Summary
Мы описывают использование количественных immunoblotting для проверки иммунофлюоресценции гистологии, наряду с анализом изображений как средства количественного протеин интереса в образцах тканей формалином исправлена, парафин врезанных (FFPE). Наши результаты показывают полезность гистология иммунофлюоресценции для выяснения относительное количество белков биомаркеров в обычной биопсии образцы.
Abstract
Количественная оценка протеинов интереса в образцах тканей формалином исправлена, парафин врезанных (FFPE) имеет важное значение в клинических и научно-исследовательских приложениях. Оптимальный метод количественной оценки является точным, имеет широкий динамический диапазон линейных и поддерживает структурную целостность образца для идентификации типов отдельных клеток. Нынешние методы иммуногистохимии (IHC), масс-спектрометрии и immunoblotting друг не соответствуют эти положения ввиду их категорического характера или необходимо гомогенизировать образца. В качестве альтернативного метода мы предлагаем использование иммунофлюоресценции (КРП) и анализа изображений для определения относительного изобилия протеин интереса в FFPE тканях. Здесь мы продемонстрировать, что этот метод легко оптимизируется, дает широкий динамический диапазон и линейно количественному сравнению с золотой стандарт количественных immunoblotting. Кроме того этот метод разрешает сохранение структурной целостности образца и позволяет для разграничения различных типов клеток, которые могут иметь решающее значение в диагностические приложения. В целом это надежный метод для количественной оценки относительной белков в FFPE образцах и может быть легко адаптирована с учетом клинических или исследовательских потребностей.
Introduction
Во многих клинических областях существует необходимость для количественного определения белков в формалин исправлена, парафин врезанных образцах биопсии тканей (FFPE). Например количественная оценка биомаркер белков в обычной биопсии образцов используется прогноз и информировать лечения для рака пациентов1. Однако текущие методы обычно субъективные и отсутствие проверки.
Иммуногистохимия (IHC) обычно используется в лаборатории патологии и обычно зависит от основного антитела, направленные против целевого белка и вторичное антитело проспряганное с ферментативной метки например пероксидазы хрена2. Обычные IHC чувствителен, можно сделать использование минуту образцы и сохраняет морфологической целостности образцов тканей, тем самым позволяя оценки экспрессии белков в своих соответствующих гистологические контексте. Однако потому что хромогенных сигнал IHC Субтрактивный, он страдает от относительно узкий динамический диапазон и предлагает ограниченный потенциал для мультиплексирования2,3,4. При содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрии изображений (MALDI-MSI) сохраняет морфологической целостности. Однако эта технология развивающихся ассоциируется с скромные морфологических резолюции и требует значительных калибровки и нормализации, умаление его осуществимости для рутинного использования клинических5,6,7. Альтернативные методы для количественного определения белка в образцах тканей включают immunoblotting8, масс-спектрометрия9,10,11и иммуноферментного анализа (ИФА)12, каждый из которых начинается с усредненной lysate образец ткани. Образцы основной ткани являются разнородными, в том, что они содержат множество типов клеток. Таким образом методы, которые влекут за собой гомогенизация пробы не количественной белка в конкретной ячейке населения интереса, таких как раковые клетки.
Как ИХС, если это применимо к малым FFPE образцы и разрешает сохранение гистологические целостности13. Однако, благодаря добавка характер флуоресценции сигналов, если поддается применение нескольких первичных антител и флуоресцентные метки. Таким образом протеин интереса может быть относительно количественно в пределах конкретных ячеек или сотовой отсеков (например, ядра и цитоплазмы) определяется с помощью других антител. Флуоресценции сигналы также имеют преимущество большего динамического диапазона13,14. Превосходство, воспроизводимость и мультиплексирования потенциал если применен к FFPE образцов был продемонстрировали13,14,15.
Здесь мы описываем использование количественных immunoblotting, с использованием установленных клеточных линий как золотой стандарт для выяснения количественный характер, если в сочетании с анализа компьютерного изображения при определении относительного изобилия протеин интереса к Гистологические срезы из образцов ткани FFPE. Мы применили этот метод успешно в мультиплекс подход к количественно биомаркер белков в клинической биопсии образцы16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Разрешение на использование образцов первичной человеческой ткани был получен от медицинских наук и связанные учебных больницах исследований этики Совет (HSREB) в Университете королевы.
1. Строительство линии клетки Microarray ткани (TMA)
- Урожай и вымыть клетки.
Примечание: Этот протокол был протестирован на различных установленных увековечен клеточных линий (например HeLa, Jurkat, РЦГ-ACV).- Для адэрентных клеток урожай примерно 1.3 x 107 клетки, как только они достигают примерно 80% confluency. Отсоедините клеток с использованием реагентов для этой линии клеток.
