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Biochemistry

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58754
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 1
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der Ionen-Kanalstrukturen von Kryo-Elektronenmikroskopie, darunter ein Baculovirus-System verwendet, um effizient Gene in Säugerzellen mit minimalem Aufwand und Toxizität, Proteingewinnung, Reinigung, und Qualitätsprüfung, Raster Probenvorbereitung und Screening, sowie Datenerfassung und Verarbeitung.

Abstract

Transienten Rezeptor möglichen Kanäle (TRPCs) der kanonischen TRP Unterfamilie sind obstructions kationen-Kanäle, die eine wichtige im Kalzium-Homöostase, insbesondere Shop betrieben Kalzium-Eintrag, ist entscheidend Rolle für die einwandfreie Funktion der Aufrechterhaltung synaptischen Vesikel Release und intrazellulären Signalwege. Dementsprechend waren TRPC Kanäle in einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf-Störungen wie Herzhypertrophie, neurodegenerativer Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit und neurologische Störungen wie Spinozerebellare Ataxie verwickelt. Deshalb sind TRPC Kanäle ein potenzielles pharmakologische Ziel bei menschlichen Erkrankungen. Die molekularen Mechanismen der Anspritzung in diesen Kanälen sind jedoch noch unklar. Die Schwierigkeit bei der Beschaffung von großen Mengen an stabile, homogene und gereinigtes Protein wurde ein limitierender Faktor in Struktur Entschlossenheit Studien, insbesondere bei Säugetieren Membranproteine wie die TRPC Ionenkanäle. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für den großen Ausdruck von Säugetieren Ionen-Kanal Membranproteinen Affinität und Größe-Ausschluss-Chromatographie eine modifizierte Baculovirus-gen-Transfer-System und die Reinigung dieser Proteine durch. Weiter präsentieren wir ein Protokoll, Single-Teilchen Cryo-Elektron Mikroskopie Bilder von gereinigtes Protein zu sammeln und diese Bilder zu verwenden, um die Proteinstruktur zu bestimmen. Strukturaufklärung ist eine leistungsfähige Methode für das Verständnis der Mechanismen der gating und Funktion im Ionenkanäle.

Introduction

Kalzium ist in die zelluläre Prozesse einschließlich der Signalisierung Kaskaden, Transkription Kontrolle, Neurotransmitter-Freisetzung und Hormon-Molekül Synthese1,2,3beteiligt. Die homöostatische Wartung der cytosolischen freie Kalzium ist entscheidend für die Gesundheit und Funktion der Zellen. Einer der wichtigsten Mechanismen der intrazellulären Calcium-Homöostase ist Store betrieben Kalzium Eintrag (SOCE), ein Prozess, in dem gespeichert Erschöpfung des Kalziums in das endoplasmatische Retikulum (ER) löst die Öffnung von Ionenkanälen auf der Plasmamembran zu erleichtern, die Auffüllung der ER Kalzium, die dann in weiteren Signalisierung4,5,6verwendet werden kann. Transienten Rezeptor möglichen Kanäle (TRPCs), die Kalzium-durchlässige Kanäle, die TRP-Superfamilie angehören, wurden als einer der wichtigsten Teilnehmer SOCE7,8,9 identifiziert.

Unter den sieben Mitgliedern der Familie TRPC TRPC3, TRPC6 und TRPC7 bilden eine Untergruppe homolog, und sie sind einzigartig in der Fähigkeit von Lipid sekundäre Messenger Diacylglycerol (DAG), ein Abbauprodukt von Signalisierung Lipid aktiviert werden Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 drückt sich hoch, in glatten Muskulatur und in der zerebralen und zerebelläre Regionen des Gehirns, wo er entscheidende Rolle spielt bei der Signalisierung von Kalzium, die Neurotransmission und Neurogenese12,13auswirken. Dysfunktion des TRPC3 ist mit Störungen des zentralen Nervensystems, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und bestimmten Krebsarten wie z. B. Eierstock Adenokarzinom14,15,16verbunden worden. Deshalb verspricht TRPC3 als pharmazeutische Ziel für die Behandlung dieser Krankheiten. Die Entwicklung gezielt Medikamente, die auf TRPC3 wurde durch einen Mangel an Verständnis für die molekulare Aktivierungsmechanismen, einschließlich Lipid Bindung Seiten17,18beschränkt. Wir haben die erste atomarer Auflösung Struktur des menschlichen TRPC3 Kanals (hTRPC3) und seine zwei Lipid-Bindungsstellen im geschlossenen Zustand berichtet, wichtige Einblicke in diese Mechanismen19.

Der entscheidende Faktor für die Bestimmung der Struktur eines Proteins Membran mit hoher Auflösung ist Protein von hoher Qualität zu erhalten. Die entsprechenden Screening von Ausdruck und Reinigung Bedingungen notwendig, hochwertiges Eiweiß zu erhalten kann ein Zeit- und kostenaufwendig Unterfangen sein. Hier präsentieren wir ein Protokoll beschreibt im Detail wie ermitteln wir die optimalen Bedingungen für den Ausdruck und die Reinigung des hTRPC3, die in unseren ersten Screening schlecht benommen. Wir präsentieren einige wichtige Punkte zur Problembehandlung und optimieren die Protein-Verhalten, das eine solide Grundlage für unsere Cryo-Elektron Mikroskopie (Cryo-EM) Studien geschaffen. Wir verwenden eine modifizierte Baculoviral Vektor (pEG), entwickelt von Gouaux und Kollegen, die optimiert ist für das screening-Assays und effiziente Erzeugung von Baculovirus in Säugerzellen20generieren. Dieser Ausdruck-Methode eignet sich für schnelle und kostengünstige Überexpression von Proteinen in der Säugetier-Zelle Membrane. Wir kombinieren die Verwendung dieses Vektors mit einem Fluoreszenz-Detektion Größe-Ausschluss Chromatographie-basierte (FSEC) prescreening Methode21. Diese Methode verwendet einen grün fluoreszierendes Protein (GFP) Tag verschmolzen, das Konstrukt von Interesse und verbessert die Visualisierung des Zielproteins in kleine, ganze Zelle solubilisiert Proben. Dies ermöglicht für das Screening der Proteinstabilität im Beisein von verschiedenen Wasch- und Zusatzstoffe, mit thermostabilizing Mutationen, und ermöglicht die Verwendung einer kleinen Anzahl von Zellen aus kleinen transiente Transfektion. Auf diese Weise kann eine Vielzahl von Bedingungen rasch untersucht werden, bevor er zu einer groß angelegten Proteinreinigung. Nach Ausdruck, Screening und Reinigung präsentieren wir ein Protokoll für die Beschaffung und Verarbeitung von Bildern von Cryo-EM, eine de-Novo -Strukturaufklärung des Proteins zu generieren. Wir glauben, dass die hier beschriebenen Vorgehensweisen als verallgemeinerbare Protokoll für strukturelle Studien der TRP-Kanal-Rezeptoren und andere Membranproteine dienen werden.

