Summary
Vi beskriver brugen af kvantitative immunoblotting at validere immunofluorescens histologi kombineret med billedanalyse som et middel til at kvantificere en protein af interesse i formalin-fast, paraffin-embedded (FFPE) vævsprøver. Vores resultater viser nytten af immunofluorescens histologi for fastslå det relative antal biomarkør proteiner i rutinemæssig biopsi prøver.
Abstract
Kvantificering af proteiner af interesse i formalin-fast, paraffin-embedded (FFPE) vævsprøver er vigtigt i kliniske og forskningsmæssige anvendelser. En optimal metode til kvantificering er nøjagtig, har en bred lineær dynamikområde og vedligeholder den strukturelle integritet af prøven at muliggøre identificering af enkelte celletyper. Nuværende metoder såsom Immunhistokemi (IHC), massespektrometri og immunoblotting hver undlader at opfylde disse bestemmelser på grund af deres kategoriske karakter eller skal omrystes prøven. Som en alternativ metode foreslår vi anvendelse af immunofluorescens (IF) og billedanalyse til at bestemme den relative forekomst af et protein af interesse i FFPE væv. Heri vise vi, at denne metode er let optimeret, giver et bredt dynamikområde og er lineært kvantificerbare i forhold til guldstandarden af kvantitative immunoblotting. Desuden, denne metode tillader opretholdelse af den strukturelle integritet af prøven og giver mulighed for at skelne mellem forskellige celletyper, som kan være afgørende i diagnostiske programmer. Alt i alt, dette er en robust metode til den relative kvantificering af proteiner i FFPE prøver og nemt kan tilpasses til at passe til kliniske eller forskning behov.
Introduction
Er nødvendigheden at kvantificere proteiner i formalin-fast, paraffin-embedded (FFPE) biopsi vævsprøver findes i mange kliniske områder. For eksempel, bruges kvantificering af biomarkør proteiner i rutinemæssig biopsi prøver til at belyse prognose og informere behandling for kræft patienter1. Nuværende metoder er dog typisk subjektiv og mangler validering.
Immunhistokemi (IHC) anvendes rutinemæssigt i patologi laboratorier og generelt afhænger af en primær antistof rettet mod målet protein og en sekundær antistof konjugeret med en enzymatisk etiket som peberrodsperoxidase2. Konventionelle IHC er følsomme, kan gøre brug af minut prøver og bevarer vævsprøver dermed tillader vurdering af protein udtryk inden for dens relevante histologiske forbindelse morfologiske integritet. Men fordi kromogent signalet genereret af IHC er subtraktiv, det lider af en relativt snævre dynamikområde og giver et begrænset potentiale for multiplexing2,3,4. Matrix assisted laser desorption/Ionisation massespektrometri imaging (MALDI-MSI) bevarer morfologiske integritet. Men denne udvikling teknologi er forbundet med beskedne morfologiske opløsning og kræver betydelige kalibrering og normalisering, forringer dens gennemførlighed for rutinemæssig klinisk brug5,6,7. Alternative teknikker til at kvantificere protein i vævsprøver omfatter immunoblotting8, massespektrometri9,10,11og enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA)12, hver af som begynder med en homogeniseret lysate af vævsprøve. Primære vævsprøver er heterogene, idet de indeholder en lang række celletyper. Derfor, teknikker, der medfører homogenisering prøverne ikke tillader kvantificering af et protein i en bestemt celle population af interesse, såsom kræftceller.
Ligesom IHC, hvis gælder for lille FFPE prøver og tillader lagring af histologiske integritet13. Men takket være den additive natur af fluorescens signaler, hvis er åbne over for anvendelsen af flere primære antistoffer og fluorescerende etiketter. Således, en protein af interesse kan kvantificeres relativt inden for bestemte celler eller cellulære rum (eksempelvis kerne versus cytoplasma) defineret ved hjælp af andre antistoffer. Fluorescens signaler har også fordelen af et større dynamikområde13,14. Overlegenhed, reproducerbarhed og multiplexing potentiale for har hvis påføres FFPE prøver været demonstreret13,14,15.
Heri beskriver vi anvendelse af kvantitative immunoblotting ved hjælp af etablerede cellelinier som en guld standard for at undersøge kvantitativ art, hvis kombineret med computerstøttet billedanalyse til at bestemme den relative forekomst af et protein af interesse i histologiske snit fra FFPE vævsprøver. Vi har anvendt denne metode med held i en multiplex tilgang til at kvantificere biomarkør proteiner i klinisk biopsi prøver16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkendelse til at bruge primære menneskelige vævsprøver blev indhentet fra Sundhedsvidenskab og tilknyttede universitetshospitaler forskning etik Board (HSREB) på Queen's University.
1. opbygning af en celle-line væv Microarray (TMA)
- Høst og vask celler.