Примечание: Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) предпочтительнее вообще трипсина для снижения риска деградации белков поверхности. При использовании трипсина, нейтрализовать трипсина, используя плода бычьим сывороточным (ФБС) сразу же после сбора урожая клетки. - Для подвески клетки урожай примерно 8 х 107 клеток в лаг фазы роста.
- Соберите урожай/отдельностоящий клетки центрифугированием за 5 мин на 225 x g в 50 мл Конические трубки.
- Декант супернатант и вновь приостановить гранулы в 10 мл 1 X фосфат амортизированное saline (PBS). Центрифуга для 5 мин на 225 x g и сцеживаться супернатант.
Примечание: 1 X PBS состоит из 137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мм Na2HPO4, 1.8 мм х2PO4 в дистиллированной воде; Отрегулируйте пэ-аш до 7,4.
- Для адэрентных клеток урожай примерно 1.3 x 107 клетки, как только они достигают примерно 80% confluency. Отсоедините клеток с использованием реагентов для этой линии клеток.
- Исправьте клетки в формалине и Пелле их.
- Приостановите Пелле ячейки в пределах конические пробки в 10 мл нейтрального буферизации формалина 10% (NBF).
Примечание: NBF может быть подготовлен путем разбавления 1 мл 37% формальдегида раствор в 9 мл ПБС.
Предупреждение: Будьте осторожны при обращении с формалином и формальдегида. Используйте вытяжной шкаф для шагов, связанных с формалином и формальдегида. - Инкубируйте клетки на рокер на 24 об/мин при комнатной температуре на ночь (около 17 ч).
- Приготовляют раствор 1% о низкой температурой плавления агарозы в PBS (0.01 g агарозы 1 мл PBS).
- Подготовьте достаточно для 500 мкл раствора агарозы за образец клеток линии.
- Растворите агарозы в 80 ° C водой ванну или тепла блоке, с случайного смешивания для 2-5 мин. После роспуска, держите решение в блоке Ванна или тепла воды 37 ° C для предотвращения упрочнения.
- Пелле, фиксированные клетки от шаг 1.2.2 центрифугированием за 5 мин на 225 x g. удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 500 мкл ПБС.
- Перенесите клетки в пробки microcentrifuge 1,5 мл и Пелле центрифугированием за 5 мин на 290 x g. аспирата все супернатант.
- Приостановите Пелле ячейки в пределах конические пробки в 10 мл нейтрального буферизации формалина 10% (NBF).
- Литой клетки в агарозы.
- ~ 500 мкл агарозы 1% раствора (от шага 1.2.3) к каждой трубе, содержащий ячейки. Аккуратно, но быстро Пипетка смесь вверх и вниз с помощью P-1000 микропипеткой смешивать.
Примечание: Отрежьте конце кончика пипетки для увеличения диафрагмы и избежать формирования пузырьков. Держите агарозы рабочий раствор в ванну воды 37 ° C для предотвращения упрочнения. - Дайте раствору агарозы клеток для упрочнения (5-10 мин) при комнатной температуре. Добавьте 1 мл 10% NBF для каждого microcentrifuge трубка, содержащая образец и держать при комнатной температуре до парафин, встраивание (до 24 ч).
- ~ 500 мкл агарозы 1% раствора (от шага 1.2.3) к каждой трубе, содержащий ячейки. Аккуратно, но быстро Пипетка смесь вверх и вниз с помощью P-1000 микропипеткой смешивать.
- Подготовьте вилку агарозы для встраивания парафина.
- Аспирационная покинуть NBF из образца.
- Удалите заглушку ячейки с помощью лезвия вырежьте пробки microcentrifuge, поместите вилку в пластиковых ткани кассеты. Храните кассеты в 10% NBF при комнатной температуре.
- Обработка образцов ночь либо вручную или с использованием автоматизированных ткани процессора и встроить в парафин с использованием методов стандартных гистологии.
Примечание: См. Фишер и др. 19 для примера протокола. - С помощью специализированного инструмента «ткани arrayer», урожай повторяющиеся 0,6 мм ядер из парафина блока из каждой ячейки строки и вставить их, в строках, в пустой получателей парафин блок для создания линии клетки TMA.
Примечание: Стандартные методы должны использоваться такие, как описанные в Федор и De Marzo20. - Включать ядра от первичных проб, представляющие типы 2-3 дополнительных тканей (например, миндалин, толстой кишки, яичников и т.д.) как положительный или отрицательный контроль в TMA. Выбор тканей, которые являются подходящими для протеина интереса.
