Summary
ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織サンプルに興味の蛋白質を定量化するための手段として画像解析と相まって蛍光組織学を検証する定量的免疫ブロットの使用について述べる。ルーチン生検試料中のバイオ マーカー タンパク質の相対的な量を判別する蛍光組織学の有用性を示した。
Abstract
ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織サンプルの興味の蛋白質の定量化は臨床的に重要なアプリケーションを研究。定量化の最適なメソッドが正確で、線形ダイナミック レンジが広い、個々 のセルの種類を識別するためにできるようにするサンプルの構造の整合性を維持します。免疫組織染色 (IHC)、質量分析法、免疫ブロットなど現在メソッドが各はそのカテゴリの性質のためこれらの規定を満たすために失敗したりサンプルを均質化する必要があります。別の方法として蛍光抗体法 (IF) と画像解析 FFPE 組織の興味の蛋白質の量を決定するための使用を提案します。ここは、このメソッドは簡単に最適化し、広いダイナミック レンジが得られますは定量的免疫ブロットのゴールド スタンダードと比較して直線的に定量化を示します。さらに、このメソッドは、サンプルの構造の整合性の維持が可能、診断アプリケーションで重要となる可能性がありますさまざまなセルタイプの区別のためことができます。全体的にみて、これは FFPE サンプルの蛋白質の相対的な定量化のための堅牢な方法で、簡単に合わせて臨床や研究のニーズに適応することができます。
Introduction
ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織生検試料中のタンパク質を定量化する必要が多くの臨床現場であります。たとえば、ルーチン生検のマーカー蛋白質の定量は予後の解明し、癌患者1の治療に知らせるためです。ただし、現在の方法は通常主観的であり、検証がないです。
免疫組織染色 (IHC) は病理学研究室で日常的に使用、通常ターゲット蛋白質の一次抗体と二次抗体酵素西洋わさびの過酸化酵素2などラベル付き共役によって異なります。従来の IHC は敏感で、作ることができる分の使用サンプルし、その関連する組織コンテキスト内でタンパク質発現の評価が行え組織サンプルの形態学的整合性を維持します。しかし、IHC によって生成された発色の信号は減算、のでそれが比較的狭いダイナミック レンジに苦しんで、2,3、4を多重化するため限られた可能性を提供しています。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法 (MALDI MSI) をイメージングには、形態学的整合性が維持されます。しかし、発展するこの技術はささやかな形態の解像度に関連付けられて、大幅な校正と標準化、日常的に臨床使用5,6、7の可能性を損なうことが必要です。組織サンプル中のタンパク質を定量化するための代替技術は、免疫ブロット8質量9,10,11,、酵素免疫測定法 (ELISA)12、各均質化、始まるのサンプル組織ライセート。主な組織サンプルは、細胞の種類の多数を含む異種。したがって、サンプルの均質化を伴う技術が癌細胞のような興味の特定のセル人口のタンパク質の定量を許可しません。
場合、IHC の小に適用できるような FFPE サンプルし、組織学的整合性13の保持が可能します。場合、ただし、蛍光信号の添加物の性質のおかげで複数の一次抗体、蛍光ラベルの適用を受けやすいです。したがって、特定の細胞または細胞コンパートメント (たとえば、核と細胞質) 他の抗体を使用して定義内で比較的興味の蛋白質を定量化することがあります。蛍光信号も大きいダイナミック レンジ13,14の利点があります。優位性、再現性、多重性 FFPE サンプルに適用される場合は、実証された13,14,15をされています。
ここで興味の蛋白質の相対量を決定する際にコンピューター支援画像解析と組み合わされる場合の計量的性質を確認するためのゴールド スタンダードとして確立されたセルラインを使用して定量的免疫ブロットの使用について述べるFFPE 組織サンプルからの組織学的セクション。我々 は臨床の生検サンプル16,17,18バイオ マーカー蛋白質を定量化するための多重アプローチで正常にこのメソッドを適用しました。
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Protocol
主な人体組織サンプルを使用する健康科学関連教育病院研究倫理委員会 (HSREB) 女王の大学から承認されました。
1. 細胞ティッシュのマイクロ アレイ (TMA) の構築
- 収穫や洗浄のセルです。
