Summary
Vi beskriver användningen av kvantitativa immunoblotting att validera immunofluorescens histologi tillsammans med bildanalys som ett sätt att kvantifiera ett protein av intresse i formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) vävnadsprover. Våra resultat visar nyttan av immunofluorescens histologi för att fastställa den relativa mängden biomarkör proteiner i rutinmässiga biopsiprover.
Abstract
Kvantifiering av proteiner av intresse i formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) vävnadsprover är viktigt i kliniska och forskningsansökningar. En optimal metod för kvantifiering är korrekt, har en bred linjär dynamisk räckvidd och underhåller den strukturella integriteten av provet som möjliggör identifiering av enskilda celltyper. Nuvarande metoder såsom immunhistokemi (IHC), masspektrometri och immunoblotting var misslyckas att uppfylla dessa bestämmelser på grund av sin kategoriska natur eller behöva Homogenisera provet. Som en alternativ metod föreslår vi användningen av immunofluorescens (om) och bildanalys avgöra det relativa överflödet av ett protein av intresse i FFPE vävnader. Häri visar vi att denna metod är enkelt optimerad, ger ett brett dynamiskt omfång och är linjärt kvantifierbara jämfört med den gyllene standarden för kvantitativa immunoblotting. Dessutom denna metod möjliggör upprätthållandet av den strukturella integriteten av provet och tillåter för skillnaden av olika celltyper, som kan vara avgörande för diagnostik program. Övergripande, detta är en robust metod för relativ kvantifiering av proteiner i FFPE-prover och lätt kan anpassas att passa klinisk eller forskningsbehov.
Introduction
Behovet av att kvantifiera proteiner i formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) biopsi vävnadsprover finns i många kliniska områden. Till exempel används kvantifiering av biomarkör proteiner i rutinmässig biopsi prov för att belysa prognos och informera behandling för cancer patienter1. Men nuvarande metoder är vanligtvis subjektiva och saknar validering.
Immunhistokemi (IHC) används rutinmässigt i patologi laboratorier och beror i allmänhet på en primär antikropp riktad mot målproteinet och en sekundär antikropp konjugerat med en enzymatisk etikett såsom pepparrotperoxidas2. Konventionella IHC är känsliga, kan göra användning av minut prover och bevarar den morfologiska integriteten av vävnadsprover som därmed tillåter bedömning av proteinuttryck i dess relevanta histologiska sammanhang. Men eftersom kromogen signalen genereras av IHC är subtraktiv, det lider av ett relativt smalt dynamik och erbjuder begränsad potential för multiplexing2,3,4. Matrix-assisted laser desorption/jonisering masspektrometri imaging (MALDI-MSI) bevarar morfologiska integritet. Dock denna teknikutveckling är associerad med blygsamma morfologiska upplösning och kräver betydande kalibrering och normalisering, försämra dess genomförbarhet för rutinmässig klinisk användning5,6,7. Alternativa tekniker för att kvantifiera protein i vävnadsprover omfattar immunoblotting8, masspektrometri9,10,11och enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)12, varje av som börjar med en homogeniserad lysate av vävnadsprover. Primära vävnadsprover är heterogena i att de innehåller en mängd celltyper. Därför tillåter tekniker som innebär homogenisering proverna inte kvantifiering av ett protein i en viss cell population av intresse, såsom cancerceller.
Liknar IHC, om är tillämplig på små FFPE prover och tillåter lagring av histologiska integritet13. Men tack vare tillsatsen natur av fluorescens signaler, om är mottagliga för tillämpningen av flera primära antikroppar och fluorescerande etiketter. Således kan ett protein av intresse kvantifieras relativt inom specifika celler eller cellulära fack (exempelvis nucleus kontra cytoplasman) definieras med andra antikroppar. Fluorescens signaler har också fördelen av en större dynamiskt omfång13,14. Den överlägsenhet, reproducerbarhet och multiplexering potential har om tillämpas på FFPE prover visat13,14,15.
Detta dokument beskriver vi användningen av kvantitativa immunoblotting använder etablerade cellinjer som en guld-standard för att fastställa kvantitativa beskaffenhet om tillsammans med datorstödd bildanalys för att fastställa det relativa överflödet av ett protein av intresse i histologiska sektioner från FFPE vävnadsprover. Vi har tillämpat denna metod framgångsrikt i en multiplex strategi att kvantifiera biomarkör proteiner i kliniska biopsi prov16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkännande att använda primära mänskliga vävnadsprover erhölls från hälsovetenskap och anslutna universitetssjukhus forskning etik Board (HSREB) vid Queen's University.
1. bygga en cellinje vävnad Microarray (TMA)
- Skörd och tvätta cellerna.
