Summary
Nous décrivons l’utilisation d’immunotransfert quantitative pour valider l’histologie immunofluorescence couplée avec l’analyse de l’image comme un moyen de quantifier une protéine d’intérêt dans les échantillons de tissus fixés au formol, paraffine (FFIP). Nos résultats démontrent l’utilité de l’examen histologique immunofluorescence pour déterminer la quantité relative de biomarqueurs protéines dans des échantillons de biopsie systématique.
Abstract
Quantification des protéines d’intérêt dans les échantillons de tissus fixés au formol, paraffine (FFPE) est importante dans les cliniques et les demandes de recherche. Une méthode de quantification optimale est exacte, dispose d’une large gamme dynamique linéaire et maintient l’intégrité structurale de l’échantillon permettant l’identification des types de cellules individuelles. Les méthodes actuelles telles que l’immunohistochimie (IHC), spectrométrie de masse et immunoblotting chacun ne satisfont pas à ces dispositions en raison de leur nature catégorique ou besoin d’homogénéiser l’échantillon. Comme méthode alternative, nous vous proposons l’utilisation de l’immunofluorescence (IF) et analyse d’image pour déterminer l’abondance relative d’une protéine d’intérêt dans les tissus FFIP. Dans les présentes, nous démontrons que cette méthode est facilement optimisée, donne une large gamme dynamique et est quantifiable linéairement par rapport à l’étalon-or d’immunoblotting quantitative. En outre, cette méthode permet le maintien de l’intégrité structurale de l’échantillon et permet la distinction des divers types de cellules, qui peut être crucial dans les applications de diagnostic. Dans l’ensemble, c’est une méthode robuste à la quantification relative de protéines dans des échantillons FFPE et peut être facilement adapté à la fonction clinique ou besoins en recherche.
Introduction
La nécessité de quantifier des protéines dans des échantillons fixés au formol, paraffine de biopsie du tissu (FFIP) existe dans de nombreux domaines cliniques. Par exemple, des protéines de biomarqueurs chez les spécimens de biopsie systématique est employé pour élucider le pronostic et informer le traitement pour le cancer patients1. Cependant, les méthodes actuelles sont généralement subjectives et manquent de validation.
L’immunohistochimie (IHC) est utilisé de manière routinière dans les laboratoires de pathologie et dépend généralement un anticorps primaire dirigé à la protéine cible et un anticorps secondaire conjugué avec une étiquette enzymatique comme la peroxydase de raifort2. IHC conventionnelle est sensible, peut faire utilisation de minute Echantillons et préserve l’intégrité morphologique des échantillons de tissu permettant l’évaluation de l’expression de la protéine dans son contexte histologique pertinente. Cependant, parce que le signal chromogénique généré par IHC est soustractif, il souffre d’une gamme dynamique relativement étroite et offre un potentiel limité pour le multiplexage2,3,4. Spectrométrie de masse à désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-MSI) d’imagerie préserve l’intégrité morphologique. Cependant, ce développement de la technologie est associée à une résolution morphologique modeste et nécessite significative d’étalonnage et de la normalisation, altérant sa faisabilité pour utilisation clinique courante5,6,7. Les autres techniques pour quantifier les protéines dans des échantillons de tissus incluent immunoblotting8, spectrométrie de masse9,10,11et enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)12, chaque de qui commence avec un homogénéisé lysat de tissu de l’échantillon. Des échantillons de tissus primaires sont hétérogènes, car ils contiennent une multitude de types de cellules. Par conséquent, des techniques qui impliquent l’homogénéisation des échantillons ne permettent pas de quantification d’une protéine dans une population de cellules particulières d’intérêt tels que les cellules cancéreuses.
Comme IHC, si s’applique aux petites FFIP Echantillons et permet le maintien de l’intégrité histologique13. Cependant, grâce à la nature additive des signaux fluorescents, si se prête à l’application de plusieurs anticorps primaires et étiquettes fluorescentes. Ainsi, une protéine d’intérêt peut être relativement quantifiée dans des cellules spécifiques ou des compartiments cellulaires (par exemple, noyau et cytoplasme) définies à l’aide d’autres anticorps. Signaux de fluorescence ont aussi l’avantage d’une plus grande gamme dynamique13,14. La supériorité, la reproductibilité et potentiel de multiplexage de si appliquée à des échantillons FFPE a été démontrée13,14,15.
Ci-après nous décrivent l’utilisation de l’immunotransfert quantitative à l’aide de lignées cellulaires établies comme un étalon-or pour déterminer la nature quantitative de si couplée avec l’analyse d’images assistée par ordinateur pour déterminer l’abondance relative d’une protéine d’intérêt dans coupes histologiques FFIP d’échantillons de tissus. Nous avons appliqué cette méthode avec succès dans une approche multiplexe pour quantifier les protéines biomarqueur dans des échantillons de biopsie clinique16,17,18.
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Protocol
Autorisation d’utiliser des échantillons de tissus humains primaires a été obtenue de la Health Sciences et affilié hôpitaux d’enseignement recherche Ethics Board (HSREB) à l’Université Queen.
1. construction d’un lignée cellulaire tissu Microarray (TMA)
- Récolter et laver les cellules.
