식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화
Summary
이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.
Abstract
정식 TRP subfamily의 일시적인 수용 체 잠재력 채널 (TRPCs)은 비선택적 양이온 채널 칼슘 항상성 기능을 유지 하기 위해 중요 한 특히 저장소 운영 칼슘 항목에서에서 필수적인 역할을 시 냅 시스 소포 방출 하 고 세포내 신호 통로입니다. 따라서, TRPC 채널 다양 한 심장 비 대 등 심장 혈관 질환, 파 킨 슨 병 같은 신경 퇴행 성 질환, 척 증과 같은 신경학 적 장애 등 인간의 질병에에서 연루 되었습니다. 따라서, TRPC 채널 인간의 질병에 잠재적인 pharmacologic 대상을 나타냅니다. 그러나,이 채널에서 게이팅의 분자 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 균질, 안정적이 고 순화 된 단백질의 대량 취득에 어려움 특히 TRPC 이온 채널 등 포유류 막 단백질에 대 한 구조 결정 연구에 제한 요인이 되었습니다. 여기, 선물이 포유류 이온 채널 막 단백질 선호도 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수정 된 잠재 유전자 전달 시스템 및 이러한 단백질의 정화를 사용 하 여 대규모 표현 위한 프로토콜. 선물이 더 순화 된 단백질에서 단일 입자 cryo 전자 현미경 이미지를 수집 하 고 이러한 이미지를 사용 하 여 단백질 구조를 결정 하는 프로토콜. 구조 결정 게이팅 및 기능 이온 채널의 메커니즘을 이해 하는 강력한 방법입니다.
Introduction
칼슘 신호 폭포, 녹음 제어, 신경 전달 물질 방출, 및 호르몬 분자 합성1,2,3등 가장 세포질 과정에서 포함 된다. 무료 cytosolic 칼슘의 항상성 유지 건강 및 세포의 기능에 결정적 이다. 세포내 칼슘 항상성의 주요 메커니즘 중 하나는 칼슘 저장소 운영 항목 (SOCE)는 칼슘의 소모에에서 저장 된 바인딩과 그물 (응급실) 트리거 이온 채널 개방 촉진 하기 위하여 플라즈마 멤브레인에 프로세스는 4,,56더 신호에 사용할 수 있는 ER 칼슘 보충 TRP superfamily 속하는 칼슘 침투성 채널은 일시적인 수용 체 잠재력 채널 (TRPCs), SOCE7,,89 에 주요 참여자로 확인 되었습니다.
TRPC 가족에서 7 멤버 중 TRPC3, TRPC6, 및 TRPC7 homologue 하위 그룹을 형성 하 고 지질 보조 메신저 diacylglycerol (DAG)의 신호 지질 저하 제품에 의해 활성화 될 수 있는 고유 phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3은 매우 부드러운 근육에 영향 neurotransmission 및 성체12,13칼슘 신호에서 필수적인 역할을 재생 하는 두뇌의 대뇌와 소 뇌 영역에 표시 됩니다. TRPC3의 부전 중앙 신 경계 질환, 심혈 관 질환 및 난소 선 암14,,1516등 특정 암에 연결 되었습니다. 따라서, TRPC3는 이러한 질병의 치료에 대 한 제약 대상으로 약속을 보유 하고있다. TRPC3에 특별히 대상된 약물의 개발 등 지질 바인딩 사이트17,18, 분자 활성화 메커니즘의 이해의 부족에 의해 제한 되었습니다. 우리 보고 인간 TRPC3 채널 (hTRPC3)와 닫힌된 상태에 그것의 2 개의 지질 바인딩 사이트의 첫 번째 원자 해결책 구조19이러한 메커니즘 대 한 중요 한 통찰력을 제공.
높은 해상도에서 막 단백질의 구조를 결정 하기 위한 핵심 요소는 높은 품질의 단백질을 얻을 것입니다. 표현과 정화 조건 고품질 단백질을 얻기 위해 필요한의 해당 검사는 시간과 비용이 많이 드는 노력 될 수 있습니다. 여기 우리는 어떻게 우리가 식별 표현과 hTRPC3, 우리의 초기 심사에서 가난 하 게 행동의 정화에 대 한 최적의 조건을 자세히 설명 하는 프로토콜을 제시. 우리는 해결 하 고 누워 우리의 cryo 전자에 대 한 견고한 기초 현미경 (cryo-EM) 연구 하는 단백질 동작을 최적화 하는 방법에 몇 가지 핵심 포인트를 제시. 수정된 baculoviral 생성 하는 벡터 (pEG), Gouaux와 동료에 의해 개발 된 심사 분석 및 포유류 세포20에 잠재의 효율적인 생성에 대 한 최적화를 사용 합니다. 이 식은 메서드는 포유류 세포 막에 있는 단백질의 신속 하 고 비용 효율적인 overexpression에 적합 합니다. 우리는의 사용이 형광 검출 크기-배제 크로마토그래피 기반이 벡터 (FSEC) 방법21prescreening를 결합 한다. 이 메서드와 관심의 구조를 융합 하는 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그를 사용 하 여 작은, 전체 셀 solubilized 샘플에서 대상 단백질의 시각화를 향상 시킵니다. 이 다른 세제 및 첨가물, thermostabilizing 돌연변이와 단백질 안정성의 심사 가능 하며 소규모 과도 transfection에서 세포의 작은 숫자의 사용을 허용 한다. 이 방법에서는, 다양 한 조건 수 빠르게 상영 대규모 단백질 정화로 이동 하기 전에. 다음 식, 심사, 그리고 정화, 선물이 및 곳을 알아내는-EM 생성 단백질의 de novo 구조 결심 하에서 이미지를 처리 하는 프로토콜. 우리는 여기에 설명 된 방법을 일반화할 프로토콜 TRP 채널 수용 체와 다른 막 단백질의 구조 연구로 될 것입니다 믿습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
곳을 알아내는-그들에 의해 단백질의 구조 결정은 지난 몇 년 동안, 새로운 카메라와 알고리즘의 개발을 크게 하지 않는 단백질 구조 결정 속도 덕분에 구조 생물학 분야 혁명 쉽게 정보, 특히 막 단백질. 모든 cryo-EM 기술에서 최근의 진보에도 불구 하 고 높은-품질 종종 이미지를 촉진 하기 위하여 순화 된 단백질의 품질과 수량에 충분 한 준비 시간이 걸리는, 비용이 많이 드는, 그리고 도전 남아 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 데이터 수집에는 데이비드 밴 Andel 고급 Cryo 전자 현미경 검사 법에 대 한 지원에 대 한 G. 자오와 X. 멩 감사합니다. VARI-고성능 컴퓨팅 팀을 전산 지원 부탁 드립니다. 우리는이 원고를 크게 개선 하는 의견에 대 한 명. 클레 멘 테, 디 비, 제이 Floramo, 영 황, Y. 김, C. 뮬러, B. 로스, 그리고 Z. Ruan 우리의 감사를 제공 합니다. 이 원고에 대 한 편집 지원에 감사 디 Nadziejka 하 고. 이 작품은 내부 바리에서 지 원하는 자금.
Materials
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
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