Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58754
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 1
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus
* These authors contributed equally

Summary

ويصف هذا البروتوكول التقنيات المستخدمة لتحديد هياكل قناة أيون بالميكروسكوب cryo-الإلكتروني، بما في ذلك نظام باكولوفيروس لكفاءة التعبير عن الجينات في خلايا الثدييات مع الحد الأدنى من الجهد وسمية واستخراج البروتين وتنقية، والتحقق من الجودة، وإعداد شبكة العينة والفحص، فضلا عن جمع البيانات وتجهيزها.

Abstract

عابر مستقبلات القنوات المحتملة (تربكس) من فصيلة الراديكالي المتعارف عليه هي قنوات الأيونات الموجبة نونسيليكتيفي التي تلعب دوراً أساسيا في التوازن الكالسيوم، دخول خاصة تعمل على تخزين الكالسيوم، هو أمر حيوي للحفاظ على وظيفة مناسبة من الإصدار حويصلة متشابك ومسارات الإشارات داخل الخلايا. وبناء على ذلك، قد تورط القنوات TRPC في مجموعة متنوعة من الأمراض البشرية بما في ذلك اضطرابات القلب والأوعية الدموية، مثل تضخم القلب واضطرابات الأعصاب مثل مرض باركنسون، واضطرابات الجهاز العصبي مثل ترنح spinocerebellar. ولذلك، تمثل قنوات TRPC هدفا دوائية محتملة في الأمراض التي تصيب الإنسان. بيد أن آليات الجزيئية النابضة في هذه القنوات لا تزال غير واضحة. كانت صعوبة الحصول على كميات كبيرة من البروتين مستقرة ومتجانسة، وتنقية عاملاً مقيداً في هيكل تصميم الدراسات، خاصة بالنسبة للبروتينات الغشاء الثدييات مثل قنوات أيون TRPC. نقدم هنا، على بروتوكول للتعبير على نطاق واسع من الثدييات أيون قناة بروتينات الغشاء باستخدام نظام نقل جينات باكولوفيروس معدلة وتنقية هذه البروتينات بالنسب وحجم الاستبعاد اللوني. ونقدم كذلك بروتوكولا لجمع الصور مجهرية واحدة-الجسيمات cryo-إلكترون من البروتين المنقي واستخدام هذه الصور لتحديد بنية البروتين. تصميم الهيكل وسيلة قوية لفهم آليات النابضة والدالة في قنوات أيون.

Introduction

ويشارك الكالسيوم في العمليات الأكثر الخلوية بما في ذلك إشارات التحكم النسخ والإفراج العصبي، الشلالات وهرمون جزيء توليف1،،من23. الحفاظ على التماثل الساكن سيتوسوليك الكالسيوم الحرة أمر حاسم لصحة ووظيفة الخلايا. إحدى الآليات الرئيسية لاستتباب الكالسيوم داخل الخلية هو الكالسيوم تعمل بمخزن الإدخال (سوسي)، المخزنة في المشغلات هيولى (ER) على استنزاف الكالسيوم الذي فتح قنوات أيون في غشاء البلازما لتسهيل عملية تجديد ER الكالسيوم، التي يمكن استخدامها بعد ذلك في زيادة الإشارات4،،من56. وقد حددت عابر مستقبلات القنوات المحتملة (تربكس)، وقنوات الكالسيوم نفاذية تنتمي إلى فوق عائلة الراديكالي، كمشارك رئيسي في سوسي7،،من89 .

من بين سبعة أعضاء في الأسرة TRPC، TRPC3، TRPC6، و TRPC7 تشكيل فريق فرعي المناظرة، وفريدة من نوعها في القدرة على تنشيط بواسطة دهن diacylglycerol رسول الثانوي (همرشولد)، منتج التحلل من الدهون مما يشير إلى فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي (PIP2)10،11. وتعرب TRPC3 عاليا في العضلات الملساء وفي مناطق المخ والدماغ في الدماغ، حيث تقوم بأدوار أساسية في الكالسيوم مما يشير إلى أن تأثير كبيرة والخلايا،من1213. ارتبط ضعف TRPC3 لاضطرابات الجهاز العصبي المركزي، واضطرابات القلب والأوعية الدموية، وبعض أنواع السرطان مثل غدية المبيض14،،من1516. ولذلك، يبشر TRPC3 كهدف الأدوية لعلاج هذه الأمراض. وقد حدت استحداث أدوية تستهدف على وجه التحديد بناء على TRPC3 عدم فهم آلياتها التنشيط الجزيئي، بما في ذلك الدهن ملزم مواقع17،18. أبلغنا بنية الذرية القرار الأولى للقناة TRPC3 البشرية (hTRPC3) ومواقع اثنين الدهن ملزمة في حالة مغلقة، توفير معلومات هامة عن هذه الآليات19.

العامل الرئيسي لتحديد هيكل بروتين الغشاء بدقة عالية للحصول على البروتين ذات جودة عالية. ويمكن فحص المقابلة للتعبير وتنقية من الشروط اللازمة للحصول على جودة عالية البروتين مسعى تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفا. وهنا يقدم بروتوكول تصف بالتفصيل كيف يمكننا تحديد الظروف المثلى للتعبير وتنقية hTRPC3، التي تصرفت بشكل ضعيف في الفحص الأولى لدينا. نحن نقدم العديد من النقاط الرئيسية حول كيفية استكشاف أخطاء وإصلاحها وتحسين سلوك البروتين، التي ترسي أساسا متينا للبرد-إلكترون لدينا دراسات مجهرية (cryo-م). ونحن نستخدم باكولوفيرال معدلة توليد متجه (شماعة)، التي وضعتها جو والزملاء، والذي هو الأمثل للفحص فحوصات وكفاءة توليد باكولوفيروس في خلايا الثدييات20. هذا أسلوب التعبير من المناسب أوفيريكسبريشن سريعة وفعالة من حيث التكلفة للبروتينات في غشاء خلايا الثدييات. ونحن الجمع بين استخدام هذه المتجهات مع الأسفار-الكشف عن حجم استبعاد اللوني القائم (فسك) فرز طريقة21. هذا الأسلوب يستخدم علامة البروتينات فلورية خضراء (بروتينات فلورية خضراء) تنصهر فيها بناء تهم ويحسن تصور البروتين المستهدف في عينات سولوبيليزيد الصغيرة، وكامل الخلية. هذا يسمح لفحص البروتين الاستقرار حضور مختلف المنظفات والمواد المضافة، مع الطفرات ثيرموستابيليزينج، ويسمح باستخدام عدد صغير من الخلايا من تعداء عابر الصغيرة. وبهذه الطريقة، يمكن فحص العديد من الظروف سريعاً قبل أن ينتقل إلى تنقية بروتين على نطاق واسع. في أعقاب التعبير، والفرز، وتنقية، نقدم بروتوكول للحصول على ومعالجة الصور من البرد-م لتوليد تصميم هيكلي حيثياته من البروتين. ونحن نعتقد أن النهج الموصوفة هنا سيكون بمثابة بروتوكول التعميم لدراسات هيكلية الحزب قناة المستقبلات والبروتينات الغشاء الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-تحويل الخلايا المختصة DH10α لإنتاج باكميد الحمض النووي

