Summary
이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.
Abstract
정식 TRP subfamily의 일시적인 수용 체 잠재력 채널 (TRPCs)은 비선택적 양이온 채널 칼슘 항상성 기능을 유지 하기 위해 중요 한 특히 저장소 운영 칼슘 항목에서에서 필수적인 역할을 시 냅 시스 소포 방출 하 고 세포내 신호 통로입니다. 따라서, TRPC 채널 다양 한 심장 비 대 등 심장 혈관 질환, 파 킨 슨 병 같은 신경 퇴행 성 질환, 척 증과 같은 신경학 적 장애 등 인간의 질병에에서 연루 되었습니다. 따라서, TRPC 채널 인간의 질병에 잠재적인 pharmacologic 대상을 나타냅니다. 그러나,이 채널에서 게이팅의 분자 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 균질, 안정적이 고 순화 된 단백질의 대량 취득에 어려움 특히 TRPC 이온 채널 등 포유류 막 단백질에 대 한 구조 결정 연구에 제한 요인이 되었습니다. 여기, 선물이 포유류 이온 채널 막 단백질 선호도 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수정 된 잠재 유전자 전달 시스템 및 이러한 단백질의 정화를 사용 하 여 대규모 표현 위한 프로토콜. 선물이 더 순화 된 단백질에서 단일 입자 cryo 전자 현미경 이미지를 수집 하 고 이러한 이미지를 사용 하 여 단백질 구조를 결정 하는 프로토콜. 구조 결정 게이팅 및 기능 이온 채널의 메커니즘을 이해 하는 강력한 방법입니다.
Introduction
칼슘 신호 폭포, 녹음 제어, 신경 전달 물질 방출, 및 호르몬 분자 합성1,2,3등 가장 세포질 과정에서 포함 된다. 무료 cytosolic 칼슘의 항상성 유지 건강 및 세포의 기능에 결정적 이다. 세포내 칼슘 항상성의 주요 메커니즘 중 하나는 칼슘 저장소 운영 항목 (SOCE)는 칼슘의 소모에에서 저장 된 바인딩과 그물 (응급실) 트리거 이온 채널 개방 촉진 하기 위하여 플라즈마 멤브레인에 프로세스는 4,,56더 신호에 사용할 수 있는 ER 칼슘 보충 TRP superfamily 속하는 칼슘 침투성 채널은 일시적인 수용 체 잠재력 채널 (TRPCs), SOCE7,,89 에 주요 참여자로 확인 되었습니다.
TRPC 가족에서 7 멤버 중 TRPC3, TRPC6, 및 TRPC7 homologue 하위 그룹을 형성 하 고 지질 보조 메신저 diacylglycerol (DAG)의 신호 지질 저하 제품에 의해 활성화 될 수 있는 고유 phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3은 매우 부드러운 근육에 영향 neurotransmission 및 성체12,13칼슘 신호에서 필수적인 역할을 재생 하는 두뇌의 대뇌와 소 뇌 영역에 표시 됩니다. TRPC3의 부전 중앙 신 경계 질환, 심혈 관 질환 및 난소 선 암14,,1516등 특정 암에 연결 되었습니다. 따라서, TRPC3는 이러한 질병의 치료에 대 한 제약 대상으로 약속을 보유 하고있다. TRPC3에 특별히 대상된 약물의 개발 등 지질 바인딩 사이트17,18, 분자 활성화 메커니즘의 이해의 부족에 의해 제한 되었습니다. 우리 보고 인간 TRPC3 채널 (hTRPC3)와 닫힌된 상태에 그것의 2 개의 지질 바인딩 사이트의 첫 번째 원자 해결책 구조19이러한 메커니즘 대 한 중요 한 통찰력을 제공.
높은 해상도에서 막 단백질의 구조를 결정 하기 위한 핵심 요소는 높은 품질의 단백질을 얻을 것입니다. 표현과 정화 조건 고품질 단백질을 얻기 위해 필요한의 해당 검사는 시간과 비용이 많이 드는 노력 될 수 있습니다. 여기 우리는 어떻게 우리가 식별 표현과 hTRPC3, 우리의 초기 심사에서 가난 하 게 행동의 정화에 대 한 최적의 조건을 자세히 설명 하는 프로토콜을 제시. 우리는 해결 하 고 누워 우리의 cryo 전자에 대 한 견고한 기초 현미경 (cryo-EM) 연구 하는 단백질 동작을 최적화 하는 방법에 몇 가지 핵심 포인트를 제시. 수정된 baculoviral 생성 하는 벡터 (pEG), Gouaux와 동료에 의해 개발 된 심사 분석 및 포유류 세포20에 잠재의 효율적인 생성에 대 한 최적화를 사용 합니다. 이 식은 메서드는 포유류 세포 막에 있는 단백질의 신속 하 고 비용 효율적인 overexpression에 적합 합니다. 우리는의 사용이 형광 검출 크기-배제 크로마토그래피 기반이 벡터 (FSEC) 방법21prescreening를 결합 한다. 이 메서드와 관심의 구조를 융합 하는 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그를 사용 하 여 작은, 전체 셀 solubilized 샘플에서 대상 단백질의 시각화를 향상 시킵니다. 이 다른 세제 및 첨가물, thermostabilizing 돌연변이와 단백질 안정성의 심사 가능 하며 소규모 과도 transfection에서 세포의 작은 숫자의 사용을 허용 한다. 이 방법에서는, 다양 한 조건 수 빠르게 상영 대규모 단백질 정화로 이동 하기 전에. 다음 식, 심사, 그리고 정화, 선물이 및 곳을 알아내는-EM 생성 단백질의 de novo 구조 결심 하에서 이미지를 처리 하는 프로토콜. 우리는 여기에 설명 된 방법을 일반화할 프로토콜 TRP 채널 수용 체와 다른 막 단백질의 구조 연구로 될 것입니다 믿습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DH10α Bacmid DNA를 생산 하기 위해 유능한 세포의 변화
- 관심사의 유전자를 합성 하 고 N terminus (pFastBacI)20에서 트 롬 빈 분열 사이트와 트윈 strep 태그, His8-태그 및 GFP를 포함 하는 말뚝 벡터의 수정된 된 버전으로 그것을 subclone.
- 5 추가 하 여 유능한 세포를 변형 세포 1.5 ml에서 튜브와 얼음에 10 분 동안 품 어 DH10α의 50 μ에 pFastBacI에 원하는 유전자를 포함 하는 플라스 미드의 ng. 열 충격 45 셀 42 ° c.에 s 튜브에 catabolic 진압 (SOC) 매체와 슈퍼 최적의 국물의 200 μ를 추가 하 고 4-8 h 225 rpm에서 궤도 셰이 커에서 37 ° C에서 품 어.
- 플레이트 bacmid 파운드 한 천 배지 (50 μ g/mL 대, 7 μ g/mL gentamicin, 10 μ g/mL 항생물질, 100 μ g/mL Bluo-여자, 및 40 μ g/mL 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], 한 천)에 있는 셀의 5 μ.