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Protocol

1. Umwandlung der DH10α zuständigen Zellen, Bacmid DNA zu produzieren

  1. Das gen des Interesses zu synthetisieren und subclone es in eine überarbeitete Version des pEG-Vektors mit einem Zwilling Strep-Tag, ein His8-Tag und GFP mit ein Thrombin-Spaltstelle am N-Terminus (pFastBacI)-20.
  2. Kompetente Zellen zu verwandeln, indem man 5 ng Plasmid mit einem gewünschten gen in pFastBacI zu 50 μL der DH10α Zellen in einem 1,5 mL tube und inkubieren Sie für 10 min auf Eis. Hitze Schock die Zellen für 45 s bei 42 ° C. Das Rohr 200 μL super optimale Brühe mit katabolen Repressor (SOC) Medium hinzufügen und 4-8 h bei 37 ° C in einem Orbitalschüttler bei 225 u/min inkubieren.
  3. Platte 5 μL der Zellen auf einer Bacmid LB-Agar-Platte (50 μg/mL Kanamycin, 7 μg/mL Gentamicin, Tetracyclin, 100 μg/mL Bluo-gal und 40 μg/mL Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside [IPTG], Agar 10 μg/mL).
  4. Inkubieren Sie die Platte für 48 h bei 37 ° c
    Hinweis: Der Bluo-gal Indikator Flecken Kolonien, die noch LacZ (Vektor Insertion erfolglos), mit dem Ausdruck ermöglicht für die Auswahl der weißen (erfolgreich transformierte) Kolonien.
  5. Wählen Sie sorgfältig eine isolierte weiße Kolonie, weiße Kolonien, die in Kontakt mit blauen Kolonien und wachsen Zellen über Nacht in 6 mL Bacmid LB-Medium (50 μg/mL Kanamycin, 7 μg/mL Gentamicin, 10 μg/mL Tetracyclin) bei 37 ° C in einem Orbitalschüttler bei 225 u/min zu vermeiden.

2. bakterielle Vorbereitung zur Isolation von Bacmid DNA

  1. Um Bacmid DNA zu isolieren, spin-down Escherichia coli Zellen für 10 min bei 2880 X g.
  2. Verwerfen der Überstand und Aufschwemmen das Pellet in 200 µL der Zelle Wiederfreisetzung Lösung aus der Miniprep durch Pipettieren kit (siehe Tabelle der Materialien). Achten Sie darauf, dass das Pellet vollständig und homogen ausgesetzt ist. Übertragen Sie anschließend die Zellsuspension in 1,5 mL Röhrchen.
  3. Fügen Sie 200 µL der Zelle Lysis Lösung aus Miniprep Kit und Mix durch Umkehrung der Röhre ein paar Mal. Bis zu 5 min bei Raumtemperatur (RT), die Zellen lysiert inkubieren. Fügen Sie 200 µL der Neutralisation Lösung aus Miniprep Kit und Mischung durch invertieren Rohr ein paar Mal um die Lyse Reaktion zu stoppen.
  4. Spin-down für 10 min bei 21.130 X g in einer Tischplatte Zentrifuge. Sammeln Sie 600 μl Überstand in ein 2 mL-Tube. Fügen Sie 600 μl Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohollösung (siehe Tabelle der Materialien) und Mischung gründlich, um die DNA vom Rest der Zelle Lysis Produkte zu extrahieren.
    Achtung: Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohollösung ist giftig beim Einatmen, Berührung mit der Haut, und Verschlucken. Es kann Verätzungen verursachen und möglicherweise krebserregend. Tragen Sie Handschuhe und eine geknöpfte Kittel. Arbeiten Sie in einer Dampfhaube. Diese Sonderabfälle ordnungsgemäß entsorgen.
  5. Drehen Sie das Rohr für 10 min bei 21130 X g in einer Tischplatte Zentrifuge. Zwei flüssigen Phasen werden angezeigt. Übertragen Sie 300 μL der oberen wässrigen Phase sorgfältig auf einen neuen Schlauch. Fügen Sie 600 μL von 100 % Ethanol, die DNA zu waschen. Invertieren Sie sanft das Rohr zu mischen.
    Hinweis: Tun nicht Wirbel, wie dies Bacmid DNA zu scheren.
  6. Coole Röhren werden, indem sie in einem Gefrierschrank-20 ° C für 10 min. Spin-down für 10 min bei 21.130 X g in einer Tischplatte Zentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand und bewahren Sie das DNA-Pellet.
  7. Fügen Sie 1 mL 70 % igem Ethanol um die Pellets zu waschen. Invertieren Sie sanft das Rohr zu mischen. Drehen Sie für 10 min bei 21.130 X g in einer Table-Top-Zentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet in die Luft für ca. 5 min oder bis keine Flüssigkeit im Schlauch sichtbar ist und das DNA-Pellet durchscheinend wird.
  8. Aufschwemmen der trockenen Pellet in 50 µL steriler, DNase-free, deionisiertes Wasser. Die DNA-Konzentration zu messen.
    Hinweis: Bacmid DNA nicht einfrieren. Lagerung bei 4 ° C für bis zu mehreren Tagen.

3. die Transfektion von Sf9 Insektenzellen mit Bacmid P1 Baculovirus produzieren

  1. Samen 0,9 x 106 Sf9 Zellen/Brunnen in 2 mL des entsprechenden Mediums (siehe Tabelle der Materialien) in jede Vertiefung einer Gewebekultur 6-Well-Platte. Inkubieren Sie Zellen bei 27 ° C für 20 min, Befestigung an der Platte zu fördern.
    Achtung: Zellkulturen sind eine potenzielle Biohazard. Arbeiten in einer zugelassenen Laminar-Flow-Haube mit aseptischen Techniken und institutionellen und staatliche Richtlinien für die empfohlene Schutzkleidung und ordnungsgemäße Entsorgung der Abfälle vor der Durchführung von Experimenten zu überprüfen.
  2. Fügen Sie nach Anhang 8 µL Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien), 100 µL der Medien für jede Vertiefung der 6 gut Platte wird in ein steriles Röhrchen transfiziert. 100 µL Medium in einer separaten steriles Röhrchen 6 μg Bacmid DNA hinzufügen. 5 min bei RT. kombinieren Sie die beiden Lösungen inkubieren und 45 min bei RT inkubieren
  3. Ersetzen Sie das Medium in den 6 Brunnen mit 2 mL frisches Medium. Fügen Sie die Mischung aus vorherigen Schritt zu jedem gut tropfenweise (200 µL pro Well). Schütteln Sie die Platte, um die Vermischung der Transfektion Lösung in das Medium zu gewährleisten.
    Hinweis: Nicht schwenken oder Schütteln der Plattenrandes, denn dadurch werden Zellen zu lösen.
  4. Inkubieren Sie Zellen für die 5D (120 h) in einem befeuchteten Inkubator von 27 ° C. Überprüfen Sie die GFP Fluoreszenz vor der Ernte, um sicherzustellen, dass das Virus in einem hohen Prozentsatz der Zellen produziert wird; Wenn der Prozentsatz gering ist, erweitern die Inkubationszeit bei Bedarf (siehe Abbildung 1).
  5. Der Überstand mit P1-Virus (ca. 2 mL aus jedem Brunnen) zu sammeln. Filtern Sie das Medium mit P1 Virus in 2-mL-Röhrchen mit einer 3 mL Spritze und kleinen 0,2 µm-Filter. Eine Endkonzentration von 1 % sterile fetalen bovine Serum (FBS) hinzufügen.
    Hinweis: Dieser Bestand des P1-Virus sollte bei 4 ° C gelagert werden und vor Licht geschützt werden.

(4) Infektion der Sf9 Insektenzellen mit Baculovirus P1, P2 Baculovirus zu produzieren

  1. Bereiten Sie 200 mL (oder gewünschte Lautstärke) Sf9 Zellen in einer Konzentration von 0,8 - 0,9 x 106 Zellen/mL in geeigneter Form (siehe Tabelle der Materialien) in einem flachen Boden Kultur Erlenmeyerkolben von ausreichender Größe.
    Hinweis: Für Suspensionskultur, sollten die verwendeten Volumen nicht 40 % der Gesamtkapazität des Kolbens überschreiten.
  2. Die Zellkultur Aussetzung Sf9 1:2500 Verhältnis (V/V) von P1 Virus bestand aus 3.5 hinzufügen. Die Zeit der optimalen Virus Ausdruck (in der Regel 48-120 h abhängig von der Protein-Konstrukt) bei 27 ° C in einem Orbitalschüttler bei 115 u/min inkubieren.
    Hinweis: Die relative Virus Ausdruck kann bestimmt werden, indem Sie Anzeigen der GFP-Fluoreszenz des Virus in einer Probe der Kultur.
  3. Die Zellsuspension für 40 min bei 11.520 X g Zentrifugieren und das überstand mit P2-Virus zu sammeln. Filtern Sie den Überstand mit Einweg-0,2 µm-Filter. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 0,5 % FBS.
    Hinweis: Dieser Bestand des P2-Virus sollte bei 4 ° C gelagert werden und vor Licht geschützt werden.
  4. Erhalten Sie einen Titer für die P2-Virus mit Sf9easy Zellen oder ein Virus-Zähler.

