Summary
Nós descrevemos o uso de immunoblotting quantitativa para validar a histologia de imunofluorescência, juntamente com a análise de imagens como meio de quantificar uma proteína de interesse em amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE). Nossos resultados demonstram a utilidade da histologia de imunofluorescência para determinar a quantidade relativa de proteínas biomarcador em amostras de biópsia de rotina.
Abstract
Quantificação de proteínas de interesse em amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE) é importante na clínica e aplicações de pesquisa. Um método ideal de quantificação é exato, tem uma ampla gama de dinâmica linear e mantém a integridade estrutural da amostra para permitir a identificação dos tipos de células individuais. Métodos atuais como imuno-histoquímica (IHC), espectrometria de massa e immunoblotting cada um não cumprem estas estipulações devido à sua natureza categórica ou necessidade de homogeneizar a amostra. Como um método alternativo, propomos a utilização de análise de imagem para determinar a abundância relativa de uma proteína de interesse em tecidos FFPE e imunofluorescência (IF). Neste documento vamos demonstrar que este método é facilmente otimizado, produz uma ampla faixa dinâmica e é linearmente quantificável em comparação com o padrão-ouro de immunoblotting quantitativa. Além disso, este método permite a manutenção da integridade estrutural da amostra e permite a distinção de vários tipos de células, que pode ser crucial em aplicações diagnósticas. Globalmente, este é um método robusto para a quantificação relativa de proteínas nas amostras FFPE e pode ser facilmente adaptado para atender clínicas ou as necessidades de investigação.
Introduction
A necessidade de quantificar proteínas no formalin-fixas, parafina amostras de biópsia de tecido (FFPE) existe em muitos campos clínicos. Por exemplo, quantificação de proteínas biomarcador em espécimes de biópsia de rotina é usada para elucidar o prognóstico e informar o tratamento para pacientes de câncer1. No entanto, métodos atuais são tipicamente subjetivos e faltam de validação.
Imuno-histoquímica (IHC) é usado rotineiramente em laboratórios de patologia e geralmente depende de um anticorpo primário dirigidas a proteína do alvo e um anticorpo secundário conjugado com um rótulo enzimático, tais como a peroxidase de rábano2. IHC convencional é sensível, pode fazer uso de minuto amostras e preserva a integridade morfológica de amostras de tecido, permitindo a avaliação da expressão da proteína dentro de seu contexto histológico relevante. No entanto, porque o cromogênico sinal gerado pelo IHC é subtrativo, sofre de uma faixa relativamente estreita dinâmica e oferece um potencial limitado de multiplexação de3,2,4. Espectrometria de massa de ionização/dessorção do laser assistida por matriz (MALDI-MSI) de imagem preserva a integridade morfológica. No entanto, esta tecnologia em desenvolvimento é associada com a modesta resolução morfológica e requer calibração significativa e normalização, prejudicando sua viabilidade para uso clínico rotineiro5,6,7. Técnicas alternativas para quantificar proteínas em amostras de tecido incluem immunoblotting8, espectrometria de massa9,10,11e enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA)12, cada de que começa com um homogeneizado lisado de tecido de amostra. Amostras de tecido primário são heterogêneas em que eles contêm uma infinidade de tipos de células. Portanto, técnicas que impliquem a homogeneização das amostras não permite a quantificação de uma proteína em uma população de célula específica de interesse, tais como células cancerosas.
Como IHC, se é aplicável às pequenas FFPE amostras e permite a manutenção da integridade histológicas13. No entanto, graças à natureza aditiva de sinais de fluorescência, se é passível de aplicação de vários anticorpos primários e etiquetas fluorescentes. Assim, uma proteína de interesse pode ser quantificada relativamente dentro de células específicas ou compartimentos celulares (por exemplo, núcleo e citoplasma) definidos usando outros anticorpos. Sinais de fluorescência também têm a vantagem de uma maior gama dinâmica13,14. A superioridade, reprodutibilidade e multiplexação potencial de se aplicado a amostras FFPE tem sido demonstrada13,14,15.
Neste documento descrevemos o uso de quantitativo immunoblotting utilizando linhagens celulares estabelecidas como padrão ouro para apurar a natureza quantitativa de se juntamente com a análise de imagem computadorizada na determinação da abundância relativa de uma proteína de interesse em cortes histológicos de amostras de tecido FFPE. Nós aplicamos esse método com êxito em uma abordagem multiplex para quantificar proteínas biomarcador em amostras de biópsia clínico16,17,18.
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Protocol
Aprovação para usar as amostras de tecido humano primário foi obtida as Ciências da saúde e afiliado hospitais de ensino pesquisa ética Board (HSREB) na Universidade da rainha.
1. construção de um linha celular tecido Microarray (TMA)
- Células de colheita e lavagem.