Bemærk: Denne protokol er blevet testet på forskellige etablerede udødeliggjort cellelinjer (f.eks. HeLa, Jurkat, RCH-ACV).- Høste cirka 1,3 x 107 celler for vedhængende celler, når de når omkring 80% confluency. Frigør celler ved hjælp af en passende for den pågældende cellelinje reagens.
Bemærk: Ethylendiamintetra syre (EDTA) er generelt foretrækkes over trypsin at reducere risikoen for nedværdigende overflade proteiner. Hvis du bruger trypsin, neutralisere trypsin ved hjælp af føtal bovint serum (FBS) umiddelbart efter høst cellerne. - Suspension celler, høste ca 8 x 107 celler i log-fase af vækst.
- Indsamle de høstes/aftagelig celler ved centrifugering i 5 min ved 225 x g i en 50 mL konisk slange.
- Den dekanteres og genopslæmmes toerstoffet i 10 mL af 1 X fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Der centrifugeres i 5 min. ved 225 x g og den dekanteres.
Bemærk: 1 X PBS er sammensat af 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 i destilleret vand; justere pH 7,4.
- Høste cirka 1,3 x 107 celler for vedhængende celler, når de når omkring 80% confluency. Frigør celler ved hjælp af en passende for den pågældende cellelinje reagens.
- Fix celler i formalin og pellet dem.
- Suspendere celle pellet i konisk røret i 10 mL 10% neutrale bufferet formalin (NBF).
Bemærk: NBF kan tilberedes ved fortynding af 1 mL af 37% formaldehyd stamopløsning i 9 mL 1 X PBS.
FORSIGTIGHED: Vær forsigtig ved omgangen med formalin og formaldehyd. Bruge et stinkskab for skridt involverer formalin og formaldehyd. - Inkuber celler på en rocker på 24 rpm ved rumtemperatur natten over (ca 17 h).
- Forberede en 1% opløsning af lavt smeltepunkt Agarosen i PBS (0,01 g Agarosen per 1 mL PBS).
- Forberede nok til 500 µL af Agarosen løsning pr. celle linje prøve.
- Opløse Agarosen i en 80 ° C vand bad eller varme blok, med lejlighedsvise blanding for 2-5 min. Når opløst, holde løsningen i et 37 ° C vand bad eller varme blok at forhindre hærdning.
- Pellet fast celler fra trin 1.2.2 ved centrifugering for 5 min. ved 225 x g. Fjern supernatanten og resuspend celler i 500 µL 1 x PBS.
- Overføre cellerne i en 1,5 mL microcentrifuge rør og pellet ved centrifugering i 5 min på 290 x g. aspirat off alle supernatant.
- Suspendere celle pellet i konisk røret i 10 mL 10% neutrale bufferet formalin (NBF).
- Kaste celler i agarosegelelektroforese.
- Tilføje ~ 500 µL af 1% Agarosen løsning (fra trin 1.2.3) til hvert rør, der indeholder cellerne. Forsigtigt, men hurtigt, tilsæt blandingen op og ned ved hjælp af en P-1000 mikropipette til at blande.
Bemærk: Skåret ud i slutningen af pipette tip til at forstørre blænde og undgå at danne bobler. Holde Agarosen brugsopløsning i 37 ° C vandbad til at forhindre hærdning. - Tillad Agarosen-celle løsning til at hærde (5-10 min) ved stuetemperatur. Der tilsættes 1 mL af 10% NBF til hver microcentrifuge tube, som indeholder en sample og holde ved stuetemperatur indtil paraffin embedding (op til 24 timer).
- Tilføje ~ 500 µL af 1% Agarosen løsning (fra trin 1.2.3) til hvert rør, der indeholder cellerne. Forsigtigt, men hurtigt, tilsæt blandingen op og ned ved hjælp af en P-1000 mikropipette til at blande.
- Forberede Agarosen plug paraffin indlejring.
- Opsug fra NBF fra prøven.
- Fjerne celle stikket ved hjælp af et barberblad skæres microcentrifuge tube, Anbring stikket i plast væv kassette. Gemme kassetter i 10% NBF ved stuetemperatur.
- Behandle prøverne natten enten manuelt eller ved hjælp af en automatiseret væv processor, og integrere i paraffin voks ved hjælp af standard histologi metoder.
Bemærk: Se Fischer mfl. 19 for et eksempel protokol. - Ved hjælp af en specialiseret "væv arrayer" instrument, høst dublerede 0,6 mm kerner fra paraffin blokere fra hver cellelinje og indsætte dem i rækker, i en tom modtager paraffin blok for at skabe en cellelinje TMA.
Bemærk: Standard metoder bør anvendes som beskrevet i Fedor og De Marzo20. - Indarbejde kerner fra primære stikprøver, som repræsenterer 2-3 ekstra vævstyper (fx tonsil, kolon, testikler, osv.) som positive eller negative kontroller i TMA. Vælg væv, der er relevante for protein af interesse.