注: このプロトコルは、様々 な確立の不死化細胞株 (例えばhela 細胞の Jurkat、RCH ACV) でテストされています。- 付着性のセルの約 80% の confluency に達すれば約 1.3 倍 107セルを収穫します。そのセルの行の適切な試薬を使用してセルをデタッチします。
注: エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、トリプシン表面蛋白質を分解のリスクを軽減する以上一般に好ましい。トリプシンを使用している場合は、セルを収穫後すぐにウシ胎児血清 (FBS) を使用してトリプシンを中和します。 - 浮遊細胞の場合約 8 × 107細胞成長のログ段階を収穫します。
- 50 mL の円錐管に 225 x g で 5 分間遠心分離によって収穫戸セルを収集します。
- 上清をデカントし、再リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) X 1 の 10 mL にペレットを中断します。225 x g で 5 分間遠心し、上清をデカントします。
注: 1x PBS、1.8 mM KH2PO4蒸留水; 10 mM Na2HPO4、2.7 mM KCl 137 mM の NaCl ので構成されます。7.4 に pH を調整します。
- 付着性のセルの約 80% の confluency に達すれば約 1.3 倍 107セルを収穫します。そのセルの行の適切な試薬を使用してセルをデタッチします。
- ホルマリンのセルを修復して、それらをペレットします。
- 10% 中性緩衝ホルマリン (NBF) の 10 mL のコニカル チューブ内細胞ペレットを中断します。
注: NBF は、9 mL の 1x PBS で 37% ホルムアルデヒド原液 1 mL を希釈して準備できます。
注意: は、ホルマリンやホルムアルデヒドを取り扱うときに注意を使用します。ホルマリンとホルムアルデヒドを含む手順のヒューム フードを使用します。 - (約 17 時間) 一晩室温で 24 回転でロッカーに細胞を孵化させなさい。
- PBS で低融点アガロースの 1% 溶液 (1 mL PBS あたり agarose の 0.01 g) を準備します。
- 500 μ L 細胞ラインのサンプルあたりアガロース溶液のための十分を準備します。
- 80 ° C 水お風呂や熱ブロックで、2-5 分の臨時混合アガロースを溶解します。解散後は、硬化を防ぐために 37 ° C 水バスまたは熱ブロックのソリューションを保持します。
- ペレットから固定セル 1.2.2 ステップ 225 x g. で 5 分間遠心分離は、上澄みを除去し、500 μ L の 1x PBS で細胞を再懸濁します。
- 1.5 mL 遠心チューブ、ペレットに 290 x g. 上澄みのすべてを吸引で 5 分間遠心分離によって細胞を転送します。
- 10% 中性緩衝ホルマリン (NBF) の 10 mL のコニカル チューブ内細胞ペレットを中断します。
- アガロースのセルをキャストします。
- セルを含む各管に (ステップ 1.2.3) から 1% アガロース溶液の 〜 500 μ L を追加します。優しく、しかし、すぐにはピペット P-1000 マイクロ ピペットを使用してミックスする上下の混合物です。
注: は、開口部を拡大し、泡の形成を避けるためにピペット チップの端を切り落とします。硬化を防ぐために 37 ° C の水浴中作業アガロース溶液を維持します。 - (5-10 分) を常温で硬化する agarose 携帯ソリューションを許可します。10%、NBF を各遠心チューブのサンプルを含む、(最大 24 時間) を埋め込むパラフィンまで室温で維持の 1 つの mL を追加します。
- セルを含む各管に (ステップ 1.2.3) から 1% アガロース溶液の 〜 500 μ L を追加します。優しく、しかし、すぐにはピペット P-1000 マイクロ ピペットを使用してミックスする上下の混合物です。
- パラフィン包埋用アガロース プラグを準備します。
- サンプルから NBF を離れて吸い出しなさい。
- かみそりの刃を使用して遠心チューブを切断、プラスチック組織カセットにプラグインを配置するセルのプラグを取り外します。10% でカセットを保存常温 NBF。
- サンプルを処理手動で夜通しまたは自動ティッシュ プロセッサを使用して、標準組織学方法を使用してパラフィン ワックスで埋め込みます。
注: は、フィッシャーらを参照してください。19例プロトコル。 - 特殊なを使用して"組織 arrayer"楽器、パラフィンから重複する 0.6 mm コア各セルラインからブロックし、TMA 培養細胞株を作成するために空の受信者パラフィン ブロックに行を挿入する、収穫。