5. Infektion von HEK293 Säugerzellen mit P2 Baculovirus für groß angelegte Proteinexpression

  1. Bereiten Sie ein wünschenswert Volumen an HEK293 Säugerzelle Suspensionskultur (4-6 L empfiehlt sich für die Zubereitung von gefrorenen Grids) in einer Konzentration von 3,5-3,8 X 106 Zellen/mL im Ausdruck Medium (siehe Tabelle der Materialien) ergänzt mit 1 % (V / (V) sterile FBS in verblüfft unten Erlenmeyerkolben Kultur von ausreichender Größe.
    Hinweis: Für Suspensionskultur, sollten die verwendeten Volumen nicht 40 % des Gesamtvolumens des Kolbens überschreiten.
  2. Die HEK293 Zellen Suspensionskultur 8 % (V/V) von P2 Virus Stammlösung aus Schritt 4.3 hinzufügen. Inkubation bei 37 ° C in einem Orbitalschüttler bei 135 Umdrehungen pro Minute.
  3. Fügen Sie 10 mM Natrium Butyrat am 12-18 h nach der Infektion. Die Zeit des optimalen Protein-Expression (in der Regel 36-72 h) bei 30 ° c inkubieren
  4. Für 20 min bei 2.880 X gZentrifugieren, um Zellen zu ernten. Waschen Sie Zellen von resuspending in ca. 100 mL Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) pro Liter Zellen geerntet. Wieder für 20 min bei 2.880 X g Zentrifugieren Sie und sammeln Sie die Zelle Pellet.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Zelle Pellets können Snap in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° C bis zur Reinigung gelagert.
    Achtung: Flüssigstickstoff kryogene Verbrennungen oder Verletzungen verursachen. Es kann Erfrierungen verursachen. Es kann Sauerstoff verdrängen und zur raschen Erstickung führen. Tragen Sie kalten isolierende Handschuhe und Gesichtsschutz.
  5. Sammeln Sie kleine 1 mL Ernten zu unterschiedlichen Zeitpunkten und anderweitig für 2 h bei 4 ° C mit Schaukeln oder rühren in Anwesenheit von verschiedenen Wasch-und/oder Zusatzstoffen. Diese kleine ganze-solubilized Zellproben durch Ultrazentrifugation 235.000 × g für 10 min bei 4 ° C und laufen als 30 μl Probe auf eine Chromatographiesäule Größe-Ausschluss (SEC) geklärt werden können (siehe Tabelle der Materialien), um festzustellen, die beste Zeit für Ausdruck und die besten Solubilisierung Bedingungen.
    Hinweis: Im Falle von hTRPC3, dieses Screening enthalten verschiedene Puffer mit pH Werten von 4.0-9.5 und Salzkonzentrationen von 50-500 mM; verschiedene ionische Kompositionen (z. B. MgCl2 oder NaCl); verschiedene Reinigungsmittel mit kritischen Micelle (CMC) Konzentrationswerte von 0,1 - 20 mM; Verringerung der Zusätze wie Dithiothreitol, tris(2-carboxyethyl) Phosphin und β-Mercaptoethanol; und die Kalzium-chelatisierenden additive Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA).

6. Reinigung des hTRPC3 Proteins aus gefrorenen Zelle Pellet

  1. Tauen Sie das Pellet in Puffer mit 20 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF) 0,8 μM Aprotinin, 2 μg/mL Leupeptin, 2 mM Pepstatin A, und 1 % Digitonin, mit 100 mL Puffer pro Liter Zellen geerntet. Einmal aufgetaut, Homogenität der Lösung durch pipettieren und unter ständigem Rühren zu gewährleisten. Für 2 h bei 4 ° C in ein Becherglas eingetaucht in Eis mit einer Stir Bar rotierenden lösen lassen.
  2. Entfernen Sie die Zelle Ablagerungen durch Ultrazentrifugation 235.000 × g für 1 h bei 4 ° C. Protein-Menge durch Ausführen einer 30 μl Probe auf einem SEC-Spalte zu überprüfen (siehe Tabelle der Materialien) durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und visualisieren das Zielprotein von der GFP-Signalausgang.
  3. Inkubieren Sie das solubilized Protein (überstand) mit Kobalt Affinität Harz für 1-2 h bei 4 ° c Proteinbindung an das Harz durch Ausführen einer 30 μl Probe auf einem SEC-Spalte zu überprüfen.
    Hinweis: Wenn Proteinbindung aufgetreten ist, wird das GFP-tagged Protein-Ziel auf die Spalte, in der durchströmten nicht gefunden einbehalten. Kein Signal der GFP wird daher an der Position, die Zielgröße Protein entspricht, wenn der Durchfluss auf HPLC ausgeführt wird, vorhanden sein.
  4. Waschen Sie das Harz mit 10 Spalte Bände des Puffers (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol und 0,1 % Digitonin). Suchen Sie nach Proteinverlust durch Ausführen einer 30 μl Probe auf einem SEC-Spalte.
    Hinweis: Wenn Proteinverlust aus der Spalte aufgetreten ist, wird die GFP tagged Protein Ziel in der Waschpuffer gefunden werden, die über die Spalte übergeben hat. GFP-Signal wird daher an der Position, die Zielgröße Protein entspricht, wenn der Waschpuffer auf HPLC ausgeführt wird, vorhanden sein. Wenn Proteinverlust aufgetreten ist, müssen die Imidazol-Konzentration von den Waschpuffer abgesenkt werden, um zu verhindern, dass seine Tag-Bindung an die Spalte die Affinität zu stören.
  5. Die Harz-gebundene hTRPC3 mit Puffer (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol und 0,1 % Digitonin) eluieren. Hinzufügen von Thrombin an einem 01:20 Molverhältnis (um das GFP-Tag cleave) und der eluierten Probe 10 mM EDTA (ein hTRPC3 Stabilisierungsmittel) hinzufügen und 3 h bei 4 ° c inkubieren Überprüfen Sie, dass Protein 90 μL eine Probe verdünnt 1: 100 auf einer SEC-Spalte ausgeführt und überprüft das Vorhandensein von ein GLP-Signal an der Position entsprechend auf die Zielgröße Protein eluiert wurde hat.
    Hinweis: an dieser Stelle kann das Tryptophan-Signal vom Gesamt-Protein in der Elution auch angezeigt werden. Nur das Zielprotein Affinität gereinigt in der Elutions- und der GFP bleibt und Tryptophan-Signale werden in der Nähe im Profil identisch. Wenn das Zielprotein ist in großer Menge in der Elution nicht gesehen, aber war im Durchflussverfahren oder waschen nicht verloren, das Protein blieb wahrscheinlich an die Säule gebunden und kann mit einer höheren Konzentration von Imidazol im Puffer eluiert werden.
  6. Das Eluat zu 500 μL zu konzentrieren oder weniger in einem 15 mL 100K zentrifugale Filter von Spinnen bei 2.880 X g bei 4 ° C in Schritten von 5 min tube (siehe Tabelle der Materialien). Aufschwemmen des Proteins durch pipettieren die Lösung oben und unten zwischen den Spins um overconcentrating zu vermeiden.
    Hinweis: Zentrifuge Zeit kann verkürzt werden, da das Volumen der gewünschten Endvolumen nähert.
  7. Laden Sie das Konzentrat auf einer SEC-Spalte im Puffer (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,1 % Digitonin). Ausgeführt werden.
  8. Kombinieren Sie Gipfel Brüche mit den intakten TRPC3 Tetramer als visualisierte durch UV-Absorption-Signal, und konzentrieren uns wieder auf eine Endkonzentration von mindestens 5 mg/mL.