- 37 ° c.에서 48 h에 대 한 접시를 품 어
참고: 여전히 lacZ (벡터 삽입 실패), 표현 하는 Bluo-여자 표시기 얼룩 식민지 흰색 (성공적으로 변환된) 식민지의 선택에 대 한 허용. - 신중 하 게 블루 식민지, 접촉 하 고 bacmid 파운드 매체 (50 μ g/mL 대, 7 μ g/mL gentamicin, 10 μ g/mL 항생물질) 225 rpm에서 궤도 셰이 커에서 37 ° C에서의 6 mL에서 하룻밤 세포 성장 어떤 백색 식민지를 피하고 고립 된 백색 식민지를 선택 합니다.
2. 세균 대비 Bacmid DNA의 분리
- Bacmid DNA를 분리, 2880 x g에서 10 분 동안 대장균 세포 아래로 회전 합니다.
- Resuspend는 miniprep에서 셀 물의 resuspension 솔루션의 200 µ L에서 펠 릿 하 고 상쾌한 키트 ( 재료의 표참조) pipetting으로 삭제 합니다. 펠 릿은 완전히 그리고 homogenously 일시 중단 해야 합니다. 그런 다음, 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
- 몇 번 튜브를 거꾸로 하 여 miniprep 키트 및 혼합에서 세포 세포의 용 해 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다. 최대 5 분 실 온 (RT) 세포를 lyse에서 품 어. 중화 솔루션의 200 µ L에서 추가 miniprep 키트 및 혼합 몇 번 튜브를 거꾸로 하 여 세포 반응을 중지 하.
- 탁상 원심 분리기에서 21,130 x g 에서 10 분 동안 아래로 회전 합니다. 2 mL 튜브에 상쾌한의 600 μ를 수집 합니다. 600 μ 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 해결책을 추가 하십시오 ( 재료의 표참조) 및 혼합 철저 하 게 세포 세포의 용 해 제품의 나머지에서 DNA를 추출.
주의: 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 해결책은 흡입, 피부 접촉에 의해 독성을 삼 킨 경우. 그것은 화학 화상을 일으킬 수 있습니다. 있으며 발암 성 수 있습니다. 착용 장갑 및 buttoned 연구실 코트. 증기 두건에서 작동 합니다. 이 유해 폐기물의 적절 하 게 처분. - 탁상 원심 분리기에서 21130 x g 에서 10 분 동안 튜브를 회전 합니다. 액체 단계에 표시 됩니다. 신중 하 게 새로운 튜브를 위 수성 단계의 300 μ를 전송 합니다. DNA를 씻어 100% 에탄올의 600 μ를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 튜브 반전.
참고:이 bacmid DNA 전단 수로 소용돌이 하지 마십시오. - 10 분-20 ° C 냉장고에 배치 하 여 멋진 튜브 탁상 원심 분리기에서 21,130 x g 에서 10 분 동안 아래로 회전 합니다. 삭제는 상쾌한 고 DNA 펠 릿을 보존 한다.
- 펠 릿을 세척을 70% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 튜브 반전. 탁상용 원심 분리기에서 21,130 x g 에서 10 분에 대 한 스핀. 삭제는 상쾌한 고 아무 액체 튜브에서 볼 수 있으며 DNA 펠 릿 반투명 됩니다 때까지 약 5 분 또는 건조 공기에 펠 릿을 허용.
- 살 균, DNase 무료 50 µ L에서 건조 펠 릿 resuspend, 저온. DNA 농도 측정 합니다.
참고: bacmid DNA를 고정 하지 마십시오. 몇 일까지 4 ° C에서 저장 합니다.
3. P1 잠재 생산 하는 Bacmid와 Sf9 곤충 세포의 transfection
- 시드 0.9 x 106 Sf9 셀/잘 적절 한 매체의 2 ml에서 ( 재료의 표참조)에 6 잘 조직 배양 플레이트의 각 잘. 셀 20 분 접시에 부착 홍보 27 ° C에서 품 어.
주의: 세포 배양은 잠재적인 생물. 무 균 기술을 사용 하 여 승인 된 층 류 두건 및 권장된 보호 의류와 실험을 수행 하기 전에 폐기물의 적절 한 처리에 대 한 기관 및 정부 지침을 확인 합니다. - 첨부 파일, 후 8 µ L transfection 시 약의 추가 ( 재료의 표참조)는 6의 각 음에 대 한 미디어의 100 µ L을 무 균 튜브에 페 되 고 접시 잘. 별도 무 균 튜브에 매체의 100 µ L를 bacmid DNA의 6 μ g를 추가 합니다. 실시간 결합 두 솔루션에서 5 분을 품 어 및 실시간에 45 분 동안 품 어
- 6 우물에서 매체를 2 mL 신선한 매체의 바꿉니다. 혼합 추가 이전 단계에서 각각 잘 dropwise (잘 당 200 µ L). 부드럽게 transfection 솔루션의 매체에 혼합 되도록 접시 바위.
참고: 소용돌이 하거나 분리 하려면 셀이 때문에 접시를 흔들 없습니다. - 27 ° C 습도 인큐베이터에서 5 d (120 h)에 대 한 셀을 품 어. 그 바이러스는 세포;의 큰 비율에 생산 되는 확인 하려면 수확 전에 GFP 형광을 확인 비율이 낮은 경우에, 필요에 따라 보육 시간을 연장 ( 그림 1C참조).
- 표면에 뜨는 포함 P1 바이러스 (각 우물에서 약 2 mL)를 수집 합니다. P1 바이러스 3 mL 주사기와 작은 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 2 mL 튜브에 들어 있는 매체를 필터링 합니다. 1%의 최종 농도에 메 마른 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 추가 합니다.
참고: P1 바이러스의이 주식 4 ° C에서 저장 되어야 하 고 빛 으로부터 보호.
4. P2 잠재 생산 P1 잠재 된 Sf9 곤충 세포의 감염
- 200 mL (또는 원하는 볼륨) 0.8의 농도에서 Sf9 셀의-적절 한 매체에서 106 셀/mL x 0.9 준비 ( 재료의 표참조)에 충분 한 크기의 평면 하단 삼각 문화 플라스 크.
참고: 서 스 펜 션 문화에 대 한 사용 하는 볼륨 넘지 말아야 한다 40% 총 용량의 플라스 크의. - Sf9 셀 서 스 펜 션 문화를 3.5에서 P1 바이러스 주식의 1: 2500 비율 (v/v)를 추가 합니다. 최적의 바이러스 식 (단백질 구조에 따라 보통 48-120 h)의 시간에 대 한 115 rpm에서 궤도 셰이 커에 27 ° C에서 품 어.
참고: 상대 바이러스 식 문화권의 샘플에서 바이러스의 GFP 형광을 확인 하 여 확인할 수 있습니다. - 11,520 x g 에서 40 분 동안 세포 현 탁 액을 원심을 표면에 뜨는 포함 P2 바이러스를 수집 합니다. 상쾌한 일회용 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 필터링 합니다. 0.5%의 최종 농도에 FBS를 추가 합니다.
참고: P2 바이러스의이 주식 4 ° C에서 저장 되어야 하 고 빛 으로부터 보호. - Sf9easy 셀 또는 바이러스 카운터를 사용 하 여 P2 바이러스 titer를 가져옵니다.