  1. توليف في الجينات للفائدة وسوبكلون أنه في نسخة معدلة من ناقلات الوتد الذي يحتوي على علامة بكتيريا توأم، His8--الوسم، والتجارة والنقل مع موقع انقسام ثرومبين في المحطة النهائية (بفاستباسي) ن20.
  2. تحويل الخلايا المختصة بإضافة 5 نانوغرام بلازميد المحتوية على جين المرغوب في بفاستباسي إلى 50 ميكروليتر من DH10α الخلايا في 1.5 مل أنبوب واحتضان لمدة 10 دقائق على الجليد. صدمة الحرارة الخلايا ل 45 ثانية في 42 درجة مئوية. إضافة 200 ميكروليتر من مرق سوبر الأمثل مع المتوسطة قامع تقويضي (شركة نفط الجنوب) إلى الأنبوبة واحتضانها ح 4-8 في 37 درجة مئوية في شاكر مداري 225 لفة في الدقيقة.
  3. لوحة 5 ميكروليتر من الخلايا على طبق أجار باكميد رطل (50 ميكروغرام/مل كاناميسين، 7 ميكروغرام/مل الجنتاميسين، أجار التتراسيكلين و 100 ميكروغرام/مل بلوو-غال 40 ميكروغرام/مل الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي [إيبتج]، 10 ميكروغرام/مل).
  4. احتضان لوحة ل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: بلو-غال مؤشر المستعمرات البقع التي لا تزال تعرب عن لاكز (ناقل الإدراج غير الناجحة)، والسماح للتحديد الأبيض المستعمرات (محولة بنجاح).
  5. حدد بعناية مستعمرة بيضاء معزولة، تجنب أي مستعمرات البيضاء التي هي على اتصال بالمستعمرات الزرقاء، وتنمو خلايا بين عشية وضحاها في 6 مل متوسطة باكميد رطل (50 ميكروغرام/مل كاناميسين، 7 ميكروغرام/مل الجنتاميسين، التتراسيكلين 10 ميكروغرام/مل) في 37 درجة مئوية في شاكر مداري 225 لفة في الدقيقة.

2-البكتيرية أعدادا لعزل باكميد الحمض النووي

  1. لعزل الحمض النووي باكميد، تدور أسفل خلايا الإشريكيّة القولونية لمدة 10 دقائق في 2880 x ز.
  2. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر الحل استثارة خلية من مينيبريب كيت (انظر الجدول للمواد) التي بيبيتينج. تأكد من أن تعليق بيليه هو تماما والمتجانس. ثم قم بنقل تعليق خلية في أنابيب 1.5 مل.
  3. إضافة 200 ميليلتر من الحل تحلل الخلية من مجموعة مينيبريب ومزيج بعكس الأنبوبة عدة مرات. احتضان لمدة تصل إلى 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) في الخلايا. إضافة 200 ميليلتر لتحييد الحل من مجموعة مينيبريب ومزيج بعكس الأنبوبة عدة مرات لوقف رد الفعل تحلل.
  4. تدور إلى أسفل لمدة 10 دقيقة في س 21,130 ز في أجهزة الطرد مركزي في أعلى الجدول. جمع 600 ميكروليتر من المادة طافية في أنبوب 2 مل. إضافة 600 حل الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل ميكروليتر (انظر الجدول للمواد)، ومزيج دقيق لاستخراج الحمض النووي من الجزء المتبقي منتجات تحلل الخلية.
    تنبيه: الفينول: كلوروفورم: إيسواميل الكحول الحل السمية بالاستنشاق، على اتصال بالجلد، وإذا ابتلع. أنها يمكن أن تسبب الحروق الكيميائية، وقد تكون مسببة للسرطان. ارتداء القفازات ومعطف مختبر زرر. ويعمل في غطاء دخان. التخلص من هذه النفايات الخطرة على النحو المناسب.
  5. تدور أنبوب لمدة 10 دقيقة في 21130 س ز في أجهزة الطرد مركزي في أعلى الجدول. مرحلتين السائل منفصلة ستكون مرئية. نقل 300 ميكروليتر المرحلة المائية العليا بعناية إلى أنبوب جديد. إضافة 600 ميكروليتر من الإيثانول 100% يغسل الحمض النووي. عكس أنبوب للمزيج بلطف.
    ملاحظة: لا دوامة، كهذا يمكن قص الحمض النووي باكميد.
  6. أنابيب باردة بوضعها في ثلاجة-20 درجة مئوية للحد الأدنى 10 تدور إلى أسفل لمدة 10 دقيقة في س 21,130 ز في أجهزة الطرد مركزي في أعلى الجدول. تجاهل المادة طافية والحفاظ على بيليه الحمض النووي.
  7. أضف 1 مل إيثانول 70% لغسل بيليه. عكس أنبوب للمزيج بلطف. تدور لمدة 10 دقيقة في س 21,130 ز في الطرد مركزي جدول أعلى. تجاهل المادة طافية وتسمح بيليه للهواء الجاف لمدة 5 دقائق تقريبا أو حتى أي سائل غير مرئية في الأنبوب وبيليه الحمض النووي يصبح شفاف.
  8. ريسوسبيند بيليه الجافة في 50 ميكروليتر معقمة وخالية من الدناز، منزوع الماء. قياس تركيز الحمض النووي.
    ملاحظة: لا تجميد الحمض النووي باكميد. تخزين في 4 درجات مئوية ليصل إلى عدة أيام.