注: 標準的な方法はヒョードルと De Marzo20に記載されているなど使用必要があります。 - TMA に正または負のコントロールとして 2-3 追加の組織型 (例えば、扁桃、コロン、精巣、等) を表す主なサンプルからコアを組み込みます。興味の蛋白質の適切な組織を選択します。
- ミクロトームを使用して 2 標本、約 4 に 6 μ m 厚い、セルライン TMA を準備します。組織学のスライドのセクションをマウント、乾燥させ、(前述のヒョードルと De Marzo20) を deparaffinize します。
2. サンプルの蛍光抗体法による染色
- 一次抗体の希釈を最適化します。
注: 標準のプロトコルは、梶村らのように FFPE 組織セクションの IHC かの最適化21. アプローチの概要を紹介します。- 製造元の指示に導かれる興味の蛋白質に一次抗体の希釈を 4-5 を準備します。
- 形態学的に認識可能な細胞集団の興味の蛋白質を表現する動物や人間のソースからコントロール組織型を識別します。組織のセクションを準備し、ヒョードルと De Marzo20のように標準的な免疫組織化学の手順スライドにそれらをマウントします。
注: 必要なセクションの数は、一次抗体希釈液に加えて、1 つ余分な数です。 - Immunohistology の自動または手動のシステムを使用して、テスト ステップ 2.1.2 からスライドで 2.1.1 各手順の一次抗体希釈液です。余分なスライドから一次抗体のアプリケーションを省略し、ネガティブ コントロールとして使用します。
- 染色の過程では、4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 核対比染色と蛍光タグ二次抗体を持つすべてのスライドを染色します。高い感度が必要な場合使用、HRP (西洋わさびペルオキシダーゼ)-共役二次抗体とパスチラミドシグナル ベースの信号増幅システム (スタックらを参照してください。13)。
注: 一次抗体を多重化、各蛋白質の別の蛍光ラベルが使用されます。 - 励起と検出波長使用された蛍光物質に適切なを使用してデジタル画像ファイルを生成することができる適切な装置を使用して immunostained スライドをスキャンします。
- 適切なソフトウェアを使用して、デジタル画像を表示および経験的背景の蛍光性の相対的な信号強度を最適化する一次抗体希釈を選択します。
注: 必要な場合は、HRP 標識二次抗体、3, 3'-ジアミノベンジジン (軽打)、明視野顕微鏡を使用してこの最適化が発生することができます。
- セルライン TMA に染色する場合を実行します。
- Immunohistology の自動または手動システムを使用して、最適化された一次抗体希釈 (定める手順 2.1) でセル行 TMA のスライドを染色します。2 番目のスライドから一次抗体のアプリケーションを省略し、ネガティブ コントロールとして使用します。
- 染色の過程では、すべてのスライドおよび二次抗体とステップ 2.1.4 のようにパスチラミドシグナルが 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 核の対比染色としてを染色します。
- 励起と検出波長使用された蛍光物質に適切なを使用してデジタル画像ファイルを生成することができる適切な装置を使用して immunostained スライドをスキャンします。
- 画像解析ソフトウェア パッケージを使用して興味 (すなわち、細胞質と核) の細胞内コンパートメントを識別し、各セルラインの平均蛍光強度 (MFI) を定量化します。
注: さまざまなソフトウェア パッケージはこの目的に使用することができます、多くはスタックらで説明されます。13。
3 細胞の定量的免疫ブロット
- セル lysates を準備します。
- 1.1.1 から 1.1.3 への手順の説明に従って各セルラインの 200 万セルを収穫します。
- 50 mL コニカル チューブ 650 x g で 5 分間細胞をスピンダウンします。上清をデカントします。
- 10 ml の氷冷 PBS のセルを洗浄します。1 mL の氷冷 PBS と 1.5 mL 遠心チューブに転送で再懸濁します。3.1.2 のステップに従って遠心分離機、デカント、氷の上のセルのまま。
- 細胞に冷たい radioimmunoprecipitation (RIPA) 換散バッファーとプロテアーゼ阻害薬 (RIPA 溶解バッファーの mL あたり 100 X 阻害剤の 10 μ L) の約 200 μ L を追加渦と 15 分間氷の上を孵化させなさい。