Nota: Este protocolo foi testado em várias linhas celulares imortalizado estabelecidas (por exemplo, HeLa, Jurkat, RCH-ACV).- Para as células aderentes, colheita aproximadamente 1,3 x 107 células quando atingem cerca de 80% de confluência. Separe células usando um reagente apropriado para essa linha de celular.
Nota: O ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) é geralmente preferido por tripsina para reduzir o risco de degradação de proteínas de superfície. Se usando tripsina, neutralize a tripsina utilizando soro fetal bovino (FBS) imediatamente após a colheita das células. - Para células de suspensão, colheita cerca de 8 x 107 células em fase de crescimento log.
- Colete as células colhidas/separado por centrifugação por 5 min em 225 g de x em um tubo cónico de 50 mL.
- Decante o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x. Centrifugue por 5 min em x 225g e decante o sobrenadante.
Nota: 1X PBS é composto de 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 em água destilada; ajuste o pH para 7,4.
- Para as células aderentes, colheita aproximadamente 1,3 x 107 células quando atingem cerca de 80% de confluência. Separe células usando um reagente apropriado para essa linha de celular.
- Pelota-los e corrigir as células em formol.
- Suspenda o centrifugado no interior do tubo cônico em 10 mL de formol tamponado neutro a 10% (NBF).
Nota: NBF pode ser preparado diluindo-se 1 mL de solução de formaldeído 37% em 9 mL de 1X PBS.
Cuidado: Tenha cuidado ao manusear formalina e formaldeído. Use uma coifa para etapas envolvendo formalina e formaldeído. - Incube as células em um roqueiro a 24 rpm na temperatura de quarto durante a noite (cerca de 17 h).
- Prepare uma solução de 1% de agarose de baixo ponto de fusão em PBS (0,01 g de agarose por 1 mL de PBS).
- Prepare-se para 500 µ l da solução de agarose, por exemplo de linha de celular.
- Dissolva o agarose em um 80 ° C água banho ou calor bloco, com ocasionais de mistura para 2-5 min. Uma vez dissolvido, manter a solução em um bloco 37 ° C de água banho ou calor para evitar o endurecimento.
- Pellet de células fixas do passo 1.2.2 a centrifugação por 5 min em 225 g. x remover o sobrenadante e ressuspender as células em 500 µ l de PBS 1x.
- Transferi as células em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e pelota por centrifugação por 5 min em 290 x g. aspirado de fora todo o sobrenadante.
- Suspenda o centrifugado no interior do tubo cônico em 10 mL de formol tamponado neutro a 10% (NBF).
- Converter células em agarose.
- Adicione ~ 500 µ l de solução de agarose 1% (da etapa 1.2.3) para cada tubo contendo as células. Suavemente, mas rapidamente, pipete mistura acima e para baixo usando uma micropipeta P-1000 para misturar.
Nota: Corte a extremidade da ponta da pipeta para ampliar a abertura e evitar a formação de bolhas. Manter a solução de agarose trabalhando em banho de água a 37 ° C para evitar o endurecimento. - Permitir que a solução de agarose-célula a endurecer (5-10 min) à temperatura ambiente. Adicione 1 mL de 10% NBF para cada microcentrifuga tubo contendo uma amostra e manter à temperatura ambiente até parafina incorporação (até 24 h).
- Adicione ~ 500 µ l de solução de agarose 1% (da etapa 1.2.3) para cada tubo contendo as células. Suavemente, mas rapidamente, pipete mistura acima e para baixo usando uma micropipeta P-1000 para misturar.
- Prepare a ficha de agarose para a incorporação de parafina.
- Aspire fora o NBF da amostra.
- Retire a ficha da célula usando uma lâmina de barbear para cortar o tubo microcentrifuga, coloque a tomada dentro de tecido plástico. Armazenar fitas em 10% NBF em temperatura ambiente.
- Processar as amostras durante a noite ou manualmente ou usando um processador de tecido automatizado e incorporar em cera de parafina usando métodos padrão de histologia.
Nota: Ver Fischer et al. 19 para um protocolo de exemplo. - Usando um especializados "arrayer de tecido" instrumento, colheita duplicados núcleos de 0,6 mm de parafina bloqueiam de cada linhagem celular e insira-os, nas linhas, um bloco de parafina destinatário vazio a fim de criar uma linha de celular TMA.
Nota: Os métodos padrão devem ser usados como os descritos em Fedor e De Marzo20. - Incorpore os núcleos de amostras primárias, representando 2-3 tipos de tecido adicional (por exemplo, tonsila, cólon, testículos, etc.) como controles positivos ou negativos para o TMA. Escolha os tecidos que são apropriados para a proteína de interesse.
- Use um micrótomo para preparar dois cortes histológicos, aproximadamente de 4 a 6 µm de espessura, da linha celular TMA. Montar a seção em um slide de histologia, secá-lo e deparaffinize (conforme descrito em Fedor e De Marzo20).