- Используйте микротом подготовить два гистологических срезах, примерно 4-6 мкм толщиной, клеточной линии TMA. Смонтировать раздел на слайде гистологии, высушить его и deparaffinize (как описано в Федор и De Marzo20).
2. образец пятная иммунофлуоресценции
- Оптимизируйте разрежения основное антитело.
Примечание: Стандартные протоколы существуют для оптимизации IHC или если для разделов ткани FFPE такие как в Kajimura и др. 21. Краткий обзор подхода изложена здесь.- Подготовка 4-5 разведений первичных антител к протеину интереса, руководствуясь инструкциями производителя.
- Определите тип ткани управления из источника животного или человека, который выражает протеин интереса в популяции клеток морфологически узнаваемым. Подготовка разделов ткани и смонтировать их на слайд, после процедуры стандартного иммуногистохимия такие как Федор и De Marzo20.
Примечание: Количество необходимых разделов является количество разведений основного антитела плюс один дополнительный. - С помощью системы автоматической или ручной для immunohistology, протестируйте основное антитело разведениях от шага 2.1.1 каждый на слайде из шага 2.1.2. Исключить применение основного антитела от дополнительных слайд и использовать его в качестве отрицательного контроля.
- Во время процесса окрашивания пятно все слайды с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) как ядерной изображение и дневно тегами вторичное антитело. Если требуется повысить чувствительность, используйте HRP (пероксидазы)-конъюгированных вторичные антитела и усиления системы на основе tyramide сигнала (см. стек et al. 13).
Примечание: Когда мультиплексирования первичного антитела, различные Флюоресцентная метка используется для каждого белка. - Сканирование слайдов immunostained, используя соответствующий инструмент, способный генерировать файл цифрового изображения с помощью возбуждения и обнаружения длин волн, соответствующих флуорофоров, которые были использованы.
- Используйте соответствующее программное обеспечение для просмотра цифровых изображений и эмпирически выбрать основное антитело разрежения, которая оптимизирует интенсивность сигнала относительно фона флуоресценции.
Примечание: При желании, эта оптимизация может произойти с помощью HRP-конъюгированных вторичные антитела, 3, 3'-диаминобензидин (DAB) и brightfield микроскопии.
- Выполняйте, если окрашивание на линии клеток TMA.
- Использование автоматической или ручной системы для immunohistology пятно слайд клеточной линии TMA с оптимизированной основное антитело разрежения (как определено в шаге 2.1). Исключить применение основного антитела от второго слайда и использовать его как отрицательный контроль.
- Во время процесса окрашивания пятно все слайды с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) как ядерной изображение и вторичные антитела и tyramide как шаг 2.1.4.
- Сканирование слайдов immunostained, используя соответствующий инструмент, способный генерировать файл цифрового изображения с помощью возбуждения и обнаружения длин волн, соответствующих флуорофоров, которые были использованы.
- Используйте пакет программного обеспечения анализа изображений для выявления клеточных отсек интереса (то есть, цитоплазма против ядро) и подсчитать среднее флуоресценции интенсивности (МФО) для каждой ячейки строки.
Примечание: Для этой цели могут использоваться различные пакеты программного обеспечения и многие обсуждаются в стек и др. 13.
3. количественные Immunoblotting клеточных линий
- Подготовьте лизатов клеток.
- Урожай 2 миллионов клеток каждой ячейки строки, как описано в шагах 1.1.1 до 1.1.3.
- Вращать клетки вниз на 5 мин на 650 x g в 50 мл Конические трубки. Декант супернатант.
- Вымойте клетки с 10 мл ледяной PBS. Ресуспензируйте в 1 мл ледяной PBS и передачи пробки microcentrifuge 1,5 мл. Центрифуга согласно шаг 3.1.2, декантируют и оставить клетки на льду.
- Около 200 мкл буфера lysis холодной radioimmunoprecipitation (RIPA) с ингибиторами протеаз (10 µL 100 X ингибиторов мл буфера lysis RIPA) клеток, вихрь и инкубировать на льду за 15 мин.
Примечание: Количество буфера lysis, необходимых для эффективного лизис варьируется в зависимости от линии клеток и может быть определено эмпирического. Буфер RIPA состоит из 150 мм NaCl, 5 мм ЭДТА, 50 мм трис, 1,0 NP-40%, 0,5% Дезоксихолат натрия, 0.1% SDS в дистиллированной воде. - Чтобы обеспечить относительно даже нагрузка на иммуноблотов, количественного определения общего белка в 20 мкл пример из каждого lysate с использованием соответствующего метода как assay Брадфорд. Около 40 мкл буфера lysis 6 X Laemmli остаток (примерно 180 мкл) каждой lysate клетки и варить при 100 ° C тепла блок или водой ванну за 5 мин.