Obs: Detta protokoll har testats på olika etablerade förevigade cellinjer (t.ex. HeLa, Jurkat, RCH-ACV).- För vidhäftande celler, skörda ungefär 1,3 x 107 celler när de når cirka 80% konfluens. Lossa celler med hjälp av en reagens som är lämpliga för den cell-linjen.
Obs: Etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) är generellt att föredra över trypsin att minska risken för förnedrande ytproteiner. Om du använder trypsin, neutralisera den trypsin använder fetalt bovint serum (FBS) omedelbart efter skörden cellerna. - För suspension celler, skörda ungefär 8 x 107 celler i log-fas av tillväxt.
- Samla de skördas/borttagbar cellerna genom centrifugering för 5 min på 225 x g i en 50 mL konisk tub.
- Dekantera supernatanten och resuspendera pelleten i 10 mL 1 X fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Centrifugera i 5 min på 225 x g och Dekantera supernatanten.
Obs: 1 X PBS består av 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 i destillerat vatten. Justera pH till 7,4.
- För vidhäftande celler, skörda ungefär 1,3 x 107 celler när de når cirka 80% konfluens. Lossa celler med hjälp av en reagens som är lämpliga för den cell-linjen.
- Fixa cellerna i formalin och pellet dem.
- Centrifugerade cell inom koniska röret i 10 mL 10% neutral buffrad formalin (NBF).
Obs: NBF kan förberedas genom spädning av 1 mL stamlösning 37% formaldehyd i 9 mL 1 X PBS.
Varning: Var försiktig vid hantering av formalin och formaldehyd. Använda ett dragskåp för åtgärder som involverar formalin och formaldehyd. - Inkubera cellerna på en rocker på 24 rpm över natten i rumstemperatur (ca 17 h).
- Förbereda en 1% lösning av låg smältpunkt agaros i PBS (0,01 g av agaros per 1 mL PBS).
- Förbereda nog för 500 µL agaros lösning per cell linje prov.
- Lös upp Agarens i en 80 ° C vatten bad eller värme block, med enstaka blandning för 2-5 min. När upplöst, förvara lösningen i en 37 ° C vatten bad eller värme block att förhindra härdning.
- Pellet fast cellerna från steg 1.2.2 för centrifugering för 5 min på 225 x g. avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 500 µL 1 x PBS.
- Överföra cellerna i en 1,5 mL mikrocentrifug rör och pellet genom centrifugering för 5 min på 290 x g. Aspirera ut alla av supernatanten.
- Centrifugerade cell inom koniska röret i 10 mL 10% neutral buffrad formalin (NBF).
- Gjutna celler i agaros.
- Tillsätt ~ 500 µL av 1% agaros lösning (från steg 1.2.3) till varje tub som innehåller celler. Försiktigt, men snabbt, pipett blandningen upp och ner med en P-1000 mikropipett för att blanda.
Obs: Skära av slutet av pipettspetsen att förstora bländaren och undvika bildar bubblor. Hålla agaros arbetslösning i 37 ° C vattenbad att förhindra härdning. - Låt agaros-cell lösningen härda (5-10 min) i rumstemperatur. Tillsätt 1 mL 10% NBF till varje mikrocentrifug rör som innehåller ett urval och förvara i rumstemperatur tills paraffinet inbäddning (upp till 24 h).
- Tillsätt ~ 500 µL av 1% agaros lösning (från steg 1.2.3) till varje tub som innehåller celler. Försiktigt, men snabbt, pipett blandningen upp och ner med en P-1000 mikropipett för att blanda.
- Förbereda agaros kontakten för inbäddning av paraffin.
- Aspirera off NBF från provet.
- Stickproppen cell med ett rakblad för att skära mikrocentrifug röret, placera pluggen i plast vävnad kassett. Förvara kassetterna i 10% NBF vid rumstemperatur.
- Bearbeta proverna övernattning antingen manuellt eller med hjälp av en automatiserad vävnadsprocessor och bädda in i paraffin vax med standard histologi metoder.
Obs: Se Fischer et al. 19 för ett exempel-protokoll. - Med hjälp av en specialiserad ”tissue arrayer” instrument, skörd dubblerade 0.6-mm kärnor från paraffinet blockera från varje cellinje och infoga dem i rader, i ett tomt mottagarens paraffin-block för att skapa en cellinje TMA.
Obs: Standardmetoder bör användas såsom de beskrivs i Fedor och De Marzo20. - Införliva kärnor från delprov som motsvarar 2-3 ytterligare vävnadstyper (t.ex. tonsill, kolon, testiklarna, etc.) som positiva eller negativa kontroller i TMA. Välj vävnader som är lämpliga för proteinet av intresse.