- Bruge en mikrotom til at forberede to histologiske sektioner, ca 4-6 µm tykt, af cellelinie TMA. Montere afsnittet på et histologi dias, tør det, og deparaffinize (som beskrevet i Fedor og De Marzo20).
2. prøven farvning ved immunfluorescens
- Optimere fortynding af primære antistof.
Bemærk: Standard protokoller findes for optimering af IHC eller hvis for FFPE væv sektioner såsom i Kajimura et al. 21. en kort oversigt over fremgangsmåde er beskrevet her.- Forbered 4-5 fortyndinger af primære antistof til protein af interesse styret af producentens anvisninger.
- Identificere en kontrolelementtype på væv fra en animalsk eller human kilde, der udtrykker interesse i morfologisk genkendelige cellepopulationer protein. Forberede sektioner af væv og montere dem på en slide efter standard Immunhistokemi procedure som i Fedor og De Marzo20.
Bemærk: Antallet af afsnit kræves er antallet af primære antistof fortyndinger plus en ekstra. - Ved hjælp af en automatisk eller manuel system for immunohistology, teste de primære antistof fortyndinger fra trin 2.1.1 hver på et dias fra trin 2.1.2. Udelader anvendelsen af primære antistof fra den ekstra dias og bruge det som en negativ kontrol.
- Under farvning processen plette alle dias med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) som en nuklear kontrastfarve og en fluorescently tagged sekundær antistof. Hvis større følsomhed er påkrævet, skal du bruge en HRP (peberrodsperoxidase)-konjugeret sekundær antistof og tyramide-baserede signal forstærkning system (Se stak et al. 13).
Bemærk: Når multiplexing primære antistoffer, bruges en anden fluorescerende etiket for hvert protein. - Skan immunostained dias ved hjælp af et passende instrument i stand til at generere en digital billedfil ved hjælp af excitation og påvisning bølgelængder passende til den fluorophores, der blev brugt.
- Bruge passende software til at se de digitale billeder og empirisk vælge den primære antistof fortynding, der optimerer signal intensitet i forhold til baggrunden fluorescens.
Bemærk: Hvis det ønskes, denne optimering kan forekomme ved hjælp af en HRP-konjugerede sekundær antistof, 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) og brightfield mikroskopi.
- Udføre hvis farvning på cellelinie TMA.
- Bruge en automatisk eller manuel system for immunohistology at plette et dias af cellelinie TMA med optimeret primære antistof fortynding (som bestemt i trin 2.1). Udelader anvendelsen af primære antistof fra det andet dias og bruge det som en negativ kontrol.
- Under farvning processen plette alle dias med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) som en nuklear kontrastfarve, og med en sekundær antistof og tyramide som i trin 2.1.4.
- Skan immunostained dias ved hjælp af et passende instrument i stand til at generere en digital billedfil ved hjælp af excitation og påvisning bølgelængder passende til den fluorophores, der blev brugt.
- Bruge et billede analyse softwarepakke til at identificere den cellulære rum af interesse (dvs., cytoplasma versus kerne) og kvantificere den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) for hver cellelinje.
Bemærk: Forskellige softwarepakker kan bruges til dette formål og mange diskuteres i stak et al. 13.
3. kvantitative Immunoblotting af cellelinier
- Forberede lysates af celler.
- Høste 2 millioner celler af hver cellelinje, som beskrevet i trin 1.1.1 til 1.1.3.
- Spin celler ned i 5 min på 650 x g i en 50 mL konisk slange. Dekanteres.
- Vaske cellerne med 10 mL iskold PBS. Resuspend i 1 mL iskold PBS og overførsel til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Centrifugeres pr. trin 3.1.2, dekanteres og forlade celler på is.
- Tilføje omkring 200 µL af kolde radioimmunoprecipitation (RIPA) lysisbuffer med proteasehæmmere (10 µL af 100 X hæmmere pr. mL af RIPA lysisbuffer) til cellerne, vortexes og inkuberes i isbad i 15 min.
Bemærk: Mængden af lysisbuffer kræves til effektiv lysis varierer efter cellelinie og kan bestemmes empirisk. RIPA buffer består af 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0% NP-40, 0,5% natrium deoxycholate, 0,1% SDS i destilleret vand. - For at sikre relativt selv indlæsning på immunoblots, kvantificere den total protein i en 20 µL prøve fra hver lysate efter en passende metode som Bradford assay. Tilføje omkring 40 µL af 6 X Laemmli lysisbuffer til resten (ca 180 µL) i hver celle lysate og koges ved 100 ° C i varme blok eller vand bad i 5 min.
Bemærk: 6 X Laemmli buffer er sammensat af 300 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w/v) SDS, 60% glycerol, 0,6% (w/v) bromophenol blå, 50 mM dithiothreitol (DTT) i destilleret vand. - Gemme prøver på-20 ° C i op til to uger.