Remarque : Ce protocole a été testé sur plusieurs lignes de cellules immortalisées (p. ex. HeLa, Jurkat, RCH-ACV).- Pour les cellules adhérentes, récolter environ 1,3 x 107 cellules dès qu’ils atteignent environ 80 % de confluence. Détacher les cellules à l’aide d’un réactif approprié pour cette ligne de la cellule.
NOTE : Acide Tétraacétique (EDTA) est généralement préférée à la trypsine pour réduire le risque de dégrader les protéines de surface. Si vous utilisez la trypsine, neutraliser la trypsine à l’aide de sérum fœtal (SVF) immédiatement après la récolte des cellules. - Pour les cellules en suspension, récolter environ 8 x 107 cellules en phase de croissance logarithmique.
- Recueillir les cellules récoltées/détaché par centrifugation pendant 5 min à 225 g dans un tube conique de 50 mL.
- Décanter le liquide surnageant et resuspendre le culot dans 10 mL de 1 X solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Centrifuger pendant 5 min à 225 x g et éliminer le surnageant.
Remarque : 1 X PBS est composée de 137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 dans l’eau distillée ; ajuster le pH à 7,4.
- Pour les cellules adhérentes, récolter environ 1,3 x 107 cellules dès qu’ils atteignent environ 80 % de confluence. Détacher les cellules à l’aide d’un réactif approprié pour cette ligne de la cellule.
- Fixer les cellules dans du formol et les granulés.
- Suspendre le culot cellulaire dans le tube à fond conique dans 10 mL de formol tamponné neutre de 10 % (NBF).
NOTE : NBF peut être préparé en diluant 1 mL de solution mère de 37 % de formaldéhyde dans 9 mL de solution 1 PBS X.
Attention : Soyez prudent lorsque vous manipulez le formol et le formaldéhyde. Utiliser une hotte aspirante pour étapes impliquant le formol et le formaldéhyde. - Incuber les cellules sur un rocker à 24 t/mn à température ambiante pendant la nuit (environ 17 h).
- Préparer une solution à 1 % d’agarose de la bas point de fusion dans du PBS (0,01 g d’agarose par 1 mL de PBS).
- Préparer suffisamment pour 500 µL de solution d’agarose par échantillon ligne cellulaire.
- Dissoudre l’agarose dans un 80 ° C eau bain-marie ou bloc chauffant, avec occasionnellement mélanger pendant 2-5 min. Une fois dissous, conserver la solution dans un 37 ° C eau bain-marie ou bloc chauffant pour empêcher le durcissement.
- Pellet les cellules fixes d’étape 1.2.2 par centrifugation pendant 5 min à 225 x g. éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules de 500 µL de PBS 1 x.
- Transférer les cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL et pellet par centrifugation pendant 5 min à 290 x g. aspirer tous le surnageant.
- Suspendre le culot cellulaire dans le tube à fond conique dans 10 mL de formol tamponné neutre de 10 % (NBF).
- Monter les cellules dans l’agarose.
- Ajouter ~ 500 µL de solution d’agarose à 1 % (à l’étape 1.2.3) dans chaque tube contenant les cellules. Doucement, mais rapidement, pipetter mélange et descendre à l’aide d’une micropipette P-1000 mélanger.
NOTE : Couper l’extrémité de l’embout de la pipette pour agrandir l’ouverture et éviter la formation de bulles. Conserver la solution d’agarose dans le bain d’eau de 37 ° C afin d’empêcher le durcissement. - Laisser la solution d’agarose-cellule à durcir (5-10 min) à température ambiante. Ajouter 1 mL de 10 % NBF à chaque microtubes contenant un échantillon de tube et conserver à température ambiante jusqu'à paraffine embedding (jusqu'à 24 h).
- Ajouter ~ 500 µL de solution d’agarose à 1 % (à l’étape 1.2.3) dans chaque tube contenant les cellules. Doucement, mais rapidement, pipetter mélange et descendre à l’aide d’une micropipette P-1000 mélanger.
- Préparer la fiche d’agarose pour l’enrobage de paraffine.
- Aspirer au large de la FBN de l’échantillon.
- Enlever le bouchon de cellule à l’aide d’une lame de rasoir pour couper le tube de microcentrifuge, mettez la fiche dans la cassette de tissu en plastique. Stocker des cassettes dans 10 % NBF à température ambiante.
- Traiter les échantillons du jour au lendemain soit manuellement ou en utilisant un processeur de tissus automatisés et incorporez en cire de paraffine à l’aide de méthodes standard de l’histologie.
Remarque : Voir Fischer et al. 19 pour un protocole de l’exemple. - En utilisant un spécialisé « arrayer tissu » instrument, de la récolte en double cœurs de 0,6 mm de la paraffine bloquent de chaque lignée cellulaire et introduisez-les, en rangées, dans un bloc de paraffine destinataire vide afin de créer une lignée de cellules TMA.
Remarque : Les méthodes Standard doivent être utilisées comme celles décrites dans Fedor et De Marzo20. - Incorporer les carottes prélevées sur des échantillons primaires représentant 2-3 types de tissus supplémentaires (p. ex., amygdale, côlon, testicules, etc.) sous forme de contrôles positifs ou négatifs dans l’ordre des médecins. Choisissez les tissus qui sont appropriés pour la protéine d’intérêt.