3-تعداء الخلايا Sf9 الحشرات مع باكميد لإنتاج باكولوفيروس P1

  1. بذور 0.9 × 106 الخلايا Sf9/بئر في 2 مل الوسيلة المناسبة (انظر الجدول للمواد) في كل من لوحة زراعة الأنسجة 6-جيدا جيدا. احتضان الخلايا عند 27 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتعزيز مرفق اللوحة.
    تنبيه: الثقافات الخلية هي الإخطار محتملة. العمل في هود الاندفاق الصفحي معتمدة استخدام تقنيات العقيم والتحقق من المبادئ التوجيهية للملابس الواقية الموصى بها والتخلص السليم من النفايات قبل إجراء التجارب المؤسسية والحكومية.
  2. بعد الإلحاق، إضافة 8 ميليلتر من تعداء كاشف (انظر الجدول للمواد) إلى 100 ميليلتر لوسائل الإعلام لكل بئر من 6 أيضا لوحة يجري transfected في أنبوب عقيم. إضافة 6 ميكروغرام من باكميد الحمض النووي إلى 100 ميليلتر من المتوسطة في أنبوب عقيم منفصلة. احتضان 5 دقيقة في حلول الرايت الجمع بين الاثنين، واحتضان لمدة 45 دقيقة في الرايت
  3. يستعاض عن المتوسط في الآبار 6 مع 2 مل متوسطة جديدة. إضافة الخليط من الخطوة السابقة لكل منهما جيدا دروبويسي (200 ميليلتر للبئر الواحد). روك بلطف لوحة لضمان خلط الحل تعداء في المتوسط.
    ملاحظة: لا عباب أو اهتزاز اللوحة لأن هذا سوف يسبب الخلايا لفصل.
  4. احتضان خلايا لمد 5 (120 ساعة) في حاضنة هوميديفيد 27 درجة مئوية. تحقق من الأسفار بروتينات فلورية خضراء قبل الحصاد للتحقق من أن الفيروس يتم إنتاجه في نسبة كبيرة من الخلايا؛ في حالة انخفاض النسبة المئوية، تمديد فترة الحضانة حسب الضرورة (انظر الشكل 1).
  5. جمع الفيروس P1 تتضمن طافية (حوالي 2 مل من كل بئر). تصفية المتوسطة التي تحتوي على الفيروسات P1 إلى أنابيب 2 مل باستخدام حقنه 3 مل والصغيرة من 0.2 ميكرون تصفية. إضافة المصل البقري الجنين العقيمة (FBS) إلى تركيز نهائي من 1%.
    ملاحظة: هذا المخزون من الفيروسات P1 يجب تخزينها في 4 درجات مئوية، وتكون محمية من الضوء.

4-عدوى خلايا الحشرات Sf9 مع باكولوفيروس P1 لإنتاج باكولوفيروس P2

  1. إعداد 200 مل (أو المجلد المطلوب) من الخلايا Sf9 بتركيز 0.8-0.9 × 106 خلايا/مل في المتوسط المناسبة (انظر الجدول للمواد) في قارورة ثقافة Erlenmeyer مسطحة قاع ذات حجم كاف.
    ملاحظة: لتعليق الثقافة، لا ينبغي أن يتجاوز حجم يستخدم 40% السعة الإجمالية لقارورة.
  2. إضافة نسبة مساحية (v/v) من مخزون فيروس P1 من 3.5 إلى ثقافة تعليق خلية Sf9. احتضانها لوقت التعبير الأمثل الفيروس (عادة 48-120 ح اعتماداً على بناء البروتين) عند 27 درجة مئوية في شاكر مداري في 115 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: يمكن تحديد التعبير النسبي الفيروس عن طريق عرض fluorescence بروتينات فلورية خضراء من الفيروس في عينة من الثقافة.
  3. الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 40 دقيقة في 11,520 س ز وجمع الفيروس P2 يتضمن طافية. تصفية المادة طافية باستخدام المتاح من 0.2 ميكرون مرشحات. إضافة FBS إلى تركيز نهائي من 0.5 في المائة.
    ملاحظة: هذا المخزون من الفيروسات P2 يجب تخزينها في 4 درجات مئوية، وتكون محمية من الضوء.
  4. الحصول على من عيار الفيروس P2 استخدام الخلايا Sf9easy أو عداد فيروس.