- Udføre en immunblot af alle celler linjer til at bestemme, hvilken cellelinje er den mest rigelige protein af interesse.
Bemærk: Følg fremgangsmåden i Mahmood, T. og Yang, PC. 22, med følgende ændringer.- Alikvot celle lysate (udarbejdet i trin 3.1) indeholdende 10-50 µg protein (afhængigt af overfloden af protein af interesse) i microcentrifuge rør. Tilføje 2,5 µL af 6 X Laemmli buffer og tilstrækkelig RIPA lysisbuffer at gøre volumen op til 15 µL.
- Indlæse en 5% stabling og en passende koncentration løsning (f.eks.10% til proteiner mellem 15-100 kDa) SDS-PAGE gel med en protein stigen og prøver fra trin 3.2.1. Læg 1 X Laemmli buffer i tomme brønde. Køre strømforsyningen på relevante indstillinger, typisk 125 V, 80 min. eller indtil bromophenol blå farvestoffet når bunden af pladen.
- Udføre en halvtør protein overførsel, som beskrevet i Wiedemann et al. 23.
Bemærk: For de repræsentative resultater, en nitrocellulose membran, (som ikke behøver at være gennemblødt i methanol), og kolde Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) overførsel buffer blev brugt. BSN buffer består af 48 mM Tris, 39 mM glycin, 20% methanol i destilleret vand. - Efter overførslen, skal du bruge et barberblad til at skære membran vandret for at adskille den del, som indeholder protein af interesse fra en hensigtsmæssigt intern kontrol protein, såsom GAPDH.
- Fortsæt til blokering og antistof inkubationer ved hjælp af de blokerende buffer anbefalet af producenten af de primære antistoffer.
Bemærk: Optimale primære antistof fortyndinger kan variere betydeligt afhængigt af protein overflod og følsomhed. For de repræsentative resultater nedenfor kræves antistof til protein af interesse en 1:1,000 fortynding mens kontrolelementet GAPDH kræves en 1:40,000 fortynding. Fortynding af sekundært antistoffer bruges var 1:3, 000. - Efter antistof inkubationer og vask af membranen, skal du placere membran strimler i en klar plast kappe som en sandwich taske.
- Forbered enchanced kemiluminescens (ECL) blanding efter fabrikantens anvisninger. Brug en P-1000 pipette til at dække membran med ECL blanding, lukke kappe og inkuberes membran strimler med blandingen i mørke ved stuetemperatur i 1-2 min.
- Sted membran jakke i en digital imaging platform. Brug chemiluminescence og kolorimetrisk markør påvisning at indfange forskellige eksponeringer af membranen.
Bemærk: Eksponering gange vil variere baseret på mængden af protein indlæst, overflod af target protein, antistof affinitet osv begynder med en automatisk eksponering (typisk et par sekunder), og test eksponering gange over og under ad gangen i et par sekunder. - Empirisk, eller brug billede analyse software, bestemme hvilke cellelinie udtrykker de mest mål protein.
- Find den lineære dynamiske rækkevidde af hver primære antistof ved hjælp af en seriel fortynding.
- Udfør trin 3.2.1-3.2.8 ved hjælp af en serie af serielle fortyndinger fra den cellelinie, som udtrykker den højeste koncentration af target proteinet (identificerede i trin 3.2.9).
- Bruge billede analyse software som ImageJ for at udføre densitometri på eksponering billeder.
- For eksempel, brug ImageJ, bruge værktøjet Rektangulært valg til at vælge den første lane gel til at kvantificere. Gå til analysere | Gels | Vælg første Lane. Brug musen til at flytte den resulterende rektangel over til den næste lane. Gå til analysere | Gels | Vælg næste Lane. Gentagne gange Flyt rektanglet til det næste lane og vælg lane for resten af banerne.
- Gå til analysere | Gels | Plot baner. Brug værktøjet Lige linje til at tegne linjer på tværs af baserne af hver top til at fjerne baggrundsstøj. Brug værktøjet tryllestav til at vælge hver top, og indsamle tætheden af hver top, fremover benævnt band intensitet, fra vinduet resultater .
- Bruge densitometri arbejdsydelse hen til skabe en scatterplot af bandet intensitet versus beløbet af total protein indlæst for hver primære antistof. Brug en linje af bedste pasform og besigtigelse, bestemme placering (intensitet interval) for den lineære dynamiske rækkevidde af hver antistof.
- Vælg en proteinkoncentration, der genererer en værdi på den højere ende af den lineære område skal koncentrationen bevæger sig fremad med alle cellelinjer.
Bemærk: Da denne koncentration er lavere end den mætning i cellelinie med den største mængde af dette protein, der bør ingen fare for over udsætte bands for de andre cellelinjer.
