, o che il IB segnali hanno raggiunto il fondo del limite di rilevazione lineare e sono meno accurati. In entrambi i casi, questo indica che se i valori a quella fascia hanno meno probabili di essere precisi in questo sistema, e che la tecnica è ottima per le proteine medio - a altamente-espresso. Inoltre, l'uso di anticorpi secondari coniugati HRP non è ottima ai fini quantitativi, come discusso in precedenza per quanto riguarda IHC2,3. Usando gli anticorpi secondari fluorescente contrassegnati per il immunoblot fornirebbe una conferma più robusta che IF è infatti linearmente quantitativa30,31, tuttavia, il valore di r di Pearson di 0.984 ottenuti utilizzando il HRP-coniugato anticorpi secondari nel protocollo di cui sopra è stato sufficiente per gli scopi attuali. Potenziali inconvenienti associati con se, come autofluorescenza e tempra variare basano su strumentazione di laboratorio individuali, le pratiche e tipo di tessuto e possono essere minimizzati da varie misure preventive32,33. Una piccola quantità di autofluorescence nei risultati della rappresentativi può essere visto in nessun campione di anticorpo di Bcl-2 in Figura 3, tuttavia questo importo è banale in confronto il restante se segnali.
La necessità di quantificare con precisione le proteine di interesse dai campioni di tessuto FFPE relativamente ai clinica e scopi di ricerca in molti campi biologici. Il protocollo presentato qui illustra l'utilizzo di IF quantitativa su sezioni di tessuto FFPE e convalida la sua natura semi-quantitativa di immunoblotting di linee cellulari immortalizzate. Questo metodo consente la quantificazione attraverso un'ampia gamma dinamica, come pure il mantenimento dell'integrità strutturale del campione di tessuto, che non viene mantenuto in molti altri quantificazione metodi3,8,11. Inoltre, questo protocollo è facilmente adattabile e può essere applicato nella ricerca e regolazioni cliniche, soprattutto per la ricerca legata al cancro e prognosi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Fredrick Banting e Charles Best Canada Graduate Scholarship (A.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | - | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | - | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | - | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | - | For densitometry analysis |
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