2. amostra de coloração por imunofluorescência
- Otimize a diluição do anticorpo primário.
Nota: Os protocolos padrão existem para a otimização de IHC ou se para seções de tecido FFPE tais como em Kajimura et al 21. um breve panorama da abordagem é descrito aqui.- Prepare diluições de 4-5 de anticorpo primário para a proteína de interesse guiado pelas instruções do fabricante.
- Identifica um tipo de tecido do controle de fonte animal ou humana que expressa a proteína de interesse em populações de células morfologicamente reconhecíveis. Preparar as seções do tecido e montá-los em um slide, seguindo o procedimento padrão imuno-histoquímica como Fedor e De Marzo20.
Nota: O número de seções necessárias é o número de diluições de anticorpo primário, mais um extra. - Usando um sistema automatizado ou manual para o immunohistology, teste as diluições de anticorpo primário da etapa 2.1.1 cada em um slide da etapa 2.1.2. Omitir a aplicação de anticorpo primário de slide extra e usá-lo como um controle negativo.
- Durante o processo de coloração, manche todas as lâminas com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) como um corante de contraste nuclear e um anticorpo secundário fluorescente etiquetado. Se maior sensibilidade for necessária, use um HRP (peroxidase de rábano silvestre)-conjugado anticorpo secundário e o sistema de amplificação de sinal com base em tyramide (veja pilha et al 13).
Nota: Quando os anticorpos primários de multiplexação, uma etiqueta fluorescente diferente é usada para cada proteína. - Digitalizar slides immunostained usando um instrumento adequado capaz de gerar um arquivo de imagem digital, usando a excitação e deteção comprimentos de onda adequados para o fluorophores que foram usados.
- Use o software apropriado para visualizar as imagens digitais e escolha empiricamente a diluição do anticorpo primário que otimiza a intensidade de sinal em relação à fluorescência de fundo.
Nota: Se desejado, essa otimização pode ocorrer usando um anticorpo secundário conjugado HRP, 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) e microscopia brightfield.
- Execute se coloração sobre a linha de celular TMA.
- Use um sistema automatizado ou manual para o immunohistology para manchar um slide da linha celular TMA com a diluição de anticorpo primário otimizado (conforme determinado na etapa 2.1). Omitir a aplicação de anticorpo primário do segundo slide e usá-lo como um controle negativo.
- Durante o processo de coloração, manche todas as lâminas com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) como um corante de contraste nuclear e um anticorpo secundário e tyramide como na etapa 2.1.4.
- Digitalizar slides immunostained usando um instrumento adequado capaz de gerar um arquivo de imagem digital, usando a excitação e deteção comprimentos de onda adequados para o fluorophores que foram usados.
- Use um pacote de software de análise de imagem para identificar o compartimento celular de interesse (ou seja, citoplasma e núcleo) e quantificar a intensidade de fluorescência média (IFM) para cada linha de celular.
Nota: Vários pacotes de software podem ser usados para essa finalidade, e muitos são discutidos em pilha et al 13.
3. quantitativo Immunoblotting de linhas celulares
- Prepare lysates de células.
- Colheita 2 milhões de células de cada linha de celular, como descrito nos passos de 1.1.1 a 1.1.3.
- Gire as células para baixo por 5 min a 650 x g em um tubo cónico de 50 mL. Decante o sobrenadante.
- Lavam-se células com 10 mL de PBS gelado. Resuspenda em 1 mL de PBS gelada e a transferência para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Centrifugue conforme passo 3.1.2, decantar e deixar as células no gelo.
- Adicionar cerca de 200 µ l de tampão de Lise radioimmunoprecipitation frio (RIPA) com inibidores de protease (10 µ l de inibidores de X 100 / mL de tampão de Lise RIPA) para as células, vórtex e incubar no gelo por 15 min.
Nota: A quantidade de tampão de Lise necessário para lise eficaz varia conforme a linha celular e pode ser determinada empiricamente. O amortecedor de RIPA é composto por 150 mM de NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0% NP-40, 0,5% de sódio Deoxycholate do, SDS 0,1% em água destilada. - Para garantir o mesmo relativamente a carregar sobre o immunoblots, quantificar a proteína total em uma amostra de 20 µ l de cada lisado usando um método apropriado, tais como o ensaio de Bradford. Adicionar cerca de 40 µ l de tampão de Lise X Laemmli 6 que o restante (aproximadamente 180 µ l) de cada lisado celular e ferve a 100 ° C em um banho de água ou bloco térmico por 5 min.
Nota: 6 X Laemmli reserva é composta de 300 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (p/v) SDS, 60% de glicerol, 0,6% (p/v) de bromofenol, 50mm ditiotreitol (DTT) em água destilada. - Armazene as amostras a-20 º C por até duas semanas.