注: 効果的な換散のため必要な換散バッファー量細胞によって異なりますが、経験的に決定できます。RIPA バッファーは、150 mM の NaCl、5 mM, 50 mM Tris, EDTA 1.0 の NP 40%、0.5% デオキシ コール酸ナトリウム、蒸留水で 0.1 %sds で構成されます。 - 比較的、immunoblots に荷を積むためには、各ライセート ブラッドフォードの試金など適切な方法を使用から 20 μ L のサンプルで総蛋白を定量化します。各細胞ライセートの残りの部分 (約 180 μ L) 6 X Laemmli 換散バッファーの約 40 μ L を追加し、5 分間熱ブロックや水浴 100 ° C で沸騰します。
注: 6 X 塩化物イオン バッファーは 300 mM トリス-HCl (pH 6.8) 4% (w/v) SDS、60% のグリセロール、0.6% (w/v) プロムフェノール ブルーとから成る 50 mM ジチオトレイトール (DTT) の蒸留水。 - 2 週間の-20 ° C でサンプルを格納します。
- どのセルの行に興味の最も豊富な蛋白質を確認するすべての細胞ラインのイムノブロットを実行します。
注: マフムード、t. と陽、PC で説明されている手順に従います。22, 以下の変更。- 因数は (興味の蛋白質の豊富) によって蛋白質のライセート (の準備ステップ 3.1) 含む 10 50 μ g をセル マイクロ遠心チューブ用にします。2.5 μ L の 6 X 塩化物イオンとバッファーと 15 μ L にボリュームを作るに十分な RIPA 溶解バッファーを追加します。
- スタッキング 5% と (例えば、15 100 kDa のタンパク質の 10%) を解決する適切な濃度を読み込む蛋白質の梯子とステップ 3.2.1 からサンプル SDS ページのゲル。空井戸 1 X Laemmli バッファーに読み込みます。125 V、80 分またはブロモフェノール ブルー色素プレートの底に達するまで通常の適切な設定で電源を実行します。
- ヴィーデマンらと半乾燥タンパク質の転送を実行します。23。
注: の代表的な結果、(これはメタノール中で浸漬する必要はありません) 硝酸セルロースの膜、冷たい Bjerrum シェーファー ニールセン (BSN) 転送バッファーが使用されました。BSN バッファーは、48 mM トリス、39 mM グリシン、蒸留水で 20% メタノールで構成されます。 - 編入後、かみそりの刃を使って水平 GAPDH などの適切な内部統制蛋白質からの興味の蛋白質を含んでいる部分を分離する膜をカットできます。
- 一次抗体の製造元の推奨ブロック バッファーを使用してブロックと抗体の孵化に進みます。
注: 最適な一次抗体希釈液は、蛋白質量と感性によって大きく異なってきます。以下の代表的な結果の興味の蛋白質に抗体が必要縮尺希釈 GAPDH コントロール 1:40,000 希釈が必要です。使用される二次抗体の希釈は、1:3, 000 だった。 - 抗体の孵化と膜の洗浄の後に、サンドイッチ バッグなど透明なプラスチック鞘膜ストリップを配置します。
- 製造元の指示に従って誘起化学発光 (ECL) の混合物を準備します。ECL 混合膜をカバーし、シースを閉じて、1-2 分間室温で暗闇の中で混合膜のストリップをインキュベート P-1000 ピペットを使用します。
- デジタル イメージング プラットフォームに膜鞘を配置します。膜の様々 なエクスポー ジャーをキャプチャするのに化学発光と比色マーカー検出を使用します。
注: 露光時間はロードの蛋白質の量によって異なりますが、ターゲット蛋白質の豊富な抗体親和性などを数秒ずつ自動露出 (通常いくつか秒) とテスト露光時間の上と下で開始。 - 経験的に、どのセルの行は、最もターゲット蛋白質を表現イメージ解析ソフトウェアを使用してか。
- シリアル希釈を使用して各一次抗体の線形動的な範囲を見つけます。
- 手順 3.2.1-3.2.8 を実行 (手順 3.2.9 で識別される) ターゲット蛋白質の高い濃度を表現する細胞ラインからシリアル希薄の一連を使用して。
- ImageJ など画像解析ソフトウェアを使用すると、露出画像の密度測定を実行できます。
- たとえば、ImageJ を用いた定量化するのにゲルの最初の車線を選択するのに長方形選択ツールを使用します。への分析 |ゲル |最初のレーンを選択。隣の車線に結果として得られる四角形を移動するのにマウスを使用します。への分析 |ゲル |次のレーンを選択。繰り返し四角形を隣のレーンに移動し、車線の残りの部分のための車線を選択します。
- への分析 |ゲル |レーンのプロット。直線ツールを使用して、バック グラウンド ノイズを削除する各ピークの拠点間で線を描きます。杖ツールを使用して、各ピークを選択し、今後に結果ウィンドウからバンド強度と呼ばれる、それぞれのピークにおける密度を収集します。
- 総蛋白量各一次抗体のためにロード、バンド強度対の散布図を作成する出力密度を使用します。ベスト フィットと目視検査のラインで、各抗体の線形ダイナミック レンジの場所 (強度範囲) を特定します。
