Summary
Questo protocollo descrive le tecniche utilizzate per determinare le strutture di canale ionico di cRIO-microscopia elettronica, compreso un sistema di baculovirus usato per esprimere in modo efficiente geni in cellule di mammiferi con minimo sforzo e tossicità, estrazione della proteina, purificazione, e controllo di qualità, preparazione del campione griglia e screening, nonché raccolta dati ed elaborazione.
Abstract
Canali di potenziale transitorio del ricevitore (TRPC) della sottofamiglia TRP canonica sono canali cationici non selettivi che svolgono un ruolo essenziale nell'omeostasi del calcio, voce negozio-funzionata specialmente del calcio, che è fondamentale per mantenere il corretto funzionamento del rilascio delle vescicole sinaptiche e vie di segnalazione intracellulare. Di conseguenza, canali TRPC sono stati implicati in una varietà di malattie umane, inclusi i disturbi cardiovascolari quali l'ipertrofia cardiaca, malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson e disturbi neurologici come atassia spinocerebellar. Canali TRPC rappresentano quindi un potenziale bersaglio farmacologico in malattie umane. Tuttavia, i meccanismi molecolari del gating in questi canali sono ancora poco chiari. La difficoltà nell'ottenere grandi quantità di proteina purificata, omogenea e stabile è stata un fattore limitante negli studi di determinazione di struttura, particolarmente per le proteine di membrana dei mammiferi quali i canali ionici TRPC. Qui, presentiamo un protocollo per l'espressione su larga scala di proteine di membrana del canale dello ione dei mammiferi utilizzando un sistema di trasferimento del gene di baculovirus modificate e la purificazione di queste proteine di affinità e la cromatografia di esclusione dimensionale. Presentiamo inoltre un protocollo per raccogliere immagini di microscopia di singola particella cryo-elettrone dalla proteina purificata e utilizzare queste immagini per determinare la struttura della proteina. Determinazione della struttura è un metodo potente per la comprensione dei meccanismi di gating e funzione di canali ionici.
Introduction
Calcio è coinvolto nei processi più cellulari tra cui segnalazione cascades, controllo trascrizione, rilascio di neurotrasmettitori e ormoni molecola sintesi1,2,3. Il mantenimento omeostatico di calcio libero citosolico è cruciale per la salute e la funzione delle cellule. Uno dei principali meccanismi dell'omeostasi intracellulare del calcio è calcio store-operati voce (SOCE), un processo in cui lo svuotamento di calcio memorizzati nei trigger del reticolo endoplasmatico (ER) l'apertura dei canali ionici sulla membrana plasmatica per facilitare la rifornimento di calcio di ER, che può quindi essere utilizzato in ulteriore segnalazione4,5,6. Canali di potenziale transitorio del ricevitore (TRPC), che sono canali calcio-permeabile della superfamiglia di TRP, sono stati identificati come un partecipante importante SOCE7,8,9 .
Tra i sette membri della famiglia di TRPC, TRPC3, TRPC6 e TRPC7 formano un sottogruppo di omologo, e sono unici nella capacità di essere attivato dal lipido messaggero secondario diacilglicerolo (DAG), un prodotto di degradazione del lipido di segnalazione fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2)10,11. TRPC3 è altamente espressa nel muscolo liscio e nelle regioni cerebrali e cerebellari del cervello, in cui svolge ruoli essenziali nella segnalazione del calcio che hanno un impatto neurotrasmissione e neurogenesi12,13. Disfunzione di TRPC3 è stata collegata a disturbi del sistema nervoso centrale, disturbi cardiovascolari e alcuni tipi di cancro come adenocarcinoma ovarico14,15,16. Pertanto, TRPC3 tiene la promessa come una destinazione farmaceutica per il trattamento di queste malattie. Lo sviluppo di farmaci specificamente mirati che agiscono sul TRPC3 è stato limitato da una mancanza di comprensione dei suoi meccanismi molecolari di attivazione, tra cui lipidica associazione siti17,18. Abbiamo segnalato la prima struttura di atomico-risoluzione del canale umano di TRPC3 (hTRPC3) e suoi siti di legame di lipido due in uno stato chiuso, fornendo importanti intuizioni questi meccanismi19.
Il fattore chiave per determinare la struttura di una proteina di membrana ad alta risoluzione è quello di ottenere proteine di alta qualità. La proiezione corrispondente espressione e purificazione condizioni necessarie per ottenere proteine di alta qualità può essere uno sforzo lungo e oneroso. Qui presentiamo un protocollo che descrive in dettaglio come identificare le condizioni ottimali per l'espressione e purificazione di hTRPC3, che si è comportato male in nostro screening iniziale. Vi presentiamo alcuni punti chiave su come risolvere i problemi e ottimizzare il comportamento della proteina, che pongono una solida base per il nostro cryo-elettrone studi di microscopia (cryo-EM). Usiamo un baculovirus modificate generando vettoriale (pEG), sviluppato da Gouaux e colleghi, che è ottimizzato per lo screening di analisi e generazione efficiente di baculovirus in cellule di mammifero20. Questo metodo di espressione è appropriato per rapido ed economico iperespressione delle proteine nella membrana delle cellule dei mammiferi. Uniamo l'utilizzo di questo vettore con una rilevazione della fluorescenza esclusione basata su cromatografia (FSEC) prescreening metodo21. Questo metodo utilizza un tag di proteina fluorescente verde (GFP) fuso al costrutto di interesse e migliora la visualizzazione della proteina dell'obiettivo in piccole, cellule intere campioni solubilizzati. Questo permette per lo screening della stabilità proteica in presenza di diversi detergenti e additivi, con mutazioni di thermostabilizing e permette l'uso di un piccolo numero di cellule dalla trasfezione transiente in piccola scala. In questo modo, una moltitudine di condizioni può essere rapidamente proiettata prima di passare ad una purificazione di proteine su larga scala. A seguito di espressione, lo screening e la purificazione, presentiamo un protocollo per ottenere ed elaborare immagini da cryo-EM per generare una de novo determinazione strutturale della proteina. Noi crediamo che gli approcci descritti qui servirà come un protocollo generalizzabile per studi strutturali di recettori canale TRP e altre proteine di membrana.
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Protocol
1. trasformazione delle cellule competenti di DH10α per produrre Bacmid DNA
- Sintetizzare il gene di interesse e subclone esso in una versione modificata del vettore pEG contenente un doppia strep-tag, un His8-tag e GFP con un sito di clivaggio della trombina al capolinea (pFastBacI) N20.
- Trasformare cellule competenti con l'aggiunta di 5 ng di plasmide contenente un gene desiderato in pFastBacI a 50 μL di DH10α cellule in un 1,5 mL tubo e incubare per 10 minuti in ghiaccio. Le cellule per 45 di scossa di calore s a 42 ° C. Aggiungere 200 μL di brodo super ottima con il mezzo di repressore catabolico (SOC) al tubo e incubare per 4-8 h a 37 ° C in un agitatore orbitale a 225 giri/min.