- Execute um immunoblot de todas as linhas de células para determinar qual linha celular tem a mais abundante proteína do interesse.
Nota: Siga o procedimento descrito em Marques, T. e Yang, PC. 22, com as seguintes modificações.- Alíquota de células lisado (preparado no passo 3.1) contendo 10-50 µ g de proteína (dependendo da abundância da proteína de interesse) para tubos de microcentrifuga. Adicione 2,5 µ l de 6 X Laemmli buffer e suficiente do lysis RIPA tornar-se o volume até 15 µ l.
- Carregar um 5% de empilhamento e uma concentração adequada resolução (por exemplo, 10% para proteínas entre 15-100 kDa) gel de SDS-PAGE com uma escada de proteína e as amostras da etapa 3.2.1. Carrega 1 buffer de X Laemmli em poços vazios. Execute o fornecimento de energia em configurações apropriadas, normalmente 125 V, para 80 min ou até que o corante azul de bromofenol atinge o fundo do prato.
- Executar uma transferência de proteína semi-seca, conforme descrito no Wiedemann et al . 23.
Nota: para os resultados representativos, uma membrana de nitrocelulose (que não precisa ser embebido em metanol), e buffer de transferência frio Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) foram utilizados. Buffer de BSN é composta de 48 mM Tris, glicina de 39 milímetros, 20% de metanol em água destilada. - Após a transferência, use uma lâmina de barbear para cortar a membrana horizontalmente para separar a porção que contém a proteína de interesse de uma proteína de controlo interno apropriado, como GAPDH.
- Proceda à incubação do bloqueio e anticorpo usando o tampão de bloqueio recomendado pelo fabricante dos anticorpos primários.
Nota: As diluições de anticorpo primário podem variar dramaticamente dependendo da sensibilidade e da abundância de proteína. Para os resultados representativos abaixo, o anticorpo à proteína de interesse necessário uma diluição de 1:1,000 enquanto o controle GAPDH necessária uma diluição de 1:40,000. A diluição de anticorpos secundários usado foi de 1:3, 000. - Após a incubação do anticorpo e lavagem da membrana, coloque as tiras de membrana em uma bainha de plástico transparente como um saco de sanduíche.
- Prepare a mistura de quimioluminescência (ECL) de enchanced seguindo as instruções do fabricante. Use uma pipeta P-1000 para cobrir a membrana com a mistura de ECL, fechar a bainha e incubar as tiras de membrana com a mistura no escuro à temperatura ambiente por 1-2 min.
- Lugar da bainha da membrana em uma plataforma digital de imagem. Uso da quimioluminescência e deteção de marcador colorimétrico para capturar várias exposições da membrana.
Nota: Tempos de exposição irá variar com base na quantidade de proteína carregada, abundância de proteína alvo, afinidade do anticorpo etc começar com uma exposição automática (normalmente alguns segundos) e teste de tempos de exposição acima e abaixo por incrementos de alguns segundos. - Empiricamente, ou usando o software de análise de imagem, determinar qual linha celular expressa mais proteína do alvo.
- Encontre a gama dinâmica linear de cada anticorpo primário usando uma diluição de série.
- Executar etapas 3.2.1-3.2.8 usando uma série de diluições de série da linha celular que expressa a maior concentração da proteína alvo (identificada na etapa 3.2.9).
- Use o software de análise de imagem como o ImageJ para realizar densitometria sobre as imagens da exposição.
- Por exemplo, usando o ImageJ, use a ferramenta de Seleção retangular para selecionar a primeira pista do gel para quantificar. Ir para analisar | Géis | Selecione a primeira pista. Use o mouse para mover o retângulo resultante para a próxima pista. Ir para analisar | Géis | Selecione próximo Lane. Repetidamente mover o retângulo para a pista ao lado e selecione a pista para o restante das pistas.
- Ir para analisar | Géis | Plotar rotas. Use a ferramenta de Linha reta para desenhar linhas entre as bases de cada pico para remover o ruído de fundo. Use a ferramenta varinha para selecionar cada pico e recolher a densidade de cada pico, doravante referida como a intensidade da banda, da janela de resultados .
- Use a densitometria saída para criar um gráfico de dispersão da banda intensidade versus a quantidade de proteína total carregado para cada anticorpo primário. Usando uma linha de melhor ajuste e inspeção visual, determine a localização (escala de intensidade) da gama dinâmica linear de cada anticorpo.
- Escolha uma concentração de proteína que gera um valor na extremidade superior do intervalo linear para ser a concentração de seguir em frente com todas as linhas de célula.
Nota: Uma vez que esta concentração é abaixo do nível de saturação na linha de celular com a maior quantidade desta proteína, não deve haver nenhum perigo de sobre expondo as bandas para as outras linhas de célula.