(7) Screening des Proteins von negativ-Fleck-Elektronen-Mikroskopie

  1. Die Glimmentladung Maschine einschalten. Stellen Sie das Programm für die Entladung von Kohlenstoff-beschichtete Raster mit Argon und Sauerstoff für 30 S. ausführen das Programm die Carbon-Beschichtung auf Kupfer 400-Mesh-Gitter vor der Zugabe der Proteinlösung hydrophilen vornehmen.
  2. Einrichten von fünf 40 μL Tropfen steriles Wasser und zwei 40 μL Tropfen 1 % Uranyl Formiat Lösung (auf Lab Film, Wachspapier oder eine ähnliche Oberfläche, siehe Tabelle der Materialien). Nehmen Sie das Raster aus Schritt 7.1 und fügen Sie 2,5 μL des Proteins Probe 5 mg/mL (50-200 μM), auf die dunkle Seite und lassen Sie es für 1 min.
  3. Trocknen Sie nach 1 min das Gitter mit Filterpapier. Berühren Sie das Filterpapier direkt an der Oberfläche nicht; Stattdessen bringen Sie das Papier an den Rand des flüssigen Tröpfchen und ermöglichen Sie haarartige Tätigkeit, die Flüssigkeit aus dem Netz ziehen in das Filterpapier zu.
  4. Tauchen Sie das Raster in ersten Tropfen Wasser. Mit Filterpapier trocknen und mit den restlichen Wassertropfen und der erste Tropfen Uranyl Formiat wiederholen. Lassen Sie der zweite Tropfen Uranyl Formiat für 1 min sitzen und anschließend mit Filterpapier. Erlauben Sie das Gitter, um voll Luft trocknen lassen (ca. 1 min) vor der Lagerung.
    Hinweis: Diese Färbung Protokoll ideal für alle Protein-Reinigungsmittel-Kombinationen möglicherweise nicht. Verschiedene Konzentrationen von Uranyl Formiat beflecken und unterschiedlich lange für die Fleck-Exposition sollte geprüft werden, wenn die oben genannten Schritte keinen Fleck mit gutem Kontrast bieten.
  5. Bild Rastern auf Elektronen-Mikroskop (siehe Tabelle der Materialien), die Protein-Partikel-Qualität zu überprüfen. Sicherzustellen, dass die Mikrographen zeigen zahlreiche Teilchen, die im allgemeinen Aussehen und Verteilung homogen sind, zeigen guten Kontrast und die prognostizierten Größe des Zielproteins.
  6. Vorläufige zu generieren, mit niedriger Auflösung, zweidimensionale (2D) Klassifikationen mit 50-100 Aufnahmen (siehe Datenverarbeitung – Schritt 10) zu überprüfen, ob die Partikel vertreten unterschiedliche Ansichten einer einzigen einheitlichen Struktur.
    Hinweis: Mikrographen und vorläufigen 2D Klassen von ausreichender Qualität, wie oben beschrieben, sind ein starkes Indiz dafür, dass das Protokoll ausreichend für Proteinreinigung optimiert wurde. Vorbereitung und Vorführung von Cryo-EM Gitter ist zu diesem Zeitpunkt gewährleistet.

8. EM Probenvorbereitung

  1. Glimmentladung ein gold löchrigen Kohlenstoff-Gitter (siehe Tabelle der Materialien), wie unter Punkt 7.1 beschrieben.
  2. Gelten Sie 2,5 μL der konzentrierten hTRPC3 Protein Probe (5 mg/mL) auf das Gitter. Tupfen Sie das Raster für 1.5 s mit ein Schandfleck zu zwingen, von 1 und einer Wartezeit von 5 s bei 100 % Luftfeuchtigkeit und 4 ° C, dann das Gitter stürzen flüssigem Ethan durch flüssigen Stickstoff mit einer Verglasung Maschine abgekühlt.
    Hinweis: Feuchtigkeit, Temperatur, Blot-Kraft, Blot Zeit und Wartezeit, die hier aufgeführt wurden für die Autoren hTRPC3 Studie19verwendet. Sie müssen möglicherweise geändert werden, um optimale Glaskörper Eis für andere Proteine und Waschmittel produzieren.
  3. Bildschirm eingefroren Grids für optimale Eisverhältnisse unter Verwendung eines Mikroskops Cryo-EM (siehe Tabelle der Materialien) und manuell Ansicht Regionen von dickem Eis (Planquadrate, die kleiner und dunkler erscheinen), dünne Eis (Planquadrate, die größer und heller erscheinen) und Medium Eis .
    Hinweis: Dickeres Eis hält oft mehr Partikel, während dünner Eis oft besseren Kontrast und Auflösung ergibt. Verwendung manueller Screening von Bildern zu bestimmen, die Eis Bedingungen führt eine große Anzahl von Prozess-Partikel mit gutem Kontrast und Auflösung. Sobald gute Bedingungen überprüft werden, verschieben Sie in Bildsammlung auf einem 300 kV Cryo-EM Mikroskop.

9. EM-Datenerfassung

  1. Mit einem automatisierten Übernahme Programm aufzeichnen Bild Stapel in Höchstauflösung Zählmodus gebinnten Pixel Größe 1,074 Å auf einem Elektronenmikroskop betrieben bei 300 kV mit einer nominalen Vergrößerung von 130.000 X direkte Elektron Detektors.
  2. Dosis-fraktionieren jedes Bild auf 40 Frames mit einer Gesamtbelichtungszeit von 8 s mit 0,2 s pro Frame und eine Dosisleistung von 6,76 e− Å s−2 −1 (geringe Unschärfe Werte von 1,0 bis 2,5 μm in der Autoren Experiment variiert).

10. EM Datenverarbeitung

  1. Korrektur der summiert Film Stapel22 Bewegung umsetzen und Unschärfe Werte23 mit der Datenverarbeitung Software zu schätzen (siehe Tabelle der Materialien)24.
  2. Wählen Sie Partikel aus den Mikrographen. Verwenden Sie diese Partikel aufgenommen, um eine erste Referenz-freie 2D Klassifikation mit der Software24zu konstruieren. Wählen Sie ideale 2D Klasse Durchschnittswerte für automatisierte Partikel Kommissionierung für den gesamten Datensatz als Vorlage verwenden.
  3. Manuell überprüfen Sie die Qualität der Partikel Auto abgeholt und entfernen Sie schlechte Partikel zu. Verwenden Sie mehrfache Umläufe der 2D Klassifikation, um ausgewählte Partikel bereinigen.
  4. Ein erstes Modell25zu generieren. Thema 2D aufgenommen Partikel, dreidimensionale (3D) Klassifizierung (ca. 5 Klassen) mit C1 Symmetrie und eine erste Rekonstruktion Tiefpass-Filter von 60 Å als ein Referenzmodell. Bestimmen Sie, welche Klassen hochauflösende Funktionen und Partikeln in eine solche Klasse zu kombinieren.
  5. Verfeinern Sie Partikel mit der lokalen Verfeinerung mit C4 Symmetrie (bei hTRPC3) angewendet und ein hochauflösende Grenzwert für Partikel Ausrichtung auf 4.5 Å26.