- Piastra 5 μL di cellule su una piastra di agar bacmid LB (kanamicina di 50 μg/mL, 7 μg/mL Gentamicina, agar tetraciclina, 100 μg/mL Bluo-gal e 40 μg/mL isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], 10 μg/mL).
- Incubare la piastra per 48 h a 37 ° C.
Nota: Le colonie di macchie di indicatore Bluo-gal che ancora stanno esprimendo lacZ (vettore inserimento infruttuoso), permettendo per la selezione delle colonie (con successo trasformati) bianchi. - Selezionare con attenzione una colonia bianca isolata, evitando qualsiasi bianchi colonie che sono in contatto con colonie blu e far crescere cellule pernottamento in 6 mL di terreno di bacmid LB (kanamicina di 50 μg/mL, 7 μg/mL Gentamicina, tetracicline 10 μg/mL) a 37 ° C in un agitatore orbitale a 225 giri/min.
2. batterica preparazione per isolamento di DNA Bacmid
- Per isolare il DNA bacmid, rotazione verso il basso le cellule di Escherichia coli per 10 min a 2880 x g.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 200 µ l di soluzione di risospensione delle cellule dal miniprep kit (Vedi Tabella materiali) di pipettaggio. Assicurarsi che il pellet è completamente e omogeneamente sospesa. Poi, trasferire la sospensione cellulare in provette da 1,5 mL.
- Aggiungere 200 µ l della soluzione di lisi cellulare dal kit miniprep e mescolare capovolgendo la provetta un paio di volte. Incubare per fino a 5 min a temperatura ambiente (TA) per lisare le cellule. Aggiungere 200 µ l di soluzione di neutralizzazione dal kit miniprep e mescolare capovolgendo la provetta un paio di volte per interrompere la reazione di lisi.
- Rotazione verso il basso per 10 min a 21.130 x g in una centrifuga di tavolo. Raccogliere 600 μL del surnatante in una provetta da 2 mL. Aggiungere 600 μL di soluzione di alcol fenolo: cloroformio: isoamilico (Vedi Tabella materiali) e miscelare accuratamente per estrarre il DNA dal resto dei prodotti di lisi delle cellule.
Attenzione: Fenolo: cloroformio: isoamilico soluzione di alcool è tossico per inalazione, a contatto con la pelle e per ingestione. Può causare ustioni chimiche e può essere cancerogeno. Indossare guanti e un camice da laboratorio polsini. Lavorare in una cappa aspirante. Smaltire in modo appropriato questo rifiuti pericolosi. - Girare il tubo per 10 min a 21130 x g in una centrifuga di tavolo. Due fasi liquide separate saranno visibili. Trasferire con cautela 300 μL della fase acquosa superiore ad un nuovo tubo. Aggiungere 600 µ l di etanolo al 100% per lavare il DNA. Capovolgere delicatamente la provetta per mescolare.
Nota: Non non vortice, come questo potete inclinare bacmid DNA. - Tubi cool mettendoli in un congelatore a-20 ° C per 10 min. rotazione verso il basso per 10 min a 21.130 x g in una centrifuga di tavolo. Scartare il surnatante e preservare il pellet di DNA.
- Aggiungere 1 mL di etanolo al 70% per lavare la pallina. Capovolgere delicatamente la provetta per mescolare. Centrifugare per 10 min a 21.130 x g in una centrifuga di piano d'appoggio. Scartare il surnatante e lasciar il pellet aria secca per circa 5 minuti o fino a quando il liquido non è visibile nel tubo e il pellet di DNA diventa traslucido.
- Risospendere il pellet asciutto in 50 µ l di sterile, privo di DNasi, acqua deionizzata. Misurare la concentrazione di DNA.
Nota: Non congelare bacmid DNA. Conservare a 4 ° C per diversi giorni.
3. transfezione delle cellule di insetto Sf9 con Bacmid per produrre P1 Baculovirus
- Seme: 0,9 x 106 Sf9 cellule/pozzetto in 2 mL di terreno appropriato (Vedi Tabella materiali) in ciascun pozzetto di una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti. Incubare le cellule a 27 ° C per 20 min a promuovere attaccamento alla piastra.
Attenzione: Colture cellulari sono un potenziale rischio biologico. Lavorare in una cappa a flusso laminare approvato utilizzando tecniche asettiche e controllare le linee guida istituzionali e governative per indumenti di protezione consigliati e corretto smaltimento dei rifiuti prima di eseguire gli esperimenti. - Dopo aver allegato, aggiungere 8 µ l di reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali) a 100 µ l di media per ciascun pozzetto delle 6 piastra ben essere trasfettato in una provetta sterile. Aggiungere 100 µ l di terreno in una provetta sterile separata 6 μg di bacmid del DNA. Incubare per 5 minuti a RT. combinare le due soluzioni e incubare per 45 minuti a TA.
- Sostituire il mezzo a 6 pozzetti con 2 mL di terreno nuovo. Aggiungere la miscela dal passaggio precedente a ogni bene goccia a goccia (200 µ l per pozzetto). Scuotere delicatamente la piastra per garantire la miscelazione della soluzione transfezione nel mezzo.
Nota: Non agitare o agitare la piastra perché questo farà sì che le cellule staccare. - Incubare le cellule per 5 d (120 h) in un incubatore di 27 ° C. Controllare la fluorescenza di GFP prima della raccolta per verificare che il virus viene prodotta in una grande percentuale delle cellule; Se la percentuale è bassa, estendere il tempo di incubazione come necessario (vedere Figura 1).
- Raccogliere il surnatante contenente virus P1 (circa 2 mL da ogni pozzetto). Il supporto contenente virus P1 nelle provette 2 mL utilizzando una siringa da 3 mL e 0,2 µm piccolo filtro del filtro. Aggiungere sterile siero bovino fetale (FBS) ad una concentrazione finale dell'1%.
Nota: Questo stock di virus P1 deve essere conservato a 4 ° C e protetto dalla luce.
4. infezione di cellule di insetto Sf9 con Baculovirus P1 per produrre P2 Baculovirus
- Preparare 200 mL (o volume desiderato) di Sf9 cellule ad una concentrazione di 0,8 - 0,9 x 106 cellule/mL su mezzo adeguato (Vedi Tabella materiali) in una beuta di cultura fondo piatto di dimensioni sufficienti.
Nota: Per la coltura di sospensione, il volume utilizzato non deve superare il 40% della capacità totale del pallone. - Aggiungere il rapporto di 1: 2500 (v/v) di stock di virus P1 da 3.5 alla coltura di sospensione delle cellule Sf9. Incubare per la volta di espressione ottimale virus (solitamente 48-120 h a seconda del costrutto di proteine) a 27 ° C in un agitatore orbitale a 115 giri/min.