Примечание: 6 X Лэмли, буфер состоит из 300 мм трис-HCl (рН 6,8), 4% (w/v) SDS, 60% глицерина, 0,6% (w/v) бромфеноловый синий, 50 мм Дитиотреитол (DTT) в дистиллированной воде. - Храните образцы при-20 ° C до двух недель.
- Выполните immunoblot всех клеточных линий, чтобы определить, какие линии клеток имеет наиболее распространенных протеина интереса.
Примечание: Следуйте процедуре, описанной в Махмуд, т. и Ян, PC. 22, со следующими изменениями.- Алиготе ячейки lysate (подготовленные в шаг 3.1) содержащий 10-50 мкг белка (в зависимости от обилием протеина интереса) в microcentrifuge трубы. 2.5 мкл 6 буфер Лэмли X и достаточно буфера lysis RIPA сделать объем до 15 мкл.
- Загрузить 5% укладки и соответствующей концентрации разрешения (например, 10% для белков между 15-100 кДа) геля SDS-PAGE с трапом протеина и образцы из шага 3.2.1. Загрузите 1 X Laemmli буфер в пустой скважин. Запустите блок питания на соответствующие настройки, как правило 125 V, для 80 мин, или до тех пор, пока бромфеноловый синий краситель достигает нижней части пластины.
- Выполнить передачу полусухое белка, как описано в Видемана et al. 23.
Примечание: для представителя результаты, мембраны нитроцеллюлозы (которые не должны быть выдержаны в метаноле), и холодной Bjerrum Шафер-Нильсен (НБС) передачи буфера были использованы. BSN буфер состоит из 48 мм трис, 39 мм глицин, 20% метанола в дистиллированной воде. - После передачи используйте лезвия бритвы вырезать мембраны горизонтально, чтобы отделить части, содержащие протеин интереса от надлежащего внутреннего контроля белка, такие как GAPDH.
- Продолжить блокирование и антитела инкубаций, используя блокирующий буфер, рекомендованный производителем первичных антител.
Примечание: Оптимальный основное антитело разведениях может резко варьироваться в зависимости от белка изобилия и чувствительность. Для представителя результаты ниже антител к протеину интереса требуется 1:1,000 разрежения в то время как элемент управления GAPDH требуется 1:40,000 разрежения. Разбавление вторичные антитела, которые используются был 1:3, 000. - После инкубаций антитела и промывка мембраны место мембраны полоски в прозрачной пластиковой оболочкой как мешок сэндвич.
- Приготовить смесь хемилюминесценции (ЭСЛ) доработан после инструкции производителя. Используйте P-1000 пипетки для покрытия мембраны с ECL смеси, закройте оболочка и Проинкубируйте мембрану полоски со смесью в темноте при комнатной температуре в течение 1-2 мин.
- Место оболочке мембран в цифровой обработки изображений платформы. Используйте Хемилюминесценция и колориметрические маркер обнаружения для захвата различных экспозиций мембраны.
Примечание: Время экспозиции будет меняться в зависимости от количество белка загружен, обилие целевого белка, антитела сродства и т.д. начнем с автоматической экспозиции (обычно через несколько секунд) и испытания воздействия раз выше и ниже несколько секунд. - Эмпирически или с помощью программного обеспечения для анализа изображений, определить, какая клеточная линия выражает наиболее целевого белка.
- Найти линейный динамический диапазон каждого основного антитела, используя последовательный разрежения.
- Выполните шаги 3.2.1-3.2.8 с помощью ряда серийных разведений от линии клеток, которая выражает самую высокую концентрацию целевого белка (определены в шаге 3.2.9).
- Используйте программное обеспечение для анализа изображений например ImageJ для выполнения денситометрия на экспозиции изображения.
- Например с помощью ImageJ, используйте инструмент Прямоугольного выделения для выбора первой полосе геля для количественного определения. Перейти к анализировать | Гели | Выберите первый переулок. Используйте мышь, чтобы переместить полученный прямоугольник следующей лэйн. Перейти к анализировать | Гели | Выберите следующий переулок. Неоднократно перемещения прямоугольника к следующей лэйн и выберите полосу на оставшуюся часть полосы.
- Перейти к анализировать | Гели | Участок полосы. Используйте средство Прямой линии для рисования линий через основы каждого пика чтобы удалить фоновый шум. Используйте « палочка » для выбора каждого пика и собирать плотность каждого пика, отныне именуется как группа интенсивности, в окне результаты .
- Используйте денситометрия, выход для создания рассеяния группа интенсивности по сравнению с количество общего белка, загруженные для каждого основного антитела. С помощью линии наилучшего и визуального осмотра, определите местоположение (диапазон интенсивности) линейный динамический диапазон каждого антитела.