- Använda en mikrotom för att förbereda två histologiska avsnitt, ungefär 4 till 6 µm tjock, av raden cell TMA. Montera avsnittet på en histologi bild, torka den och deparaffinize (som beskrivs i Fedor och De Marzo20).
2. prov färgning av immunofluorescens
- Optimera utspädning av primär antikropp.
Obs: Standard protokoll finns för optimering av IHC eller om för FFPE vävnadssnitt såsom i Kajimura et al. 21. en kort översikt över metoden beskrivs här.- Förbered 4-5 utspädningar av primär antikropp till proteinet av intresse styrs av tillverkarens anvisningar.
- Identifiera en kontrolltyp vävnad från ett djur eller människa källa som uttrycker proteinet av intresse i morfologiskt igenkännliga cellpopulationer. Förbereda sektioner av vävnad och montera dem på en bild efter standard immunohistokemi förfarande såsom i Fedor och De Marzo20.
Obs: Antalet sektioner som krävs är antalet primär antikropp utspädningar plus en extra. - Använda en automatiserad eller manuell system för immunohistology, testa de primär antikropp spädningarna från 2.1.1 varje steg på en bild från steg 2.1.2. Utesluta tillämpningen av primär antikropp från extra bilden och använda den som en negativ kontroll.
- Under processen färgning fläcken i alla bilder med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) som en nukleär motfärg och en fluorescently märkta sekundär antikropp. Om det krävs större känslighet, Använd en HRP (pepparrotsperoxidas)-konjugerat sekundära antikroppar och tyramide-baserade signal förstärkarsystem (se Stack et al. ( 13).
Obs: När multiplexing primära antikroppar, används en annan fluorescerande etikett för varje protein. - Skanna de immunostained bilder med hjälp av ett lämpligt instrument som kan generera en digital bildfil med hjälp av excitation och upptäckt våglängder som är lämpligt att den fluorophores som användes.
- Använd lämplig programvara för att visa digitala bilder och empiriskt välja primär antikropp utspädning som optimerar signalintensitet i förhållande till bakgrunden fluorescens.
Obs: Om så önskas, denna optimering kan ske med en HRP-konjugerad sekundär antikropp, 3, 3'-Diaminobenzidin (DAB) och mikroskopi, brightfield.
- Utför om färgning på raden cell TMA.
- Använd en automatisk eller manuell system för immunohistology att färga en bild av cellinje TMA med den optimera primär antikropp utspädningen (som anges i steg 2.1). Utesluta tillämpningen av primär antikropp från den andra bilden och använda den som en negativ kontroll.
- Under processen färgning färga alla bilder med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) som en nukleär motfärg, och med en sekundär antikropp och tyramide som i steg 2.1.4.
- Skanna de immunostained bilder med hjälp av ett lämpligt instrument som kan generera en digital bildfil med hjälp av excitation och upptäckt våglängder som är lämpligt att den fluorophores som användes.
- Använda ett avbildningspaket analys programvara för att identifiera mobilfack sevärdheter (dvs cytoplasman jämfört med kärnan) och kvantifiera genomsnittlig fluorescensintensiteten (MFI) för varje cellinje.
Obs: Olika programpaket kan användas för detta ändamål och många diskuteras i Stack et al. 13.
3. kvantitativa Immunoblotting cellinjer
- Förbereda lysates av celler.
- Skörda 2 miljoner celler i varje cell linje, enligt beskrivningen i steg 1.1.1 till 1.1.3.
- Snurra celler ner för 5 min på 650 x g i en 50 mL konisk tub. Dekantera supernatanten.
- Tvätta cellerna med 10 mL iskallt PBS. Återsuspendera i 1 mL iskallt PBS och överföring till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Centrifugera enligt steg 3.1.2, Dekantera och lämna celler på is.
- Tillsätt cirka 200 µL kalla radioimmunoprecipitation (RIPA) lyseringsbuffert med proteashämmare (10 µL av 100 X hämmare per mL RIPA lyseringsbuffert) i cellerna, vortex och inkubera på is i 15 min.
Obs: Mängden lyseringsbuffert som krävs för effektiv Lys varierar beroende cell fodrar och kan bestämmas empiriskt. RIPA bufferten består av 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0% NP-40, 0,5% natriumdeoxikolat, 0,1% SDS i destillerat vatten. - För att säkerställa relativt även fylla på immunoblots, kvantifiera det totala proteinet i ett 20 µL prov från varje lysate med en lämplig metod såsom Bradford analysen. Tillsätt ca 40 µL 6 X Laemmli lyseringsbuffert till återstoden (ungefärligt 180 µL) av varje cell lysate och kokar vid 100 ° C i en värme eller vattenbad för 5 min.