- Un microtome permet de préparer deux coupes histologiques, environ 4 à 6 µm d’épaisseur, de la lignée cellulaire TMA. Monter la section sur une lame d’histologie, séchez-le et Déparaffiner (comme décrit dans Fedor et De Marzo20).
2. l’échantillon de coloration par Immunofluorescence
- Optimiser la dilution de l’anticorps primaire.
Remarque : Il existe des protocoles Standard pour l’optimisation d’IHC ou si, pour des sections de tissu FFPE comme dans Kajimura et al. 21. un bref aperçu de l’approche est décrite ici.- Préparer des dilutions de 4-5 d’anticorps primaire de la protéine d’intérêt guidé par les instructions du fabricant.
- Identifier un type de tissu de contrôle provenant d’une source animale ou humaine qui exprime la protéine d’intérêt dans les populations de cellules morphologiquement reconnaissables. Préparer des sections de tissu et les monter sur une diapositive suivant procédure immunohistochimie standard telles que Fedor et De Marzo20.
Remarque : Le nombre de sections requises est le nombre de dilutions de l’anticorps primaire, plus un supplémentaire. - À l’aide d’un système automatisé ou manuel pour immunohistologie, tester les dilutions de l’anticorps primaire de l’étape 2.1.1 chaque diapositive de l’étape 2.1.2. Omettez l’application d’anticorps primaire de la diapositive supplémentaire et utilisez-le comme témoin négatif.
- Pendant le processus de coloration, une coloration toutes les diapositives avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) comme contre-colorant nucléaire et un anticorps secondaire fluorescent étiqueté. Si une plus grande sensibilité est nécessaire, utilisez un HRP (peroxydase de raifort)-conjugués anticorps secondaire et système d’amplification de signal tyramide-basé (voir pile et al. ( 13).
Remarque : Lorsque le multiplexage des anticorps primaires, une étiquette différente fluorescente est utilisée pour chaque protéine. - Numérisez les diapositives d’immunomarquage à l’aide d’un instrument approprié capable de générer un fichier d’image numérique à l’aide d’excitation et détection de longueurs d’onde appropriées pour les fluorophores utilisés.
- Utiliser un logiciel approprié pour afficher les images numériques et choisissez empiriquement la dilution de l’anticorps primaire qui optimise l’intensité du signal par rapport à la fluorescence de fond.
Remarque : Si vous le souhaitez, cette optimisation peut se produire à l’aide d’un anticorps secondaire conjugué HRP, 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) et microscopie de fond clair.
- Effectuer si la coloration sur la lignée cellulaire TMA.
- Utiliser un système automatisé ou manuel pour immunohistologie sur la tache une diapositive d’une lignée cellulaire TMA avec la dilution de l’anticorps primaire optimisé (tel que déterminé à l’étape 2.1). Omettez l’application d’anticorps primaire de la deuxième diapositive et utilisez-le comme témoin négatif.
- Pendant le processus de coloration, une coloration toutes les diapositives avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) comme contre-colorant nucléaire et avec un anticorps secondaire et tyramide comme au point 2.1.4.
- Numérisez les diapositives d’immunomarquage à l’aide d’un instrument approprié capable de générer un fichier d’image numérique à l’aide d’excitation et détection de longueurs d’onde appropriées pour les fluorophores utilisés.
- Utiliser un progiciel d’analyse image pour identifier le compartiment cellulaire d’intérêt (c.-à-d., cytoplasme et noyau) et de quantifier l’intensité de la fluorescence moyenne (MFI) pour chaque ligne de la cellule.
Remarque : Divers progiciels peuvent être utilisés à cet effet et beaucoup sont discutés dans la pile et al. 13.
3. quantitative Immunoblotting de lignées cellulaires
- Préparer des lysats de cellules.
- Récolter 2 millions de cellules de chaque ligne de la cellule, comme décrit aux points 1.1.1 à 1.1.3.
- Faire tourner les cellules vers le bas pendant 5 min à 650 x g dans un tube conique de 50 mL. Décanter le liquide surnageant.
- Laver les cellules avec 10 mL de PBS glacée. Remettre en suspension dans 1 mL de PBS glacée et le transfert à un tube de microtubes de 1,5 mL. Centrifuger comme par l’Etape 3.1.2, décanter et laisser les cellules sur la glace.
- Ajouter environ 200 µL de tampon de lyse froid immunoprécipitation (RIPA) avec les inhibiteurs de la protéase (10 µL d’inhibiteurs de X 100 / mL de tampon de lyse RIPA) aux cellules, vortex et incuber sur la glace pendant 15 minutes.
Remarque : La quantité de tampon de lyse requis pour lyse efficace varie selon la lignée cellulaire et peut être déterminée de manière empirique. Mémoire tampon RIPA est composé de 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0 % NP-40, désoxycholate de sodium 0,5 %, SDS 0,1 % dans l’eau distillée. - Afin d’assurer le chargement relativement même sur l’immuno-Blot, quantifier les protéines totales dans un échantillon de 20 µL de chaque lysat en utilisant une méthode appropriée, tels que l’essai de Bradford. Ajouter environ 40 µL de tampon de lyse X Laemmli 6 pour le reste (environ 180 µL) de chaque lysat cellulaire et faites bouillir à 100 ° C dans un bain de chaleur bloc ou de l’eau pendant 5 min.