5-عدوى خلايا الثدييات HEK293 مع باكولوفيروس P2 للتعبير البروتين على نطاق واسع

  1. إعداد وحدة تخزين المرغوب فيه HEK293 خلية الثدييات تعليق الثقافة (مستحسن ل 4-6 لإعداد شبكات المجمدة) بتركيز x 3.5-3.86 10 خلايا/مل في الأجلين المتوسط والتعبير (انظر الجدول للمواد) تستكمل مع 1% (v/ v) العقيمة FBS في قوارير الثقافة Erlenmeyer السفلي في حيرة من حجم كاف.
    ملاحظة: لتعليق الثقافة، لا ينبغي أن يتجاوز حجم يستخدم 40% الحجم الإجمالي لقارورة.
  2. إضافة 8% (v/v) من الفيروسات P2 الحل الأسهم من الخطوة 4، 3 إلى ثقافة تعليق خلية HEK293. احتضان عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري 135 لفة في الدقيقة.
  3. إضافة butyrate الصوديوم 10 ملم في ح 12-18 ما بعد الإصابة. احتضانها لوقت التعبير الأمثل من البروتين (عادة ح 36-72) في 30 درجة مئوية.
  4. حصاد الخلايا من سينتريفوجينج لمدة 20 دقيقة في 2,880 س ز. تغسل الخلايا التي ريسوسبيندينج في حوالي 100 مل تريس مخزنة المالحة (تبس) للتر الواحد من الخلايا تحصد. الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 20 دقيقة في 2,880 س ز وجمع بيليه الخلية.
    ملاحظة: قد يكون مؤقتاً في البروتوكول هنا. يمكن تجميد المفاجئة في النتروجين السائل الكريات الخلية وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى تنقية.
    تنبيه: قد يسبب نيتروجين سائل بيرنز المبردة أو الإصابة. فقد يتسبب قضمه الصقيع. وقد تحل محل الأكسجين ويسبب الاختناق السريع. ارتداء القفازات العازلة الباردة ودرع الوجه.
  5. جمع المحاصيل صغيرة 1 مل في نقاط زمنية مختلفة، وجعل ح 2 في 4 درجات مئوية مع هزاز أو إثارة حضور المنظفات المختلفة و/أو إضافات. يمكن توضيح هذه العينات solubilized كامل الخلية الصغيرة تنبيذ فائق في × 235,000 ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية وتشغيل كعينة ميكروليتر 30 على عمود حجم الاستبعاد لوني (ثانية) (انظر الجدول للمواد) لتحديد أفضل وقت بالنسبة التعبير وفي أفضل ظروف سولوبيليزيشن.
    ملاحظة: في حالة hTRPC3، شمل هذا الفحص مخازن مختلفة مع قيم الأس الهيدروجيني من 4.0-9.5 وتركيزات الملح من 50-500 مم؛ التراكيب الأيونية مختلفة (مثل مجكل2 أو كلوريد الصوديوم)؛ المنظفات المختلفة مع قيم تركيز (CMC) مذيل الحرجة من 0.1-20 مم؛ تقليل المواد المضافة مثل ديثيوثريتول، tris(2-carboxyethyl) الفوسفين، وبيتا-ميركابتوثانول؛ والكالسيوم خالب حمض الإيثيلين المضافة (يدتا).

6-تنقية البروتين hTRPC3 من "بيليه خلية مجمدة"

  1. ذوبان الجليد بيليه في المخزن المؤقت الذي يحتوي على 20 مم تريس (pH 8.0)، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 1 مم فينيلميثيلسولفونيل الفلوريد (بمسف)، 0.8 ميكرومتر aprotinin، 2 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، بيبستاتين 2 مم أ، وحصاد ديجيتونين 1%، باستخدام 100 مل من المخزن المؤقت للتر الواحد من الخلايا. بمجرد إذابة، ضمان التجانس للحل قبل بيبيتينج أو إثارة. السماح لجعل ح 2 في 4 درجات مئوية في كوب مغمورة في الثلج بالتناوب شريط إثارة.
  2. إزالة الحطام خلية بواسطة تنبيذ فائق في × 235,000 ز ح 1 في 4 درجات مئوية. التحقق من كمية البروتين عن طريق تشغيل عينة ميكروليتر 30 على عمود ثانية (انظر الجدول للمواد) من كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) وتمثيل البروتين المستهدف بإخراج إشارة التجارة والنقل.
  3. احتضان solubilized البروتين (طافية) مع الراتنج تقارب الكوبالت ح 1-2 في 4 درجات مئوية. التحقق من البروتين ملزمة إلى الراتنج بتشغيل عينة ميكروليتر 30 عمود ثانية.
    ملاحظة: إذا حدث ملزمة البروتين، سيتم الاحتفاظ هدف المعلمة البروتين بروتينات فلورية خضراء في العمود، لم يتم العثور على في التدفق عبر. ولذلك، لا توجد إشارة بروتينات فلورية خضراء سيكون حاضرا في الموضع المقابل لحجم البروتين المستهدف عند تشغيل على [هبلك] التدفق من خلال.
  4. أغسل الراتنج مع 10 العمود حجم المخزن المؤقت (20 مم تريس و pH 8.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 15 ملم وديجيتونين 0.1%). الاختيار لفقدان البروتين عن طريق تشغيل عينة ميكروليتر 30 على عمود ثانية.
    ملاحظة: إذا حدث فقدان البروتين من العمود، سوف تبين الهدف المعلمة البروتين بروتينات فلورية خضراء في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي التي تم تمريرها عبر العمود. ولذلك، إشارة بروتينات فلورية خضراء سيكون حاضرا في الموضع المقابل لحجم البروتين الهدف عندما يتم تشغيل المخزن المؤقت الغسيل على [هبلك]. إذا حدث فقدان البروتين، قد تحتاج تركيز ايميدازول يغسل المخزن المؤقت إلى تخفيضها لمنع تعطيل له ملزمة علامة على عمود النسب.
  5. الوت hTRPC3 الراتنج زمنياً مع المخزن المؤقت (20 مم تريس و pH 8.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 250 ملم وديجيتونين 0.1%). إضافة ثرومبين في 01:20 نسبة المولى (تهزم العلامة التجارة والنقل) وإضافة 10 مم يدتا (عامل استقرار hTRPC3) للعينة التيد واحتضانها ح 3 في 4 درجات مئوية. تحقق من أنه قد تم التيد البروتين بتشغيل ميكروليتر 90 من 1: 100 عينة مخففة على عمود ثانية والتحقق من وجود إشارة بروتينات فلورية خضراء في الموضع المقابل لحجم البروتين الهدف.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، إشارة التربتوفان من مجموع البروتين في شطف يمكن أيضا أن ينظر إلى. فقط البروتين المنقي تقارب الهدف سيبقى في شطف وفي التجارة والنقل، وسوف تكون إشارات التربتوفان قرب متطابقة في الشخصية. إذا كان لا ينظر في كمية كبيرة في شطف البروتين المستهدف لكن انقطع لا في التدفق من خلال أو الغسيل، البروتين ظلت يرجح أن منضمة إلى العمود ويمكن أن تكون التيد استخدام تركيز أعلى من ايميدازول في المخزن المؤقت.
  6. تركز النذرة إلى 500 ميكروليتر أو أقل من ذلك في عامل تصفية الطرد مركزي 15 مل ك 100 أنبوب (انظر الجدول للمواد) من الغزل في س 2,880 ز في 4 درجات مئوية في تزايدات 5 دقيقة. ريسوسبيند البروتين قبل بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً بين يدور لتجنب أوفيركونسينتراتينج.
    ملاحظة: يجوز تقصير وقت الطرد المركزي مع اقتراب الحجم وحدة التخزين النهائية المطلوبة.
  7. تحميل تركز على عمود ثانية في المخزن المؤقت (20 مم تريس و pH 8.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، يدتا 1 مم وديجيتونين 0.1%). قم بتشغيل.
  8. الجمع بين ذروة الكسور التي تحتوي على تيترامير TRPC3 سليمة، كتصور بإشارة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية، والتركيز مرة أخرى إلى نهائي تركز على الأقل 5 ملغ/مل.