Obs: 6 X Laemmli buffert består av 300 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w/v) SDS, 60% glycerol, 0,6% (w/v) bromofenolblått, 50 mM Ditiotreitol (DTT) i destillerat vatten. - Lagra proverna vid-20 ° C i upp till två veckor.
- Utföra en immunoblot av alla celler rader att avgöra vilken cellinje har det mest förekommande proteinet av intresse.
Obs: Följ proceduren som beskrivs i Mahmood, T. och Yang, PC. 22, med följande ändringar.- Alikvot cell lysate (beredd i steg 3.1) innehållande 10-50 µg av protein (beroende på överflödet av proteinet av intresse) i mikrocentrifugrör. Tillsätt 2,5 µL av 6 X Laemmli buffert och tillräcklig RIPA lyseringsbuffert att göra volymen upp till 15 µL.
- Fyll en 5% stapling och en lämplig koncentration som lösa (t.ex., 10% för proteiner mellan 15-100 kDa) SDS-PAGE gel med en protein stege och proverna från steg 3.2.1. Ladda 1 X Laemmli buffert i tomma brunnar. Köra strömförsörjningen på lämpliga inställningar, vanligtvis 125 V, 80 min eller tills bromofenolblått färgämnet når botten av plattan.
- Utföra en halvtorr protein-överföring som beskrivs i Wiedemann o.a. 23.
Obs: för representativa resultat, en nitrocellulosa-membran (som inte behöver blötläggas i metanol), och kalla Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) överföring buffert användes. BSN buffert består av 48 mM Tris, 39 mM glycin, 20% metanol i destillerat vatten. - Efter överföringen, Använd ett rakblad för att skära membranet horisontellt för att avskilja den del som innehåller proteinet av intresse från en lämplig internkontroll protein, såsom GAPDH.
- Gå vidare till blockering och antikropp inkubationer med det blockerande buffert som rekommenderas av tillverkaren av de primära antikropparna.
Obs: Optimal primär antikropp utspädningar kan variera dramatiskt beroende på protein överflöd och känslighet. För representativa resultat nedan krävs antikroppen till proteinet av intresse en 1:1,000 utspädning medan kontrollen GAPDH krävs en 1:40,000 utspädning. Utspädning av sekundära antikroppar används var 1:3 000. - Efter antikropp inkubationer och tvättning av membranet, placera membran remsorna i en genomskinlig plast slida såsom en smörgås väska.
- Förbereda dikterar chemiluminescence (ECL) blandning följa tillverkarens instruktioner. Använd P-1000 pipett för att täcka membranet med ECL blandningen, stänga slidan och inkubera membran remsorna med blandningen i mörker vid rumstemperatur i 1-2 min.
- Placera den membran slidan i digital tänkbar plattform. Använd chemiluminescence och kolorimetriska markör upptäckt för att fånga olika exponeringar av membranet.
Obs: Exponeringstider varierar beroende på mängden protein laddad, överflöd av målprotein, antikropp tillhörighet etc. börjar med en automatisk exponering (vanligen några sekunder), och testet exponering gånger ovan och nedan i steg om några sekunder. - Empiriskt, eller använda bilden analysprogram, bestämma vilken cellinje uttrycker mest målprotein.
- Hitta det linjära dynamiska omfånget av varje primär antikropp som med hjälp av en seriell utspädning.
- Utföra stegen 3.2.1-3.2.8 med hjälp av en rad seriespädningar från den cellinje som uttrycker den högsta koncentrationen av målproteinet (identifierade i steg 3.2.9).
- Använda bild analys programvara såsom ImageJ för att utföra densitometry på exponering bilder.
- Exempelvis använder ImageJ, verktyget Rektangulär val för att välja första körfältet av gelen att kvantifiera. Gå till analysera | Geler | Välj första Lane. Använd musen för att flytta den resulterande rektangeln över till nästa körfält. Gå till analysera | Geler | Välj nästa Lane. Upprepade gånger Flytta rektangeln till nästa körfält och välj körfältet för återstoden av köer.
- Gå till analysera | Geler | Rita banor. Rak linje verktyget Rita linjer över baserna av varje topp ta bort bakgrundsljud. Välj varje topp med verktyget trollstav , och samla tätheten av varje topp, hädanefter kallad bandet intensitet, från fönstret resultat .
- Använd den densitometry utgång för att skapa ett spridningsdiagram av det bandet intensitet kontra mängden totalt protein lastas för varje primär antikropp. Använda en linje för bästa passform och okulärbesiktning, fastställa platsen (intensiteten intervall) för varje antikropp linjär dynamiska omfång.
- Välja en proteinkoncentration som genererar ett värde på den högre änden av det linjära området vara koncentrationen framåt med alla cellinjer.