Nota: L'espressione relativa virus può essere determinato visualizzando la fluorescenza di GFP del virus in un campione della cultura. - Centrifugare la sospensione cellulare per 40 min a 11.520 x g e raccogliere il surnatante contenente virus P2. Filtrare il surnatante utilizzando monouso 0,2 µm filtri. Aggiungere FBS a una concentrazione finale di 0,5%.
Nota: Questo stock di virus P2 deve essere conservato a 4 ° C e protetto dalla luce. - Ottenere un titolo per il virus di P2 utilizzando un contatore di virus o cellule Sf9easy.
5. infezione di cellule di mammifero HEK293 con Baculovirus P2 per l'espressione della proteina su larga scala
- Preparare un volume desiderabile di HEK293 coltura di sospensione su cellule di mammifero (4-6 L è consigliato per la preparazione di griglie congelati) ad una concentrazione di 3.5-3.8 x 106 cellule/mL nel mezzo di espressione (Vedi Tabella materiali) completati con 1% (v / v) sterile FBS in matracci di cultura di Erlenmeyer sconcertato-fondo di dimensioni sufficienti.
Nota: Per la coltura di sospensione, il volume utilizzato non deve superare il 40% del volume totale del pallone. - Aggiungere 8% (v/v) di soluzione di riserva di virus P2 dal passaggio 4.3 alla coltura di sospensione delle cellule HEK293. Incubare a 37 ° C in un agitatore orbitale a 135 giri/min.
- Aggiungere del butirrato del sodio 10 mM post-all'infezione 12-18 h. Incubare per la volta dell'espressione proteica ottimale (di solito 36-72 h) a 30 ° C.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per 20 min a 2.880 x g. Lavare le cellule di risospensione in circa 100 mL soluzione fisiologica tamponata (TBS) per litro di cellule raccolte. Centrifugare nuovamente per 20 min a 2.880 x g e raccogliere il pellet cellulare.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Palline delle cellule possono essere snap-congelati in azoto liquido e conservati a-80 ° C fino alla purificazione.
Attenzione: Azoto liquido può causare lesioni o ustioni criogeniche. Può causare congelamento. Si può spostare l'ossigeno e causare il soffocamento rapida. Indossare guanti isolanti freddi e visiera. - Raccogliere raccolti 1ml piccoli intervalli di tempo variabili e solubilizzare per 2 h a 4 ° C con dondolo o mescolando in presenza di diversi detergenti e/o additivi. Questi piccoli campioni di cellule intere solubilizzati possono essere chiariti dall'ultracentrifugazione a 235.000 × g per 10 min a 4 ° C ed eseguire come un campione di 30 μL su una colonna di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) (Vedi Tabella materiali) per determinare il momento migliore per espressione e le migliori condizioni di solubilizzazione.
Nota: Nel caso di hTRPC3, questo screening incluso diversi buffer con valori di pH da 4.0-9.5 e concentrazioni saline del 50-500 mM; diverse composizioni ionici (ad esempio MgCl2 o NaCl); diversi detergenti con micellare critica (CMC) valori di concentrazione 0,1 - 20 mM; ridurre gli additivi come dithiothreitol, tris(2-carboxyethyl) fosfina e β-mercaptoetanolo; e il calcio-chelante acido etilendiamminotetracetico additivo (ed).
6. la purificazione della proteina di hTRPC3 dal Pellet congelati
- Scongelare il pellet in tampone contenente 20 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), 0,8 μM aprotinina, 2 μg/mL leupeptina, 2 mM pepstatina A, e 1% digitonina, utilizzando 100 mL di tampone per litro di cellule raccolte. Una volta scongelato, assicurare l'omogeneità della soluzione pipettando o agitazione. Permettono di solubilizzare per 2 h a 4 ° C in un becher immerso nel ghiaccio con un stir bar rotante.
- Rimuovere i detriti cellulari dall'ultracentrifugazione a 235.000 × g per 1 h a 4 ° C. Verificare la quantità di proteina mediante l'esecuzione di un campione di 30 μL su una colonna di SEC (Vedi Tabella materiali) mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e visualizzare la proteina dell'obiettivo con l'uscita del segnale GFP.
- Incubare le proteine solubilizzate (surnatante) con resina di affinità di cobalto per 1-2 ore a 4 ° C. Verificare il legame alle proteine alla resina eseguendo un 30 μL di campione in una colonna di SEC.
Nota: Se si è verificato un legame con le proteine, la destinazione di tagged proteina GFP viene trattenuta sulla colonna, non trovata il flusso continuo. Di conseguenza, nessun segnale GFP sarà presente nella posizione corrispondente alla dimensione di proteina bersaglio quando il flusso continuo viene eseguito su HPLC. - Lavare la resina con 10 volumi di colonna del buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazolo di 15 mM e 0,1% digitonina). Controllare per perdita della proteina eseguendo un 30 μL di campione in una colonna di SEC.
Nota: Se si è verificato la perdita di proteine dalla colonna, il bersaglio con tag proteina GFP si troverà nel tampone di lavaggio che è passato sopra la colonna. Di conseguenza, GFP segnale sarà presente nella posizione corrispondente alla dimensione di proteina bersaglio quando il tampone di lavaggio viene eseguito su HPLC. Se si è verificato la perdita di proteine, la concentrazione di imidazolo del tampone di lavaggio potrebbe essere necessario essere abbassata per evitare di interrompere la sua associazione di tag per la colonna di affinità. - Eluire il hTRPC3 associato a resina con buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazolo di 250 mM e 0,1% digitonina). Aggiungere trombina a un 01:20 rapporto molare (a fendere il tag GFP) e aggiungere 10 mM EDTA (un agente di stabilizzazione hTRPC3) nell'esempio eluito e incubare per 3 ore a 4 ° C. Verifica che la proteina ha stata eluita eseguendo 90 μL di un campione diluito 1: 100 su una colonna di SEC e verificando la presenza di un segnale GFP nella posizione corrispondente alla dimensione della proteina bersaglio.
Nota: A questo punto, il segnale di triptofano dal tenore totale di proteine l'eluizione possa anche essere visualizzato. Solo la proteina bersaglio purificato per affinità rimarrà nell'eluizione e la GFP e triptofano segnali saranno vicino a identici nel profilo. Se la proteina dell'obiettivo non è visto in gran quantità nell'eluizione ma non è stato perso in flusso continuo o lavare, la proteina probabilmente è rimasto legata alla colonna e può essere eluita utilizzando una maggiore concentrazione di imidazolo nel buffer. - Concentrare l'eluato a 500 μL o meno in un filtro centrifugo 15ml 100K tube (Vedi Tabella materiali) di filatura a 2.880 x g a 4 ° C in incrementi di 5 min. Risospendere la proteina pipettando su e giù la soluzione tra giri per evitare overconcentrating.