- Udføre en immunblot ved hjælp af proteinkoncentration valgt i trin 3.3.4 for alle cellelinjer og gentage trin 3.2.1-3.2.8.
- Udføre densitometri på de digitale scanner i trin 3.3.2. Vælg de engagementer billeder, der give signaler inden for de lineære intervaller for hver antistof identificerede i trin 3.3.3.
- Brug band intensitet signaler fra de ideelle engagementer fra 3.4.1, beregne forholdet mellem mål protein band intensitet til lastning kontrol band intensitet for hver cellelinje. Disse ratio værdier angiver den relative forekomst af target proteinet af interesse.
- Udføre en Pearson korrelation test (kan gøres ved hjælp af en statistisk programpakke) at korrelere de værdier, der er fremstillet af billedanalyse af hvis farvning (trinnet 2.2) til dem, der opnås fra immunoblotting (trin 3.4.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol blev brugt til at bekræfte, hvis evne til at bestemme de relative mængder af anti-apoptotiske protein Bcl-2 i cellelinjer til FFPE væv blokke. Kvantificere Bcl-2 selektivt i kræftceller kan belyse muterede mekanismer og kan være nyttig i patologiske diagnose og informere behandlingsprogram beslutninger24. Mere specifikt Bcl-2 spiller en rolle i ordentlig B-lymphocyte udvikling og dens udtryk er almindeligt undersøgt i forbindelse med lymfom25,26,27. Figur 1 beskriver de forskellige trin i protokollen. I en indledende hvis optimering trin, blev forskellige fortyndinger af det primære antistof, anti-Bcl-2 testet på menneskelige tonsil væv ved hjælp af en automatiseret immunohistology stainer som beskrevet i trin 2.1. Figur 2 indeholder billeder af farvede og scannede histologi slides af menneskelige tonsil væv, fik hver en anden fortynding af antistof. Det kan ses at 1:50 er den optimale fortynding, som gav stærk signal og lidt baggrund fluorescens. Denne fortynding blev derefter brugt på cellelinie TMA som beskrevet i trin 2.2. TMA var også farves ved hjælp af DAPI for at identificere kerner. En tyramide-baseret signal forstærkning kit blev brugt til at mærke Bcl-2 med en Cy5 fluorophore. Billedanalyse blev brugt til at kvantificere de cytoplasmatisk Cy5 fluorescens signal tilskrives Bcl-2 i hver cellelinje. Repræsentative billeder af farvning kan ses i figur 3. De udødeliggjort cellelinjer valgt til dette eksperiment indgår en bred vifte af lymfoide-afledte cellelinjer, nemlig 697, JeKo-1, Jurkat, RCH-ACV, Granta-519, REH og Mads, ud over HeLa, stammer fra en cervikal karcinom. HeLa celler er kendt for at udtrykke Bcl-2 på et meget lavt niveau28.
Baseret på en indledende immunblot af alle otte cellelinjer, var Granta-519 besluttet på at have den største overflod af Bcl-2 (ikke vist). Serielle fortyndinger af Granta-519 lysate blev brugt i en efterfølgende immunblot til at finde den lineære dynamiske vifte Bcl-2 og GAPDH (lastning kontrol) signaler (figur 4A). Denne immunblot blev udsat ved hjælp af den digitale scanner for varierende længder af tid. Densitometri bruger billede analyse software blev brugt til at kvantificere signalet fra hvert band, og disse værdier blev plottes mængden af protein indlæst (figur 4B). Fra data i figur 4B-top, dynamikområde for Bcl-2 i dette assay spænder fra et band intensitet på næsten nul til 7500 (arbitrære enheder, blå linje). De to højere eksponering gange passer en kvadratiske og ikke-lineære ligning, tyder på overeksponering og mætning af signal intensitet. Intervallet for GAPDH er fra 3000 til 6500 (arbitrære enheder, figur 4B-bund). Værdier under 3000 (arbitrære enheder) faldt voldsomt selvom du bruger en forholdsvis lav eksponeringstid. En lang eksponering klart resulterer i mætning. Fra disse grafer, blev det fastslået at 12 µg ville være et rimeligt beløb af protein hen til ladning når du udfører immunblot med alle cellelinjer, da denne mængde protein givet Bcl-2 intensitetsværdierne inden for det lineære område for Granta-519 celler, at reducere risiko for overeksponering for alle andre cellelinjer.