- タンパク質濃度より高い濃度のすべての細胞で前進する線形の範囲の端の値を生成するを選択します。
注: この濃度はこのタンパク質の最大量を持つ細胞における飽和レベル以下なので必要がありますない危険の他の細胞のバンドを公開する以上。
- すべての細胞の 3.3.4 でタンパク質濃度を使用して、イムノブロットを実行し、手順 3.2.1-3.2.8 を繰り返します。
- 3.3.2 のステップのようにデジタル スキャンで密度測定を実行します。3.3.3 のステップで特定した各抗体の線形の範囲内の信号をもたらす露光画像を選びます。
- 3.4.1 から理想的な露出からバンドの強度の信号を使用して、コントロール バンド強度の各セルの行を読み込むターゲット蛋白質バンド強度の比を計算します。これらの比の値は、興味のターゲット蛋白質の相対的な豊かさを示します。
- ピアソン相関テストを実行 (することができる統計ソフトウェア パッケージを使用して) 免疫ブロット (ステップ 3.4.2) から結果が得られた場合染色 (ステップの 2.2) 画像解析から得られた値を関連付ける。
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Representative Results
このプロトコルは FFPE 組織ブロック化細胞において抗アポトーシス蛋白 Bcl 2 の相対的な量を決定する場合の機能を確認するために使用されました。がん細胞に選択的に定量化 Bcl 2 発癌機構を解明することができますおよび病理組織学的診断と臨床管理決定24を通知に便利することができます。具体的には、Bcl 2 適切な b リンパ球の開発の役割を果たしているし、その表現はよくリンパ腫25,26,27のコンテキストで調査。図 1は、プロトコルに関連する手順をについて説明します。初期の場合の最適化手順で一次反 Bcl 2 抗体の様々 な希釈は手順 2.1 自動 immunohistology テナーを用いたヒト扁桃組織でテストされました。図 2には、それぞれが別の抗体の希釈を受けた人間の扁桃組織のステンド グラスとスキャンした組織学のスライドの画像が含まれています。それを見ることができるその 1:50 は強い信号と小さなバック グラウンド蛍光が得られた最適な希釈。この希釈セルライン TMA 手順 2.2 で説明されているように使用されました。TMA も核を識別するために DAPI を使用してに染まりました。パスチラミドシグナル ベースの信号増幅キットは、Cy5 fluorophore と Bcl 2 をラベルに使用されました。画像解析は、各セルラインに Bcl 2 に起因する細胞質 Cy5 蛍光信号を定量化に使用されました。図 3に、染色の代表的な画像を見ることができます。この実験のために選ばれた不死化細胞株には、リンパ球由来細胞株、すなわち 697 JeKo 1、Jurkat、RCH ACV、グランタ 519、鹿、および子宮頸癌由来 hela 細胞に加えて、らじおの様々 なが含まれています。HeLa 細胞は、非常に低レベル28で Bcl 2 を表現する知られています。
すべての 8 つの細胞ラインの初期イムノブロットに基づいて、グランタ 519 は bcl-2 (図示せず) 最大の豊かさがあると判断されました。グランタ 519 ライセートのシリアル希薄は bcl-2 と GAPDH (コントロールを読み込む) 信号 (図 4 a) の線形動的な範囲を見つけることその後イムノブロットで使用されました。このイムノブロット時間の様々 な長さのデジタルのスキャナーを使用して公開されました。デンシトメトリーによる画像解析ソフトウェアを使用して各バンドからの信号を定量化して読み込まれている (図 4 b) の蛋白質の量に対してこれらの値をプロットしました。図 4 bのデータから-7500 (任意の単位、青線) にほぼゼロのバンド強度から上部には、このアッセイで Bcl 2 のダイナミック レンジに 。2 つの高い露光時間合う、二次、非線形方程式、露出オーバーと信号強度の飽和を示唆しています。GAPDH の範囲は 3000 から 6500 (任意の単位、図 4 bの下)。比較的低露光時間を使用した場合でも、3000 (任意の単位) 未満の値は急激に減少。長時間露光は明らかに飽和を結果します。それは決定されたこれらのグラフから、12 μ g 蛋白質のこの量削減グランタ 519 細胞の線形範囲 Bcl 2 強度値が得られたので、すべての細胞とイムノブロットを実行するときに読み込む、蛋白質の合理的な量になります。他のすべての細胞の露出過度のリスク。