Nota: Il tempo di centrifugazione può essere abbreviato come il volume si avvicina il volume finale desiderato. - Caricare il concentrato su una colonna SEC nel buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA e della digitonina 0.1%). Correre.
- Combinare le frazioni di picco contenente il tetramero TRPC3 intatto, come visualizzati da segnale di assorbanza UV e concentrare nuovamente a una concentrazione finale di almeno 5 mg/mL.
7. screening della proteina da microscopia elettronica negativo-macchia
- Accendere la macchina effluvio. Impostare il programma per lo scarico di una griglia rivestita di carbonio utilizzando argon e ossigeno per 30 s. Esegui il programma per rendere il rivestimento di carbonio su rame 400-maglia griglie idrofila prima dell'aggiunta della soluzione della proteina.
- Impostare gocce cinque 40 μL di acqua sterile e gocce di due 40 μL di soluzione di formiato di uranile 1% (il film lab, carta oleata o una superficie simile, Vedi Tabella materiali). Prendere la griglia dal punto 7.1 e aggiungere 2,5 µ l di proteina campione 5 mg/mL (50-200 μM) sul lato oscuro e lasciate riposare per 1 min.
- Dopo 1 min, asciugare la griglia utilizzando carta da filtro. Non toccare la carta da filtro direttamente alla superficie della griglia; invece, portare la carta al bordo della goccia di liquido e azione capillare per estrarre il liquido dalla griglia in carta da filtro.
- Immergere la griglia nella prima goccia d'acqua. Asciugare con carta da filtro e ripetere l'operazione con le restanti gocce d'acqua e la prima goccia di formiato di uranile. Consentire la seconda goccia di uranile formiato sit per 1 min e poi asciugare con carta da filtro. Consentire la griglia completamente aria secca (circa 1 min) prima di riporlo.
Nota: Questo protocollo di colorazione può non essere ideale per tutte le combinazioni di proteine-detergente. Differenti concentrazioni di formiato di uranile macchia e varie lunghezze di tempo per l'esposizione di macchia dovrebbero essere testate se i passaggi precedenti non forniscono una macchia con un buon contrasto. - Le griglie su un microscopio elettronico di immagine (Vedi Tabella materiali) per controllare la qualità delle particelle della proteina. Garantire che le micrografie mostrano numerose particelle che sono omogenee nella distribuzione e nell'aspetto generale, buon contrasto del display e corrisponde alla dimensione prevista della proteina bersaglio.
- Preliminare di generare, a bassa risoluzione, bidimensionale (2D) classificazioni utilizzando micrografie di 50-100 (Vedi elaborazione dati – passaggio 10) per verificare che le particelle rappresentano diversi punti di vista di un'unica struttura coerenza.
Nota: Micrografie e preliminare classi 2D di qualità sufficiente, come descritto in precedenza, sono un forte indicatore che il protocollo è stato sufficientemente ottimizzato per purificazione della proteina. Preparazione e screening di griglie di cryo-EM è autorizzata a questo punto.
8. preparazione del campione EM
- Bagliore-scarico una griglia di carbonio holey oro (Vedi Tabella materiali) come descritto al punto 7.1.
- Applicare 2.5 μL del campione concentrato hTRPC3 proteina (5 mg/mL) sulla griglia. Macchia della griglia per 1,5 s utilizzando una macchia della forza di 1 e un tempo di attesa di 5 s a 4 ° C e 100% umidità quindi immergersi nella griglia etano liquido raffreddato con azoto liquido, utilizzando una macchina di vetrificazione.
Nota: L'umidità, temperatura, macchia-forza, macchia tempo e tempo di attesa elencati qui sono stati utilizzati per hTRPC3 Studio19 degli autori. Si potrebbe essere necessario essere modificato per produrre ghiaccio vitreo ottima per altre proteine e detergenti. - Schermo congelato griglie per condizioni ottimali di ghiaccio utilizzando un microscopio di cryo-EM (Vedi Tabella materiali) e manualmente Vedi regioni di ghiaccio spessa (quadrati della griglia che appaiono più piccole e più scure), sottile di ghiaccio (quadrati della griglia che appaiono più grandi e più brillanti) e mezzo di ghiaccio .
Nota: Più spesso ghiaccio contiene spesso più particelle, mentre ghiaccio sottile produce spesso ad alta risoluzione e contrasto migliore. La selezione manuale uso di immagini per determinare quale ghiaccio condizioni risultati in un gran numero di particelle di monodispersed con buon contrasto e risoluzione. Una volta verificate le condizioni buone, spostare alla collezione di immagini su un microscopio di cryo-EM 300 kV.
9. raccolta dei dati EM
- Utilizzando un programma di acquisizione automatizzata, registrare la serie di immagini in modalità Super-risoluzione di conteggio con una dimensione di pixel binned di 1.074 Å su un microscopio elettronico operati a 300 kV con un ingrandimento nominale di 130.000 X diretto rivelatore di elettroni.
- Dose-frazionare ogni immagine a 40 fotogrammi con un tempo di esposizione totale di 8 s, con 0,2 s per telaio e un tasso di dose di 6,76 e− Å s− 2 − 1 (valori di defocus nominale variano da 1,0 a 2,5 μm in esperimento degli autori).
10. EM informatica
- Implementare il movimento correzione del riassunto film pile22 e stimare valori defocus23 utilizzando il software di elaborazione dati (Vedi Tabella materiali)24.
- Raccogliere particelle dai micrografi. Utilizzare queste raccolte particelle per costruire una classificazione iniziale privo di riferimento 2D utilizzando il software di24. Medie di selezionare classe 2D ideale da utilizzare come modelli per il prelievo delle particelle automatizzati per l'intero set di dati.
- Controllare la qualità delle particelle raccolte a auto e rimuovere le particelle di cattive manualmente. Utilizzare vari cicli di classificazione 2D per ripulire le particelle raccolte.
- Generare un modello iniziale di25. 2D di soggetto scelto particelle tridimensionali (3D) classificazione (circa 5 classi) utilizzando C1 simmetria e un filtro passa-basso di ricostruzione iniziale di 60 Å come modello di riferimento a. Determinare quali classi hanno caratteristiche ad alta risoluzione e combinano le particelle all'interno di tale classe.
- Raffinare ulteriormente particelle usando la raffinatezza locale con simmetria C4 (nel caso di hTRPC3) applicato e impostato un limite ad alta risoluzione per l'allineamento delle particelle a 4.5 Å26.
11. modello di costruzione
- Costruire un modello (Vedi Tabella materiali per il software utilizzato). Per hTRPC3, utilizzare il dominio transmembrana (TMD) della melastatin potenziale transitorio del ricevitore 4 (TRPM4) struttura protein data bank (PDB) 5wp6 come una guida27. Utilizzare ingombranti residui e previsione della struttura secondaria per guidare la costruzione de novo .