En anden immunblot af alle cellelinjer blev derefter udført i trin 3.4 og kan ses i figur 5A. Denne skamplet krævedes siden de oprindelige skamplet indeholdt bands med et signal intensitet uden for det lineære område. Billede analyse software blev brugt til at bestemme signal intensiteten af hvert bånd i den nye skamplet. Kun intensitetsværdierne, der var inden for dynamisk intervallerne fastsættes ovenfor blev brugt. Pile til højre på figur 4B demonstrere repræsentative intensitetsværdierne, der blev brugt og Vis hvor de passer inden for det lineære område. Forholdet mellem Bcl-2:GAPDH blev derefter beregnet for hver cellelinje. Dette forhold, sammen med fluorescens signalet fra hvis kan ses i figur 5B. En Pearson korrelation test viste, at intensiteten nøgletal fra immunoblotting var stærkt og positivt korreleret med intensitet aflæsninger fra kvantitative, hvis (r = 0.983, p < 0,001, se figur 5 c).
Kvantitativt udmaalingen af Bcl-2 viste sig for at være særligt vanskelige, da der var en bred vifte af udtryk af dette protein på tværs af de otte testede cellelinjer. Ved hjælp af en tilstrækkelig lang eksponering til fange signalet fra de lave Bcl-2-udtrykker cellelinjer (> 1 s) gjorde det vanskeligt at forblive i det dynamiske område for de høje Bcl-2-udtrykker cellelinjer. I et forsøg på at kvantificere de svage bands produceret af cellelinjer som HeLa og Mads, flere forskellig eksponering gange, fra 0,1 s til 5 s, blev taget til fange for at bestemme den længste eksponeringstid, der kunne bruges mens de resterende i det dynamiske område af celler, såsom Granta -519 (Se figur 6). Arten af denne immunoblotting teknik begrænser nøjagtigheden af signal detection som én tilgange støj, tyder på, det er optimalt bruges til at kvantificere proteiner, der findes på mellemliggende til høj udtryk niveauer.
Figur 1 : Protokol arbejdsprocesdiagram. Immunofluorescens (IF) på en celle linje væv microarray (TMA) blev kørt parallelt med kvantitative immunoblotting (IB) af de samme cellelinjer. Signaler fra hver cellelinje sammenlignes af Pearson korrelation til at validere hvis protokollen kvantitative evne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Afprøvning og optimering immunofluorescens (IF) protokollen. Dele af tonsil var inkuberes med forskellige fortyndinger af anti-Bcl-2 antistof (1:50, 1: 100, og ingen primære antistof). Diasene var inkuberes med HRP-konjugerede sekundær antistof, signalet blev forstærket ved hjælp af en tyramide-Cy5 konjugat og dias var plettet med DAPI. Diasene blev scannet på 20 X forstørrelse ved hjælp af filteret angiver passende til maksimal excitation/emission toppene af 350/470 nm og 649/666 nm for DAPI og Cy5, henholdsvis. Respektive eksponering gange var 160 ms og 200 ms. synsfelt er centreret over den samme lymfoide follikel, som forventes at blive Bcl-2 negative i (centrale) germinale centrum og positive i zonen (perifer) kappe. 1:50 fortynding gav et stærkere signal om specifikke fluorescens uden at øge det uspecifikke signal blev derfor det brugt som fortynding går fremad. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Immunofluorescens (hvis) ved hjælp af celle væv microarray (TMA) strækningerne. Dele af cellelinie TMA blev taget og rugede med et 1:50 fortynding af anti-Bcl-2 eller med ingen primære antistof. Diasene var inkuberes med sekundær antistof, signalet blev forstærket ved hjælp af en tyramide-Cy5 konjugat og dias var plettet med DAPI. Diasene blev scannet på 20 X forstørrelse ved hjælp af filteret angiver passende til maksimal excitation/emission toppene af 350/470 nm og 649/666 nm for DAPI og Cy5, henholdsvis. Respektive eksponering gange var 250 ms og 625 ms. disse repræsentative billeder viser at farvning var vellykket, og at der er en vifte af Bcl-2 udtryk på tværs af cellelinjer. "Ingen Bcl-2 antistof" negativ kontrol dias ikke påvise nogen Cy5 signal, som forventet. Det repræsentative billede er fra linjen 697 celle. En kerne af hyperplastiske tonsil væv inkluderet på TMA viser et tilsvarende mønster som vist i figur 2. Den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) for hver cellelinje blev fastsat ved at kvantificere Cy5 fluorescens signalet ved hjælp af billede analyse software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Fastslå den lineære dynamikområde immunblot (IB) signaler. (A) IBs af serielle fortyndinger af Granta-519 lysate. Hver plet var udsat for en række gange for at finde den lineære dynamikområde. (B) Band intensitet for Bcl-2 (øverst) og GAPDH (nederst) versus mængden af total protein indlæst til IB i (A). Bandet intensiteter var kvantificeres ved hjælp af billede analyse software ImageJ. For Bcl-2 (top), signalerne forblev lineært i hele rækken af bandet intensiteter når en lav eksponeringstid (exp.) (0,2 s) var brugt (intensitet fra 0-7.200), som understøttes af en Pearsons korrelationskoefficient (r-værdien) 0.994 (p < 0,001), men ikke for større eksponering gange 1 s og 2 min. For GAPDH (nederst), data forblev lineært over en intensitet på 3000 (arbitrære enheder) for lav (0,2 s) og medium (2.2 s) eksponering gange som understøttes af Pearson's r-værdier af 0.994 (p < 0,001) og 0.992 (p < 0,001), henholdsvis, men ikke for en høj eksponering tid () 7 s). Pile til højre angiver band intensiteten for den specifikke cellelinie identificeret fra immunblot i figur 5A. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Kvantitative immunoblotting (IB) udødeliggjort cellelinjer og sammenligning til immunofluorescens (IF). (A) IB af alle cellelinjer. 12 µg af total protein blev indlæst i hver brønd. (B) IB og hvis signal intensiteter for hver cellelinje. IB signal er forholdet mellem Bcl-2:GAPDH band intensitet fra skamplet i (A) som kvantificeres ved ImageJ. Hvis signalet er fluorescens-intensiteten af hver celle linje kerne på TMA (figur 3), som bestemmes af billedanalyse. (C) Scatterplot af IF signal versus IB signal. Hvert datapunkt repræsenterer en given cellelinje. De to metoder produceret lineært korreleret resultater med en Pearson r værdien af 0.984 (p < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : At finde den optimale eksponeringstid for kvantitative immunoblotting (IB). IB af alle cellelinjer er vist. 12 mikrogram af protein blev indlæst i hver brønd. For hver IB, blev forskellige eksponeringstider brugt til at fange et billede hvor alle bands holdt sig inden for den lineære dynamikområde. Eksponeringstider af Bcl-2 og GAPDH strimler henholdsvis var: (A) 0,1 s og 0,1 s, (B) 1 s og 0,2 s, og (C) 5 s og 5 s. paneler A og C viser eksempler på engagementer hvor mindst nogle af bands på skamplet var alt for svag eller alt for stærk, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en metode der gør brug af kvantitative immunoblotting (IB) for at påvise nytten af immunofluorescens (IF) for at vurdere den relative forekomst af en target proteinet i FFPE vævsprøver. Nuværende protein kvantificering metoder er begrænset af deres kategoriske karakter, såsom kromogent IHC2,3, eller behovet for at homogenisere prøver, forhindrer undersøgelse prøve struktur og celle populationer, som med IB og massespektrometri8,9,10,11. Kvantitative hvis kan overskrider disse begrænsninger, hvis metoden er valideret og anvendes omhyggeligt. Ved at sammenligne hvis udlæsninger til kvantitative iIF af udødeliggjort cellelinjer, var vi i stand til at validere metoden hvis semi-kvantitative karakter.
Primære vævsprøver fra patienter eller forsøgsdyr er heterogene, idet de indeholder flere celletyper. Anvendelse af flere primære antistoffer i multiplex hvis tillader kvantificering af én eller flere proteiner af interesse for bestemte celletyper eller celle rum4,13. Optimering og anvendelse af multiplex hvis ligger uden for rammerne af denne artikel, men er skitseret i de følgende papirer16,17,18,29. Den overordnede filosofi er at etiketten cellepopulationer og kun kvantificere protein af interesse i den ønskede celle rum, for eksempel kerner eller cytoplasma, i den ønskede celletype. Når hvis kvantitativ karakter med en bestemt antistof er blevet bekræftet af kvantitative IB, kan protokollen være opskaleret for at give mulighed for hurtige, høj overførselshastighed protein kvantificering i kliniske prøver. Kliniske applikationer kræver generelt bestemmelse af relativ og ikke absolut, protein overflod. Dog kan metoden hvis gøres formelt kvantitative, hvis nødvendigt. For eksempel, en løsning, der indeholder renset rekombinant Bcl-2 protein kunne være forberedt og kvantificeres ved hjælp af en standard biokemiske metode. Serielle fortyndinger kunne derefter evalueres af kvantitative IB og en standardkurve genereret til at vurdere den absolutte proteinindhold pr. celle i hver cellelinje.
Vi anvendte vores hvis protokollen til TMA sektioner der repræsenterer biopsi prøver fra 66 tilfælde af de novo diffuse store B-celle lymfom. Vores resultater viste acceptable køre-hen til-opstille reproducerbarhed (Pearson r = 0.837) og den forventede, stærk tilknytning mellem "Bcl-2-positiv" status bestemt subjektivt af visuel scoring af konventionelle IHC og forhøjede udtryk bestemmes objektivt af hvis (p < 0,001). Derudover Bcl-2 overflod af hvis korreleret med Bcl-2 mRNA overflod i de samme prøver (Spearman Rho = 0,69, p < 0,001) og var væsentligt større i tilfælde med kopi nummer gevinster af BCL2 -genet (p = 0.042) eller omplantning af BCL2 til det indvendige Gearnav locus (p = 0,004), som bestemmes af fluorescens i situ hybridisering. Vi opnåede tilsvarende resultater i en separat kohorte af tilfælde. Disse resultater giver yderligere beviser, der understøtter hvis som en gyldig metode til bestemmelse af den relative forekomst af Bcl-2 i rutinemæssige FFPE prøver. Brug hvis til at kvantificere flere andre biomarkør proteiner i primære prøver er blevet beskrevet tidligere16,17.