5. 대규모 단백질 표정에 대 한 P2 잠재 HEK293 포유류 세포의 감염
- HEK293 포유류 세포 현 탁 액 문화 (4-6 L 냉동된 격자의 준비에 대 한 권장) 3.5-3.8 x의 농도에서 바람직한 볼륨 준비 106 셀/mL 식 중간에 1%와 보충 ( 재료의 표참조) (v / v) 살 균 FBS 당황 하단 삼각에 충분 한 크기의 플라스 크 문화.
참고: 서 스 펜 션 문화에 대 한 사용 하는 볼륨 넘지 말아야 한다 플라스 크의 총 볼륨의 40%. - HEK293 세포 현 탁 액 문화 단계 4.3에서에서 P2 바이러스 재고 솔루션의 8% (v/v)를 추가 합니다. 135 rpm에서 궤도 셰이 커에서 37 ° C에서 품 어.
- 감염 된 후 12-18 h에 10mm 나트륨 낙 산 염을 추가 합니다. 최적의 단백질 식 (보통 36 ~ 72 h) 30 ° c.의 동안 품 어
- 2880 x g에서 20 분 동안 centrifuging 여 세포를 수확. 약 100 mL tris 버퍼 염 분 (TBS) 수확 하는 셀의 리터 당에 resuspending에 의해 세포를 씻어. 2880 x g 에서 20 분 동안 다시 원심 고 셀 펠 릿을 수집 합니다.
참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기. 셀 펠 릿 스냅-액체 질소에서 냉동 고 정화까지-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
주의: 액체 질소는 저온 화상 이나 상해를 일으킬 수 있습니다. 그것은 동상을 발생할 수 있습니다. 그것은 산소를 치환 하 고 급속 한 질을 일으킬 수 있습니다. 차가운 보 온 장갑과 얼굴 방패를 착용. - 다양 한 시간 지점에서 작은 1 mL 수확을 수집 하 고 락 또는 다른 세제 및 첨가물의 교 반 4 ° C에서 2 h solubilize. 이러한 작은 전체 셀 solubilized 샘플 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 열에 30 μ 견본으로 4 ° C와 실행에서 10 분 동안 235000 × g 에서 ultracentrifugation에 의해 명확히 ( 재료의 표참조)에 대 한 최고의 시간을 결정 하 식 하 고 최고의 가용 화 조건입니다.
참고: hTRPC3, 경우이 검사 포함 4.0-9.5와 50-500 m m;의 소금 농도 pH 값을 가진 다른 버퍼 다른 이온 구성 (예: MgCl2 또는 NaCl); 다른 세제 임계 micelle 농도 (CMC) 값은 0.1-20 m m; dithiothreitol, 등 첨가물을 줄이는 tris(2-carboxyethyl) phosphine, 및 β-mercaptoethanol; 칼슘-킬레이트 화와 첨가제 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA).
6. 냉동 셀 펠 릿에서 hTRPC3 단백질의 정화
- 500 mM NaCl, 1 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF), 0.8 μ M aprotinin, 2 μ g/mL leupeptin, 2 mM pepstatin A, 20 mM Tris (pH 8.0)를 포함 하는 버퍼에 펠 릿을 녹여 그리고 1 %digitonin, 셀의 리터 당 버퍼의 100 mL를 사용 하 여 수확. 일단 해 동, pipetting 또는 교 반에 의해 솔루션의 동질성을 확인 합니다. 저 어 바 회전 얼음에 비 커에 4 ° C에서 2 h solubilize 허용 합니다.
- 4 ° c.에서 1 h 235000 × g 에서 ultracentrifugation에 의해 세포 파편을 제거 SEC 열에서 30 μ 샘플을 실행 하 여 단백질 수량 확인 ( 재료의 표참조) 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 대상 단백질 GFP 신호 출력으로 시각화.
- 1-2 h 4 ° c.에 대 한 코발트 선호도 수 지 (표면에 뜨는) solubilized 단백질을 품 어 SEC 열에서 30 μ 샘플을 실행 하 여 수 지에 단백질의 바인딩을 확인 합니다.
참고: 단백질 바인딩 발생 하면 GFP 태그 단백질 대상 통해 흐름에 없는 열에 유지 됩니다. 따라서, GFP 신호 흐름 통해 HPLC에서 실행 될 때 대상 단백질 크기에 해당 하는 위치에 현재 있을 것입니다. - 워시 버퍼 (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 15mm 이미, 및 0.1 %digitonin)의 10 열 량 수 지. SEC 열에서 30 μ 샘플을 실행 하 여 단백질 손실에 대 한 확인 합니다.
참고: 열에서 단백질 손실, 발생 하는 경우 GFP 태그 단백질 대상 동안 열 지나간 워시 버퍼에서 찾을 수 있습니다. 따라서, GFP 신호에 워시 버퍼 HPLC에서 실행 될 때 대상 단백질 크기에 해당 하는 위치에 있을 것입니다. 단백질 손실, 발생 하는 경우 이미 농도 워시 버퍼의 선호도 열 태그 바인딩 그의 방해를 방지 하기 위해 인하 될 필요가 있습니다. - 버퍼 (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 250mm 이미, 및 0.1 %digitonin) 수 지 바인딩된 hTRPC3 elute 1시 20분에서 트 롬 빈을 추가 (다니엘 GFP 태그)에 어 금 니 비율 eluted 샘플 10 mM EDTA (hTRPC3 안정화 에이전트)를 추가 하 고 3 h 4 ° c.에 대 한 품 어 그 단백질은 되었습니다 eluted 샘플 희석 1: 100의 90 μ SEC 열에 실행 하 고 대상 단백질 크기에 해당 하는 위치에 GFP 신호의 존재를 확인 하 여 확인 합니다.
참고:이 시점에서, 총 단백질은 차입에서에서 트립토판 신호 또한 볼 수 있습니다. 대상 선호도 정화 단백질은 차입에는 GFP 유지 됩니다 및 트립토판 신호 됩니다만 근처 프로필에 동일. 대상 단백질은 차입에 대량에서 나타나지 않습니다 하지만 흐름을 통해 또는 세척에 손실 되지 했다, 단백질 열에 바인딩된 남아 가능성이 있다 고 이미의 높은 농도 사용 하 여 버퍼에 eluted 될 수 있습니다. - 500 μ 하 eluate 집중이 15 mL 100 K 원심 필터 튜브 ( 재료의 표참조) 5 분 단위로 4 ° C에서 동작 하는 2880 x g 에서 회전 하 여. Overconcentrating을 피하기 위해 회전 사이 아래로 솔루션 pipetting으로 단백질을 resuspend.
참고: 볼륨에 근접할 때 원하는 마지막 볼륨 원심 분리기 시간이 단축 될 수 있습니다. - 로드 (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 그리고 0.1 %digitonin) 버퍼에 SEC 열에 집중. 실행 합니다.
- 포함 된 UV 흡 광도 신호에 의해 시각으로 그대로 TRPC3 tetramer 피크 분수를 결합 하 고 적어도 5 mg/mL의 최종 농도에 다시 집중.
7. 부정적인 얼룩 전자 현미경 검사 법에 의해 단백질의 심사
- 글로우 방전 기계 켜십시오. 30 미 실행에 대 한 아르곤과 산소를 사용 하 여 탄소 코팅 그리드 출력을 위한 프로그램 수 있도록 탄소 코팅 구리 400 메쉬 격자에 친수성 단백질 솔루션을 추가 하기 전에 프로그램을 설정 합니다.