7-فحص البروتين بالميكروسكوب الإلكتروني السلبي-وصمة عار

  1. قم بتشغيل الجهاز توهج التفريغ. وضع البرنامج لأداء شبكة المغلفة بالكربون باستخدام الأرجون والأكسجين لتشغيل س. 30 البرنامج جعل الكربون-الطلاء على النحاس 400-شبكة شبكات ماء قبل إضافة الحل البروتين.
  2. إعداد ميكروليتر 40 خمس قطرات من الماء المعقم وقطرات اثنين 40 ميكروليتر من 1% فورمات اليورانيل (في مختبر الفيلم أو ورق الشمع أو سطح مماثلة، انظر الجدول للمواد). تأخذ الشبكة من الخطوة 7، 1 وإضافة نموذج ميكروليتر 2.5 من البروتين 5 ملغ/مل (50-200 ميكرومتر) على الجانب المظلم والسماح لها الجلوس لمدة 1 دقيقة.
  3. وبعد 1 دقيقة، الجاف للشبكة باستخدام ورق الترشيح. لا تلمس ورقة تصفية مباشرة على سطح الشبكة؛ بدلاً من ذلك، تقديم الورقة إلى حافة الحبرية السائل والسماح بعمل شعري سحب السائل من الشبكة في ورق الترشيح.
  4. تراجع الشبكة في أول قطره ماء. جاف مع ورق الترشيح وكرر مع قطرات المتبقية من المياه وهو أول انخفاض فورمات اليورانيل. السماح بانخفاض الثانية اليورانيل فورمات الجلوس لمدة 1 دقيقة والجاف ثم مع أوراق الترشيح. تسمح الشبكة بالكامل الهواء الجاف (حوالي 1 دقيقة) قبل تخزينها.
    ملاحظة: قد لا يكون هذا البروتوكول المصبوغة مثالية لجميع تركيبات المنظفات البروتين. تركيزات مختلفة من فورمات اليورانيل وصمة عار وينبغي اختبار أطوال مختلفة من الوقت للتعرض وصمة عار إذا الخطوات المذكورة أعلاه لا توفر وصمة عار مع تباين جيد.
  5. صورة الشبكات في مجهر الإلكتروني (انظر الجدول للمواد) للتحقق من جودة البروتين الجسيمات. التأكد من أن ميكروجرافس إظهار العديد من الجزيئات التي متجانسة في المظهر العام، وتوزيع وعرض تباين جيد ويتطابق مع حجم المتوقعة من البروتين الهدف.
  6. توليد الأولية، والتصنيفات (2D) منخفضة الجودة، وثنائي الأبعاد باستخدام 50-100 ميكروجرافس (انظر تجهيز البيانات – الخطوة 10) للتأكد من أن الجزيئات تمثل وجهات نظر مختلفة من هيكل متسق واحد.
    ملاحظة: ميكروجرافس وفئات 2D الأولية ذات نوعية كافية، كما هو موضح أعلاه، مؤشرا قويا على أن البروتوكول قد الأمثل بما فيه الكفاية لتنقية البروتين. إعداد وفحص الشبكات cryo-م مطلوب في هذه المرحلة.

8. إعداد نموذج م

  1. وهج-أداء شبكة الكربون المخرمة الذهب (انظر الجدول للمواد) كما هو موضح في الخطوة 7، 1.
  2. تطبيق 2.5 ميكروليتر من العينة البروتين تتركز hTRPC3 (5 ملغ/مل) على الشبكة. لطخة الشبكة من أجل 1.5 s باستخدام اسطوانة قوة 1 ووقت انتظار من 5 s بالرطوبة 100% و 4 درجات مئوية، ثم إغراق الشبكة في الإيثان سائل التبريد بالنتروجين السائل باستخدام آلة التزجيج.
    ملاحظة: استخدمت الرطوبة، ودرجة الحرارة، ووصمة عار-القوة، وقت وصمة عار ووقت الانتظار المدرجة هنا لصاحبي hTRPC3 الدراسة19. قد تحتاج إلى تغيير إلى إنتاج الجليد الزجاجي الأمثل للبروتينات والمنظفات الأخرى.
  3. الشاشة المجمدة شبكات لأحوال الجليد الأمثل باستخدام مجهر cryo-م (انظر الجدول للمواد) والجليد يدوياً عرض مناطق الجليد السميك (شبكة المربعات التي تظهر أصغر حجماً وأكثر قتامة)، رقيقة الجليد (شبكة المربعات التي تظهر أكبر حجماً وأكثر إشراقا) والمتوسطة .
    ملاحظة: غالباً ما يحمل الجليد أكثر سمكا على جزيئات أكثر، حين الجليد أرق كثيرا ما تعطي تباين أفضل والقرار. شروط استخدام الفرز اليدوي للصور لتحديد الجليد التي النتائج في عدد كبير من الجسيمات مونوديسبيرسيد مع تباين جيد والقرار. حالما يتم التحقق من ظروف جيدة، الانتقال إلى مجموعة الصور مجهر cryo-م 300 كيلو فولت.

9. جمع بيانات م

  1. باستخدام برنامج اقتناء الآلي، تسجيل رصات الصور في وضع عد دقة فائقة مع حجم بكسل إهمال 1.074 في مجهر الإلكتروني تعمل على 300 كيلو فولت مع تكبير اسمي 000 130 دولار X مباشرة كاشف إلكترون.
  2. الجرعة-يجزئ كل الصورة إلى إطارات 40 مع وقت تعرض إجمالي 8 ق، مع 0.2 ثانية لكل إطار ومعدل جرعة 6.76 e− s2 1 (القيم الاسمية يزيل التباؤر تختلف من 1.0 إلى 2.5 ميكرومتر في التجربة صاحبي).