- Выберите концентрацию белка, который генерирует значение на более высоком конце диапазона линейной быть концентрация двигаться вперед с всех клеточных линий.
Примечание: Поскольку эта концентрация находится ниже уровня насыщения в строке ячейки с наибольшее количество этого белка, там должно быть никакой опасности за разоблачение полосы для других клеточных линий.
- Выполните immunoblot, используя концентрацию белка, выбранный на шаге 3.3.4 для всех клеточных линий и повторите шаги 3.2.1-3.2.8.
- Выполните денситометрия на цифровой сканирует как шаг 3.3.2. Выберите изображения воздействия, которые дают сигналы линейной диапазоны для каждого антитела, идентифицированную на шаге 3.3.3.
- С помощью группы интенсивности сигналов от идеальной экспозиции от 3.4.1, рассчитайте соотношение целевых белков группа интенсивности загрузки интенсивности группы управления для каждой ячейки строки. Эти соотношения указывают относительное обилие целевого протеина интереса.
- Выполнение теста корреляции Пирсона (может быть сделано с помощью пакета статистическое программное обеспечение) соотнести значения, полученные из анализа изображений если окрашивание (шаг 2.2) для тех, кто получил от immunoblotting (шаг 3.4.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол был использован для подтверждения если способность определить относительное количество анти apoptotic белка Bcl-2 в клеточных линиях в FFPE блоков ткани. Количественного определения Bcl-2 выборочно в раковых клетках можно выяснить онкогенных механизмы и может быть полезным в диагностике патологических и в информировании клинического управления решения24. Говоря более конкретно Bcl-2 играет роль в развитии надлежащего лимфоцитов и его выражение обычно изучается в контексте лимфомы25,,2627. Рисунок 1 излагаются шаги, участвующих в протоколе. В первоначальный шаг оптимизации если различных разведениях первичного антитела анти Bcl-2 были протестированы на ткани человека миндалин, с помощью автоматизированных immunohistology Стайнер, как описано в шаге 2.1. Рисунок 2 содержит изображения слайдов окрашенных и отсканированные Гистология ткани человека миндалин, что каждый получил различные разбавления антитела. Видно, что 1:50 является оптимальным разбавления, что дали сильный сигнал и мало фона флуоресценции. Затем этот разрежения использовалась на линии клеток ТМА как описано в шаге 2.2. TMA был также витражи, используя DAPI для идентификации ядер. Комплекта усиления сигнала на основе tyramide был использован для обозначения Bcl-2 с Флюорофор Cy5. Анализ изображений был использован для количественного определения цитоплазматических Cy5 флуоресценции сигнала приписываются Bcl-2 в каждой ячейки строки. Представитель изображения окрашивания можно увидеть на рисунке 3. Увековечен клеточных линий, выбранный для этого эксперимента включила в себя разнообразие лимфоидных производные клеточных линий, а именно: 697, JeKo-1, Jurkat, РЦГ-ACV, Granta-519, REH и Раджи, помимо HeLa, производные от карцинома шейки матки. Клетки HeLa известны выразить Bcl-2 на очень низком уровне28.
На основе первоначального immunoblot всех восьми клеточных линий, Granta-519 было установлено иметь наибольшее обилие Bcl-2 (не показан). Серийных разведений lysate Granta-519 были использованы в последующих immunoblot найти линейный динамический диапазон Bcl-2 и GAPDH (контроля загрузки) сигналов (рис. 4A). Этот immunoblot был разоблачен, используя цифровой сканер для различной длины времени. Денситометрия с использованием программного обеспечения для анализа изображений используется для количественного определения сигнала от каждой группы, и эти значения были заговоре против количество белка загружен (рис. 4В). Из данных в рисунке 4В-топ, динамический диапазон для Bcl-2 в этот assay охватывает от группы интенсивности почти нуля до 7500 (условные единицы, синяя линия). Два раза выше воздействия подходят квадратичные и нелинейных уравнений, предлагая передержки и насыщенность интенсивности сигнала. Диапазон для GAPDH составляет от 3000 до 6500 (условные единицы, Рисунок 4B-снизу). Значения ниже 3000 (условные единицы) резко упал даже при использовании относительно низкой выдержка. Долго воздействия явно приводит к насыщенности. Из этих графиков, было установлено, что 12 мкг бы достаточное количество белка для загрузки при выполнении immunoblot со всех клеточных линий, так как это количество белка Bcl-2 значения интенсивности в пределах диапазона линейной для клеток Granta-519, уменьшение принесли риск чрезмерного воздействия для всех других клеточных линий.