Optimering af denne protokol er en todelt proces. Første, hvis med primære antistoffer bruges skal optimeres (trin 2.1). Kommercielle antistoffer normalt foreslå fortyndinger for IHC protokoller, som skal bruges som udgangspunkt en fortynding eller to ovenfor og nedenfor dette (dvs., hvis 1: 100 anbefales, tilføje 1:50 og 1:150). Efter udførelse af IF og scanning af dias, indebærer afgøre hvilke fortynding er "optimale" visuel inspektion for at identificere den primære antistof fortynding, der genererer den lyseste signal uden at øge baggrunden fluorescens. Anden etape af optimering indebærer at vælge mængden af protein til last for immunblot sikre hvert band forbliver i den lineære område (trin 3,4). For at sikre dette, udføres en immunblot ved hjælp af en seriel fortynding af linjen celle, der udtrykker den største overflod af target protein. Herfra, kan band intensiteter versus protein beløb afbildes til at bestemme intensitet intervaller hvorigennem signalet forbliver lineær. Da dette interval er etableret i cellelinje med mest rigelige target proteinet, vil alle andre cellelinjer for en given mængde protein giver lavere signaler. Når du flytter til en immunblot af alle cellelinjer (trin 3,4), bruges fortyndingsrække at informere en protein beløb at indlæse der vil give kraftige signaler uden at løbe risikoen for overeksponering uden for det lineære område.
Trods fordelene ved denne protokol, brug af immunoblotting som en kvantificering bekræftelsesmetode har sine mangler. Den primære bekymring drejer sig om den store vifte af udtryk for forskellige proteiner mellem enhederne. Det kan være svært at holde alle prøver inden for rammerne af en lineære område, hvis nogle prøver express protein af interesse for en langt højere grad end andre. I de repræsentative resultater vist ovenfor, blev varierende engagementer fanget for at få et billede hvor yderpunkter (høj og lav) er begge inden for den lineære dynamiske område (figur 6). Den større end forventede hvis signaler set for HeLa og Jurkat cellerne i figur 5B kan angive enten den laveste mulige hvis signal for dette system, eller at IB signalerne har nået bunden af lineære påvisning begrænse og er mindre præcis. Uanset hvad, dette viser, at hvis værdier på dette område er mindre tilbøjelige til at være præcis i dette system, og at teknikken, der er optimal for medium - til meget-udtrykte proteiner. Desuden er brug af HRP-konjugerede sekundære antistoffer ikke optimal til kvantitative formål, som diskuteret tidligere med hensyn til IHC2,3. Ved hjælp af fluorescently mærket sekundære antistoffer for immunblot ville give et mere robust bekræftelse, hvis er faktisk lineært kvantitative30,31, dog Pearson r-værdien af 0.984 fremstillet ved hjælp af den HRP-konjugerede sekundære antistoffer i den ovennævnte protokol var tilstrækkeligt for de aktuelle formål. Potentielle svagheder forbundet med IF, som autofluorescence og dæmper varierer baseret på individuelle laboratorium instrumentation, praksis og vævstype, og kan blive minimeret ved forskellige forebyggende foranstaltninger32,33. En meget lille mængde af autofluorescence i de repræsentative resultater kan ses i ingen Bcl-2 antistof prøve i figur 3, men dette beløb er ubetydelige i forhold til den resterende hvis signaler.
Behovet for at nøjagtigt kvantificere proteiner af interesse fra FFPE vævsprøver vedrører kliniske og forskning med henblik på tværs af mange biologiske felter. Protokollen præsenteres her beskriver brugen af kvantitative hvis på FFPE væv sektioner og validerer sin semi-kvantitative karakter af immunoblotting af udødeliggjort cellelinjer. Denne metode giver mulighed for kvantificering på tværs af et bredt dynamikområde, samt vedligeholdelse af den strukturelle integritet af vævsprøve, der ikke er bevaret i mange andre kvantificering metoder3,8,11. Derudover denne protokol er let at tilpasse og kan anvendes i forskning og klinisk indstillingerne, især for kræft-relateret forskning og prognose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde var delvis finansieret af Fredrick Banting og Charles Best Canada Graduate stipendium (am).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | - | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | - | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | - | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | - | For densitometry analysis |
References
- Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
- Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
- Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
- Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
- Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging? Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
- Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
- Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
- AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
- Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
- Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
- Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
- Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
- Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
- Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
- Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
- Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
- The Human Protein Atlas BCL2. , https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).