- 멸 균 물 드랍 스 5 40 μ 및 2 개의 40 μ 1 %uranyl 편대 솔루션의 설정 (랩 필름, 왁 스 종이, 또는 유사한 표면에 재료의 표참조). 7.1 단계에서 격자를가지고 고 어두운 면에 단백질의 2.5 μ 샘플 5 mg/mL (50-200 μ M)를 추가 하 고 1 분 동안 앉아 보자.
- 1 분 후 필터 종이 사용 하 여 그리드를 건조. 그리드 화면;으로 직접 필터 종이 만지지 마십시오 대신, 액체 작은 물방울의 가장자리에 종이 하 고 필터 종이에 그리드에서 액체를 모 세관 작업을 허용.
- 물의 첫 번째 드롭 다운에는 그리드를 찍어. 건조 한 종이 필터 및 물의 나머지 방울과 uranyl 편대의 첫 번째 드롭 다운 반복. Uranyl 편대 앉아 1 분의 두 번째 드롭 허용 하 고 필터 종이 건조. 저장 하기 전에 완전히 건조 공기 (약 1 분)에 그리드를 허용 합니다.
참고:이 얼룩 프로토콜 모든 단백질 세제 조합에 대 한 이상적인 않을 수 있습니다. Uranyl 편대의 다른 농도 얼룩 하 고 위의 단계 좋은 콘트라스트와 얼룩을 제공 하지 않으면 얼룩 노출 시간이 서로 다른 길이 테스트 해야 합니다. - 전자 현미경에 격자를 이미지 ( 재료의 표참조) 단백질 입자 품질을 확인 하기. 현미경 수많은 입자 들 일반적인 외관 및 유통에 균질 성 표시 확인 하 고 좋은 대조, 표시 대상 단백질의 예측 된 크기와 일치.
- 예비 생성, 저해상도, 2 차원 (2D) 분류를 사용 하 여 50-100 현미경 (데이터 처리-10 단계 참조)을 확인 하는 입자는 단일 일관 된 구조를의 다른 뷰를 나타냅니다.
참고: 현미경 그리고으로 서, 위에서 설명한 프로토콜 충분히 단백질 정화에 대 한 최적화 된 강력한 표시기 충분 한 품질의 예비 2D 클래스. 준비 및 곳을 알아내는-EM 격자의 시점에서 보증 된다.
8. EM 샘플 준비
- 글로우 방전 골드 홀리 탄소 격자 ( 재료의 표참조) 7.1 단계에서 설명한 대로.
- 눈금에 집중된 hTRPC3 단백질 샘플 (5 mg/mL)의 2.5 μ를 적용 합니다. 1.5에 대 한 그리드 오 점 오를 사용 하 여 s 1과 5의 대기 시간의 힘 100% 습도에서 4 ° C, s 다음 급락 그리드 vitrification 기계를 사용 하 여 액체 질소에 의해 냉각 하는 액체 탄.
참고: 습도, 온도, 오-포스, 오 점, 시간과 대기 시간 여기에 나열 된 저자 hTRPC3 연구19사용 되었다. 그들은 다른 단백질 및 세제에 대 한 최적의 유리 얼음을 생산 하기 위해 변경 될 필요가 있습니다. - 곳을 알아내는-EM 현미경을 사용 하 여 최적의 얼음 상태에 대 한 격자를 고정 화면 ( 재료의 표참조) 얼음과 수동으로 보기 두꺼운 얼음 (작고 어두운 표시 되는 그리드 사각형)의 얇은 얼음 (크고 밝게 표시 되는 그리드 사각형)와 매체 .
참고: 얇은 얼음 종종 더 나은 명암비와 해상도 생성 하는 동안 두꺼운 얼음은 종종 더 많은 입자를 보유 합니다. 이미지는 얼음 결정의 사용 수동 심사 조건 좋은 콘트라스트와 해상도 monodispersed 입자의 많은 수에서 결과. 일단 좋은 조건 확인은 300 kV cryo-EM 현미경 이미지 컬렉션으로 이동 합니다.
9. EM 데이터 수집
- 슈퍼 해상도 1.074의 범주화 된 픽셀 크기 계산 모드에서 이미지 스택을 기록 자동된 수집 프로그램을 사용 하 여 Å 전자 현미경에 운영 300 kV X 130, 000의 명목상 확대와 함께 직접 전자 탐지기.
- 8의 총 노출 시간 40 프레임에 모든 이미지를 복용량 충분치 s, 0.2 s 프레임과 6.76 e− Å−2의 − 1 (공칭 defocus 값 저자의 실험에 2.5 μ m 1.0에서 변화)의 복용량 비율.
10. 엠 데이터 처리
- 영화 스택22 를 표현 하는 교정의 모션을 구현 하 고 defocus23 데이터 처리 소프트웨어를 사용 하 여 값을 추정 (참조 테이블의 재료)24.
- 입자를 현미경에서 선택 하십시오. 이러한 고른 입자를 사용 하 여 초기 참조 무료 2D 분류 소프트웨어24를 사용 하 여 구성. 전체 데이터 집합에 대 한 자동화 된 입자 따기에 대 한 템플릿으로 사용 하 여 선택 이상적인 2D 클래스 평균.
- 수동으로 자동 고른 입자의 품질을 확인 하 고 나쁜 입자를 제거 합니다. 2 차원 분류의 여러 라운드를 사용 하 여 고른된 입자를 청소.
- 초기 모델25를 생성 합니다. 주제 2D a 참조 모델로 C1 대칭 및 60 Å의 초기 재구성 저역 통과 필터를 사용 하 여 3 차원 (3D) 분류 (약 5 클래스) 입자를 선택. 어떤 고해상도 기능 있고 같은 클래스 내에서 입자를 결합 하 여 결정 합니다.
- C4 대칭의 경우 (hTRPC3) 적용 지역 상세를 사용 하 여 입자를 더욱 구체화 하 고 입자 정렬에 대 한 고해상도 4.5 Å26설정 합니다.
11. 모델 구축
- 모델 구축 (사용 하는 소프트웨어에 대 한 재료의 표 참조). HTRPC3를 사용 하 여 막 횡단 도메인 (TMD) 일시적인 수용 체 잠재력 melastatin 4 (TRPM4)의 구조 단백질 데이터 은행 (PDB) 5wp6 가이드27. 부피가 잔류물 및 이차 구조 예측에 사용 하 여 안내 드 노 보 건물.
- 주제 이차 구조 억제28와 실제 공간 수정 하 초기 모델. 수동으로 세련 된 모델을 검토 하 고 (사용 하는 소프트웨어에 대 한 재료의 표 참조)을 필요에 따라 remodify.