Второй immunoblot всех линий клетки затем выполняется как шаг 3.4 и можно увидеть в рисунке 5А. С момента первоначального пятно содержится полос с интенсивностью сигнала вне диапазона линейной требуется это пятно. Программное обеспечение для анализа изображения была использована для определения интенсивности сигнала каждой группы в новое пятно. Были использованы только значения интенсивности, которые были в пределах динамических диапазонов определены выше. Стрелки на правом рисунке 4В продемонстрировать представитель интенсивности значения, которые были использованы и показать, где они вписываются в пределах диапазона линейной. Отношение Bcl-2:GAPDH затем рассчитываются для каждой ячейки строки. Это соотношение, наряду с флуоресцентным сигнал от если можно увидеть на рисунке 5B. Теста корреляции Пирсона показал, что соотношение интенсивности от immunoblotting сильно и положительно коррелировали с интенсивность чтений от количественных если (r = 0.983, p < 0,001; см. рис. 5 c).
Количественно оценить количество Bcl-2 оказался особенно сложно, поскольку существует широкий спектр выражения этого белка через восемь протестированных клеточных линий. С помощью достаточно долго воздействия для захвата сигнала низкой Bcl-2-выражая клеточных линий (> 1 s) сделал это трудно оставаться в динамический диапазон для высокой Bcl-2-выражая клеточных линий. В попытке дать количественную оценку слабых полос, выпускаемые линии клетки HeLa и Раджи, несколько различных воздействия раз, от 0,1 s 5 s, были захвачены определить длинный время экспозиции, которые могут быть использованы при этом оставаясь в динамический диапазон для клеток, таких как Granta -519 (см. рис. 6). Характер этой техники immunoblotting ограничивает точность обнаружения сигнала как один из подходов шум, предполагая, что оптимально используется для количественного определения белков, обнаруженных на уровнях среднего и высокого выражение.
Рисунок 1 : Диаграмма протокол рабочего процесса. Иммунофлюоресценции (если) на линии клеток ткани microarray (TMA) выполнялась параллельно с immunoblotting (IB) количественные же клеточных линий. Сигналы от каждой ячейки строки сравниваются по корреляции Пирсона для проверки количественных способность если протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Тестирования и оптимизации протокола иммунофлюоресценции (если). Разделы миндалины были инкубировали с различных разведениях антитела анти Bcl-2 (1:50, 1: 100 и не основного антитела). Слайды были инкубировали с ПХ конъюгированных вторичное антитело, сигнал был усилен с помощью tyramide-Cy5 конъюгата, и слайды окрашивали DAPI. Слайды были отсканированы на 20 X увеличение с помощью фильтра задает соответствующие вершины максимального возбуждения/выбросов 350/470 Нм и 649/666 Нм для DAPI и Cy5, соответственно. Соответствующих выдержек были 160 мс и 200 г-жа поле зрения центрируется над же лимфоидных фолликулов, который ожидается Bcl-2 отрицательным в зародышевого центра (Центральный) и положительный в зоне (периферийных) мантии. 1:50, разбавления дал сигнал сильнее конкретных флуоресценции без увеличения неспецифических сигнала поэтому он был использован как разрежения, идти вперед. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Иммунофлюоресценции (если) с использованием клеток линии разделов ткани microarray (TMA). Секции клеточной линии ТМА были взяты и инкубировали с 1:50 разрежения анти Bcl-2 или с не основное антитело. Слайды были инкубировали с вторичное антитело, сигнал был усилен с помощью tyramide-Cy5 конъюгата, и слайды окрашивали DAPI. Слайды были отсканированы на 20 X увеличение с помощью фильтра задает соответствующие вершины максимального возбуждения/выбросов 350/470 Нм и 649/666 Нм для DAPI и Cy5, соответственно. Соответствующих выдержек были 250 мс и 625 г-жа эти представительные изображения указывают что окрашивание был успешным, и что существует выражение диапазона Bcl-2 по всей линии клетки. Отрицательный контроль слайд «нет антител Bcl-2» не смогла продемонстрировать любой Cy5 сигнал, как ожидалось. Представитель изображение — из 697 ячейки строки. Ядро гиперпластические миндалин ткани на TMA демонстрирует эквивалентное шаблон, как показано на рисунке 2. Интенсивность средняя флуоресцирования (МФО) для каждой ячейки строки определяется количественной Cy5 флуоресценции сигнал с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Определение динамического диапазона линейной сигналов immunoblot (IB). (A) IBs серийных разведений Granta-519 lysate. Каждое пятно был разоблачен на целый ряд попыток найти линейный динамический диапазон. (B) Группа интенсивности Bcl-2 (сверху) и GAPDH (внизу) по сравнению с количество общего белка загружен для IB в (A). Группа интенсивности были количественно с помощью программного обеспечения для анализа изображений ImageJ. Bcl-2 (сверху), сигналы оставался линейной во всем диапазоне интенсивностей группы при низкой Выдержка (эксп.) (0.2 s) был используется (интенсивности от 0-7200) как