- Soggetto il modello iniziale alla raffinatezza di spazio reale con struttura secondaria restrizioni28. Esaminare il modello raffinato e remodify come necessario (vedere Tabella materiali per il software utilizzato) manualmente.
- Applicare Fourier coperture curve di correlazione (FSC) per calcolare la differenza tra il modello finale e la mappa di EM per la convalida della struttura raffinata. Valutare le geometrie dei modelli atomici (Vedi Tabella materiali per il software utilizzato)29,30.
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Representative Results
Una descrizione schematica del protocollo per l'espressione e purificazione di hTRPC3 è mostrati in Figura 1A. Un'immagine della hTRPC3 bacmid piastra con colonie bianchi ideale, simile a quella selezionata per purificazione del DNA di bacmid, è mostrata in Figura 1B. Abbiamo trovato che 48 ore è ideale per la colorazione chiara Bluo-gal mantenendo la presenza di colonie isolate. Picco della produzione di virus P2 per hTRPC3, come visualizzati da fluorescenza GFP, è stato visto dopo 4 d dell'infezione nelle cellule di insetto Sf9 (Figura 1).
Baulovirus P2 è stato raccolto da parte dei media, completati con 1% FBS e utilizzate per infettare una sospensione di cellule di mammifero HEK293. Butirrato di sodio è stato aggiunto per gli infetti cellule 12-18 h dopo il virus a spinta di espressione di proteine20. Le cellule sono state quindi incubate per altre 36 h a 30 ° C. Le cellule sono state raccolte e sottoposto a solubilità e stabilità screening da FSEC (Figura 2A)21. Le cellule sono state solubilizzate utilizzando sette diversi detergenti con valori CMC di 0,01 - 20 mM ad una concentrazione di detersivo circa 10 volte il valore CMC. Dopo solubilizzazione di cellule intere, i detriti di lisi delle cellule è stato rimosso dall'ultracentrifugazione e il supernatante contenente proteine solubilizzate è stato caricato su una colonna SEC ed eseguire su HPLC in n-dodecil-β-D-maltopyranoside/del colesterile hemisuccinate (DDM/CHS) buffer contenente detersivo per confrontare la solubilità assoluta e posizione di volume di picco di hTRPC3 in condizioni diverse rispetto a un controllo di TRPM4 (Figura 2B). Abbiamo scelto di utilizzare DDM/CHS del buffer corrente iniziale per i campioni solubilizzati in diversi detergenti perché DDM/CHS è il più comunemente usato detersivo quando risolvere le strutture delle proteine di membrana. Tutte le differenti detergente-solubilizzato TRPC3 campioni ha mostrato picco posizioni a circa 11,9 mL, che probabilmente è troppo grande, perché la forma tetramerica di hTRPC3 ha un peso molecolare minore rispetto il positivo controllo umano TRPM4 (Figura 2A e Figura 2B).
Tuttavia, poiché non c'era nessuna struttura di qualsiasi ricevitore canale TRPC a confrontare i nostri risultati a e il grande peso molecolare potrebbe essere causato dall'architettura di TRPC3 o di altri fattori, abbiamo effettuato una purificazione su piccola scala di hTRPC3 con 25 mL di soluzione cellule usando DDM/CHS in tutto l'esperimento come DDM/CHS ha dato la migliore solubilità di hTRPC3. Il profilo di SEC di hTRPC3 ha mostrato un picco monodispersi ma era ancora in una posizione di picco che rappresenta un peso molecolare maggiore rispetto a TRPM4 (dati non mostrati). Abbiamo controllato la proteina nella frazione di picco del profilo SEC da EM negativo-macchia, perché è un metodo rapido di verificare la qualità di proteina e richiede una quantità molto piccola di proteine. Nel Micrografo, particelle sono state osservate con due domini transmembrana presenti nella stessa particella. Sembrava che di due hTRPC3 particelle dimerized in un testa a testa modo attraverso l'interazione tra due domini citosolici (Figura 3D). Abbiamo quindi incluso la riduzione reagente ditiotreitolo (DTT) nel buffer di purificazione per la purificazione secondo su piccola scala, sperando di perturbare la dimerizzazione di hTRPC3. Infatti, un secondo picco con peso molecolare inferiore apparso dal frazionamento del SEC. Tuttavia, le particelle è apparso troppo piccole per essere un tetramero intatto e non ha mostrato caratteristiche delle proteine di membrana come un dominio transmembrana. Si è scoperto che il DDM/CHS non era un detergente adatto per hTRPC3, nonostante dando la migliore solubilità per hTRPC3 di purificazione.
Successivamente, abbiamo provato una digitonina detergente, più mite, per solubilizzare hTRPC3 e confrontato con la proteina solubilizzata in DDM/CHS. Qui abbiamo usato due diversi in esecuzione buffer contenente DDM/CHS e digitonina, rispettivamente. Questo era importante dato che il detersivo nel buffer in esecuzione spesso contribuisce alla stabilità proteica e che la proteina della membrana potrebbe diventare instabile quando si modificano i detergenti da solubilizzazione a FSEC. La proteina eseguire in tampone contenente digitonina ha mostrata uno spostamento di picco promettente verso un peso molecolare inferiore quando solubilizzato in DDM/CHS o digitonina. La proteina solubilizzato da ed eseguire in digitonina ha reso il picco più alto in una posizione ragionevole rispetto alla posizione del controllo positivo, TRPM4 umano (Figura 3A). Poi ci siamo spostati in avanti eseguendo una purificazione in piccola scala con 25 mL di cellule. Anche se più e picchi di vasti sono stati osservati da SEC (Figura 3B), la proteina ha mostrato le caratteristiche di un canale singolo tetramerica hTRPC3 in 2D classificazione da EM negativo-macchia (Figura 3 e Figura 3D). Concludiamo che digitonina è un detergente ideale per hTRPC3 di purificazione.
Abbiamo scalato l'espressione di hTRPC3 ed abbiamo effettuato una purificazione di medie dimensioni con 400 mL di cellule in digitonina. Così facendo, abbiamo sperato di ottenere proteine sufficienti per alcune griglie congelati senza perdere medio e detersivo prima abbiamo capito le circostanze finali per la purificazione dell'hTRPC3 su larga scala. Capita spesso che le proteine di membrana mostrano instabilità quando altamente concentrato per la preparazione di griglie congelati. La proteina purificata e concentrata non solo spostato verso un più alto peso molecolare di FSEC, ma inoltre ha mostrato sfondo rumoroso nelle griglie di cryo-EM Imaging utilizzando un microscopio elettronico dotato di una fotocamera EMCCD. Anche se siamo stati in grado di osservare singoli, recettori tetramerica intatti, hTRPC3 purificati in digitonina non era ideale per gli studi ad alta risoluzione cryo-EM.