- Executar um immunoblot usando a concentração de proteína escolhida na etapa 3.3.4 para todas as linhas de célula e repita etapas 3.2.1-3.2.8.
- Realize densitometria nos exames Digitas como na etapa 3.3.2. Escolha as imagens de exposições que geram sinais dentro das escalas lineares para cada anticorpo identificado na etapa 3.3.3.
- Usando os sinais de intensidade de banda partir da 3.4.1 os riscos ideais, calcule a relação de intensidade de banda de proteína alvo de intensidade de banda controle para cada linha de célula de carga. Esses valores de relação indicam a abundância relativa da proteína alvo de interesse.
- Executar um teste de correlação de Pearson (pode ser feito usando um pacote de software estatístico) para correlacionar os valores obtidos da análise de imagem do se coloração (passo 2.2) àqueles obtidos de immunoblotting (etapa 3.4.2).
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Representative Results
Este protocolo foi utilizado para confirmar a capacidade de se determinar a quantidade relativa da proteína anti apoptótica Bcl-2 em linha de celular feita em blocos de tecido FFPE. Bcl-2 quantificando seletivamente nas células cancerosas pode elucidar mecanismos oncogênicos e pode ser útil no diagnóstico patológico e em informar as decisões de manejo clínico24. Mais especificamente, Bcl-2 desempenha um papel no desenvolvimento de linfócitos adequado, e a sua expressão é comumente investigado no contexto do linfoma25,26,27. A Figura 1 descreve as etapas envolvidas no protocolo. Em uma etapa inicial de otimização se, várias diluições do anticorpo primário anti-Bcl-2 foram testadas em tecido humano tonsila usando um corante immunohistology automatizado, conforme descrito no passo 2.1. Figura 2 contém imagens dos slides manchadas e digitalizados histologia do tecido da amígdala humana que cada um recebeu uma diluição diferente de anticorpos. Pode ser visto que 01:50 é a diluição ideal que gerou o sinal forte e pouco fundo de fluorescência. Esta diluição foi então usada na linha de célula TMA conforme descrito no passo 2.2. O TMA também estava manchado usando DAPI para identificar os núcleos. Um kit de amplificação do sinal com base em tyramide foi usado para rotular Bcl-2 com um fluoróforo Cy5. Análise de imagem foi utilizada para quantificar o sinal de fluorescência citoplasmático Cy5 atribuído a Bcl-2 em cada linha de celular. Imagens representativas da coloração podem ser vistas na Figura 3. As linhas de célula imortalizado escolhidas para esta experiência incluíam uma variedade de linhas de células linfoides-derivados, nomeadamente 697,-JeKo-1, Jurkat, RCH-ACV, Granta-519, REH e Ribeiro, além de HeLa, derivado de um carcinoma cervical. As células HeLa são conhecidas por expressar Bcl-2 em um nível muito baixo de28.
Baseado em um immunoblot inicial de todas as linhas de oito células, Granta-519 estava determinado a ter a maior abundância de Bcl-2 (não mostrado). Diluições em série do lisado o Granta-519 foram usadas em uma subsequente immunoblot para encontrar a gama dinâmica linear do Bcl-2 e sinais GAPDH (controle de carregamento) (Figura 4A). Este immunoblot foi exposto usando o scanner de digital para diferentes comprimentos de tempo. Densitometria usando software de análise de imagem foi usada para quantificar o sinal de cada banda, e esses valores foram plotados contra a quantidade de proteína carregada (Figura 4B). A partir dos dados na Figura 4B-top, a gama dinâmica para Bcl-2 neste ensaio estende-se desde uma intensidade de banda de quase zero para 7500 (linha de unidades arbitrárias, azul). Os dois tempos de exposição superiores cabem um quadráticas e equações não lineares, sugerindo a superexposição e saturação de intensidade do sinal. O intervalo para GAPDH é de 3000 a 6500 (unidades arbitrárias, Figura 4B-inferior). Valores abaixo de 3000 (unidades arbitrárias) caiu vertiginosamente, mesmo quando se usa um tempo de exposição relativamente baixo. Uma longa exposição claramente resulta em saturação. Partir destes gráficos, determinou-se que 12 µ g seria uma quantidade razoável de proteína para carregar quando executar o immunoblot com todas as linhas de celular, desde que esta quantidade de proteína rendeu Bcl-2 valores de intensidade dentro da escala linear para as células de Granta-519, reduzindo o risco de superexposição para todas as outras linhas de célula.