NOTE : 6 X Laemmli tampon est composé de 300 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4 % (p/v) SDS, 60 % de glycérol, de 0,6 % (p/v) de bromophénol bleu, 50 mM le dithiothréitol (DTT) dans l’eau distillée. - Stocker les échantillons à-20 ° C pendant deux semaines.
- Effectuer un transfert de toutes les lignées de cellules afin de déterminer quelle ligne de la cellule est la protéine la plus abondante d’intérêt.
Remarque : Suivez la procédure décrite dans les marais, T. et Yang, PC. 22, avec les modifications suivantes.- Aliquote cell lysate (document établi en étape 3.1) contenant 10 à 50 µg de protéines (en fonction de l’abondance de la protéine d’intérêt) dans des tubes de microcentrifuge. Ajouter 2,5 µL de tampon de Laemmli X 6 et de tampon de lyse RIPA suffisante pour transformer le volume jusqu'à 15 µL.
- Charger un empilage de 5 % et une concentration appropriée de résoudre (par exemple, 10 % pour les protéines entre 15 et 100 kDa) gel SDS-PAGE avec une échelle de protéine et les échantillons de l’étape 3.2.1. Charge 1 X Laemmli tampon dans puits vides. Exécuter le bloc d’alimentation à des réglages appropriés, généralement 125 V, 80 min ou jusqu'à ce que le colorant bleu de bromophénol atteigne le fond de la plaque.
- Effectuer un transfert de protéines demi-sec, tel que décrit Wiedemann et al. 23.
Remarque : pour des résultats représentatifs, une membrane de nitrocellulose (qui n’a pas besoin d’être trempés dans du méthanol), et le tampon de transfert froid Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) ont été utilisés. Tampon BSN est composé de 48 mM Tris, glycine de 39 mM, méthanol 20 % dans l’eau distillée. - Après transfert, utiliser une lame de rasoir pour couper la membrane horizontale pour séparer la partie contenant la protéine d’intérêt d’une protéine de contrôle interne appropriés, tels que GAPDH.
- Procéder au blocage et anticorps incubations en utilisant le tampon de blocage recommandé par le fabricant de l’anticorps primaires.
Remarque : Les dilutions de l’anticorps primaire optimale peuvent varier considérablement selon la sensibilité et l’abondance de la protéine. Pour les résultats représentatifs ci-dessous, l’anticorps à la protéine d’intérêt requis une dilution de 1 : 1 000, tandis que le contrôle GAPDH requis une dilution de 1:40,000. La dilution d’anticorps secondaires utilisé était de 3 000:1. - Après incubation des anticorps et le lavage de la membrane, placer les bandes de membrane dans une gaine en plastique transparent comme un sac à sandwich.
- Préparer enchanced chimiluminescence (ECL) mélange suivant les instructions du fabricant. Utiliser une pipette de P-1000 pour couvrir la membrane avec le mélange de l’ECL, fermez la gaine et incuber les bandes de membrane avec le mélange dans l’obscurité à température ambiante pendant 1 à 2 min.
- Placer la gaine de la membrane dans une plate-forme d’imagerie numérique. Utilisation de chimiluminescence et détection colorimétrique marqueur pour capturer les diverses expositions de la membrane.
NOTE : Temps d’exposition varie selon la quantité de protéines chargées, abondance de protéine cible, affinité anticorps etc. commencent par une exposition automatique (en général quelques secondes) et temps d’exposition de test au-dessus et en dessous par intervalles de quelques secondes. - Empiriquement, ou en utilisant le logiciel d’analyse image, déterminer quelle ligne de la cellule exprime le plus la protéine cible.
- Trouver la plage dynamique linéaire de chaque anticorps primaire en utilisant une dilution en série.
- Effectuer des mesures 3.2.1-3.2.8 à l’aide d’une série de dilutions en série de la lignée cellulaire qui exprime la concentration la plus élevée de la protéine cible (identifiée à l’étape 3.2.9).
- Logiciel d’analyse image comme ImageJ permet d’effectuer la densitométrie sur les images de l’exposition.
- Par exemple, à l’aide de ImageJ, utilisez l’outil de Sélection rectangulaire pour sélectionner la première voie du gel pour quantifier. Aller à analyser | Gels | Sélectionnez la première ruelle. Utilisez la souris pour déplacer le rectangle résultant à la prochaine voie. Aller à analyser | Gels | Sélectionnez Next Lane. Déplacer le rectangle vers la voie suivante et sélectionnez la voie pour le reste des voies à plusieurs reprises.
- Aller à analyser | Gels | Tracer des voies. Utilisez l’outil de Ligne droite pour dessiner des lignes à travers les bases de chaque pic pour éliminer le bruit de fond. Utilisez l’outil baguette magique pour sélectionner chaque pic et recueillir la densité de chaque pic, désormais dénommé intensité de bande, de la fenêtre de résultats .
- Utilisez la densitométrie de sortie pour créer un diagramme de dispersion de la bande intensité par rapport à la quantité de protéines totales chargés pour chaque anticorps primaire. À l’aide d’une ligne de meilleur ajustement et une inspection visuelle, déterminez l’emplacement (plage d’intensité) de la gamme dynamique linéaire de chaque anticorps.