すべての細胞の 2 番目イムノブロット 3.4 の手順を行ったし、図 5 aで見ることができます。このしみは線形範囲外の信号強度を持つ含まれている初期のしみバンド以来必要でした。画像解析ソフトウェアは、新しいしみの各バンドの輝度を決定するために使用されました。上記決定のダイナミック レンジ内であった強度値のみが使用されました。図 4 bの右上の矢印は、使用された代表的な強度値と彼らが線形の範囲内に収まるよう表示を示しています。Bcl の比率-2:GAPDH 各セルラインを計算しました。図 5 bの場合からの蛍光信号とともに、この比率を見ることができます。ピアソン相関テストを示した免疫ブロットから強度比が強くかつ積極的に相関していることから定量的強度測定値と (r = p < 0.001 0.983;図 5を参照してください)。
8 テスト セルを越えてこの蛋白質の表現の広い範囲があった、特に難しいことが分かった Bcl 2 量を定量的に評価します。低 Bcl 2 発現細胞の信号をキャプチャするのに十分な長さの露出を使用して (> 1 s) 高 Bcl 2 発現細胞のダイナミック レンジを維持することができています。らじお hela 細胞などの細胞によって生成されるかすかなバンドを定量化しようとして、いくつかの異なる露出時間、0.1 から 5 s s、グランタなど細胞のダイナミック レンジのまま使用できる最長露光時間を決定するために捕獲されました。-519 (図 6を参照)。この免疫ブロット法の性質は、高中間表現のレベルで見つけられる蛋白質を定量化する使用を最適化を示唆して、1 つのアプローチ ノイズとして信号検出の精度を制限します。
図 1: プロトコル ワークフロー ダイアグラム。セルの行組織マイクロ アレイ (TMA) の蛍光抗体法 (IF) は、同じ細胞の定量的免疫ブロット (IB) に並列に実行されました。各セルラインからの信号は、場合プロトコルの定量的能力を検証するピアソン相関によって比較されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: テストと蛍光抗体法 (IF) プロトコルを最適化します。扁桃部反 Bcl 2 抗体 (ない一次抗体、1: 100、1:50) の異なる希釈液を添加されました。HRP 標識二次抗体を添加して、スライド、パスチラミドシグナル Cy5 共役を使用して信号が増幅された、DAPI 染色スライド。スライドがスキャンされたフィルターを使用して倍率設定 350/470 の最大励起/蛍光ピークに適切な 20 X で nm と 649/666 DAPI と Cy5 nm それぞれ。それぞれの露出回 160 ms と 200 ms、視野は Bcl 2 をされる予定です同じのリンパ濾胞の中央 (中央) 胚中心の正および負 (周辺機器) のマントル層に。1:50 希釈が非特異的な信号を増やすことがなく強い特定の蛍光信号を与えた従ってそれは今後希釈として使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 蛍光抗体法 (IF) セル行組織マイクロ アレイ (TMA) セクションを使用して。TMA の細胞ラインのセクションの撮影されたし、1:50 でインキュベート反 Bcl 2 のない一次抗体希釈。二次抗体を添加して、スライド、パスチラミドシグナル Cy5 共役を使用して信号が増幅された、DAPI 染色スライド。スライドがスキャンされたフィルターを使用して倍率設定 350/470 の最大励起/蛍光ピークに適切な 20 X で nm と 649/666 DAPI と Cy5 nm それぞれ。それぞれの露出時間が 250 ms と 625 さんこれらの代表的なイメージを示す染色が成功したことと、セルの行に Bcl 2 範囲式があります。期待どおりに、「Bcl 2 抗体ない」ネガティブ コントロール スライドは、Cy5 信号を示していませんでした。代表的な画像は、697 セルの行からです。TMA に含まれる過形成性扁桃組織のコアは、図 2に示す同等パターンを示します。各セルラインの平均蛍光強度 (MFI) は、画像解析ソフトを使用した蛍光信号の Cy5 の定量化により決定されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: イムノブロット (IB) 信号の動的線形範囲を決定する。(A) IBs のケム川-519 ライセートのシリアル希薄。それぞれのしみは、線形動的な範囲を見つけるために数回さまざまな公開されました。(B) バンド強度 Bcl 2 (上) と総蛋白量対GAPDH (下) (A) で IB のロードします。画像解析ソフトウェア ImageJ を用いたバンド強度の量を示します。Bcl 2 (top)、信号に残ったバンド強度と低露光 (exp.) 時間の範囲で線形 (0.2 秒) 0.994 (p < 0.001) はなく、ピアソンの相関係数 (r 値) でサポートされている使用 (0 7,200 から強度) をだった大きい1 s と 2 分の露光時間。