11. Modellbau

  1. Ein Modell zu bauen (siehe Tabelle der Materialien für die verwendete Software). Für hTRPC3, verwenden Sie die transmembrane Domäne (TMD) von transienten Rezeptor potenzielle Melastatin 4 (TRPM4) Struktur-Protein Data Bank (PDB) 5wp6 als ein Führer-27. Verwenden Sie sperrige Rückstände und Sekundärstruktur Vorhersage, de Novo Gebäude führt.
  2. Unterziehen Sie das ursprüngliche Modell Realraum Verfeinerung mit Sekundärstruktur Fesseln28. Manuell überprüfen Sie das verfeinerte Modell und remodify nach Bedarf (siehe Tabelle der Materialien für die verwendete Software).
  3. Gelten Sie Fourier-Shell Korrelation (FSC) Kurven um die Berechnung der Differenz zwischen dem endgültigen Modell und die EM-Karte für die Validierung der raffinierte Struktur. Bewerten die Geometrien der Atommodelle (siehe Tabelle der Materialien für die verwendete Software)29,30.

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Representative Results

Abbildung 1Azeigt einen schematischen Überblick über das Protokoll für die Expression und Reinigung des hTRPC3. Abbildung 1 bzeigt ein Bild der hTRPC3 Bacmid Platte mit idealer weiße Kolonien, ähnlich dem für Bacmid DNA-Reinigung, ausgewählt. Wir fanden, dass 48 h ideal für klare Bluo-gal-Färbung unter Beibehaltung der Präsenz der isolierten Kolonien. Höchstproduktion P2 Virus für hTRPC3, als visualisierte durch GFP Fluoreszenz, galt nach 4D der Infektion in Sf9 Insektenzellen (Abbildung 1).

P2 Baulovirus geerntet wurde, aus den Medien, ergänzt mit 1 % FBS, und verwendet, um eine Aussetzung der HEK293 Säugetier-Zellen infizieren. Natrium-Butyrat wurde hinzugefügt, um die infizierten Zellen 12-18 h nach dem Virus Protein Ausdruck20steigern. Zellen wurden dann für weitere 36 h bei 30 ° c inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und Löslichkeit und Stabilität Screening von FSEC (Abbildung 2A)21. Die Zellen wurden solubilisiert mit sieben verschiedenen Reinigungsmitteln mit CMC Werte von 0,01 - 20 mM bei einer Waschmittel Konzentration ungefähr 10 Mal den CMC-Wert. Nach der ganzen Zelle Solubilisierung Lyse Zellenrückstand durch Ultrazentrifugation entfernt wurde und der Überstand mit solubilisiert Protein wurde auf einer SEC-Spalte geladen und führen auf HPLC in n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside/Cholesteryl Hemisuccinate (DDM/CHS) Waschmittel-haltigen Puffer, absolute Löslichkeit und Volumen Höchstposition von hTRPC3 unter verschiedenen Bedingungen relativ zu einem TRPM4-Steuerelement (Abb. 2 b) zu vergleichen. Wir entschieden uns für DDM/CHS als den ersten laufenden Puffer zu verwenden, für die Proben in verschiedenen Detergenzien solubilisiert, weil DDM/CHS die am häufigsten ist Waschmittel, beim Lösen von der Strukturen der Membranproteine verwendet. Alle anderen Reinigungsmittel solubilisiert TRPC3 Proben zeigte Peak Positionen bei ca. 11,9 mL, die wahrscheinlich zu groß ist, weil die tetrameres Form des hTRPC3 ein kleineres Molekulargewicht als die Positive hat Kontrolle menschlichen TRPM4 (Abb. 2A und Abbildung 2 b).

Dennoch, da gab es keine Struktur TRPC Kanal Rezeptor, unsere Ergebnisse zu vergleichen und hohem Molekulargewicht von der Architektur der TRPC3 oder andere Faktoren verursacht werden könnte, führten wir eine kleine Reinigung des hTRPC3 mit 25 mL Zellen mit DDM/CHS in das Experiment als DDM/CHS gab die beste Löslichkeit von hTRPC3. Das SEC-Profil des hTRPC3 zeigte eine Monodisperse Spitze aber war noch in einer Peak-Position vertritt ein höheres Molekulargewicht als TRPM4 (Daten nicht gezeigt). Wir checkten das Protein in der Peak-Fraktion der SEC-Profil von negativ-Fleck EM, denn es eine schnelle Methode zur Überprüfung der Proteinqualität ist und eine sehr geringe Menge des Proteins erfordert. Im Schliffbild wurden Partikel mit zwei transmembranen Domänen im gleichen Teilchen beobachtet. Es zeigte sich, dass zwei Teilchen, die hTRPC3 in direkter Weise durch die Interaktion zwischen zwei cytosolischen Domänen (Abbildung 3D dimerized). Wir gehörten die reduzierenden Reagenzien Dithiothreitol (DTT) im Puffer für die zweite kleine Reinigung Reinigung in der Hoffnung, die Dimerisierung von hTRPC3 zu stören. In der Tat, erschien eine zweite Spitze mit geringeren Molekulargewicht von SEC Fraktionierung. Jedoch erschien zu klein, um eine intakte Tetramer werden die Partikel und zeigte keine Features der Membranproteine, z. B. eine transmembrane Domäne. Es stellte sich heraus, dass DDM/CHS keine geeignete Reinigungsmittel zur Reinigung von hTRPC3 war, trotz die beste Löslichkeit für hTRPC3 geben.

Anschließend versuchte ein milder Reinigungsmittel, Digitonin, um hTRPC3, solubilisieren und verglich es mit dem Protein in DDM/CHS solubilisiert. Hier haben wir zwei verschiedene laufende Puffer mit DDM/CHS und Digitonin, beziehungsweise. Dies war wichtig, angesichts der Tatsache, dass das Waschmittel im laufenden Puffer oft Proteinstabilität trägt und, die das Membranprotein kann instabil werden, beim Wechsel der Reinigungsmittel von Solubilisierung zu FSEC. Das Protein in Puffer mit Digitonin zeigte eine aussichtsreiche Gipfel Verschiebung in Richtung eine geringere Molekulargewicht als DDM/CHS oder Digitonin solubilisiert laufen. Das Protein von solubilisiert und laufen in Digitonin ergab den höchsten Gipfel in einer günstigen Position relativ zur Position der Positivkontrolle, menschliche TRPM4 (Abb. 3A). Dann zogen wir nach vorn durch eine kleine Reinigung mit 25 mL Zellen ausführen. Obwohl mehrere und breiten Gipfel wurden von SEC (Abb. 3 b), das Protein zeigte Features eines einzigen tetrameres hTRPC3 Kanals in 2D Klassifizierung von negativ-Fleck EM (Abbildung 3 und Abbildung 3D) beobachtet. Wir schließen, dass Digitonin ist ein ideales Reinigungsmittel zur Reinigung von hTRPC3.

Wir skalieren die Expression von hTRPC3 und eine mittlerer Reinigung mit 400 mL Zellen in Digitonin durchgeführt. Auf diese Weise hofften wir ausreichend Protein für ein paar gefrorene Netze ohne Medium und Waschmittel verschwendet einholen, bevor wir die endgültigen Bedingungen zur Reinigung von hTRPC3 in großem Maßstab herausgefunden. Es passiert oft, dass Membranproteine Instabilität bei hochkonzentriert für die Zubereitung von gefrorenen Raster zeigen. Gereinigten und konzentrierten Proteins nicht nur in Richtung einer höheren Molekulargewicht um FSEC verschoben, sondern zeigte auch lauten Hintergrund in Cryo-EM Raster abgebildet mit einem Elektronenmikroskop mit einer EMCCD Kamera ausgestattet. Obwohl wir die einzigen beobachten konnten, war intakt tetrameres Rezeptoren, hTRPC3 in Digitonin gereinigt nicht ideal für hochauflösende Cryo-EM Studien.