10. تجهيز البيانات م

  1. تنفيذ حركة تصحيح قد لخص الفيلم مكدسات22 وتقدير القيم يزيل التباؤر23 باستخدام برامج معالجة البيانات (انظر الجدول للمواد)24.
  2. التقاط جزيئات من ميكروجرافس. استخدم هذه التقطت الجسيمات لبناء تصنيف 2D خالية من الإشارة أولى استخدام البرمجيات24. حدد فئة 2D المثالي المتوسطات لاستخدامها كقوالب للانتقاء الجسيمات الآلي لمجموعة البيانات بالكامل.
  3. التحقق من جودة الجسيمات اختار السيارات وإزالة جسيمات سيئة يدوياً. استخدام جولات متعددة لتصنيف 2D لتنظيف جزيئات المنتقاة.
  4. إنشاء نموذج أولى25. التقطت 2D موضوع الجسيمات للتصنيف (3D) ثلاثي الأبعاد (حوالي 5 فصول دراسية) باستخدام التناظر C1 وتعمير أولية منخفضة تمرير مرشح من 60 Å كنموذج مرجعي. تحديد الفئات التي لها ميزات عالية الدقة، والجمع بين الجسيمات داخل هذه فئة.
  5. زيادة صقل الجسيمات باستخدام صقل المحلية مع التماثل C4 (في حالة hTRPC3) المطبقة وتعيين حد ذات الدقة عالية للجسيمات المحاذاة إلى 4.526.

11-نموذج بناء

  1. بناء نموذج (انظر الجدول للمواد للبرمجيات المستخدمة). ل hTRPC3، استخدام المجال ترانسميمبراني (TMD) ميلاستاتين مستقبلات عابر المحتملة 4 (TRPM4) هيكل البروتين مصرف بيانات (PDB) 5wp6 ك دليل27. استخدام مخلفات ضخمة والتنبؤ بهيكل الثانوية لتوجيه بناء حيثياته .
  2. النموذج الأولى لصقل الفضاء الحقيقية مع الهيكل الثانوي القيود28من هذا الموضوع. دراسة نموذج المكرر و remodify حسب الحاجة (انظر الجدول للمواد للبرمجيات المستخدمة) يدوياً.
  3. تطبيق المنحنيات الارتباط (FSC) شل فورييه لحساب الفرق بين النموذج النهائي وخريطة م للتحقق هيكل المكرر. تقييم الهندسات النماذج الذرية (انظر الجدول للمواد للبرمجيات المستخدمة)29،30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1Aنظرة تخطيطية للبروتوكول للتعبير وتنقية hTRPC3. صورة للوحة باكميد hTRPC3 مع مستعمرات بيضاء مثالية، مماثلة لتلك التي اختيرت لتنقية الحمض النووي باكميد، يرد في الشكل 1 باء. لقد وجدنا أن ح 48 ومثالي لتلطيخ غال بلو واضحة مع الحفاظ على وجود المستعمرات المعزولة. واعتبر ذروة إنتاج الفيروسات P2 ل hTRPC3، كتصور بالأسفار بروتينات فلورية خضراء، بعد 4 د عدوى في خلايا الحشرات Sf9 (الشكل 1).

كان حصاد بولوفيروس P2 من وسائط الإعلام، وتستكمل مع 1% FBS، واستخدامها لتصيب تعليق HEK293 خلايا الثدييات. تم إضافة بوتيرات الصوديوم للمصابين خلايا ح 12-18 بعد الفيروس إلى زيادة البروتين التعبير20. ثم كانت المحتضنة الخلايا ح 36 إضافية في 30 درجة مئوية. الخلايا تم حصادها وتعرض للذوبان والاستقرار الفرز من فسك (الشكل 2A)21. كانت solubilized الخلايا باستخدام المنظفات المختلفة سبعة مع قيم 0.01-20 مم بتركيز منظفات حوالي 10 إضعاف قيمة CMC CMC. بعد solubilization كامل الخلية، تمت إزالة الأنقاض تحلل الخلية بواسطة تنبيذ فائق والمادة طافية يحتوي على بروتين solubilized تم تحميله على عمود ثانية وتشغيل على [هبلك] في ن-دوديسيل-β-د-مالتوبيرانوسيدي/تشوليستيريل هيميسوكسيناتي (DDM/CHS) المخزن المؤقت المحتوية على مواد التنظيف مقارنة القيمة المطلقة للذوبان وذروة حجم الموقف من hTRPC3 تحت ظروف مختلفة بالنسبة لعنصر تحكم TRPM4 (الشكل 2). لقد اخترنا باستخدام DDM/CHS كالمخزن المؤقت قيد التشغيل الأولية للعينات solubilized في المنظفات المختلفة لأن DDM/CHS الأكثر شيوعاً استخدام المنظفات عند حل هياكل البروتينات الغشاء. جميع المنظفات solubilized TRPC3 العينات أظهرت ذروة المواقف المختلفة في حوالي 11.9 مل، الذي من المرجح كبيرة جداً، لأن شكل تيتراميريك hTRPC3 وزن الجزيئي أصغر من الإيجابية التحكم TRPM4 البشري (الشكل 2 ألف و الشكل 2B).