GAPDH (下)、データ残った低 3000 (任意の単位) の強度上線形 (0.2 s)、媒体 (2.2 s) として露出時間 0.994 (p < 0.001) と (p < 0.001) のピアソンの r 値をそれぞれ、支えがない露出度の高い時間 (7 s)。右側の矢印は、図 5 aのイムノブロットから識別された特定のセル行に対するバンド強度を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 定量的免疫ブロット (IB) の不死化細胞株と蛍光抗体法 (IF) との比較。すべての細胞の (A) IB。総蛋白の 12 μ g は、各ウェルに読み込まれました。(B) IB とシグナル強度各セルラインの。IB 信号は Bcl の比率-(a) ImageJ 量しみから 2:GAPDH バンド強度。IF 信号は TMA (図 3) に各細胞ラインの中心の蛍光画像解析によって決定されます。散布図の場合信号対IB (C) 信号。各データ ポイントは、特定のセルの行を表します。2 つのメソッドは、0.984 (p < 0.001) のピアソンの r 値を持つ直線的相関の結果を生んだ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 定量的免疫ブロット (IB) の最適な露出時間を見つけるします。すべての細胞の IB が表示されます。タンパク質 12 マイクログラムを各ウェルに読み込みました。IB ごとの様々 な露光時間は、すべてのバンドが線形ダイナミック レンジ内で推移イメージをキャプチャする使用されました。Bcl-2 と GAPDH のストリップの露光時間がそれぞれあった: (A) 0.1 s と 0.1 秒、(B) 1 s, 0.2 s、および (C) 5 s と 5 s. パネルAとCの例を示しますのエクスポー ジャーが、少なくともしみのバンドのいくつかがあまりにもかすか またはあまりにも強い、それぞれ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
については、メソッドを利用する定量的免疫ブロット (IB) 蛍光抗体法 (IF) の有用性を実証する FFPE 組織サンプルのターゲット蛋白質の相対的な豊かさを判別します。現在蛋白質定量方法が発色 IHC2,3などそのカテゴリ性質またはサンプル、サンプル構造と細胞集団に調査を防止するなどを統一する必要性によって限られています。IB と質量8,9,10,11。定量の場合は、メソッドは検証され、慎重に適用される場合、これらの制限を越えることができます。不死化細胞株の定量的 iIF に場合の読み出しを比較すると、場合のアプローチの半定量的性質を検証することができました。
患者または実験動物から一次組織サンプルは、異種種類細胞にはが含まれています。多重の場合で複数の一次抗体のアプリケーションは、特定の細胞型の細胞コンパートメント4,13興味の 1 つまたは複数の蛋白質の定量化を許可します。最適化、多重の場合のアプリケーションのこの記事の範囲を超えています次論文16,17,18,29に記載されています。広い哲学ラベル セルの人口とだけ目的のセル、たとえば核や細胞質、目的のセルのタイプに興味の蛋白質を定量化します。特定の抗体を持つ場合の計量的性質が定量的 IB によって確認されたら、プロトコルの臨床サンプルで迅速、高スループットのプロテインの定量を可能にするのにスケール アップすることができます。臨床アプリケーションは、一般に、相対的ではなく、絶対的な蛋白質量の定量を必要です。ただし、必要であれば正式に定量的、場合のアプローチは作成できます。たとえば、精製組換え bcl-2 蛋白を含むソリューション準備でしたし、標準的な生化学的方法を用いて定量化します。シリアルの希薄、定量的 IB によって判定される、標準曲線生成各セルラインのセルごとの絶対のタンパク質含有量を推定します。
TMA セクション 66 件・ デ ・ ノボびまん性大 B 細胞リンパ腫の生検サンプルを表す私たちの場合プロトコルに適用した.実験の結果, 許容される実行する再現性 (ピアソンの r = 0.837) と主観的視覚得点によって決定されます「Bcl 2 肯定的な」状態間の予想される、強力なアソシエーション従来 IHC の発現を決定場合によって客観的に (p < 0.001)。同じサンプルでBcl 2 mRNA 多量さらに、場合によって Bcl 2 豊かさに関連 (スピアマン ρ = 0.69、< p 0.001) BCL2遺伝子のコピー数増加症例で有意に大きく、(p = 0.042) またはBCL2 の転流 IGH遺伝子座に (p = 0.004)、蛍光の in situハイブリダイゼーションによって決定されます。場合の別のコホートで同等の結果を得た.これらの調査結果は、ルーチンの FFPE 標本で Bcl 2 の相対量を決定するための有効な方法として場合をサポートする追加の証拠を提供します。一次サンプルの他のいくつかのバイオ マーカー蛋白質を定量化する場合は、使用されている16,17で説明しました。