- Choisir une concentration de protéine qui génère une valeur sur l’extrémité supérieure de la gamme linéaire la concentration va de l’avant avec les lignées cellulaires.
Remarque : Étant donné que cette concentration est au-dessous du niveau de saturation dans la lignée de cellules avec la plus grande quantité de cette protéine, au-dessus ne doit être aucun danger d’exposer les bandes pour les autres lignées cellulaires.
- Effectuer un immunoblot en utilisant la concentration de protéine choisie à l’étape 3.3.4 pour toutes les lignées cellulaires et répétez les étapes 3.2.1-3.2.8.
- Effectuer la densitométrie sur les scans numériques comme au point 3.3.2. Choisir les images des expositions qui donnent des signaux dans les gammes linéaires pour chaque anticorps identifié à l’étape 3.3.3.
- À l’aide de l’intensité de la bande des signaux de l’exposition idéale de 3.4.1, calculer le rapport de cible protéine bande intensité à intensité de bande de contrôle pour chaque ligne de la cellule de chargement. Ces valeurs indiquent l’abondance relative de la protéine cible d’intérêt.
- Effectuer un test de corrélation de Pearson (peut être fait à l’aide du progiciel de statistiques) pour établir une corrélation entre les valeurs obtenues par l’analyse d’image de l’IF coloration (étape 2.2) à ceux obtenus par immunotransfert (étape 3.4.2).
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Representative Results
Ce protocole a été utilisé pour confirmer la capacité de IF pour déterminer la quantité relative de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 dans les lignées cellulaires à confectionner des blocs de tissus FFIP. Quantification de Bcl-2 sélectivement dans les cellules cancéreuses peut élucider les mécanismes oncogènes et peut être utile dans le diagnostic pathologique et en informant des décisions de prise en charge clinique24. Plus précisément, Bcl-2 joue un rôle dans le bon développement de b-lymphocyte et son expression est couramment étudiée dans le contexte du lymphome25,26,27. La figure 1 décrit les étapes impliquées dans le protocole. Dans un premier temps IF de l’optimisation, diverses dilutions de l’anticorps primaire d’anti-Bcl-2 ont été testées sur le tissu humain amygdale à l’aide d’une passoire immunohistologie automatisé tel que décrit à l’étape 2.1. La figure 2 contient des images des lames colorées et numérisée de l’histologie du tissu humain amygdale que chacun a reçu une dilution différente d’anticorps. On voit que 01:50 correspond à la dilution optimale qui a donné le signal fort et peu fluorescence de fond. Cette dilution a été ensuite utilisée sur la lignée cellulaire TMA comme indiqué au point 2.2. La TMA était également taché à l’aide de DAPI pour identifier les noyaux. Un kit d’amplification de signal axée sur la tyramide a été utilisé pour marquer la Bcl-2 avec un fluorophore Cy5. Analyse d’image a été utilisé pour quantifier le signal de fluorescence cytoplasmique Cy5 attribué à Bcl-2 dans chaque lignée cellulaire. Des images représentatives de la coloration peuvent être vu dans la Figure 3. Les lignées cellulaires immortalisées choisies pour cette expérience inclus une variété de lignées de cellules lymphoïdes dérivés, à savoir 697, JeKo-1, Jurkat, RCH-ACV, Granta-519, REH et Raji, en plus de HeLa, dérivé d’un carcinome du col utérin. Les cellules HeLa sont connus pour exprimer la protéine Bcl-2 à un très bas niveau28.
Un immunoblot initiale de toutes les lignées cellulaires huit, Granta-519 a été déterminé d’avoir la plus grande abondance de Bcl-2 (non illustré). Des dilutions de la Granta-519 lysat servaient dans un immunoblot suivante pour trouver la plage dynamique linéaire de la Bcl-2 et les signaux GAPDH (contrôle de chargement) (Figure 4 a). Cette immunoblot a été exposée à l’aide du scanner numérique pendant diverses périodes de temps. Densitométrie en utilisant le logiciel d’analyse image a été utilisée pour quantifier le signal de chaque bande, et ces valeurs ont comploté contre la quantité de protéines chargées (Figure 4 b). Partir des données de la Figure 4 b-haut, la plage dynamique de Bcl-2 dans ce dosage s’étend d’une intensité de bande de presque zéro à 7500 (ligne unités arbitraires, bleu). Les temps d’exposition plus élevés deux fit une quadratique et non-équation linéaire, ce qui suggère une surexposition et la saturation de l’intensité du signal. La gamme de GAPDH est de 3000 à 6500 (unités arbitraires, Figure 4 b-bas). Valeurs inférieures à 3000 (unités arbitraires) a chuté brusquement lorsqu’on utilise un temps d’exposition relativement faible. Une longue exposition se traduit clairement par saturation. Ces graphiques, on a déterminé que 12 µg serait une quantité raisonnable de protéines à charger lorsque vous effectuez l’immunoblot avec toutes les lignées cellulaires, puisque cette quantité de protéines ont donné des valeurs d’intensité de Bcl-2 dans la plage linéaire pour les cellules de Granta-519, réduisant le risque de surexposition pour toutes les autres lignées cellulaires.