Um die Proteinstabilität weiter zu verbessern, haben wir eine große Anzahl von Bedingungen, die im Protokoll Schritt 5 beschrieben überprüft. Wir entschieden uns für Bildschirm Zusatzstoffe basierend auf den physiologischen Charakter des hTRPC3; zB., EDTA wurde ausgewählt, weil hTRPC3 durchlässig für Kalzium ist und entfernen das Kalzium kann das Protein stabilisieren. Aller Proben von FSEC läuft im Digitonin-haltigen Puffer getestet 10 mM EDTA zeigte eine bemerkenswerte Wirkung auf hTRPC3 in einer intakten tetrameres Peak-Position (Abb. 4A) zu stabilisieren. Es auch deutlich stieg die Zahl der Teilchen in der Cryo-EM Schliffbild und verringert das Rauschen im Hintergrund, wie in Abbildung 5dargestellt.

Nach der Identifizierung der idealen Bedingungen für Ausdruck und Reinigung, führten wir einen groß angelegte Ausdruck (2 L) hTRPC3. Die Zellen mit hTRPC3 wurden geerntet und dann solubilisiert. Ultrazentrifugen geklärt war lysate Metall-Affinität Spalte Reinigung durch Batch-Bindung mit einem Kobalt-Harz, gefolgt von Reinigung in einer Spalte der Schwerkraft ausgesetzt. Aufbewahrung von solubilisiert Protein innerhalb der Spalte und Elution von Affinität gereinigtes Protein aus der Spalte wurde durch FPLC (Abbildung 4 b) überprüft. Wir fanden, dass für hTRPC3, eine Imidazol-Konzentration von 15 mM in der Waschpuffer genügte, um kontaminierende Proteine mit unspezifischen Harz-Bindung zu entfernen, und 250 mM Imidazol in der Elution Puffer reichte aus, um die Mehrheit der solubilisiert hTRPC3 eluieren Protein an das Harz gebunden. Alle Proben wurden vom FSEC geprüft und eluierten Proteins zeigte ein scharf, Monodisperse Peak bei den richtigen Höchstposition. Als intrinsische Flexibilität zwischen den GFP-Tag und das hTRPC3-Protein kann die Ausrichtung der Eiweißteilchen während der Bildverarbeitung schwieriger machen, und da ein Thrombin-Spaltstelle zwischen GFP und hTRPC3 liegt, wir testeten eine kleine Menge gereinigt Protein bei verschiedenen Spaltung Zeiten mit Thrombin Protease. Angesichts der Tatsache, dass bei einer 01:20 eluierten Proteins mit Thrombin Molverhältnis angemessene Stabilität und komplette Spaltung nach 2 h bei 4 ° C zeigte inkubiert, wir gespalten aus der GFP aus dem gereinigten Protein mit den gleichen Bedingungen geprüft und mittels HPLC zu bestätigen, dass GFP c wurde Ompletely entfernt (Abbildung 4). Das Protein wurde weiter durch S gereinigt, und die Spaltung der GLP wieder visualisiert werden durch die Spitze Positionsverschiebung auf ein kleineres Molekulargewicht (Abbildung 4). Eine kleine unachtsame Probe aus der Hauptgipfel-Fraktion wurde verwendet, um Netze für negativ-Fleck EM machen. Alle Fraktionen mit der tetrameres hTRPC3 waren dann kombiniert und reconcentrated, eine Endkonzentration von 5 mg/mL, die verwendet wurde, um die Netze für Cryo-EM Imaging vorzubereiten. Wie wir haben beobachtet, dass ein Teil des Proteins noch nach und nach verlagerte sich in Richtung einer größeren Molekulargewicht wir erfasst nur die Brüche an den richtigen Molekulargewicht und fror die Netze unmittelbar nach Proteinreinigung. In der Regel haben wir die Reihenfolge der Experimente von Reinigung des Proteins zur Vorbereitung der gefrorenen Netze innerhalb eines Tages abgeschlossen.

Eine 2,5 μl Probe des gereinigten hTRPC3 Protein (Konzentration 5 mg/mL) wurde auf ein Glühen entladen löchrigen Kohlenstoff-Raster angewendet. Eine Verglasung Maschine wurde verwendet, um das Gitter, mit einem 1,5 bereiten s beflecken Zeit unter 100 % Luftfeuchtigkeit von einem Sprung in flüssigem Ethan gefolgt mit flüssigem Stickstoff gekühlt. Dieser Schritt friert die Probe in glasigen Eis für die Bildgebung. Bilder wurden aufgenommen bei 130.000 X geringe Vergrößerung durch ein Kryo-Elektronenmikroskop betrieben bei 300 kV. Bild-Stacks wurden in Höchstauflösung Zählmodus gebinnten Pixel Größe 1,074 Å und eine geringe Unschärfe-Wert von 1,0 bis 2,5 μm mit Hilfe eines direkten Elektron Detektors und automatisierte Datenerfassungs-Software aufgezeichnet. Jedes Bild wurde Dosis fraktioniert auf 40 Frames mit einer Gesamtbelichtungszeit von 8 s (0,2 s pro Bild) und eine Dosisleistung von 6,76 e− Å−2 s−1. Eine repräsentative Schliffbild aus diesem Datensatz ist in Abbildung 5dargestellt.

Bewegungskorrektur und Einschätzung der Unschärfe Werte der summierten Film Stacks wurde durchgeführt. Rund 200 resultierende Mikrographen dienten als Quelle für manuelle Partikel sammeln und erste Referenz-freie 2D Klassifizierung31. Neun repräsentative 2D Klasse Mittelwerte aus diesem vorläufigen Einstufung wurden ausgewählt und als Vorlage für die automatisierte Partikel Kommissionierung für den gesamten Datensatz verwendet. Eine manuelle Überprüfung der Autopicked Partikel wurde durchgeführt, um offensichtlich schlechte Partikel zu entfernen, dann drei Runden der 2D Klassifikation wurden eingesetzt, um die Auswahl der Autopicked Partikel (Abbildung 5) verfeinern. Diese 2D-Klasse ausgewählte Partikel wurden in fünf 3D Klassen mit einem Low-Pass-Filter von 60 eingeteilt Å als erste Referenzmodell. Diese fünf Klassen angezeigt nur eine hochauflösende Funktionen (Abbildung 5). Partikel aus dieser Klasse ausgesetzt waren weitere lokale Verfeinerung mit hoher Auflösung maximal 4,5 Å und C4 Symmetrie angewandt (Abbildung 5)32. Das verfeinerte Modell wurde manuell geprüft und remodified. Die feine Struktur wurde durch Berechnung der FSC Kurven um den Unterschied zwischen dem endgültigen Modell und EM-Karte bestimmen und durch Auswertung der Geometrien der Atommodelle33validiert.

Anfänglichen Modellbau erfolgte mittels der TMD-Domäne des TRPM4-Struktur (PDB 5wp6) als ein Führer-34. De Novo Gebäude des Modells der hTRPC3 wurde vor allem durch sperrige Rückstände und Sekundärstruktur Vorhersage, mit vielen α-Helices in der Struktur stark erleichtern Register Zuordnung geführt. In der ersten de-Novo-Modell gebaut, die Reihenfolge, Länge und Position der sekundären Strukturmerkmale und sperrige Rückstände sind in enger Abstimmung mit der Vorhersage. Während Verfeinerung fand die Auflösung auf eine untere Grenze als die Auflösung für die endgültige Rekonstruktion geschätzt. Dreidimensionale FSC wurde verwendet, um die normalisierte Kreuzkorrelation Koeffizient zwischen zwei unabhängig generierten 3D Karten (jeweils mit der Hälfte des Datensatzes) über entsprechende Schalen im Fourier Raum (als Funktion der Ortsfrequenz) zu messen. Wir Beschäftigten eine weiche Maske von 4.3 Å aus den Wiederaufbau und eine zusätzliche 4.3 Å Kosinus-Soft edge zusammen mit einem Tiefpass-Filter von 10 Å, dann verwendet der Goldstandard FSC 0.143 cutoff-Schwelle. Dies war für die endgültige Auflösung Berichterstellung verwendet.