Obs: Eftersom denna koncentration är lägre än mättnadsnivån i cell linje med den största mängden av detta protein, det bör ingen risk för över utsätta banden för de andra cellinjer.
- Utföra en immunoblot med hjälp av protein-koncentrationen som valdes i steg 3.3.4 för alla cellinjer och upprepa steg 3.2.1-3.2.8.
- Utföra densitometry på digitala genomsökningar som i steg 3.3.2. Välj de exponeringar bilder som ger signaler inom linjär spänner för varje antikropp som identifierades i steg 3.3.3.
- Med hjälp av bandet intensitet från de perfekta exponeringarna från 3.4.1, beräkna förhållandet mellan mål protein band intensitet till lastning kontroll bandet intensitet för varje cellinje. Dessa baserat på värden anger det relativa överflödet av proteinet target sevärdheter.
- Utföra en Pearson korrelation test (kan göras med hjälp av en statistiskt programpaket) att korrelera de värden som erhålls från bildanalys av om färgning (steg 2.2) som erhålls från immunoblotting (steg 3.4.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll användes för att bekräfta om förmåga att fastställa den relativa mängden av proteinet anti-apoptotiska Bcl-2 i cellinjer som gjort i FFPE vävnad block. Kvantifiera Bcl-2 selektivt i cancerceller kan belysa onkogena mekanismer och kan vara användbart i patologisk diagnos och att informera klinisk hantering beslut24. Mer specifikt, Bcl-2 spelar en roll i lämplig B-lymphocyte utveckling och dess uttryck utreds vanligen i samband med lymfom25,26,27. Figur 1 beskriver de olika stegen i protokollet. I ett första steg om optimering testades olika spädningar av primära anti-Bcl-2 antikroppen på mänskliga tonsill vävnad med hjälp av en automatiserad immunohistology stainer som beskrivs i steg 2.1. Figur 2 innehåller bilder av betsad och skannade histologi bilder av mänskliga tonsill vävnad att varje fick en olika utspädning av antikropp. Det kan ses som 1:50 är den optimala utspädning som gav stark signal och lite bakgrund fluorescens. Denna utspädning användes sedan på raden cell TMA som beskrivs i steg 2.2. TMA var också målat med DAPI för att identifiera atomkärnor. Ett tyramide-baserade signal förstärkning kit användes att märka Bcl-2 med en Cy5 fluorophore. Bildanalys används för att kvantifiera den cytoplasmiska Cy5 fluorescens signalen tillskrivs Bcl-2 i varje cellinje. Representativa bilder av färgningen kan ses i figur 3. De förevigade cellinjer som valts för detta experiment ingår en mängd lymfoida-derived cellinjer, nämligen 697, JeKo-1, Jurkat, RCH-ACV, Granta-519, REH och Raji, förutom HeLa, härrör från en cervikal cancer. De HeLa cellerna är kända för att uttrycka Bcl-2 en mycket låg nivå28.
Baserat på en inledande immunoblot av alla åtta cellinjer, Granta-519 var fast besluten att ha det största överflödet av Bcl-2 (visas inte). Seriespädningar av den Granta-519 lysate användes i en efterföljande immunoblot för att hitta det linjära dynamiska omfånget av Bcl-2 och GAPDH (lastning kontroll) signaler (figur 4A). Detta immunoblot utsattes med hjälp av digitala skanner för varierande längd av tid. Densitometry med bild analys programvara användes för att kvantifiera signalen från varje band, och dessa värden var plottas mot mängden protein laddad (figur 4B). Från data i figur 4B-toppen, det dynamiska omfånget för Bcl-2 i denna analys spänner från en band intensitet från nästan noll till 7500 (godtyckliga enheter, blå linje). De två högsta exponering gångerna passar en kvadratisk och icke-linjära ekvation, vilket tyder på överexponering och mättnad av signal intensiteten. Intervallet för GAPDH är från 3000 till 6500 (godtyckliga enheter, figur 4B-botten). Värden under 3000 (godtyckliga enheter) tappade precipitously även när du använder en relativt låg exponeringstid. En lång exponering resultat tydligt i mättnad. Från dessa grafer, det bestämdes att 12 µg skulle vara en rimlig mängd protein att ladda när du utför immunoblot med alla cellinjer, eftersom denna mängd protein gav Bcl-2 intensitetsvärden inom intervallet linjär för Granta-519 cellerna, vilket minskar risken för överexponering för alla andra cellinjer.