ومع ذلك، لأنه لا يوجد أي هيكل أي مستقبلات قناة TRPC لمقارنة النتائج على ونظرا لأن الوزن الجزيئي كبير يمكن أن تسببها بنية TRPC3 أو عوامل أخرى، أننا نفذنا على تنقية hTRPC3 صغيرة باستخدام 25 مل من وقدم الخلايا باستخدام DDM/CHS طوال هذه التجربة ك DDM/CHS الذوبان أفضل من hTRPC3. صورة ثانية hTRPC3 أظهر ذروة مونوديسبيرسي ولكن كان لا يزال في وضع ذروة تمثل وزن الجزيئي أعلى من TRPM4 (البيانات لا تظهر). نحن فحص البروتين في كسر ذروة الشخصية ثانية قبل م وصمة سلبية، لأنها طريقة سريعة للتحقق من نوعية البروتين ويتطلب كمية صغيرة جداً من البروتين. في صورة مجهرية، لوحظت الجسيمات مع اثنين من المجالات transmembrane الموجودة في الجسيمات نفسها. ويبدو أن اثنين من الجسيمات hTRPC3 ديميريزيد بطريقة وجها لوجه من خلال التفاعل بين هذين المجالين سيتوسوليك (الشكل 3D). ثم أدرجنا ديثيوثريتول كاشف الحد (DTT) في المخزن المؤقت للتنقية لتنقية صغيرة النطاق الثاني، أملا في تعطيل ثنائي hTRPC3. وفي الواقع، يبدو ذروة ثانية مع انخفاض الوزن الجزيئي بتجزئة ثانية. بيد أن الجسيمات تبدو صغيرة جداً لتكون تيترامير سليمة وأظهر أي ميزات للبروتينات الغشاء مثل مجال transmembrane. واتضح أن DDM/CHS ليس مطهر مناسب لتنقية hTRPC3، على الرغم من إعطاء أفضل قابلية الذوبان ل hTRPC3.

وبعد ذلك، حاولنا ديجيتونين منظفات، أكثر اعتدالا، جعل hTRPC3، ومقارنة مع البروتين solubilized في DDM/CHS. هنا استخدمنا اثنين مخازن تشغيل مختلفة التي تحتوي على DDM/CHS وديجيتونين، على التوالي. هذا أمر هام نظراً لأن المنظفات في المخزن المؤقت قيد التشغيل التي غالباً ما يساهم في الاستقرار بروتين وبروتين غشائي قد تصبح غير مستقرة عند تغيير المنظفات من سولوبيليزيشن إلى فسك. تشغيل البروتين في المخزن المؤقت الذي يحتوي على ديجيتونين وأظهرت تحولاً ذروة واعدة نحو انخفاض وزن الجزيئي عند solubilized في DDM/CHS أو ديجيتونين. البروتين سولوبيليزيد بها وتشغيلها في ديجيتونين أسفرت عن أعلى قمة في موقف معقول نسبة إلى موضع عنصر التحكم الإيجابي، TRPM4 البشري (الشكل 3A). ثم انتقلنا إلى الأمام عن طريق إجراء تنقية صغيرة الحجم باستخدام 25 مل خلايا. على الرغم من أن عدة وقمم واسع لاحظها ثانية (الشكل 3B)، البروتين وأظهر ميزات قناة واحدة hTRPC3 تيتراميريك في 2D التصنيف السلبي-وصمة عار م (الشكل 3 و الشكل 3D). نخلص إلى أن ديجيتونين منظفات مثالية لتنقية hTRPC3.

علينا الارتقاء بالتعبير عن hTRPC3 ويقوم على تنقية متوسطة الحجم باستخدام 400 مل خلايا في ديجيتونين. بالقيام بذلك، كنا نأمل بالحصول على البروتين الكافي لشبكات المجمدة قليلة دون إضاعة المتوسطة والمنظفات قبل نحن احسب الشروط النهائية لتنقية hTRPC3 على نطاق واسع. وكثيراً ما يحدث أن بروتينات الغشاء إظهار عدم الاستقرار عند التركز الشديد لإعداد شبكات المجمدة. البروتين المنقي وتتركز تحولت نحو وزن الجزيئي أعلى من فسك، بل أظهرت أيضا خلفية صاخبة في شبكات cryo-م تصويرها باستخدام مجهر الإلكتروني مزودة كاميرا امككد. حتى ولو كنا قادرين على مراقبة واحدة، مستقبلات تيتراميريك سليمة، hTRPC3 تنقية في ديجيتونين لم تكن مثالية للدراسات العالية الاستبانة cryo-م.

لمواصلة تحسين استقرار البروتين، ونحن فحص عدد كبير من الشروط الموضحة في الخطوة 5 من البروتوكول . لقد اخترنا المضافات الشاشة استناداً إلى الطابع الفسيولوجية من hTRPC3؛ على سبيل المثال-، يدتا اختير لأن hTRPC3 نفاذية للكالسيوم وإزالة الكالسيوم قد استقرار البروتين. جميع عينات اختبار بواسطة تشغيل في المخزن المؤقت الذي يحتوي على ديجيتونين فسك، أظهرت يدتا 10 ملم لها تأثير ملحوظ على استقرار hTRPC3 في موقف ذروة تيتراميريك سليمة (الشكل 4 أ). أيضا بدرجة كبيرة زاد عدد الجسيمات في صورة مجهرية cryo-م وانخفض الضوضاء في الخلفية، كما هو مبين في الشكل 5.