Figure 1
Abbildung 1: Expression und Reinigung des hTRPC3 mit dem BacMam System. (A) schematische Verfahren für hTRPC3 Ausdruck und Reinigung. (B) Bacmid Kolonie Auswahl auf blau-weißen Kennzeichen Platte. Wählen Sie eine isolierte weiße Kolonie (schwarzer Pfeil), keine weiße Kolonie mit einem eingebetteten blauen Kolonie oder eine weiße Kolonie in Kontakt mit einer blauen Kolonie (rote Pfeile). (C) GLP Fluoreszenz von P2 Baculovirus in Sf9 Zellen unter 20 X Vergrößerung. Fluoreszenz sollte hell und auf der Zellmembran und/oder das Innere der Großteil der Zellen für eine potente Virus vorhanden sein. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Stabilität-Screening von hTRPC3 durch FSEC. (A) Waschmittel screening von hTRPC3. Das hTRPC3 war ganz-Zelle in einer Vielzahl von Reinigungsmitteln mit einer kritischen Micelle Konzentration von 0,01 - 20 mM solubilisiert und im DDM/CHS-haltigen Puffer ausgeführt wurde. Obwohl DDM/CHS die höchste Löslichkeit von hTRPC3 zeigt, scheint der Gipfel an der falschen Stelle, zu groß, um die tetrameres hTRPC3 werden (blaue Spur). (B) TRPM4-Steuerelement mit einem tetrameres Molekulargewicht von etwa 540 kDa, solubilisiert und laufen in DDM/CHS, hatte eine Elution Volumen von rund 12,9 mL, während TRPC3, mit einem tetrameres Molekulargewicht von etwa 400 kDa, solubilisiert und laufen im DDM/CHS hatte eine Elution Volumen von ca. 11,9 mL. Mit einem kleineren Molekulargewicht dürften die hTRPC3 haben eine Elution Volumen etwas größer als TRPM4, nicht etwas kleiner, was darauf hindeutet, dass DDM/CHS möglicherweise kein ideales Reinigungsmittel für hTRPC3 Solubilisierung und Reinigung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Waschmittel Puffer Screening von hTRPC3 durch FSEC. (A) Löslichkeit und Stabilität Test des hTRPC3 mit Digitonin. Digitonin wurde für die Solubilisierung und im laufenden Puffer getestet. Beachten Sie die Peak-Position des hTRPC3 Proteins solubilisiert in Digitonin verlagerte sich in Richtung einer größeren Elution Volumen im Vergleich zu dem Protein solubilisiert im DDM/CHS (gelbe Spur vs. blaue und rote Spuren). Erst die Kombination mit Digitonin in Solubilisierung und laufen Puffer zeigt die korrekte Größe des hTRPC3 von FSEC (gelbe Spur, Sternchen). (B) ähnlich wie die FSEC Ergebnisse der gesamten Zelle solubilisiert hTRPC3, Peak-Position des hTRPC3 Protein Affinität in Digitonin (rote Spur, 14 mL) verschoben auf ein größeres Elution Volumen im Vergleich zu den Protein-Affinität in DDM/CHS (blau gereinigt gereinigt Trace, 12 mL) SEC-Fraktionierung gemessen. (C) negativ-Fleck EM wurde verwendet, um die Qualität des gereinigten Protein vor Cryo-EM Datenerhebung zu überprüfen. Eine ideale Fleck sollten Partikel (rote Kreise) negativ gefärbt (erscheinen weiße) präsentieren und umgeben von einem Waschmittel Ring (erscheinen schwarze). Ein Vertreter, ideale Schliffbild, in denen diese Partikel reichlich vorhanden sind, Prozess und Gegenwart in mehreren Ausrichtungen wird angezeigt. (D) Qualitätsdaten von negativ-Fleck EM soll eine klare und einheitliche allgemeine Architektur 2D Klassen und mehrere Ausrichtungen des Proteins, mit Durchschnittswerten enthalten und zentriert innerhalb der Maske (schwarzer Kreis) umfassen sollte. 2D Klassen von negativ-Fleck EM Mikrographen hTRPC3 solubilisiert im DDM/CHS vorliegenden Partikel, die ein Kopf an Kopf Dimerisierung von hTRPC3 Monomere zu sein scheinen. Im Gegensatz dazu ergibt sich eine grobe (aber klare und einheitliche) insgesamt Eichel tetrameres Struktur in 2D Klassen aus negativ-Fleck EM Mikrographen von hTRPC3 in Digitonin solubilisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Reinigung von hTRPC3. (A) Stabilität Testen des hTRPC3 im Beisein von EDTA. hTRPC3 wurde in Digitonin in der Gegenwart (rote Spur) oder Abwesenheit (blaue Spur) von 10 mM EDTA solubilisiert. Erstere zeigte eine Einzel- und schmalere Spitze an der Tetramer-Protein-Position (rote Spur, Sternchen), darauf hinweist, dass EDTA hTRPC3 in seine tetrameres Konformation stabilisiert. (B) GLP Fluoreszenz-signal FSEC für hTRPC3 in Digitonin solubilisiert und im Digitonin Puffer ausgeführt. Der Tetramer-Gipfel wird im solubilized Material vor Metall-Affinität Spalte Reinigung (blaue Spur, Sternchen) beobachtet. Das Fehlen von diesem Gipfel im Durchflussverfahren Bruch zeigt eine vollständige Bindung des hTRPC3-Proteins in der Affinität Spalte (rote Spur). Nach der Elution von Imidazol wurden die Fraktionen in der Elution Gipfel von FSEC (grüne Spur) überprüft. Alle Fraktionen zeigt intakten Tetramer Gipfel wurden für weitere Reinigung gesammelt. (C) Prüfung der GFP Spaltung von hTRPC3 mit Thrombin. Aufschlusszeit wurde getestet, mit einem kleinen Betrag des Proteins bei 4 ° C, und die Vollständigkeit der Verdauung wurde von FSEC überprüft. In jeder Spur die Spitze auf der linken Seite entspricht der hTRPC3-Tetramer-Gipfel (Sternchen) und die Spitze auf der rechten Seite ist der kostenlose GLP-Gipfel. Mit zunehmender Länge der Verdauung verringerte sich das Verhältnis von tetrameres Protein GFP zu befreien, darauf hinweist, dass die GFP wurde von dem Protein gespalten wird. Die 2 h Verdauung zeigt eine komplette Spaltung der GFP. (D) SEC Profil der hTRPC3 vor oder nach der Verdauung Thrombin in Digitonin mit 10 mM Puffer mit hinzugefügt EDTA. Wie erwartet, ist der Peak-Position in Richtung das geringere Volumen der Elution nach Thrombin Verdauung (rote Spur) verschoben. Der Hauptgipfel (Sternchen) repräsentiert die tetrameres hTRPC3. Die Brüche zwischen roten Linien wurden für Cryo-EM Experimente gesammelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Schematische der Cryo-EM Datenerhebung und-Verarbeitung für hTRPC3. Die Sammlung von 3.660 Film Stapel von gereinigten hTRPC3 erfolgte mit Hilfe eines Elektronenmikroskops mit einem direkten Elektron-Detektor. Wiederum 3.580 Mikrographen wurden Bewegungskorrektur und manuelle Auswahl angewandt. Partikel wurden Autopicked und 2D Klassifizierung unterzogen. 2D Klassen wurden durch 3D Klassifikation weiter verfeinert. Nur jeder fünfte 3D Klassen angezeigt hochauflösende Funktionen. Diese Klasse wurde für 3D Verfeinerung und Frealign lokalen Verfeinerung, wodurch eine Struktur für hTRPC3 bei 3,3 Å Auflösung ausgewählt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Strukturaufklärung von Proteinen durch Cryo-EM revolutioniert den Bereich der Strukturbiologie in den letzten Jahren, dank der Entwicklung von neuen Kameras und Algorithmen, die erheblich beschleunigt die Strukturaufklärung von Proteinen, die nicht kristallisieren Sie leicht, besonders Membranproteine. Trotz aller Fortschritte in der Cryo-EM-Technik bleibt die Vorbereitung der gereinigten Proteine in Qualität und Quantität ausreichend qualitativ hochwertige Bildgebung oft Erleichterung zeitaufwendig, teuer und schwierig. Die Fähigkeit, schnell zu äußern und Bildschirm mehrere gen unter den unterschiedlichsten Bedingungen Reinigung, konstruiert verbessert wie im obigen Protokoll beschrieben die Effizienz dieses Prozesses ermöglicht die schnelle und kostengünstige Produktion von qualitativ hochwertigen gereinigtes Protein für Cryo-EM Studien.