- 최종 모델과 세련 된 구조의 유효성 검사에 대 한 EM 지도 간의 차이 계산을 푸리에 셸 상관 (FSC) 곡선을 적용 합니다. (사용 하는 소프트웨어에 대 한 재료의 표 참조) 원자 모델의 형상 평가29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
식에 대 한 프로토콜의 도식 개요 및 hTRPC3의 정화 그림 1A에 표시 됩니다. HTRPC3 bacmid 플레이트 bacmid DNA 정화, 선정 하는 나와 비슷한 이상적인 백색 식민지와의 이미지는 그림 1B에서 표시 됩니다. 우리는 그 48 h는 분명 Bluo 여자 고립 된 식민지의 존재를 유지 하면서 얼룩을 발견. GFP 형광에 의해 시각으로 hTRPC3에 대 한 P2 바이러스의 피크 생산 Sf9 곤충 세포 (그림 1C)에 감염의 4 d 후 보였다.
P2 baulovirus 1% 보충 미디어에서 수확 했다 FBS, 정지 HEK293 포유류 세포를 감염 하는 데 사용. 나트륨 낙 산 염 추가 되었습니다 감염에 바이러스 단백질 식20부스트를 후 12-18 h 세포. 셀은 다음 30 ° c.에 추가 36 h에 대 한 인 큐베이 팅 셀 수확 되었고 FSEC (그림 2A)21, 가용성 및 안정성 검사를 받게 됩니다. 셀은 0.01-세제 농도 CMC 값의 약 10 배에서 20 mM의 CMC 값 7 다른 세제를 사용 하 여 solubilized 했다. 전체 셀 가용 화, 후 셀 세포 파편은 ultracentrifugation에 의해 제거 되었다 고 상쾌한 solubilized 단백질을 포함 하는 SEC 열에 로드 된 n-라우릴-β-D-maltopyranoside/cholesteryl hemisuccinate (DDM/CHS) HPLC에 실행 절대 용 해도 및 TRPM4 컨트롤 (그림 2B)을 기준으로 서로 다른 조건 하에서 hTRPC3의 피크 볼륨 위치 비교를 세제 포함 된 버퍼입니다. 우리는 막 단백질의 구조를 해결 하는 경우 세제를 사용 하는 다른 세제에서 solubilized DDM/CHS는 가장 일반적으로 때문에 샘플에 대 한 초기 실행 버퍼 DDM/CHS를 사용 하기로 결정 했습니다. 다른 세제 solubilized TRPC3 샘플 보였다 피크 위치 hTRPC3의 tetrameric 모양 긍정 보다 작은 분자량을가지고 있기 때문에 너무 큰 가능성이 있는 약 11.9 mL에서의 모든 인간 TRPM4 제어 (그림 2A 와 그림 2B).
그럼에도 불구 하 고, 우리의 결과 비교 하려면 어떤 TRPC 채널 수용 체의 아무 구조 때문에 그리고 큰 분자량 TRPC3 또는 다른 요인의 아키텍처에 의해 발생할 수 있기 때문에, 실시의 25 mL를 사용 하 여 hTRPC3의 소규모 정화 DDM/CHS로 실험 내내 DDM/CHS를 사용 하 여 셀 hTRPC3의 최고의 가용성을 했다. HTRPC3의 초 프로필 단 분산 피크 보여주지만, TRPM4 보다는 더 높은 분자량을 나타내는 피크 위치에 아직도 (데이터 표시 되지 않음). 우리는 단백질 품질을 확인 하는 빠른 방법 이며, 매우 적은 양의 단백질을 필요로 하기 때문에 부정적인 얼룩 EM에 의해 초 프로 파일의 피크 분수에 단백질을 확인 합니다. 현미경 사진, 입자 2 막 횡단 도메인 동일한 입자에 관찰 되었다. 그것은 두 개의 hTRPC3 입자 (그림 3D) 두 cytosolic 도메인 간의 상호 작용을 통해 머리 방식에서 dimerized 나타났다. 우리 다음 포함 줄이는 시 약 dithiothreitol (DTT) 두 번째 소규모 정화에 대 한 정화 버퍼에서 hTRPC3의 이합체 화를 중단 하 길 원하고. 실제로, 더 낮은 분자량으로 두 번째 피크 초 분류에 의해 나타났다. 그러나, 입자 너무 작은 그대로 tetramer 등장 하 고 막 횡단 도메인 같은 막 단백질의 아무 기능을 보여주었다. DDM/CHS hTRPC3, hTRPC3에 대 한 좋은 용 해도 주는도 불구 하 고 정화에 대 한 적당 한 세제 아니었다 껐다.
다음, 우리 hTRPC3, solubilize에 온화한 세제, digitonin를 시도 하 고 단백질 DDM/CHS에서 solubilized와 비교. 여기 우리는 DDM/CHS와 digitonin, 각각 포함 된 두 개의 다른 실행 중인 버퍼를 사용 합니다. 이것은 중요 한 실행 버퍼에는 세제는 종종 단백질 안정성에 기여 하 고 가용 화에서 FSEC 세제를 변경할 때 막 단백질 불안정 될 수 있습니다. 단백질은 DDM/CHS 또는 digitonin에서 solubilized 때 더 낮은 분자량으로 유망한 피크 변화를 보였다 digitonin를 포함 하는 버퍼에서 실행 합니다. 단백질에 의해 solubilized digitonin에서 실행 나왔고 긍정적인 통제, 인간 TRPM4의 위치를 기준으로 적절 한 위치에서 가장 높은 봉우리 (그림 3A). 그럼 우리가 셀의 25 mL를 사용 하 여 소규모 정화를 수행 하 여 앞으로 이동. 비록 여러 광범위 한 봉우리 초 (그림 3B)에 의해 관찰 되었다 단백질 부정적인 얼룩 EM (그림 3C 와 그림 3D)에 의해 2 차원 분류에서 단일 tetrameric hTRPC3 채널의 기능을 보여주었다. 우리는 digitonin이 정화 hTRPC3 위한 이상적인 세제 결론.
우리는 hTRPC3의 식을 확장 하 고 digitonin 셀의 400 mL를 사용 하 여 중간 규모 정화를 수행. 이렇게 함으로써, 우리는 우리가 큰 규모로 hTRPC3 정화에 대 한 최종 조건을 생각 하기 전에 낭비 매체와 세제 없이 몇 가지 고정된 격자에 대 한 충분 한 단백질을 얻기 위해 기대. 막 단백질 냉동된 격자의 준비를 위해 매우 집중 하는 때 불안정 표시 자주 발생 합니다. 정제 및 농축 단백질 FSEC, 높은 분자 무게를 향해 이동 뿐만 아니라 또한 시끄러운 배경 cryo-EM 격자 EMCCD 카메라를 장착 하는 전자 현미경을 사용 하 여 몇 군데에서 보였다. 비록 단일 관찰 수 있었습니다, 그대로 tetrameric 수용 체 hTRPC3 digitonin에서 순화 되지 않았습니다 고해상도 cryo-EM 연구에 이상적.
추가로 단백질 안정성을 개선 하기 위해, 우리는 많은 프로토콜 단계 5에서에서 설명한 조건 상영. 우리 hTRPC3;의 생리 적 특성에 따라 화면 첨가제 선택 예., EDTA hTRPC3 칼슘 침투성 이며 칼슘 제거 단백질 안정화 수 때문에 선정 되었다. 모든 샘플 FSEC digitonin를 포함 하는 버퍼에서 실행 하 여 테스트의 10 mM EDTA 그대로 tetrameric 피크 위치 (그림 4A)에 hTRPC3 안정화에 놀라운 효과 보였다. 그것은 또한 크게 cryo-EM 현미경 사진에 있는 입자의 수를 증가 하 고 그림 5와 같이 백그라운드에서 소음을 감소.