Per migliorare ulteriormente la stabilità proteica, abbiamo proiettato un gran numero di condizioni descritte nel protocollo passaggio 5. Abbiamo scelto di additivi di schermo sulla base del carattere fisiologico di hTRPC3; ad es., EDTA è stato selezionato perché hTRPC3 è permeabile al calcio e rimuovendo il calcio può stabilizzare la proteina. Di tutti i campioni testati da FSEC in esecuzione nel buffer della digitonina-contenente, 10mm EDTA ha mostrato un effetto notevole sulla stabilizzazione hTRPC3 in una posizione di picco tetramerica intatto (Figura 4A). Anche significativamente aumentato il numero di particelle nel micrografo di cryo-EM ed ha fatto diminuire il rumore di fondo, come mostrato nella Figura 5.
Dopo aver individuato le condizioni ideali per espressione e purificazione, abbiamo effettuato un'espressione su larga scala (2 L) di hTRPC3. Le celle che contengono hTRPC3 sono state raccolte e poi solubilizzate. Ultracentrifuga-chiarito lisato è stato sottoposto a purificazione colonna metallo-affinità batch-legandosi con una resina di cobalto seguita da purificazione in una colonna di gravità. Ritenzione di proteine solubilizzate all'interno della colonna ed eluizione delle proteine purificate per affinità dalla colonna è state verificate da FPLC (Figura 4B). Abbiamo trovato che per hTRPC3, una concentrazione di imidazolo di 15 mM di tampone di lavaggio era sufficiente per rimuovere proteine contaminanti con associazione di resina non specifici e imidazolo 250 mM nel buffer di eluizione era sufficiente per eluire la maggior parte dei hTRPC3 solubilizzate proteina associata alla resina. Tutti i campioni sono stati controllati da FSEC, e le proteine eluite ha mostrato un picco di monodisperse tagliente, in corrispondenza della posizione corretta di picco. Purificato come intrinseca flessibilità tra il tag GFP e la proteina di hTRPC3 può rendere l'allineamento delle particelle della proteina durante l'elaborazione più impegnativo dell'immagine, e perché un sito di clivaggio della trombina è situato tra GFP e hTRPC3, abbiamo testato una piccola quantità di proteina scissione diverse volte utilizzando proteasi trombina. Dato che le proteine eluite incubati con trombina a un 01:20 rapporto molare ha mostrato stabilità ragionevole e scissione completa dopo 2 ore a 4 ° C, siamo spaccati fuori la GFP da tutti la proteina purificata utilizzando le stesse condizioni e controllato da HPLC per confermare che la GFP è stato c completamente rimosso (Figura 4). La proteina è stata ulteriormente purificata di S e la fenditura di GFP ancora possa essere visualizzata tramite lo spostamento della posizione di picco verso un più piccolo peso molecolare (Figura 4). Un piccolo campione non concentrato dalla frazione cima principale è stato usato per fare le griglie per EM negativo-macchia. Tutte le frazioni contenenti il hTRPC3 tetramerica sono stati poi combinate e reconcentrated a una concentrazione finale di 5 mg/mL, che è stato usato per preparare le griglie per l'imaging di cryo-EM. Come abbiamo osservato quella parte della proteina ancora gradualmente spostato verso un più grande peso molecolare, abbiamo raccolto solo le frazioni presso il peso molecolare corretto e ha congelato le griglie immediatamente dopo purificazione della proteina. Solitamente abbiamo completato la sequenza di esperimenti da purificazione della proteina per preparazione di griglie congelati all'interno di un singolo giorno.
Un campione di 2,5 µ l di proteina purificata hTRPC3 (concentrazione 5mg/mL) è stato applicato su una griglia di carbonio holey Scarica a bagliore. Una macchina di vitrificazione è stata utilizzata per preparare la griglia, utilizzando un 1.5 s macchiare tempo sotto 100% umidità seguita da un tuffo in etano liquido raffreddato con azoto liquido. Questo passaggio si blocca il campione in ghiaccio vitreo per l'imaging. Immagini sono state catturate a 130.000 X ingrandimento nominale da un microscopio elettronico di cryo operato a 300 kV. Serie di immagini sono state registrate a Super-risoluzione conteggio modalità con una dimensione di pixel binned di 1.074 Å e un valore nominale defocus, che vanno da 1,0 a 2,5 μm utilizzando un rivelatore di elettroni diretto e acquisizione software automatizzato. Ogni immagine era dose-frazionato a 40 fotogrammi con un tempo di esposizione totale di 8 s (0,2 s per fotogramma) e un tasso di dose di 6,76 e− Å−2 s−1. Un rappresentanza Micrografo da questo set di dati è illustrato nella Figura 5.
Correzione dei movimenti e la stima dei valori di defocus degli stack sommati film è stato effettuato. Circa 200 micrografie risultante sono stati utilizzati come fonte per la raccolta manuale delle particelle e iniziale classificazione privo di riferimento 2D31. Nove rappresentative 2D classe medie da questa classificazione iniziale sono state selezionate e utilizzate come modelli per il prelievo delle particelle automatizzati per l'intero set di dati. Un controllo manuale delle particelle di autopicked è stato effettuato per rimuovere particelle ovviamente male, quindi tre turni di classificazione 2D sono stati applicati per rifinire la selezione delle particelle autopicked (Figura 5). Queste particelle selezionate 2D-classe sono state classificate in cinque classi 3D utilizzando un filtro passa-basso di 60 Å come un modello di riferimento iniziale. Di queste cinque classi, unico visualizzato le caratteristiche ad alta risoluzione (Figura 5). Particelle da questa classe sono stati ulteriormente sottoposti a raffinatezza locale con un limite di alta risoluzione di 4.5 Å e C4 simmetria applicata (Figura 5)32. Il modello raffinato è stato esaminato e modificarle manualmente. La raffinata struttura è stata convalidata dal calcolo delle curve FSC per determinare la differenza tra il modello finale ed EM mappa e dalla valutazione delle geometrie dei modelli atomici33.
Costruzione di modello iniziale è stato effettuato utilizzando il dominio TMD della struttura TRPM4 (PDB 5wp6) come una guida34. Edificio de novo del modello di hTRPC3 era principalmente guidato da residui ingombranti e previsione della struttura secondaria, con i molti α eliche nella struttura notevolmente facilitare l'assegnazione del registro. Nel iniziale de novo-costruito il modello, l'ordine, la lunghezza e la posizione del secondari caratteristiche strutturali e ingombranti residui sono in stretto accordo con la previsione. Raffinatezza, si tenne la risoluzione di un limite inferiore rispetto alla risoluzione stimato per la ricostruzione finale. FSC tridimensionale è stato usato per misurare il coefficiente di correlazione normalizzato tra due mappe 3D indipendentemente generate (ogni utilizzando metà del set di dati) sopra le coperture corrispondente nello spazio di Fourier (in funzione della frequenza spaziale). Abbiamo impiegato una maschera morbida di 4.3 Å dalla ricostruzione e un 4.3 ulteriori Å coseno morbido bordo insieme a un filtro passa-basso di 10 Å, allora utilizzate il gold standard FSC 0.143 soglia di cut-off. Questo è stato usato per la segnalazione di risoluzione finale.