En andra immunoblot av alla cellinjer utfördes sedan som i steg 3,4 och kan ses i figur 5A. Denna skamfläck krävdes sedan de inledande blot innehöll band med en signalintensitet utanför det linjära området. Bild analys programvara användes för att bestämma signal intensiteten i varje band i nya blot. Bara intensitetsvärdena som fanns inom dynamisk intervall bestäms ovan användes. Pilarna till höger om figur 4B visar representativa intensitetsvärdena som användes och show där de passar in i det linjära området. Förhållandet mellan Bcl-2:GAPDH beräknades sedan för varje cellinje. Detta förhållande, tillsammans med fluorescens-signalen från om kan ses i figur 5B. En Pearson korrelation test visat att intensiteten nyckeltalen från immunoblotting var starkt och positivt korrelerade med intensitet avläsningarna från kvantitativa om (r = 0.983, p < 0,001; se figur 5 c).
Kvantitativt bedöma mängden Bcl-2 visade sig vara särskilt svårt eftersom det inte fanns ett brett spektrum av uttryck av detta protein över de åtta testade cellinjer. Använder en tillräckligt lång exponering för att fånga signalen av låg Bcl-2-uttryckande cellinjer (> 1 s) gjorde det svårt att stanna kvar i det dynamiska omfånget för de höga Bcl-2-uttryckande cellinjer. I ett försök att kvantifiera de svaga banden som produceras av cellinjer som HeLa och Raji, flera olika exponering gånger, från 0,1 s till 5 s, tillfångatogs för att fastställa den längsta exponeringstiden som kan användas samtidigt i det dynamiska omfånget för celler såsom Granta -519 (se figur 6). Arten av denna immunoblotting teknik begränsar noggrannheten för signaldetektion som ett tillvägagångssätt buller, tyder på att det används optimalt att kvantifiera proteiner som finns på mellannivå till höga nivåer.
Figur 1 : Protokoll arbetsflödesdiagram. Immunofluorescens (om) på en cell linje vävnad microarray (TMA) kördes parallellt med kvantitativa immunoblotting (IB) av samma cellinjer. Signaler från varje cellinje jämförs av Pearson korrelation att validera protokollet om kvantitativa förmåga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Testa och optimera immunofluorescens (om) protocol. Delar av tonsill inkuberades med olika spädningar av anti-Bcl-2-antikroppar (1:50, 1: 100 och ingen primär antikropp). Bilderna inkuberades med HRP-konjugerad sekundär antikropp, signalen var förstärkt med ett tyramide-Cy5 konjugat och bilderna var fläckade av DAPI. Bilderna skannades 20 X förstoring med hjälp av filter anger lämplig till maximal excitation/utsläpp topparna av 350/470 nm och 649/666 nm för DAPI och Cy5, respektive. Respektive exponering gånger var 160 ms och 200 ms. synfältet är centrerad över samma lymfoida follikeln, som förväntas vara Bcl-2 negativa i (central) germinal center och positiva i zonen (perifer) mantel. 1:50 utspädning gav en starkare specifika fluorescens-signal utan att öka ospecifik signalen därför användes som den utspädning som framöver. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Immunofluorescens (om) använder cell banavsnitt vävnad microarray (TMA). Delar av cellinje TMA togs och inkuberas med 1:50 utspädning av anti-Bcl-2 eller med ingen primär antikropp. Bilderna inkuberades med sekundär antikropp, signalen var förstärkt med ett tyramide-Cy5 konjugat och bilderna var fläckade av DAPI. Bilderna skannades 20 X förstoring med hjälp av filter anger lämplig till maximal excitation/utsläpp topparna av 350/470 nm och 649/666 nm för DAPI och Cy5, respektive. Respektive exponering gånger var 250 ms och 625 ms. dessa representativa bilder visar att färgningen var framgångsrika, och att det finns ett utbud av Bcl-2 uttryck över cellinjer. ”Ingen Bcl-2-antikroppar” negativ kontroll bilden visat inte någon Cy5 signal, som förväntat. Den representativa bilden är från den 697 cellinje. En kärna av hyperplastiska tonsiller vävnad på TMA visar ett motsvarande mönster som visas i figur 2. Genomsnittlig fluorescensintensiteten (MFI) för varje cellinje bestämdes av kvantifiera Cy5 fluorescens signalen med bild analys programvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Att bestämma den linjära dynamik av immunoblot (IB) signalerar. (A) IBs av seriella utspädningar av Granta-519 lysate. Varje blot var utsatt för en mängd olika tider att hitta det linjära dynamiska omfånget. (B) bandet intensitet för Bcl-2 (överst) och GAPDH (nederst) kontra mängden totalprotein lastas för IB i (A). Band stödnivåer kvantifierades med hjälp av bild analys programvara ImageJ. För Bcl-2 (överst), signalerna förblev linjär hela utbud av bandet stödnivåer när en låg exponering (exp.) (0,2 s) var används (stödnivåer från 0-7200) som stöds av en Pearsons korrelationskoefficient (r-värdet) av 0.994 (p < 0,001), men inte för större exponeringstiderna 1 s och 2 min. För GAPDH (botten), återstod data linjärt över en intensitet av 3000 (godtyckliga enheter) för låg (0,2 s) och medium (2.2 s) exponeringstider som stöds av Pearson's r-värden av 0.994 (p < 0,001) och 0.992 (p < 0,001), respektive, men inte för en hög exponering tid () 7 s). Pilar till höger visar bandet intensiteten för den specifika cellen fodrar identifieras från immunoblot i figur 5A. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Kvantitativa immunoblotting (IB) av förevigade cellinjer och jämförelse med immunofluorescens (om). (A) IB av alla cellinjer. 12 µg totalt protein lästes in i varje brunn. (B) IB och om signalen intensiteter för varje cellinje. IB signalen är förhållandet mellan Bcl-2:GAPDH band intensitet från blot (a) som kvantifieras i ImageJ. Om signalen är fluorescensintensiteten hos varje cell linje core på TMA (figur 3) som bestäms av bildanalys. (C), spridningsdiagram av om signal kontra IB signal. Varje datapunkt representerar en viss cell linje. De två metoderna producerade linjärt korrelerade resultat med en Pearson r-värde på 0,984 (p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Att hitta den optimala exponeringstiden för kvantitativa immunoblotting (IB). IB i alla cellinjer visas. Tolv mikrogram av protein lastades i varje brunn. För varje IB användes olika exponeringstider för att fånga en bild där alla band förblev inom det linjära dynamiskt omfånget. Exponeringstiderna av Bcl-2 och GAPDH remsorna respektive var: (A) 0,1 s och 0,1 s, (B), 1 s och 0.2 s, och (C), 5 s och 5 s. paneler A och C visar exempel på exponeringar där åtminstone några av banden på blot var för svag eller alltför stark, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit en metod som använder kvantitativa immunoblotting (IB) för att påvisa nyttan av immunofluorescens (om) för att fastställa det relativa överflödet av ett målprotein i FFPE vävnadsprover. Nuvarande metoder för kvantifiering av protein är begränsade av sin kategoriska natur, såsom kromogen IHC2,3, eller att behöva homogenisera prover, förhindra utredning prov struktur och cell befolkningen, såsom med IB och masspektrometri8,9,10,11. Kvantitativa om kan överskrida dessa begränsningar om metoden är validerad och tillämpas noggrant. Genom att jämföra om avläsning till kvantitativa iIF förevigade cellinjer, kunde vi validera semikvantitativt beskaffenhet metoden om.
Primära vävnadsprover från patienter eller försöksdjur är heterogena i att de innehåller flera celltyper. Tillämpningen av flera primära antikroppar i multiplex om tillåter kvantifiering av en eller flera proteiner av intresse i specifika celltyper eller cell fack4,13. Vid optimering och tillämpning av multiplex om är utanför ramen för denna artikel men beskrivs i de följande papper16,17,18,29. Den breda filosofin är att etiketten cellpopulationer och endast kvantifiera proteinet av intresse i önskad cell facket, till exempel kärnor eller Cytoplasman, i den önskad celltypen. När den kvantitativa naturen om med en särskild antikropp har kontrollerats av kvantitativa IB, kan protokollet skalas för att möjliggöra snabb, hög genomströmning protein kvantifiering i kliniska prover. Kliniska tillämpningar kräver generellt bestämning av relativa snarare än absoluta, protein överflöd. Metoden om kan dock göras formellt kvantitativa vid behov. Exempelvis en lösning innehållande renat rekombinant Bcl-2 protein kunde förberedas och kvantifieras med hjälp av en biokemisk standardmetod. Seriespädningar kan sedan utvärderas av kvantitativa IB och en standardkurva som genereras för att uppskatta absoluta proteininnehållet per cell i varje cellinje.
Vi tillämpat vårt om protokoll för TMA sektioner som representerar biopsiprover från 66 fall av de novo diffusa stora B-cells lymfom. Våra resultat visade acceptabel kör-och-kör reproducerbarhet (Pearson r = 0,837) och beräknade, stark association mellan ”Bcl-2-positiv” status bestäms subjektivt av visuella scoring av konventionella IHC och förhöjda uttryck bestäms objektivt av IF (p < 0,001). Dessutom Bcl-2 överflöd av om korrelerade med Bcl-2 mRNA överflöd i samma prover (Spearman ρ = 0,69, p < 0,001) och var signifikant större i fall med kopia antalet vinster av BCL2 genen (p = 0,042) eller flyttning av BCL2 till det IGH -locus (p = 0,004), som bestäms av fluorescens i situ hybridisering. Vi erhöll likvärdiga resultat i en separat kohort av fall. Dessa fynd ger ytterligare bevis som stöder om som en giltig metod för att bestämma det relativa överflödet av Bcl-2 i rutinmässiga FFPE exemplar. Användningen av om att kvantifiera flera andra biomarkör proteiner i delprov har tidigare beskrivits16,17.