Un deuxième immunoblot de toutes les lignées cellulaires s’est déroulée alors qu’à l’étape 3.4 et peut être vu dans la Figure 5 a. Cette tache était nécessaire depuis les bandes de tache initiale figure avec une intensité de signal à l’extérieur de la gamme linéaire. Logiciel d’analyse image a été utilisée pour déterminer l’intensité du signal de chaque bande dans la nouvelle tache. Uniquement les valeurs d’intensité qui relevaient les plages dynamiques déterminées ci-dessus ont été utilisés. Les flèches sur la droite de la Figure 4 b démontrent les valeurs d’intensité représentatifs qui ont été utilisés et montrer où ils s’inscrivent dans le domaine de linéarité. Le ratio de Bcl-2:GAPDH a ensuite été calculé pour chaque lignée cellulaire. Ce rapport, ainsi que le signal de fluorescence de IF peut être vu dans la Figure 5 b. Un test de corrélation de Pearson a démontré que le rapport d’intensité de l’immunotransfert était fortement et positivement corrélé avec les lectures de l’intensité de IF quantitative (r = 0,983, p < 0,001 ; voir Figure 5).
Évaluer quantitativement la quantité de la protéine Bcl-2 s’est avérée particulièrement difficile car il y avait un large éventail d’expression de cette protéine à travers huit lignées cellulaires testées. En utilisant une exposition assez longtemps pour capter le signal des lignées cellulaires faibles expression de Bcl-2 (> 1 s) rendait difficile de rester dans la plage dynamique pour les lignées de cellules exprimant le Bcl-2 hautes. Pour tenter de quantifier les faibles bandes produites par des lignées de cellules HeLa et Raji, exposition différente plusieurs fois, allant de 0,1 s à 5 s, ont été capturés pour déterminer le temps d’exposition plus long qui pourraient être utilisé tout en restant dans la gamme dynamique de cellules comme Granta -519 (voir Figure 6). La nature de cette technique d’immunoblotting limite la précision de détection des signaux comme un bruit d’approches, suggérant qu'il est optimal utilisé pour quantifier les protéines trouvées aux niveaux intermédiaires à élevées d’expression.
Figure 1 : Diagramme de flux de travail protocole. Immunofluorescence (IF) sur un cellule ligne tissu microarray (TMA) a été exécuté en parallèle d’immunotransfert quantitative (IB) des mêmes lignées cellulaires. Signaux de chaque lignée cellulaire sont comparés par corrélation de Pearson pour valider la capacité quantitative du protocole IF. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Test et optimisation de protocole d’immunofluorescence (IF). Sections de l’amygdale sont incubées avec différentes dilutions d’anticorps anti-Bcl-2 (01:50, 1/100 et aucun anticorps primaire). Les diapositives ont été incubées avec l’anticorps secondaire conjugué HRP, le signal a été amplifié à l’aide d’un tyramide-Cy5 conjugué et les lames sont colorées au DAPI. Les diapositives ont été balayées à 20 X grossissement à l’aide du filtre définit approprié vers les sommets de l’excitation/émission maximale de 350/470 nm et 649/666 nm DAPI et Cy5, respectivement. Temps d’exposition respectifs étaient ms 160 et 200 m le champ de vision est centrée sur le même follicule lymphoïde, qui est censé être la protéine Bcl-2 négatif dans la centre de germinal (moyen) et positif dans la zone du manteau (périphérique). Le 01:50 dilution a donné un signal de fluorescence spécifique plus fort sans pour autant augmenter le signal non spécifique donc il a été utilisé comme la dilution à l’avenir. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Immunofluorescence (IF) à l’aide de sections de cellule ligne tissu microarray (TMA). Sections de la lignée cellulaire TMA ont été prises et incubées avec un 01:50 dilution d’anti-Bcl-2 ou avec aucun anticorps primaire. Les diapositives ont été incubées avec l’anticorps secondaire, le signal a été amplifié à l’aide d’un tyramide-Cy5 conjugué et les lames sont colorées au DAPI. Les diapositives ont été balayées à 20 X grossissement à l’aide du filtre définit approprié vers les sommets de l’excitation/émission maximale de 350/470 nm et 649/666 nm DAPI et Cy5, respectivement. Temps d’exposition respectifs étaient ms 250 et 625 Mme ces images représentatives indiquent que la coloration a réussi, et qu’il y a une expression de plage de Bcl-2 dans les lignées cellulaires. La glissière de contrôle négatif « aucun anticorps de Bcl-2 » n’a pas démontré de n’importe quel signal Cy5, comme prévu. L’image représentant provient de la lignée 697 cellulaire. Un noyau de tissu hyperplasique amygdale inclus sur la TMA montre un modèle équivalent à celui illustré à la Figure 2. L’intensité de la fluorescence moyenne (MFI) pour chaque lignée cellulaire a été déterminée par la quantification du signal de fluorescence Cy5 en utilisant le logiciel d’analyse image. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Détermination de la gamme linéaire dynamique des signaux immunoblot (IB). IBs (A) des dilutions successives du lysat Granta-519. Chaque tache a été exposée à une variété de fois pour trouver la plage dynamique linéaire. (B) intensité de la bande de Bcl-2 (en haut) et GAPDH (en bas) par rapport à quantité de protéines totales chargé pour IB (a). Intensités de bande ont été quantifiées en utilisant le logiciel d’analyse image ImageJ. Bcl-2 (en haut), les signaux restée linéaires sur toute la gamme d’intensités de bande lorsqu’un temps d’exposition faible (exp.) (0,2 s) a été utilisées (intensités de 0-7 200), soutenue par le coefficient de corrélation de Pearson, une (valeur r) de 0.994 (p < 0,001), mais pas pour une plus grande temps d’exposition de 1 s et 2 min. GAPDH (en bas), les données restée linéaires ci-dessus une intensité de 3000 (unités arbitraires) pour faible (0,2 s) et moyen (2.2 s) temps d’exposition comme soutenu par les valeurs de r de Pearson de 0.994 (p < 0,001) et 0,992 (p < 0,001), respectivement, mais pas pour une forte exposition du temps () 7 s). Sur la droite, les flèches indiquent l’intensité de la bande pour la lignée de cellules spécifiques identifiée de l’immunoblot dans la Figure 5 a. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Quantitatif immunotransfert (IB) de lignées cellulaires immortalisées et comparaison d’immunofluorescence (IF). (A) IB de toutes les lignées cellulaires. 12 µg de protéines totales a été chargé dans chaque puits. (B) IB et si signalent intensités pour chaque lignée cellulaire. Le signal de l’IB est le rapport entre la Bcl-intensité de bande de 2:GAPDH de la tache en (A) tel que quantifié par ImageJ. Le signal de l’IF est l’intensité de la fluorescence de chaque coeur de ligne de cellule sur la TMA (Figure 3), tel que déterminé par analyse d’image. Signal (C), à la dispersion de si signal contre IB. Chaque point de données représente une lignée cellulaire donné. Les deux méthodes produit des résultats linéairement corrélées avec une valeur r de Pearson de 0,984 (p < 0,001). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Trouver le temps d’une exposition optimale pour immunoblotting quantitative (IB). IB de toutes les lignées de cellules s’affiche. Douze microgrammes de protéines ont été chargés dans chaque puits. Chaque IB, temps d’exposition différents ont été utilisés pour capturer une image où toutes les bandes est resté dans la gamme dynamique linéaire. Les temps d’exposition des bandes Bcl-2 et GAPDH ont été respectivement : (A) 0,1 s et 0,1 s, (B), 1 s et 0,2 s et (C), 5 s et 5 s. panneaux A et C montrent des exemples d’expositions où au moins certaines des bandes sur la tache étaient trop faibles ou trop fort, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous avons décrit une méthode qui utilise immunoblotting quantitative (IB) pour démontrer l’utilité de l’immunofluorescence (IF) pour déterminer l’abondance relative d’une protéine cible dans les échantillons de tissus FFIP. Les méthodes actuelles de quantification des protéines sont limités par leur nature catégorique, comme chromogène IHC2,3, ou par la nécessité d’homogénéiser les échantillons, empêchant l’enquête sur la population échantillon de structure et cellule, tels que avec IB et spectrométrie de masse8,9,10,11. IF quantitative peut transcender ces limites si la méthode est validée et appliquée avec soin. En comparant les afficheurs IF à iIF quantitative des lignées cellulaires immortalisées, nous avons pu valider la nature semi-quantitative de l’approche de l’IF.
Des échantillons de tissus primaires de patients ou d’animaux de laboratoire sont hétérogènes qu’elles contiennent plusieurs types de cellules. L’application de plusieurs anticorps primaires dans IF multiplex permet la quantification d’une ou plusieurs protéines d’intérêt dans les types spécifiques de cellules ou cellules compartiments4,13. L’optimisation et l’application de multiplex fi déborde le cadre de cet article, mais est décrite dans les documents suivants16,17,18,29. La philosophie générale est de populations de cellules d’étiquette et seulement quantifier la protéine d’intérêt dans le compartiment de la cellule souhaitée, par exemple le noyau ou le cytoplasme, dans le type de la cellule souhaitée. Une fois que la nature quantitative de IF avec un anticorps spécifique a été vérifiée par quantitative de l’IB, le protocole peut être rehaussée pour permettre une quantification de la protéine rapide et à haut débit dans les échantillons cliniques. Applications cliniques exigent généralement la détermination de l’abondance relative plutôt qu’absolue, protéines. Toutefois, l’approche de l’IF peut être faite officiellement quantitative si nécessaire. Par exemple, une solution contenant recombinant purifié protéine Bcl-2 peut être préparée et quantifiées à l’aide d’une méthode biochimique standard. Dilutions sérielles pourraient ensuite évaluées par IB quantitative et une courbe standard d’estimer la teneur absolue par cellule dans chaque lignée cellulaire.