Figura 1: espressione e purificazione di hTRPC3 utilizzando il sistema di BacMam. (A) procedura schematica per hTRPC3 espressione e purificazione. (B) Bacmid selezione di Colonia sulla piastra indicatore blu-bianco. Scegliere una colonia bianca isolata (freccia nera), non una colonia bianca con una radicata Colonia blu o una colonia bianca a contatto con una colonia blu (frecce rosse). (C) GFP fluorescenza di baculovirus P2 in Sf9 cellule sotto i 20 ingrandimenti. Fluorescenza dovrebbe essere presente sulla membrana delle cellule e/o all'interno della maggior parte delle cellule per un virus potente e brillante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: proiezione di stabilità di hTRPC3 di FSEC. (A) detergente proiezione del hTRPC3. Il hTRPC3 era intero-cellula solubilizzata in una varietà di detergenti con una concentrazione micellare critica di 0.01 - 20 mM ed era gestito nel buffer di DDM/CHS-contenente. Anche se DDM/CHS Mostra la solubilità massima di hTRPC3, il picco viene visualizzato nella posizione sbagliata, troppo grande per essere il hTRPC3 tetramerica (blu traccia). (B) controllo di TRPM4, con un peso molecolare tetramerica del kDa circa 540, solubilizzate e gestito nel DDM/CHS, aveva un volume di eluizione di circa 12,9 mL, mentre TRPC3, con un peso molecolare tetramerica del kDa circa 400, solubilizzato ed eseguire nel DDM/CHS, aveva un volume di eluizione di circa 11,9 mL. Con un peso molecolare minore, hTRPC3 dovrebbe avere un volume di eluizione leggermente più grande di TRPM4, non leggermente più piccolo, suggerendo che il DDM/CHS non può essere un detergente ideale per hTRPC3 solubilizzazione e purificazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: proiezione di tampone detergente di hTRPC3 di FSEC. (A) solubilità e stabilità test di hTRPC3 utilizzando digitonina. Digitonina è stata testata sia per solubilizzazione e nel tampone di corsa. Si noti la posizione del picco di hTRPC3 proteine solubilizzate in digitonina spostata verso un più grande volume di eluizione in confronto la proteina solubilizzato in DDM/CHS (traccia gialla vs blu e rosso le tracce). Solo la combinazione utilizzando digitonina nei buffer di solubilizzazione sia in esecuzione Mostra la corretta dimensione del hTRPC3 di FSEC (traccia gialla, asterisco). (B) simile ai risultati FSEC della intero-cellula solubilizzate hTRPC3, la posizione del picco di hTRPC3 affinità di proteina purificata in digitonina (traccia rossa, 14 mL) spostata verso un più grande volume di eluizione in confronto l'affinità della proteina purificata nel DDM/CHS (blu tracciare, 12ml) come misurato dal SEC-frazionamento. (C) negativo-macchia EM è stato utilizzato per verificare la qualità della proteina purificata prima della raccolta di dati di cryo-EM. Una macchia ideale dovrebbe presentare particelle (cerchi rossi) macchiate negativamente (che appare bianco) e circondato da un anello di detersivo (che appare nero). Viene mostrato un rappresentante, microfotografia ideale in cui queste particelle sono abbondanti, monodispersed e presente in diverse posizioni. (D) qualità dei dati da negativo-macchia EM dovrebbe fornire classi 2D con una chiara e coerenza architettura generale e dovrebbe comprendere più orientamenti della proteina, con medie contenute e centrato all'interno della maschera (cerchio nero). Classi 2D da micrografie EM negativo-macchia di hTRPC3 solubilizzato in particelle presenti DDM/CHS che sembrano essere una testa a testa dimerizzazione di monomeri hTRPC3. Al contrario, una ruvida (ma chiara e coerente) nel complesso ghianda-come la struttura tetramerica è ravvisabile nelle classi 2D da micrografie EM negativo-macchia di hTRPC3 solubilizzato in digitonina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: purificazione di hTRPC3. Test di stabilità (A) di hTRPC3 in presenza di EDTA. hTRPC3 è stato solubilizzato in digitonina in presenza (linea rossa) o assenza (traccia blu) di 10 mM EDTA. Il primo ha mostrato un picco singolo e più stretto nella posizione di proteina tetramero (traccia rossa, asterisco), che indica che l'EDTA stabilizzata hTRPC3 nella sua conformazione tetramerica. (B) GFP fluorescenza segnale FSEC per hTRPC3 solubilizzato in digitonina ed eseguire nel buffer di digitonina. Il picco del tetramero è osservato in materiale solubilizzato prima della purificazione di affinità di metallo colonna (traccia blu, asterisco). L'assenza di questo picco nella frazione del flusso continuo indica un'associazione completa della proteina hTRPC3 nella colonna di affinità (traccia rossa). Dopo eluizione di imidazolo, le frazioni nel picco di eluizione sono state controllate da FSEC (traccia verde). Tutte le frazioni picco tetramero intatti sono stati raccolti per ulteriore purificazione. (C) Test di fenditura GFP, del hTRPC3, utilizzando trombina. Tempo di digestione è stato testato utilizzando una piccola quantità di proteina a 4 ° C, e la completezza della digestione era controllata dagli FSEC. In ogni traccia, il picco a sinistra corrisponde al picco del tetramero di hTRPC3 (asterisco) e il picco sulla destra è il picco GFP gratis. Mentre la lunghezza della digestione è aumentato, il rapporto della proteina tetramerica gratuita GFP è diminuito, che indica che la GFP è stato essere fenduto dalla proteina. La digestione di 2h Mostra una scissione completa di GFP. Profilo (D) SEC di hTRPC3 prima o dopo la digestione di trombina in digitonina contenente tampone di corsa con 10 mM EDTA aggiunto. Come previsto, la posizione del picco è spostata verso il più piccolo volume di eluizione dopo digestione della trombina (traccia rossa). La vetta principale (asterisco) rappresenta il hTRPC3 tetramerica. Le frazioni tra linee rosse sono stati raccolti per esperimenti di cryo-EM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: schematico di cryo-EM dati raccolta ed il trattamento per hTRPC3. La collezione di 3.660 pile di film di hTRPC3 purificato è stato fatto utilizzando un microscopio elettronico con un rivelatore di elettroni diretto. Correzione dei movimenti e selezione manuale sono state applicate con conseguente 3.580 micrografie. Le particelle sono stati autopicked e sottoposti a classificazione 2D. Classi 2D sono state ulteriormente affinate mediante classificazione 3D. Solo uno su cinque classi 3D visualizzato le caratteristiche ad alta risoluzione. Questa classe è stata selezionata per 3D ricercatezza e raffinatezza locale Frealign, risultante in una struttura per hTRPC3 a 3,3 Å risoluzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Determinazione strutturale delle proteine da cryo-EM ha rivoluzionato il campo della biologia strutturale negli ultimi anni, grazie allo sviluppo delle nuove telecamere e algoritmi che velocizza notevolmente la determinazione della struttura delle proteine che non prontamente cristallizzarsi, in particolare proteine di membrana. Nonostante tutti i recenti progressi nella tecnica di cryo-EM, la preparazione delle proteine purificate in qualità e quantità sufficiente per facilitare ad alta-qualità delle immagini spesso rimane che richiede tempo, costoso e impegnativo. La capacità di esprimere rapidamente e schermo gene multiplo costruisce in una varietà di condizioni di purificazione, come descritto nel protocollo precedente, migliora l'efficienza di questo processo, consentendo la produzione rapida e conveniente di alta qualità proteina purificata per uso negli studi di cryo-EM.