데 식 고 정화에 대 한 이상적인 조건을 식별, 우리는 대규모 식 (2l) hTRPC3의 수행. HTRPC3를 포함 하는 셀 수확 되었고 solubilized. Ultracentrifuge 명확히 lysate 복종 되었다 금속 선호도 열 정화를 일괄 바인딩에 의해 중력 열에 정화 뒤 코발트 수 지와 함께. 열 내의 solubilized 단백질의 보존 및 열에서 선호도 정화 단백질의 차입 FPLC (그림 4B)에 의해 확인 되었다. 우리는 발견 hTRPC3에 대 한 워시 버퍼에 15 mM의 이미 농도 일반적인 수 지 바인딩을 사용 오염 단백질을 제거 하기에 충분 한 차입 버퍼에서 250mm 이미 solubilized hTRPC3의 대부분을 elute 충분 했다 단백질은 수 지에 바인딩된. 모든 샘플 FSEC에 의해 확인 되었다 고 eluted 단백질 정확한 피크 위치에 날카로운, 단 분산 피크를 보여주었다. GFP 태그와 hTRPC3 단백질 사이 유연성 이미지 더 많은 도전, 처리 하는 동안 단백질 입자의 정렬 할 수 있습니다 그리고 우리는 작은 양의 테스트 트 롬 빈 분열 사이트 GFP와 hTRPC3 사이 위치는, 때문에 본질적인 정화 트 롬 빈 프로 테아 제를 사용 하 여 시간 다른 분열에 단백질입니다. 주어진 eluted 단백질 1:20 4 ° C에서 2 시간 후 합리적인 안정성과 완전 한 분열을 보였다 어 금 니 비율에서 트 롬 빈과 인 큐베이 팅, 우리 같은 조건을 사용 하 여 모든 순화 된 단백질에서은 GFP 떨어져 죽 습을 HPLC GFP c 되었습니다 확인 하 여 확인 ompletely 제거 (그림 4C). 단백질 s, 더 순화 했다 그리고 GFP의 분열 다시 작은 분자량 (그림 4D)으로 피크 위치 변화에 의해 구상 될 수 있다. 주요 피크 분수에서 작은 unconcentrated 샘플 부정적인 얼룩 EM에 대 한 격자를 만들기 위해 사용 되었다. Tetrameric hTRPC3를 포함 하는 모든 분수 다음 결합 되었고 5 mg/mL, cryo-EM 이미징에 대 한 격자를 준비 하는 데 사용 했다의 최종 농도를 reconcentrated. 우리가 여전히 점차적으로 단백질의 부분을 관찰 해야 더 큰 분자량을 향해 이동 우리만 정확한 분자량에 분수를 수집 고 단백질 정화 후 즉시 격자를 동결. 우리는 보통 하루 안에 냉동된 격자의 준비에 단백질의 정화에서 실험의 순서 완료.
순화 hTRPC3 단백질의 2.5 μ 샘플 (농도 5 mg/mL) 글로우 방전 홀리 탄소 격자에 적용 되었다. Vitrification 기계 1.5를 사용 하 여 그리드를 준비 하는 데 사용 되었다 시간 100% 습도 돌입 하 여 액체 탄으로 blotting s 액체 질소에 의해 냉각. 이 단계는 이미징에 대 한 유리 같은 얼음으로 샘플을 동결합니다. 이미지는 300에서 운영 하는 cryo 전자 현미경에 의해 명목상 배율 X 130, 000에서 캡처된 kV. 이미지 스택 슈퍼 해상도 모드 1.074의 범주화 된 픽셀 크기를 Å와 공칭 defocus 값 1.0에서 직접 전자 감지기를 사용 하 여 2.5 μ m 계산과 자동 수집 소프트웨어에 기록 되었다. 각 이미지는 8의 총 노출 시간 40 프레임 복용량 분류 한 s (0.2의 프레임 당)과 복용량의 6.76 e− Å−2의 −1. 이 데이터 집합에서 대표적인 현미경 사진 그림 5에 표시 됩니다.
모션 수정 및 요약된 영화 스택 defocus 값의 추정 수행 되었다. 약 200 결과 현미경 수동 입자 따기 및 초기 참조 무료 2D 분류31에 대 한 원본으로 사용 되었다. 9 대표적인 2D 클래스 평균이 초기 분류에서 선택 하 고 전체 데이터 집합에 대 한 자동화 된 입자 따기 위해 사용 했다. Autopicked 입자의 수동 검사 분명 나쁜 입자를 제거 하기 위해 수행 되었다 다음 2D 분류의 3 라운드 수정 autopicked 입자 (그림 5)의 선택에 적용 했다. 이러한 2D 클래스 선택한 입자 5 3D 클래스 사용 하 여 낮은 패스 필터 60으로 분류 되었다 Å 초기 참조 모델로 서. 이러한 5 개의 클래스 중 하나만 표시 고해상도 기능 (그림 5). 이 클래스에서 입자 더 4.5의 고해상도도 로컬 수정 하 복종 되었다 Å C4 대칭 적용 (그림 5)32. 세련 된 모델은 수동으로 검사 하 고 remodified. 세련 된 구조는 최종 모델 및 EM 지도 사이의 차이 확인 하려면 FSC 곡선의 계산 및 원자 모델33의 형상의 평가 의해 검증 되었다.
초기 모델 건설 가이드34로 TRPM4 구조 (PDB 5wp6)의 전역 도메인을 사용 하 여 수행 되었다. HTRPC3 모델의 드 노 보 건물은 주로 부피가 잔류물 및 이차 구조 예측, 레지스터 할당을 크게 촉진 하는 구조에서 많은 α 나선에 의해 유도 됩니다. 초기 드 노 보에서-모델을 작성 순서, 길이 및 보조 구조 기능 및 부피가 잔류물의 위치 예측와 가까운 계약에 있다. 세련미, 중 해상도 해상도 최종 재건에 대 한 예상 보다 더 낮은 한계에 개최 되었다. 3 차원 FSC (공간 주파수의 함수로) 푸리에 공간에서 해당 포탄 이상 두 독립적으로 생성 된 3 차원 지도 (사용 하 여 각 데이터 집합의 절반) 사이의 정규화 된 교차 상관 계수를 측정에 사용 되었다. 우리 고용 4.3의 부드러운 마스크 Å 개조 및 추가 4.3 Å 코사인 소프트 가장자리 10 Å, 그때의 저역 통과 필터와 함께 황금 표준 FSC 0.143 사용 차단 임계값. 이것은 최종 해상도 보고를 위해 사용 되었다.