Um segundo immunoblot de todas as linhas de célula realizou-se, então, como no passo 3.4 e pode ser visto na Figura 5A. Essa mancha foi necessária desde as mancha inicial contida bandas com uma intensidade de sinal fora da faixa linear. Software de análise de imagem foi usada para determinar a intensidade do sinal de cada banda no novo blot. Foram utilizados apenas os valores de intensidade que estavam dentro das escalas dinâmicas determinadas acima. As setas no lado direito da Figura 4B demonstram valores de intensidade representativa que foram usados e mostrar onde eles se encaixam dentro da escala linear. A relação da Bcl-2:GAPDH foi então calculado para cada linha de celular. Esta proporção, juntamente com o sinal de fluorescência do IF pode ser vista na Figura 5B. Um teste de correlação de Pearson demonstrou que os rácios de intensidade de immunoblotting foram fortemente e positivamente correlacionados com as leituras de intensidade de quantitativo se (r = 0.983, p < 0,001; consulte a Figura 5).
Avaliar quantitativamente a quantidade de Bcl-2 mostrou-se particularmente difícil pois não havia uma ampla gama de expressão desta proteína através de oito linhas celulares testados. Usando uma exposição longa o suficiente para captar o sinal das linhas de baixo expressando Bcl-2 célula (> 1 s) tornou difícil permanecer no intervalo dinâmico para as linhas de células expressando Bcl-2 altos. Na tentativa de quantificar as bandas fracas produzidas por linhas celulares como HeLa e Raji, exposição diferente várias vezes, de 0,1 s a 5 s, foram capturados para determinar o tempo de exposição mais longo que poderia ser utilizado, permanecendo na faixa dinâmica para células como Granta -519 (ver Figura 6). A natureza desta técnica de immunoblotting limita a precisão da detecção de sinal, como um ruído de abordagens, sugerindo a que forma ideal é usado para quantificar proteínas encontradas em níveis intermediários de alta expressão.
Figura 1 : Diagrama de fluxo de trabalho do protocolo. Imunofluorescência (IF) em uma linha de celular tecido microarray (TMA) foi executada em paralelo para immunoblotting quantitativa (IB), a mesma linha de celular. Os sinais de cada linha de celular são comparados pela correlação de Pearson para validar a capacidade quantitativa do protocolo se. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Testes e otimização de protocolo de imunofluorescência (IF). Seções de tonsila foram incubadas com diferentes diluições do anticorpo anti-Bcl-2 (01:50, 1: 100 e nenhum anticorpo primário). As lâminas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado HRP, o sinal foi amplificado usando um conjugado tyramide-Cy5 e as lâminas foram coradas com DAPI. Os slides foram escaneados em 20 X ampliação usando filtro define apropriada para os picos de excitação/emissão máxima de 350/470 nm e 649/666 nm para DAPI e Cy5, respectivamente. Tempos de exposição respectivos foram 160 ms e 200 ms. O campo de visão é centrado sobre o mesmo folículo linfoide, que deverá ser Bcl-2 negativos no centro germinativo (central) e positivos na zona do manto (periféricos). O 01:50 diluição deu um sinal de fluorescência específica mais forte sem aumentar o sinal não específico, portanto, foi usado como a diluição vai para a frente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Imunofluorescência (IF) usando seções de microarray (TMA) de tecido de linha celular. Seções da linha celular TMA foram tiradas e incubadas com um 01:50 diluição da anti-Bcl-2 ou com nenhum anticorpo primário. As lâminas foram incubadas com anticorpo secundário, o sinal foi amplificado usando um conjugado tyramide-Cy5 e as lâminas foram coradas com DAPI. Os slides foram escaneados em 20 X ampliação usando filtro define apropriada para os picos de excitação/emissão máxima de 350/470 nm e 649/666 nm para DAPI e Cy5, respectivamente. Tempos de exposição respectivos foram 250 ms e 625 MS. essas imagens representativas indicam que a mancha foi bem sucedida, e que há uma gama de Bcl-2 expressão através das linhas de celular. O slide de controlo negativo "Nenhum anticorpo Bcl-2" não demonstrou qualquer sinal de Cy5, conforme esperado. A imagem representativa é da linhagem 697 celular. Um núcleo de tecido hiperplásico tonsila incluído na TMA demonstra um padrão equivalente ao mostrado na Figura 2. A intensidade de fluorescência média (IFM) para cada linha de celular foi determinada através da quantificação do sinal de fluorescência Cy5 usando software de análise de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Determinação da gama dinâmica linear dos sinais de immunoblot (IB). (A) IBs de diluições em série do lisado Granta-519. Cada borrão foi exposto para uma variedade de vezes para encontrar a gama dinâmica linear. (B) intensidade de banda para Bcl-2 (em cima) e GAPDH (inferior) versus quantidade de proteína total carregado para IB em (A). Intensidades de banda foram quantificadas usando o software de análise de imagem ImageJ. Para Bcl-2 (parte superior), os sinais permaneceram lineares em toda a gama de intensidades de banda quando um tempo de exposição baixo (exp.) (0,2 s) foi usadas (intensidades de 0-7.200) como suportado pelo coeficiente de correlação de Pearson, uma (valor de r) de 0.994 (p < 0,001), mas não para maior tempos de exposição de 1 s e 2 min. Para GAPDH (parte inferior), os dados permaneceram lineares acima uma intensidade de 3000 (unidades arbitrárias) para baixo (0.2 s) e médio (2.2 s) tempos de exposição como suportada por valores de r de Pearson de 0.994 (p < 0,001) e 0.992 (p < 0,001), respectivamente, mas não para uma exposição de alta (o tempo 7 s). Setas à direita indicam a intensidade de banda para a linha de celular específico identificada desde o immunoblot na Figura 5A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Immunoblotting quantitativa (IB) de linhas celulares imortalizado e comparação de imunofluorescência (IF). (A) IB de todas as linhas de célula. 