Optimering av detta protokoll är en tvåfaldig process. Första, om med primära antikroppar används måste optimeras (steg 2.1). Kommersiella antikroppar tyder vanligen spädningar för IHC-protokoll som ska användas som utgångspunkt tillsammans med en spädning eller två ovan och under detta (dvs. om 1: 100 rekommenderade, Lägg till 1:50 och 1:150). Efter utför IF och skannar bilden, innebär att bestämma vilken utspädning är ”optimalt” visuell inspektion för att identifiera primär antikropp utspädning som genererar den ljusaste signalen utan att öka bakgrunden fluorescens. Den andra etappen av optimering innebär att välja mängden protein att ladda för immunoblot för varje band ska förbli i det linjära området (steg 3,4). För att säkerställa detta, utförs en immunoblot med hjälp av en seriell utspädning av den cellinje som uttrycker störst överflödet av målprotein. Här kan bandet stödnivåer kontra protein beloppet ritas att bestämma intensitet spänner genom vilken signalen förblir linjär. Eftersom detta intervall är etablerad i cellinje med mest överflödande målproteinet, för en viss mängd protein kommer att alla andra cellinjer ge lägre signaler. När du flyttar till en immunoblot av alla cellinjer (steg 3,4), används spädningsserien för att informera ett protein belopp att ladda det ger starka signaler utan att riskera överexponering utanför det linjära området.
Trots fördelarna med detta protokoll, användning av immunoblotting som en kvantifiering verifieringsmetod har sina brister. Den primära oro kretsar kring det stora utbudet av uttryck för olika proteiner mellan exemplar. Det kan vara svårt att hålla alla prover inom ramen för ett linjärt intervall om några prover express proteinet av intresse i mycket större utsträckning än andra. I de representativa resultat visas ovan, fångades varierande exponeringar för att få en bild där ytterligheterna (hög och låg) ligger båda inom det linjära dynamiskt omfånget (figur 6). Större än förväntat om signaler ses av HeLa och Jurkat celler i figur 5B kan tyda på antingen lägsta möjliga om signalen för detta system, eller som IB signalerar har nått botten av linjära detektionsgränsen och är mindre exakt. Hursomhelst, detta indikerar att om värden på detta område är mindre benägna att vara korrekt i detta system, och att tekniken är optimal för medium - till mycket-uttryckta proteiner. Dessutom, är användning av HRP-konjugerad sekundära antikroppar inte optimal för kvantitativa ändamål, som diskuterats tidigare med avseende på IHC2,3. Med fluorescently märkta sekundära antikroppar för immunoblot skulle ge en mer robust bekräftelse att IF är verkligen linjärt kvantitativ30,31, dock Pearson r-värdet av 0,984 som erhållits med hjälp av HRP-konjugerad sekundära antikroppar i protokollet ovan var tillräckligt för de nuvarande ändamål. Potentiella brister är associerad med IF, såsom autofluorescens och snabbkylning varierar utifrån enskilda laboratoriet instrumentering, praxis och vävnadstyp och kan minimeras med olika förebyggande åtgärder32,33. En mycket liten mängd autofluorescens i representativa resultat kan ses i ingen Bcl-2 antikroppen prov i figur 3, men detta belopp är triviala i jämförelse med den återstående om signaler.
Behovet av att exakt kvantifiera proteiner av intresse från FFPE vävnadsprover avser klinisk och forskningsändamål inom många biologiska områden. Det protokoll som presenteras här beskriver användningen av kvantitativa om på FFPE vävnadssnitt och validerar sin semikvantitativt natur av immunoblotting förevigade cellinjer. Denna metod tillåter kvantifiering över ett brett dynamiskt omfång, samt upprätthållandet av den strukturella integriteten av de vävnadsprov, som inte bevaras i många andra kvantifiering metoder3,8,11. Dessutom detta protokoll är lätt anpassningsbar och kan användas i forskning och kliniska miljöer, särskilt för cancer-relaterad forskning och prognos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades delvis av Fredrick Banting och Charles Best Kanada Graduate stipendium (A.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | - | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | - | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | - | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | - | For densitometry analysis |
References
- Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
- Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
- Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
- Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
- Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging? Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
- Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
- Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
- AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
- Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
- Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
- Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
- Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
- Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
- Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
- Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
- Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
- The Human Protein Atlas BCL2. , https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).