поддерживаемый коэффициент корреляции Пирсона (r-значение), 0.994 (p < 0,001), но не более время воздействия 1 и 2 мин. Для GAPDH (внизу), данные по-прежнему линейной выше интенсивность 3000 (произвольные единиц) для низкой (0.2 s) и средних (2.2 s) воздействия раз как поддержке Пирсона r значения 0.994 (p < 0,001) и 0.992 (p < 0,001), соответственно, но не для высоких воздействия раз () 7 s). Стрелки справа показывают интенсивность группы для конкретных клеток линии от immunoblot в Рисунок 5A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Количественные immunoblotting (IB) увековечена клеточных линий и сравнение иммунофлюоресценции (если). IB (A) всех клеточных линий. в каждой скважине был загружен 12 мкг, общего белка. (B) IB и если сигнал интенсивности для каждой ячейки строки. IB сигнал — это отношение Bcl-2:GAPDH группа интенсивности от пятно в (A) как количественно ImageJ. Если сигнал является интенсивность флуоресценции каждой линии сердечника клетки на ТМА (рис. 3) определяется анализа изображений. (C) против IB рассеяния если сигнал сигнал. Каждая точка данных представляет собой линию заданной ячейки. Эти два метода дают линейно коррелированных результаты со значением r Пирсон 0,984 (p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Поиск оптимальной экспозиции время количественных immunoblotting (IB). Показано IB всех клеточных линий. Двенадцать мкг белка были загружены в каждой скважине. Для каждого IB различные экспозиции раз использовались для захвата изображения где все группы оставался в пределах линейный динамический диапазон. Время экспозиции Bcl-2 и GAPDH полос, соответственно, были: (A) 0,1 s и 0,1 s, (B) 1 s и 0,2 s и (C) 5 s и 5 s. групп A и C показаны примеры воздействия где по крайней мере некоторые из полос на пятно были слишком слабый или слишком сильным, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали метод который использует количественных immunoblotting (IB) для демонстрации полезности иммунофлюоресценции (IF) для выяснения относительное обилие целевого белка в FFPE образцах тканей. Текущие методы количественной оценки белка ограничены их категорического характера, например хромогенных IHC2,3, или необходимостью однородности выборок, предотвращая расследование образец структуры и клеток населения, такие как с IB и масс-спектрометрии8,9,10,11. Количественные если можно преодолеть эти ограничения, если метод проверен и применяется тщательно. Сравнивая если показаний к количественным iIF увековечен клеточных линий, мы смогли проверить полуколичественного характер если подход.
Образцы основной ткани от пациентов или экспериментальных животных являются разнородными, в том, что они содержат несколько типов клеток. Применение нескольких первичных антител в мультиплекс, если позволяет количественного определения одного или нескольких протеинов интереса в типы конкретных ячеек или ячеек отсеков4,13. Оптимизации и применения мультиплекс если выходит за рамки этой статьи, но приводится в следующих документах16,17,18,29. Широкий философии является метка клеточных популяций и только количественно протеина интереса в отсеке для нужной ячейки, например ядер или цитоплазмы, в тип нужной ячейки. После того, как количественный характер, если с конкретной антитела была проверена количественных IB, протокол может расширены для количественной оценки быстрой и высок объём белка в клинических пробах. Клинические приложения обычно требуют определения относительных, а не абсолютным, белок изобилия. Однако если подход могут быть сделаны официально количественных, при необходимости. Например раствор, содержащий очищенного рекомбинантных белков Bcl-2 может быть подготовлен и количественно, используя стандартный биохимический метод. Серийных разведений затем могли бы быть оценены количественных IB и калибровочной кривой генерируется оценить содержание абсолютного белка в клетку в каждой ячейке строки.
Мы обратились наши если протокол ТМА секций, представляющих биопсия из 66 случаев диффузный большой B-клеточной лимфомы de novo . Наши результаты продемонстрировали приемлемый запуска к запуску воспроизводимость (Пирсона r = 0.837) и ожидалось, сильная связь между «Bcl-2-позитив» статус определяется субъективно визуального скоринга IHC обычных и повышенных выражение определено объективно, если (p < 0,001). Кроме того, изобилие Bcl-2, если коррелирует с Bcl-2 мРНК изобилия в том же образцах (Спирмена ρ = 0,69, p < 0,001) и был значительно больше, в случаях с номером выгоды копирования BCL2 гена (p = 0,042) или транслокации BCL2 к IGH локус (p = 0,004), как определено флуоресценции в situ гибридизация. Мы получили эквивалентные результаты в отдельном когорте случаев. Эти результаты дают дополнительные доказательства того, что поддерживает если как допустимого метода для определения относительного изобилия Bcl-2 в обычной FFPE образцов. Использование IF для количественного определения нескольких других белков биомаркеров в первичных проб было описано ранее16,17.