12 µ g da proteína total foi carregado em cada poço. (B) IB e se sinal intensidades para cada linha de celular. O sinal de IB é a proporção de Bcl-intensidade de banda 2:GAPDH de blot no (A) conforme quantificada pelo ImageJ. O sinal de IF é a intensidade de fluorescência de cada núcleo celular linha o TMA (Figura 3), conforme determinado pela análise de imagem. (C) sinal gráfico de dispersão de se contra IB sinal. Cada ponto de dados representa uma linha de determinada célula. Os dois métodos produziram resultados linearmente correlacionados com um valor r de Pearson de 0,984 (p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Encontrar o tempo de exposição ideal para immunoblotting quantitativa (IB). IB de todas as linhas de célula é mostrado. Doze microgramas de proteína foram carregadas em cada poço. Para cada IB, tempos de exposição diferentes foram usados para capturar uma imagem onde todas as bandas manteve-se dentro da faixa linear dinâmica. Os tempos de exposição das tiras Bcl-2 e GAPDH respectivamente foram: (A), 0.1 s e 0,1 s, (B) 1 s e 0,2 s e (C) 5 s e 5 painéis de s. A e C mostram exemplos de exposições onde pelo menos algumas das bandas sobre o blot eram demasiado ténue ou demasiado forte, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Descrevemos um método que faz uso de immunoblotting quantitativa (IB) para demonstrar a utilidade da imunofluorescência (IF) para determinar a abundância relativa de uma proteína do alvo em amostras de tecido FFPE. Métodos de quantificação da proteína atual são limitados pela sua natureza categórica, como cromogênico IHC32,, ou pela necessidade de homogeneizar as amostras, impedindo a investigação sobre as populações de estrutura e célula de amostra, tais como com IB e espectrometria de massa8,9,10,11. Estas limitações quantitativa se pode transcender e se o método é validado e aplicado com cuidado. Comparando-se as leituras se a iIF quantitativa de linhas celulares imortalizado, fomos capazes de validar a natureza semi-quantitativa da abordagem se.
Amostras de tecido primário de pacientes ou animais experimentais são heterogêneas em que eles contêm vários tipos de células. A aplicação de vários anticorpos primários no multiplex, se permite a quantificação de uma ou mais proteínas de interesse em tipos específicos de célula ou células compartimentos4,13. A otimização e a aplicação de multiplex, se está além do escopo deste artigo, mas é descrito no seguinte papéis16,17,18,29. A ampla filosofia é para populações de células de rótulo e só quantificar a proteína de interesse no compartimento da célula desejada, por exemplo, núcleos ou citoplasma, no tipo de célula desejada. Quando a natureza quantitativa de IF com um anticorpo específico tiver sido verificada pelo IB quantitativa, o protocolo pode ser com upscaling para permitir a quantificação de proteína rápida, alta produtividade em amostras clínicas. Aplicações clínicas geralmente requerem a determinação da abundância relativa, ao invés de absoluto, proteína. No entanto, a abordagem se pode ser feita formalmente quantitativa se necessário. Por exemplo, uma solução contendo recombinante purificado da proteína Bcl-2 poderia ser preparada e quantificados usando um método padrão de bioquímico. Diluições em série então poderiam ser avaliadas pelo IB quantitativa e uma curva padrão gerado para estimar o teor de proteínas absoluto por célula em cada linha de celular.
Nós aplicamos nosso protocolo se para seções TMA representando amostras de biópsia de 66 casos de linfoma de célula B grande difusa de novo . Nossos resultados demonstraram reprodutibilidade aceitável de execução para execução (Pearson r = 0.837) e a esperado, forte associação entre estatuto "Bcl-2-positivo" determinada subjetivamente marcando visual de IHC convencional e elevada expressão determinada objetivamente por IF (p < 0,001). Além disso, a abundância de Bcl-2 por se correlacionada com abundância de mRNA Bcl-2 nas mesmas amostras (Spearman ρ = 0,69, p < 0,001) e foi significativamente maior nos casos com ganhos números de cópia do gene BCL2 (p = 0.042) ou translocação de BCL2 para o locus da IGH (p = 0,004), conforme determinado pela hibridação de fluorescência in situ . Obtivemos resultados equivalentes em uma coorte separado de casos. Estes resultados fornecem evidência adicional que suporta-se como um método válido para determinar a abundância relativa de Bcl-2 em amostras FFPE rotina. O uso de várias outras proteínas biomarcador em amostras primárias de quantificar, se tem sido descrito anteriormente16,17.