그림 1: 식 및 BacMam 시스템을 사용 하 여 hTRPC3의 정화. (A) hTRPC3 식 고 정화에 대 한 도식 절차. (B) 블루 화이트 표시기 접시에 Bacmid 식민지 선택. 고립 된 백색 식민지 (검은색 화살표), 임베디드 블루 식민지와 백색 식민지 또는 블루 식민지 (빨간색 화살표)을 접촉 하 여 백색 식민지를 선택 합니다. Sf9에서 P2 잠재의 (C) GFP 형광 세포 20 배 확대. 형광은 밝고 강력한 바이러스에 대 한 세포 막 및 세포의 대부분의 내부에 존재 해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: FSEC에 의해 hTRPC3의 안정성 심사. (A) 세제 hTRPC3의 심사. HTRPC3는 전체 셀 0.01-20 m m의 임계 micelle 농도와 세제의 다양 한에서 solubilized 이었고 DDM/CHS 포함 된 버퍼에 실행 했다. 비록 DDM/CHS hTRPC3의 높은 용 해도 보여줍니다, 피크 tetrameric hTRPC3 수 너무 커서 잘못 된 위치에 나타납니다 (파란색 추적). (B) TRPM4에의 한 제어 시 약 540 kDa, solubilized 및 실행에 DDM/CHS의 tetrameric 분자량 약 400 kDa, solubilized 및 실행의 tetrameric 분자량으로 약 12.9 mL, TRPC3, 동안에의 한 차입 볼륨 했다 DDM/CHS, 약 11.9 mL의 차입 볼륨을 했다. 작은 분자량 hTRPC3 TRPM4, 보다 약간 더 큰 볼륨을 차입 하지 약간 작은, DDM/CHS hTRPC3 가용 화 및 정화에 대 한 이상적인 세제를 되지 않을 수 있습니다 제안 해야 것으로 예상 될 것 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 세제 버퍼 심사 FSEC에 의해 hTRPC3. (A) 용 해도 안정성의 테스트 hTRPC3 digitonin를 사용 하 여 합니다. Digitonin 가용 화 및 버퍼를 실행 테스트를 했다. DDM/CHS (노란색 추적 대 파란색과 빨간색 추적)에서 solubilized 단백질에 비해 더 큰 차입 볼륨으로 이동 하는 digitonin에서 solubilized hTRPC3 단백질의 피크 위치 note Digitonin를 사용 하 여 가용 화 및 실행 버퍼에만 조합 FSEC (노란색 추적, 별표)에 의해 hTRPC3의 정확한 크기를 보여줍니다. 전체 셀 solubilized hTRPC3, hTRPC3 단백질 선호도 DDM/CHS (블루에서 순화 하는 단백질 선호도 비해 대량의 차입으로 이동 되는 digitonin (빨간 추적, 14 mL)에서 정화의 피크 위치 FSEC 결과 마찬가지로 (B) 추적, 12 mL) 초 분류 기준으로 측정. (C) 부정적인 얼룩 EM cryo-EM 데이터 수집 전에 순화 된 단백질의 품질을 확인 하기 위해 사용 되었다. 이상적인 얼룩 입자 (빨간색 원) 부정적인 얼룩이 (흰색 표시)를 선물 해야 한다 (검은 게재) 세제 반지에 의해 포위 하 고. 이 입자는 풍부한 이상적인 현미경 사진, monodispersed, 및 현재 여러 방향에서 표시 됩니다. (D) 부정적인 얼룩 EM에서 품질 데이터 명확 하 고 일관 된 일반적인 아키텍처와 2D 클래스를 제공 해야 하 고 평균 포함 및 마스크 (검은 원) 내에서 중심으로, 단백질의 여러 방향을 포괄 해야. HTRPC3 hTRPC3 단위체의 머리 이합체 화 처럼 DDM/CHS 현재 입자에서 solubilized의 부정적인 얼룩 EM 현미경에서 2D 클래스. 대조적으로, 거친 (그러나 명확 하 고 일관 된) 전반적으로 도토리 모양의 tetrameric 구조는 hTRPC3 digitonin에서 solubilized의 부정적인 얼룩 EM 현미경에서 2D 클래스에 명백한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: hTRPC3의 정화. EDTA의 hTRPC3의 (A) 안정성 테스트. hTRPC3 (빨간 추적) 유무 (블루 추적) 10 mm EDTA에 digitonin에서 solubilized 했다. 전 보여 tetramer 단백질 위치 (붉은 추적, 별표)에서 단일 및 좁은 피크 EDTA의 tetrameric 구조에서 hTRPC3 안정 나타내는. (B) GFP 형광 FSEC solubilized digitonin에 hTRPC3에 대 한 신호 하 고 digitonin 버퍼에서 실행 합니다. Tetramer 피크 금속 선호도 열 정화 (블루 추적, 별표) 전에 solubilized 자료에서 관찰 됩니다. 흐름을 통해 분수에이 피크의 부재 선호도 열 (빨간 추적)에 hTRPC3 단백질의 완전 한 바인딩을 나타냅니다. 이미 여 차입, 후 차입 피크에 분수 FSEC (녹색 추적)에 의해 확인 했다. 그대로 tetramer 피크를 보여주는 모든 분수 추가 정화에 대 한 수집 했다. 트 롬 빈을 사용 하 여 hTRPC3의 GFP 분열의 (C) 테스트 합니다. 소화 시간이 4 ° C에서 단백질의 작은 금액을 사용 하 여 테스트 하 고 소화의 완전성 FSEC에 의해 확인 되었다. 각 추적에서 왼쪽에 피크 hTRPC3 tetramer 피크 (별표)에 해당 하 고 오른쪽에 피크는 무료 GFP 피크. 소화의 길이 증가, GFP 단백질에서 죽 습 되는 나타내는 tetrameric 단백질 GFP 무료의 비율이 감소 합니다. 2 h 소화 GFP의 완전 한 분열을 보여 줍니다. 10 m m와 버퍼를 실행 전에 또는 digitonin 포함 된에 트 롬 빈 소화 후 hTRPC3의 (D) 초 프로필 EDTA를 추가. 예상 했던 대로, 피크 위치는 트 롬 빈 소화 (빨간 추적) 후 작은 차입 볼륨으로 이동 됩니다. 주요 피크 (별표) tetrameric hTRPC3을 나타냅니다. 레드 라인 사이의 분수는 cryo-EM 실험에 대 한 수집 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 곳을 알아내는-EM 데이터 수집 및 hTRPC3에 대 한 처리의 도식. 순화 hTRPC3의 3,660 영화 스택 컬렉션 수행 되었다 전자 현미경을 사용 하 여 직접 전자 감지기. 모션 보정 및 수동 선택 결과 3,580 현미경에 적용 되었다. 입자 autopicked 고 2D 분류 대상이. 2D 클래스 추가 3 차원 분류에 의해 세련 되었다. 단 하나 5 3D 클래스 고해상도 기능 표시. 이 클래스는 3D 세련미와 Frealign 지역 수정, 해상도 Å 3.3 hTRPC3에 대 한 구조에서 결과 대 한 선정 됐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
곳을 알아내는-그들에 의해 단백질의 구조 결정은 지난 몇 년 동안, 새로운 카메라와 알고리즘의 개발을 크게 하지 않는 단백질 구조 결정 속도 덕분에 구조 생물학 분야 혁명 쉽게 정보, 특히 막 단백질. 모든 cryo-EM 기술에서 최근의 진보에도 불구 하 고 높은-품질 종종 이미지를 촉진 하기 위하여 순화 된 단백질의 품질과 수량에 충분 한 준비 시간이 걸리는, 비용이 많이 드는, 그리고 도전 남아 있습니다. 위의 프로토콜에 설명 된 대로 높은-품질의 신속 하 고 비용 효율적인 생산 함으로써의이 과정의 효율성을 향상 빠르게 표현 하는 능력 및 다양 한 정화 조건에서 여러 유전자 구성 화면 곳을 알아내는-EM 연구에 사용 하기 위해 순화 된 단백질.