Mentre il metodo qui descritto fornisce un modo per purificare grandi quantità di proteine di membrana dei mammiferi a costo inferiore a quello di transfezione diretta e più rapidamente che dalla generazione di una linea cellulare stabilmente trasfettate, ha molti passaggi, ognuno dei quali deve essere ottimizzato per fornire un rendimento di proteine di alta qualità. All'interno di tecniche biochimiche usate per produrre e purificare hTRPC3, ci sono una serie di passaggi critici e i punti di controllo. Il primo punto di controllo critico è la produzione di bacmid del DNA. Come descritto nei risultati, selezione di Colonia ideale è il primo passo nella generazione di un virus di qualità per l'espressione della proteina. Inoltre, se la concentrazione di bacmid DNA purificato dalla colonia selezionata è inferiore a 1 μg/μL, il virus risultante non sarà sufficiente per l'espressione della proteina robusto. Secondo punto di controllo critico è la produzione di baculovirus P1 e P2. Titolo del virus può essere stimato mediante fluorescenza GFP, come illustrato nella Figura 1 o può essere misurata come descritto da Coleman et al. 35. oltre al titolo virale, un corso di tempo di tempo di infezione dovrebbe essere intrapreso per ogni nuovo costrutto determinare il momento ottimale di infezione per l'espressione massima della proteina. Punto critico di controllo tre è la solubilità e la stabilità screening illustrato nella Figura 2. Detergenti con un CMC alto, ad esempio DDM, possono fornire ad alta solubilità, ma non sono l'ideale per l'imaging di cryo-EM perché possono causare un'abbondanza delle micelle di contaminanti. Un detergente più delicato, come digitonina, in grado di fornire sufficiente solubilità, preservando la stabilità proteica. Lo screening di additivi, come l'EDTA in caso di hTRPC3, è importante per scoprire una condizione di purificazione che si traduce in proteine intatte e omogenea, probabilmente rimuovendo il calcio dal hTRPC3, che è permeabile al calcio. Punto di controllo critico quattro è la verifica dell'acquisizione di proteine specifiche ed efficiente durante la purificazione di colonna di affinità e l'osservazione di un picco di proteina ideale durante il SEC-frazionamento (Figura 4). Evitare l'inclusione di particelle di proteine contaminanti mantenendo tutti della proteina bersaglio è fondamentale per ottenere una resa abbastanza alto di proteine per l'imaging di cryo-EM. Alterazione del tempo e del rapporto di resina per proteine solubilizzate batch-associazione può contribuire a migliorare la ritenzione proteica tramite la colonna di resina. La qualità complessiva del picco SEC-frazionamento è nella nostra esperienza il migliore indicatore, prima dell'imaging, della qualità delle particelle della proteina purificata. Un basso o un vasto picco durante il SEC-frazionamento indica possibili problemi di troppo poche particelle di proteina per immagine o la presenza di contaminanti prodotti di aggregazione/degradazione della proteina, rispettivamente. Inoltre, le modifiche al tag di affinità all'interno del costrutto stesso ha dimostrato necessario in alcuni casi per assicurare il sufficienti affinità-tag associazione. Il checkpoint finale prima della raccolta del set di dati di cryo-EM è la verifica della qualità delle particelle della proteina da negativo-macchia EM. Mentre non è strettamente necessario, troviamo che questo fornisce un'eccellente opportunità per problemi di qualità di proteina di spot e corretta prima di investire nel processo ad alta intensità di tempo e di costo della raccolta di dati da cryo-EM.
Un metodo alternativo per produrre proteine per studi strutturali cryo-EM è la purificazione diretta della proteina dall'origine tessuto nativo. Mentre questo metodo incontra spesso problemi con resa di proteina, è un'ottima alternativa per le proteine che sono molto abbondanti nelle cellule o che esiste come parte di un grande complesso della multi-proteina, che può essere difficile produrre utilizzando una sovraespressione ricombinante sistema36. Tuttavia, per singole proteine espresse in quantità moderata o bassa in condizioni fisiologiche, il sistema di espressione e purificazione presentato qui è un efficiente metodo relativamente basso costo e ad alto rendimento per la produzione di purificato e proteine di membrana dei mammiferi per gli studi strutturali di cryo-EM. Un metodo che potrebbe integrare fortemente che qui presentato è la ricostituzione della proteina purificata in lipidi nanodiscs prima del cryo-EM dati raccolta37. Sotto questo metodo, le proteine sono inserite in un piccolo disco di doppio strato lipidico, probabilmente fornendo un microambiente nativo-come rispetto ai detergenti micelle, anche se non ci sono prove finora che le strutture sciolto in detergente e nanodisc sono diversi38,39,40. Un altro approccio consiste nell'estrarre la proteina direttamente utilizzando polimeri amphipathic come anidride maleica dello stirolo (SMA), che è stato utilizzato con successo per la determinazione della proteina di membrana strutture41,42.
Questi approcci descritti in questo manoscritto hanno dimostrato di essere facilmente adattabile nel nostro laboratorio per una varietà di altre proteine di membrana dei mammiferi di là di canali ionici. Pertanto, riteniamo che questo protocollo sarà uno strumento prezioso nelle analisi strutturali e funzionali che sono alla base della progettazione di farmaci mirati ad alta specificità. Questo sarà particolarmente utile nelle malattie neurodegenerative, malattie cardiovascolari e cancro, in cui ioni canali sono bersagli difficili ma ad alto potenziale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Si ringraziano G. Zhao e X. Meng per il supporto con raccolta di dati presso il David Van Andel Advanced Cryo-Electron microscopia Suite. Apprezziamo il team VARI High-Performance Computing per supporto computazionale. Noi diamo la nostra gratitudine a N. Clemente, D. debiti, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth e Ruan z per i commenti che ha notevolmente migliorato questo manoscritto. Si ringrazia D. Nadziejka per supporto editoriale per questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da interno VARI finanziamenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent - to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
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