このプロトコルの最適化は、2 つのプロセスです。まず、一次抗体の使用を最適化する必要がある場合 (ステップ 2.1)。市販抗体は一般的 IHC プロトコルと共に、希釈または上記の 2 つと下の出発点として使用するための希釈を提案する (すなわち、 1: 100 推奨される、追加 1:50 と 1: 150)。IF を実行して、スライドをスキャン後、背景の蛍光性を増加させることがなく明るい信号を生成する一次抗体希釈を識別するために目視検査を伴いますどの希釈が「最適」を判断します。最適化の第二段階は、線形の範囲 (ステップ 3.4) 各バンドを確保するイムノブロットの読み込みに蛋白質の量を選ぶことを含みます。そのためには、標的タンパク質の最大の豊かさを表すセル行のシリアル希薄を使用、イムノブロットが実行されます。ここから、信号のまま直線強度範囲を決定する蛋白質量対バンド強度をプロットできます。この範囲は、最も豊富なターゲット蛋白質の細胞ラインに設立され、以来蛋白質の特定量の他のすべての細胞をもたらす低い信号。すべての細胞株 (ステップ 3.4) のイムノブロットに移動する場合は、希釈系列を使用をロードする蛋白質量は線形範囲を超えて露出オーバーのリスクを実行せず強力な信号を生成を通知します。
このプロトコルの利点があるにもかかわらず数量の検証方法として免疫ブロットの使用の欠点があります。最大の関心事は、標本間の様々 な蛋白質の表現の広い範囲を中心に展開します。いくつかのサンプルは、他よりもはるかに大きい程度に興味の蛋白質を表現する場合、線形の範囲の範囲内のすべてのサンプルを維持する困難になることがあります。上記の代表的な結果、様々 なエクスポー ジャーは極端な (高低) がある (図 6) 線形ダイナミック レンジ内で両方のイメージを得るに捕獲されました。大きい信号図 5Bで hela 細胞および Jurkat 細胞に見られる可能性がありますどちらか最低可能な場合のための信号このシステムまたは IB 信号を線形の検出限界の下に達しているより正確に測定する場合に予想よりも。どちらにしても、これがその範囲で値がこのシステムに正確に可能性が低く、テクニックは媒体に高-発現タンパク質の最適な場合を示します。また、HRP 標識二次抗体の使用は IHC2,3に関して前述定量目的に最適ではありません。確かに直線的定量30,31, しかし、HRP 標識を用いて 0.984 のピアソンの r 値である場合より堅牢な確認を提供する、イムノブロット蛍光タグ二次抗体を用いた上記のプロトコルで二次抗体は現在の目的のために十分だった。自家蛍光特性と焼入れが異なる場合に関連する潜在的な欠点は、個々 の研究室計測、プラクティスや組織型に基づいており、様々 な予防対策32,33で最小限に抑えることができます。代表の結果に蛍光の非常に小さい量は図 3のない Bcl 2 抗体サンプルで見ることができる、しかしこの量は残りの場合と比較すると些細な信号します。
FFPE 組織サンプルからの興味の蛋白質を正確に定量化する必要性は臨床に関連し、多くの生物学的分野の研究目的。ここで提示されたプロトコルは FFPE 切片に定量の場合の使用について概説し、不死化細胞株のイムノブロットの半定量的性質を検証します。このメソッドは、定量化を多く他の定量化方法3,8,の11は保持されません組織のサンプルの構造の整合性の維持と同様、広いダイナミック レンジでできます。さらに、このプロトコルを簡単に適応して研究と臨床、特に癌関連研究と予後のために適用することができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品はフレドリック バンティングとチャールズ ・ ベスト カナダ大学院奨学金 (午前) 部分的に資金を供給されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | - | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | - | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | - | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | - | For densitometry analysis |
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