여기 설명 하는 방법을 직접 transfection에 의해 보다 적은 비용에 포유류 막 단백질의 대량을 정화 하는 방법을 제공 하 고 더 신속 하 게 보다 안정적으로 transfected 세포 라인의 세대, 많은 단계, 각각의 낙관 되어야 한다 하는 동안 높은-품질 단백질 수율을 제공 합니다. 생 화 확 적인 기술을 생산 하 고 hTRPC3를 정화 하는 데 사용, 내에서 중요 한 단계 및 검사점의 여러 가지가 있습니다. 첫 번째 중요 한 검사점 bacmid DNA의 생산 이다. 결과에 설명 된 대로 이상적인 식민지 선택 세대 품질 바이러스의 단백질 발현에 대 한 첫 번째 단계입니다. 또한, 선택 된 식민지에서 정화 bacmid DNA의 농도 1 μ g/μ 인 경우에, 결과 바이러스 강력한 단백질 표정에 대 한 충분 한 되지 않습니다. 두 번째 중요 한 검사점 P1 및 P2 잠재의 생산 이다. 바이러스 titer 그림 1C 와 같이 GFP 형광, 예상할 수 있는 또는 콜맨 외 에 설명 된 대로 측정 될 수 있다 35. 바이러스 titer, 뿐만 아니라 감염의 시간 과정 이루어져야 한다 최대한 단백질 표정에 대 한 감염의 최적의 시간을 결정 하기 위해 각 새로운 구조에 대 한. 중요 한 검문소 3은 용 해도 안정성 심사 그림 2에 표시 된. DDM, 등 높은 CMC와 세제 높은 가용성을 제공할 수 있습니다 하지만 그들은 곳을 알아내는-EM 이미징 풍부한 micelles 오염 될 수 있습니다 때문에 적합 하지 않습니다. Digitonin, 같은 온화한 세제는 단백질 안정성을 유지 하면서 충분 한 가용성을 제공할 수 있습니다. 첨가제의 경우 hTRPC3, EDTA 등의 심사 결과 그대로 하 고 동종 단백질, 아마 칼슘 침투성은 hTRPC3에서 칼슘을 제거 하 여 정화 상태를 발견 하기 위해 중요 하다. 중요 한 검문소 4 선호도 열 정화 하는 동안 특정 하 고 효율적인 단백질 캡처의 확인 이며 초-분류 (그림 4) 동안 이상적인 단백질 피크의 관찰. 모든 대상 단백질을 유지 하면서 단백질 입자 오염의 포함의 cryo-EM 이미징에 대 한 단백질의 높은 수익률을 얻기에 중요 하다. 일괄 바인딩 시간과 solubilized 단백질에 수 지의 비율의 변화는 수 지 열에 의해 단백질 유지를 개선할 수 있습니다. 초 분류의 전반적인 품질 이미징, 순화 된 단백질 입자의 품질의 이전 최고의 표시등이 우리의 경험에서입니다. 낮은 또는 초 분류 하는 동안 광범위 한 최대 이미지 당 너무 단백질 입자의 가능한 문제 또는 오염 단백질 집계/저하 제품의 존재를 각각 나타냅니다. 또한, 자체 구문 내 선호도 태그 변경 충분 한 선호도 태그 바인딩 수 있도록 어떤 경우에 필요한 입증 했다. 곳을 알아내는-EM 데이터 집합의 컬렉션 이전 마지막 검사점 부정적인 얼룩 EM에 의해 단백질 입자 품질의 확인입니다. 엄격 하 게 필요, 우리는이 곳을 알아내는-EM 데이터 수집의 시간 및 비용 집중 과정에 투자 하기 전에 자리 하 고 올바른 단백질 품질 문제를 좋은 기회 제공 찾으십시오.
곳을 알아내는-EM 구조 연구에 대 한 단백질 생산의 한 대체 방법은 기본 조직 소스 로부터 단백질의 직접 정화 이다. 이 방법은 종종 단백질 수율 문제를 발견 하는 동안 그것은 매우 풍부한 셀에 하거나 재조합 overexpression를 사용 하 여 생성할 수 큰 다중 단백질 복합물의 한 부분으로 존재 하는 단백질에 대 한 우수한 대안 시스템36. 그러나, 단일 단백질 생리 적인 조건 하에서 또는 낮은 금액에 표현, 여기에 제시 된 표현과 정화 시스템은 효율적인, 상대적으로 낮은-비용 및 높은 수율 생산 방법을 포유류 막 단백질 정화 곳을 알아내는-EM 구조 연구 대 한. 여기에 제시 된 수 강력 하 게 보완 하는 한 가지 방법은 지질 nanodiscs 곳을 알아내는-EM 데이터 수집37이전에 순화 된 단백질의 재구성 이다. 이 방법에서 단백질은 지질 bilayer, 제공 하 고 세제 micelles 비해 네이티브 같은 microenvironment 비록 증거가 지금까지 세제에 용 해 구조 및 nanodisc는 그의 작은 디스크에 새겨져 있는 다른38,,3940. 다른 방법은 직접 스 티 렌 maleic 무수 물 (SMA), 막 단백질 구조41,42의 결정을 위해 성공적으로 사용 되었습니다 처럼 amphipathic 폴리머를 사용 하 여 단백질을 추출 하는 것입니다.
이 원고에 설명 된이 방법을 이온 채널을 넘어 다른 포유류 막 단백질의 다양 한 우리의 실험실에서 쉽게 적응할 수 있는 것을 입증 했다. 따라서, 우리는이 프로토콜 높은 특이성 대상된 약물 디자인 기초 구조 및 기능 분석에 유용한 도구가 될 것입니다 믿습니다. 이것은 신경 질환, 심혈 관 질환 및 암, 어떤 이온 채널은 어렵지만 높은 잠재적인 약물 표적에 특히 유용할 것 이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 데이터 수집에는 데이비드 밴 Andel 고급 Cryo 전자 현미경 검사 법에 대 한 지원에 대 한 G. 자오와 X. 멩 감사합니다. VARI-고성능 컴퓨팅 팀을 전산 지원 부탁 드립니다. 우리는이 원고를 크게 개선 하는 의견에 대 한 명. 클레 멘 테, 디 비, 제이 Floramo, 영 황, Y. 김, C. 뮬러, B. 로스, 그리고 Z. Ruan 우리의 감사를 제공 합니다. 이 원고에 대 한 편집 지원에 감사 디 Nadziejka 하 고. 이 작품은 내부 바리에서 지 원하는 자금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent - to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
- Sudhof, T. C.
- Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
- Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
- Prakriya, M., Lewis, R. S.
- Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
- Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
- Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
- Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
- Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
- Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
- Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
- Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
- Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
- Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
- Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
- Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
- Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
- Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
- Bayburt, T. H., Sligar, S. G.
- Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
- Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
- Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).