Nous avons appliqué notre protocole IF à sections TMA représentant des échantillons de biopsie de 66 cas de lymphome à cellules B grand diffus de novo . Nos résultats démontrent une reproductibilité acceptable run-to-run (Pearson r = 0,837) et l’association attendue, forte entre la situation de « Bcl-2 positive » subjectivitée en marquant visuel d’IHC classique et d’expression élevée déterminée objectivement, par IF (p < 0,001). En outre, abondance de la protéine Bcl-2 par la fi corrélée avec l’abondance d’ARNm de Bcl-2 dans les mêmes échantillons (Spearman ρ = 0,69, p < 0,001) et était significativement plus élevée dans les cas les gains nombre de copie du gène BCL2 (p = 0,042) ou translocation de BCL2 au locus IGH (p = 0,004), tel que déterminé par hybridation de fluorescence in situ . Nous avons obtenu des résultats équivalents dans une cohorte distincte des cas. Ces résultats fournissent des preuves supplémentaires qui prend en charge si comme une méthode valable pour déterminer l’abondance relative de Bcl-2 dans les échantillons FFPE systématiques. L’utilisation de IF pour quantifier plusieurs autres protéines de biomarqueurs dans les échantillons primaires a été décrit plus haut16,17.
Optimisation du présent protocole est un processus à deux volets. Tout d’abord, si avec des anticorps primaires utilisés doit être optimisé (étape 2.1). Anticorps commerciaux couramment suggèrent des dilutions pour protocoles IHC qui devraient être utilisés comme point de départ avec une dilution ou deux ci-dessus et en dessous (c.-à-d., si recommandée de 1/100, ajouter à 01:50 et 1 : 150). Après avoir effectuer la fi et scanne le dia, déterminer quelle dilution est « optimale » implique une inspection visuelle pour identifier la dilution de l’anticorps primaire qui génère le signal plus brillants sans augmenter la fluorescence de fond. La deuxième étape de l’optimisation consiste à choisir la quantité de protéine à charger pour l’immunoblot pour que chaque bande demeure dans la gamme linéaire (étape 3.4). Pour y parvenir, un immunoblot est effectuée en utilisant une dilution en série de la lignée cellulaire qui exprime la plus grande abondance de protéine cible. De là, la bande intensités par rapport aux protéines quantité peut être tracée afin de déterminer les gammes d’intensité à travers lequel le signal reste linéaire. Étant donné que cette plage est établie dans la lignée de cellules avec la protéine la plus abondante de cible, pour une quantité donnée de protéine toutes les autres lignées cellulaires rapportera signaux inférieurs. Lors du déplacement vers un immunoblot de toutes les lignées cellulaires (étape 3.4), la série de dilution est utilisée pour informer une quantité de protéines pour charger qui donneront des signaux forts sans courir le risque de surexposition au-delà de la plage linéaire.
Malgré les avantages du présent protocole, l’utilisation de "immunoblot" comme une méthode de vérification de quantification a ses défauts. La principale préoccupation tourne autour de la large gamme d’expression des protéines différentes entre les échantillons. Il peut être difficile de garder tous les échantillons dans les limites d’une plage linéaire si certains échantillons expriment la protéine d’intérêt à un degré bien plus élevé que les autres. Dans les résultats représentatifs montrés ci-dessus, différentes expositions ont été capturées pour obtenir une image où les extrêmes (haute et basse) sont à la fois au sein de la gamme dynamique linéaire (Figure 6). La plus forte que prévu si les signaux vu pour les cellules HeLa et Jurkat dans la Figure 5 b peuvent indiquer soit le plus bas possible IF signal pour ce système, ou que les signaux de l’IB ont atteint le fond de la détection linéaire limite et est moins précises. Quoi qu’il en soit, cela indique que, si les valeurs à cette gamme sont moins susceptibles d’être précis dans ce système, et que la technique est optimale pour les moyennes à très-protéines exprimées. En outre, l’utilisation d’anticorps secondaires conjugué HRP n’est pas optimale pour les besoins quantitatifs, comme discuté plus tôt en ce qui concerne les IHC2,3. En utilisant des anticorps secondaires fluorescent étiquetés pour l’immunoblot fournirait une confirmation plus robuste que le si est en effet linéaire quantitative30,31, toutefois, la valeur de r de Pearson de 0,984 obtenues à l’aide de la HRP conjugué anticorps secondaires au protocole précité a été suffisant pour l’application actuelle. Lacunes potentielles associées à IF, comme autofluorescence et trempe varient fondant sur l’instrumentation de laboratoire individuels, de pratiques et de type tissulaire et peuvent être minimisés par diverses mesures préventives32,33. Une très petite quantité d’autofluorescence dans les résultats représentatifs peut être vus dans aucun échantillon d’anticorps de Bcl-2 dans la Figure 3, toutefois, ce montant est négligeable en comparaison avec le cas restants des signaux.
La nécessité de quantifier avec précision les protéines d’intérêt à partir des échantillons de tissu FFPE se rapporte à la clinique et de recherche dans des domaines très biologiques. Le protocole présenté ici décrit l’utilisation de IF quantitative sur des sections de tissu FFPE et valide sa nature semi quantitative par immunoblotting de lignées cellulaires immortalisées. Cette méthode permet la quantification à travers une large gamme dynamique, ainsi que le maintien de l’intégrité structurale de l’échantillon de tissu, ce qui n’est pas conservé dans de nombreux autres quantification méthodes3,8,11. En outre, ce protocole est facilement adaptable et peut être appliqué dans la recherche et les milieux cliniques, en particulier pour la recherche sur le cancer et le pronostic.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par le Fredrick Banting et Charles Best Canada Graduate Scholarship (a.m.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | - | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | - | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | - | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | - | For densitometry analysis |
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