Два раза процесс оптимизации этого протокола. Во-первых, если с основного антитела, которые используются, должны быть оптимизированы (шаг 2.1). Коммерческие антитела обычно предложить разведений IHC протоколов, которые должны использоваться в качестве отправной точки вместе с разрежения или два выше и ниже (то есть, если рекомендованные масштаба 1: 100, добавить 1:50 до 1: 150). После выполнения IF и сканирование слайдов, определение, какие разбавления «оптимальный» предполагает визуального осмотра для выявления первичного антитела разрежения, который генерирует яркие сигнала без увеличения фона флуоресценции. Второй этап оптимизации включает в себя выбор количество белка для загрузки immunoblot чтобы убедиться, что каждая группа остается в диапазона линейной (шаг 3.4). Для обеспечения этого, immunoblot осуществляется с помощью последовательного растворения клеточной линии, которая выражает наибольшее обилие целевого белка. Отсюда группа интенсивности против количество белка могут быть отображены для определения диапазонов интенсивности, через которые сигнал остается линейной. Поскольку этот диапазон устанавливается в строке ячейки с наиболее распространенными целевого белка, для определенного количества белка всех клеточных линий даст Нижняя сигналов. При переходе к immunoblot всех клеточных линий (шаг 3.4), разведение серии используется для информирования что количество белка для загрузки, даст сильный сигнал без риска чрезмерного за пределами диапазона линейной.
Несмотря на преимущества этого протокола использование immunoblotting в качестве метода проверки количественной оценки имеет свои недостатки. Главной заботой вращается вокруг большого диапазона выражения для различных белков между образцами. Это может быть трудно держать всех образцов в пределах диапазона линейной, если некоторые образцы выражают протеин интереса в гораздо большей степени, чем другие. В представитель результаты, показанные выше чтобы получить изображение, где крайности (высокая и низкая) находятся в пределах линейный динамический диапазон (рис. 6) были захвачены различной экспозицией. Больше, чем ожидалось, если сигналы для клеток HeLa и Jurkat на рисунке 5B может указывать либо низкие возможности если сигнал для этой системы, или что IB сигналов достигли нижней части линейной обнаружения ограничить и менее точным. В любом случае, это означает, что если значения в этом диапазоне менее вероятно быть точным в этой системе, и что метод является оптимальным для средне высоко выразили белков. Кроме того использование вторичных антител, ПХ конъюгированных не является оптимальным для количественных целей, как обсуждалось ранее в отношении IHC2,3. Использование дневно тегами вторичные антитела для immunoblot обеспечит более надежное подтверждение того, что если действительно линейно количественных30,31, однако, Пирсона r значение 0,984, полученные с помощью HRP-конъюгированных вторичные антитела в вышеупомянутый Протокол был достаточным для текущих целей. Потенциальные недостатки, связанные с если, такие как аутофлюоресценция и закалки различаются основаны на индивидуальных лабораторных приборов, практики и типа ткани и могут быть уменьшиты различные превентивные меры32,33. Очень небольшое количество аутофлюоресценция представитель результаты можно увидеть в образце антитела не Bcl-2 на рисунке 3, однако эта сумма является тривиальным по сравнению с оставшихся если сигналы.
Необходимость точно подсчитать протеинов интереса от образцов ткани FFPE относится к клинической и исследовательских целей во многих биологических полей. Протокол, представленные здесь описывается использование количественных если на разделах ткани FFPE и проверяет его полу количественный характер, immunoblotting увековечена клеточных линий. Этот метод позволяет количественной оценки через более широкий динамический диапазон, а также сохранение структурной целостности образца ткани, который не сохраняется на многих других количественная оценка методов3,8,11. Кроме того этот протокол может быть легко адаптирована и может применяться в области исследований и клинических параметров, особенно для научных исследований, связанных с раком и прогноз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа частично финансируется Фредерик Banting и Чарльз Лучшие Канада выпускников стипендии (а.м.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | - | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | - | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | - | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | - | For densitometry analysis |
References
- Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
- Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
- Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
- Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
- Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging? Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
- Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
- Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
- AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
- Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
- Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
- Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
- Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
- Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
- Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
- Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
- Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
- The Human Protein Atlas BCL2. , https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).