Otimização do presente protocolo é um processo duplo. Primeiro, se com anticorpos primários utilizados deve ser otimizada (passo 2.1). Anticorpos comerciais comumente sugerem diluições para protocolos IHC, que devem ser usados como ponto de partida, juntamente com uma diluição ou dois acima e abaixo deste (ou seja, se recomendado de 1: 100, adicionar 01:50 e 1:150). Depois de executar o IF e digitalização do slide, determinar qual diluição é "ideal" implica uma inspeção visual para identificar a diluição do anticorpo primário que gera o sinal mais brilhante sem aumento da fluorescência, plano de fundo. A segunda etapa da otimização envolve escolher a quantidade de proteína para carregar para o immunoblot para cada banda permaneça na faixa linear (passo 3.4). Para garantir isso, uma immunoblot é executada usando uma diluição de série da linha celular que expressa a maior abundância de proteína do alvo. A partir daqui, a banda intensidades versus proteína quantidade pode ser plotada para determinar os intervalos de intensidade através do qual o sinal permanece linear. Desde este intervalo é estabelecido em linhagem celular, com a mais abundante proteína do alvo, para uma determinada quantidade de proteína todas as outras linhas de célula irão produzir sinais inferiores. Quando se deslocam para um immunoblot de todas as linhas de célula (passo 3.4), a série de diluição é usada para informar uma quantidade de proteína para carregar que irá produzir sinais fortes sem correr o risco de superexposição além da escala linear.
Apesar dos benefícios do presente protocolo, o uso de immunoblotting, como um método de verificação de quantificação tem suas deficiências. A principal preocupação gira em torno da grande variedade de expressão de várias proteínas entre as amostras. Pode ser difícil de manter todas as amostras dentro dos limites de um intervalo linear se algumas amostras de expressam a proteína de interesse para um grau muito maior do que outros. Os resultados representativos mostrados acima, variando as exposições foram capturadas para obter uma imagem onde os extremos (alta e baixa) são ambos dentro do intervalo dinâmico linear (Figura 6). Maior do que o esperado se sinais vistos para as células HeLa e Jurkat na Figura 5B podem indicar também o mais baixo possível sinal IF para este sistema, ou que o IB sinaliza ter atingido o fundo do limite de detecção linear e são menos precisos. De qualquer forma, isso indica que se valores no intervalo são menos propensos a ser precisos neste sistema, e que a técnica é ideal para proteínas médio - a altamente-expresso. Além disso, o uso de anticorpos secundarios conjugados a HRP não é o ideal para fins quantitativos, como discutido anteriormente, no que diz respeito a IHC2,3. Usar fluorescente etiquetados anticorpos secundários para o immunoblot forneceria uma confirmação mais robusta que o se é efectivamente linearmente quantitativos30,31, no entanto, o valor de r de Pearson de 0,984 obtidos usando o conjugado HRP anticorpos secundários no protocolo acima foi suficiente para os fins de atuais. Deficiências potenciais associadas com se, tais como autofluorescência e têmpera variam baseadas em Instrumentação de laboratório individuais, práticas e tipo de tecido e podem ser minimizadas por várias medidas preventivas32,33. Uma pequena quantidade de autofluorescência nos resultados representativos pode ser vista em nenhuma amostra de anticorpo Bcl-2 na Figura 3, no entanto, esta quantidade é trivial em comparação com o restante, se os sinais.
A necessidade de quantificar com precisão as proteínas de interesse de amostras de tecido FFPE pertence aos clínica e finalidades de investigação através dos muitos campos biológicos. O protocolo aqui apresentado descreve o uso de quantitativa, se em secções de tecido FFPE e valida sua natureza semi-quantitativa por immunoblotting de linhas celulares imortalizado. Este método permite a quantificação em uma ampla faixa dinâmica, bem como a manutenção da integridade estrutural da amostra de tecido, que não é preservada em muitos outros quantificação métodos3,8,11. Além disso, este protocolo é facilmente adaptável e pode ser aplicado em pesquisa e configurações clínicas, especialmente para pesquisas relacionadas ao câncer e prognóstico.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente financiado pela Fredrick Banting e Charles Best Canadá Graduate Scholarship (A.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | - | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | - | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | - | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | - | For densitometry analysis |
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