Während die hier beschriebene Methode eine Möglichkeit bietet, große Mengen von Säugetieren Membranproteinen zu geringeren Kosten als durch direkte Transfektion zu reinigen und schneller als durch Erzeugung einer stabil transfizierte Zelllinie, es viele Schritte hat, von denen jeder optimiert werden muss bieten Sie einen hochwertiges Eiweiß-Ertrag. Innerhalb der biochemischen Techniken verwendet, um zu produzieren und hTRPC3 zu reinigen gibt es eine Reihe von kritischen Schritte und Checkpoints. Die ersten kritischen Kontrollpunkt ist die Produktion von Bacmid DNA. Wie in den Ergebnissen beschrieben, ist ideale Kolonie Auswahl der erste Schritt in eine Qualität Virus-Generation für Protein-Expression. Darüber hinaus ist die Konzentration von Bacmid DNA gereinigt von der ausgewählten Kolonie weniger als 1 μg/μL, wird das resultierende Virus nicht für robuste Proteinexpression ausreichen. Der zweite kritische Prüfpunkt ist die Produktion von P1 und P2 Baculovirus. Virustiter von GFP Fluoreszenz, geschätzt werden kann, wie in Abbildung 1 dargestellt oder gemessen werden, wie von Coleman Et Al. beschrieben 35. neben viralen Titer, ein zeitlichen Verlauf der Infektion Zeit für jedes neue Konstrukt zu bestimmen, der optimale Zeitpunkt der Infektion für maximale Proteinexpression unternommen werden. Kritischer Kontrollpunkt drei ist die Löslichkeit und Stabilität Screening in Abbildung 2dargestellt. Waschmittel mit einem hohen CMC wie DDM, können hohe Löslichkeit, aber sie sind nicht ideal für Cryo-EM imaging, weil sie in einer Fülle von kontaminierenden Micellen führen können. Ein milder Reinigungsmittel, wie Digitonin, bieten ausreichende Löslichkeit, unter Beibehaltung der Proteinstabilität. Das Screening von Zusatzstoffen, wie z. B. EDTA bei hTRPC3, ist wichtig für eine Reinigung-Bedingung, die intakt und homogene Protein, wahrscheinlich indem das Kalzium aus hTRPC3, die ist durchlässig für Kalzium führt zu entdecken. Kritischer Kontrollpunkt vier ist die Überprüfung der gezielt und effizient Protein-Aufnahme während der Affinitätsreinigung Spalte und die Beobachtung von einem idealen Protein Peak bei SEC-Fraktionierung (Abbildung 4). Vermeidung der Aufnahme von kontaminierenden Eiweißteilchen unter Beibehaltung aller das Zielprotein ist entscheidend für Hochzinsanleihen Proteinquelle für Cryo-EM Bildgebung zu erhalten. Änderung der Batch-Bindung Zeit und Verhältnis von Harz solubilisiert Protein kann Protein Aufbewahrung die Spalte "Harz" beitragen. Die Gesamtqualität des SEC-Fraktionierung Peak ist nach unserer Erfahrung das beste Kennzeichen vor der Bildgebung, die Qualität des gereinigten Eiweißteilchen. Eine niedrige oder eine breite Spitze während SEC-Fraktionierung zeigt mögliche Probleme zu wenig Protein-Partikel pro Bild oder das Vorhandensein von kontaminierenden Protein Aggregation/Abbauprodukte, beziehungsweise. Darüber hinaus Änderungen an der Affinität-Tag in das Konstrukt selbst hat sich als notwendig erwiesen in einigen Fällen um ausreichende Affinität-Tag Bindung zu gewährleisten. Der letzte Kontrollpunkt vor der Entnahme von Cryo-EM Datensätzen ist die Überprüfung der Partikel Proteinqualität von negativ-Fleck EM. Zwar nicht unbedingt notwendig, finden wir, dass dies eine hervorragende Gelegenheit, vor Ort und korrekte Protein Qualitätsprobleme vor einer Investition in die Zeit- und kostenintensive Prozess des Sammelns von Daten durch Cryo-EM bietet.

Eine alternative Methode zur Herstellung von Protein für Cryo-EM strukturelle Studien ist die direkte Reinigung des Proteins aus der Heimat Gewebe-Quelle. Während diese Methode häufig Probleme mit der Proteinausbeute trifft, ist es eine ausgezeichnete Alternative für Proteine, die in den Zellen sehr reichlich vorhanden sind oder vorhanden, die als Teil eines großen Multi-Protein-komplexes, die schwierig sein kann, produzieren eine rekombinante Überexpression System-36. Jedoch für einzelne Proteine in moderate oder geringe Mengen unter physiologischen Bedingungen, der hier vorgestellten Ausdruck und Reinigung System ist ein leistungsfähiges, relativ kostengünstige und High-Yield-Verfahren zur Herstellung von gereinigt Säugetier-Membranprotein für Cryo-EM strukturelle Studien. Eine Methode, die stark ergänzen könnte, die hier vorgestellt wird die Rekonstruktion des gereinigten Protein in Lipid-Nanodiscs vor der Cryo-EM Daten Sammlung37. Bei dieser Methode sind die Proteine eingebettet in eine kleine Scheibe des Lipid Bilayer, wahrscheinlich bietet eine Native-Like Mikroumgebung im Vergleich zu Waschmittel Micellen, zwar gibt es bisher keine Beweise, die die Strukturen aufgelöst in Waschmittel und nanodisc verschiedenen38,39,40. Ein anderer Ansatz ist, extrahieren das Protein direkt über amphipathische Polymere wie Styrol Maleinsäure Anhydrid (SMA), die zur Bestimmung der Membran-Protein-Strukturen-41,-42erfolgreich verwendet worden ist.

Diese Ansätze beschrieben in diesem Manuskript erwiesen sich bereitwillig anpassungsfähig in unserem Labor zu einer Vielzahl von anderen Säugetieren Membranproteinen über Ionenkanäle. Daher glauben wir, dass dieses Protokoll ein wertvolles Instrument für die strukturellen und funktionellen Analysen sein wird, die hohe Spezifität gezielte Wirkstoffdesign zugrunde liegen. Dies wird in Neurodegenerative Erkrankung, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs, in welche Ion Kanäle schwierig aber High Potentials Drogeziele sind besonders nützlich sein.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

G. Zhao und X. Meng danken wir für die Unterstützung bei der Erfassung der Daten auf die David Van Andel Advanced Cryo-Elektron Mikroskopie-Suite. Wir freuen uns über die VARI High-Performance-Computing-Team für computational Unterstützung. Wir geben unseren Dank an N. Clemente, D. Gebühren, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth und Z. Ruan für Kommentare, die diese Handschrift stark verbessert. Wir danken D. Nadziejka für redaktionelle Unterstützung für diese Handschrift. Diese Arbeit wurde unterstützt durch interne VARI Finanzierung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent - to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model

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References

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Biochemie Ausgabe 143 Ionenkanal Membranprotein Proteinreinigung Strukturaufklärung Kryo-Elektronenmikroskopie Cryo-EM baculovirus
Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie
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Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun,… More

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).

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