وبعد تحديد الظروف المثالية للتعبير وتنقية، أجرينا تعبير واسع النطاق (2 لتر) من hTRPC3. حصاد الخلايا التي تحتوي على hTRPC3 وثم سولوبيليزيد. توضيح ultracentrifuge ليستي تعرضت لتنقية المعادن-تقارب العمود بدفعه ملزمة مع راتنج الكوبالت متبوعاً بتنقية في عمود جاذبية. الاحتفاظ بالبروتين solubilized داخل العمود وشطف من البروتين المنقي تقارب من العمود تم التحقق من قبل فبلك (الشكل 4 باء). وجدنا أن ل hTRPC3، كان كافياً لإزالة البروتينات تلويث الراتنج غير محددة وملزمة تركيز ايميدازول 15 ملم في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، وايميدازول 250 ملم في المخزن المؤقت شطف كان كافياً الوتي أغلبية hTRPC3 سولوبيليزيد البروتين منضمة إلى الراتنج. تم فحص جميع العينات التي فسك، وأظهر البروتين التيد ذروة مونوديسبيرسي حادة، في الموضع الصحيح الذروة. تنقية الجوهرية المرونة بين العلامة التجارة والنقل والبروتين hTRPC3 قد جعل المحاذاة لجزيئات البروتين خلال أكثر تحديا ومعالجة الصور، ونظرا لموقع انقسام ثرومبين يقع بين التجارة والنقل، و hTRPC3، وقمنا باختبار كمية صغيرة البروتين في انشقاق مختلفة الأوقات استخدام حوزتي ثرومبين. نظراً لأن البروتين التيد المحتضنة مع ثرومبين في 01:20 نسبة المولى أظهرت استقرار معقول والانقسام كاملة بعد ح 2 في 4 درجات مئوية، ونحن المشقوق قبالة التجارة والنقل من جميع البروتين المنقي باستخدام نفس الشروط والتحقق بواسطة [هبلك] للتأكد من أن التجارة والنقل قد ج إزالة أومبليتيلي (الشكل 4). كذلك تمت تنقية البروتين من S، ويمكن تصور الانقسام من بروتينات فلورية خضراء مرة أخرى بالتحول ذروة الموقف تجاه وزن الجزيئي أصغر (الشكل 4). واستخدمت عينة فاقة صغيرة من الكسر الذروة الرئيسية جعل شبكات م وصمة سلبية. ثم مجتمعة جميع الكسور التي تحتوي على hTRPC3 تيتراميريك ومعاد لتركيز 5 ملغ/مل، الذي كان يستخدم لإعداد شبكات لتصوير م البرد نهائي. كما لاحظنا ذلك الجزء من البروتين لا تزال تدريجيا تحولت نحو وزن الجزيئي أكبر، ونحن جمعت فقط الكسور في الوزن الجزيئي الصحيحة، وجمدت الشبكات فورا بعد تنقية البروتين. نحن عادة ما تكتمل سلسلة التجارب من تنقية البروتين لإعداد شبكات المجمدة خلال يوم واحد.

عينة ميكروليتر 2.5 من البروتين المنقي hTRPC3 (تركيز 5 ملغ/مل) تم تطبيقها على شبكة الكربون المخرمة خرج توهج. تم استخدام آلة التزجيج بإعداد الشبكة، باستخدام 1.5 s النشاف الوقت تحت 100% رطوبة تليها يغرق في الإيثان السائل التبريد بالنتروجين السائل. تجميد هذه الخطوة العينة في الجليد الزجاجي للتصوير. تم القبض على الصور في 130,000 X القيمة الاسمية التكبير مجهر إلكتروني cryo تعمل على 300 كيلو فولت. وسجلت رصات الصور في القرار فائقة عد الوضع مع حجم بكسل إهمال 1.074 قيمة يزيل التباؤر الاسمية وتتراوح بين 1.0 إلى 2.5 ميكرومتر استخدام كاشف إلكترون مباشرة والآلي اقتناء البرمجيات. كل صورة كان مجزأ الجرعة إلى 40 الإطارات مع وقت تعرض إجمالي 8 s (0.2 s كل الإطار)، ومعدل جرعة 6.76 e− −2 s−1. ويرد صورة مجهرية ممثل من مجموعة البيانات هذه في الشكل 5.

وأجرى تصحيح الحركة وتقدير القيم يزيل التباؤر مكدسات فيلم summed. واستخدمت ميكروجرافس الناتج حوالي 200 كالمصدر للجسيمات دليل الانتقاء و التصنيف 2D خالية من الإشارة الأولى31. المتوسطات فئة الممثل في 2D تسعة من هذا التصنيف المبدئي المحدد واستخدامها كقوالب للانتقاء الجسيمات الآلي لمجموعة البيانات بالكامل. وأجرى فحص يدوي لجسيمات أوتوبيكيد لإزالة الجسيمات ومن الواضح أن سوء، ثم طبقت ثلاث جولات من تصنيف ثنائي الأبعاد تحسين تحديد جزيئات أوتوبيكيد (الشكل 5). صنفت هذه الجسيمات 2D-الفئة المحددة في خمسة فصول 3D استخدام منخفض-مرور-مرشح 60 كنموذج مرجعية أولية. من هذه الفئات الخمس، عرض واحد فقط ميزات عالية الدقة (الشكل 5). جزيئات من هذه الفئة تعرضوا كذلك لصقل المحلية بحد ذات الدقة عالية من 4.5 والتماثل C4 تطبيقها (الشكل 5)32. وكان فحص نموذج المكرر و remodified يدوياً. تم التحقق من صحة بنية المكرر بحساب المنحنيات منتدى التعاون الأمني لتحديد الفرق بين النموذج النهائي وخريطة م وتقييم هندستها من نماذج الذري33.

أنجز بناء النموذج الأولى باستخدام مجال أنظمة الدفاع الصاروخي التكتيكي لهيكل TRPM4 (PDB 5wp6) ك دليل34. واسترشد حيثياته بناء نموذج hTRPC3 أساسا مخلفات ضخمة والتنبؤ الهيكل الثانوي، مع لوالب α كثيرة في بنية تسهيل تعيين السجل بشكل كبير. في الأولى دي نوفو-بنيت النموذجي، النظام، والطول، وموقف من السمات الهيكلية الثانوية والمخلفات الضخمة في اتفاق وثيق مع التنبؤ. خلال الصقل، عقدت القرار إلى حد أدنى من القرار المقدرة لإعادة بناء النهائي. واستخدمت FSC ثلاثي الأبعاد لقياس معامل الارتباط عبر تطبيع بين اثنين خرائط ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها بشكل مستقل (كل استخدام نصف مجموعة البيانات) على مدى قذائف المقابلة في الفضاء فورييه (كدالة للتردد المكاني). استخدمنا قناع لينة 4.3 من إعادة الإعمار و 4.3 إضافية الحافة ناعمة جيب تمام جنبا إلى جنب مع مرشح تمرير منخفض من 10، ثم استخدام معيار الذهب منتدى التعاون الأمني 0.143 عتبة الانقطاع. واستخدم ذلك للإبلاغ عن القرار النهائي.

Figure 1
رقم 1: التعبير وتنقية hTRPC3 باستخدام نظام باكمام. (أ) الإجراء التخطيطي للتعبير hTRPC3 وتنقية. (ب) اختيار مستعمرة باكميد على لوحة المؤشر الأزرق والأبيض. اختر معزولة أبيض مستعمرة (السهم الأسود)، ليست مستعمرة بيضاء مع مستعمرة أزرق مضمن أو مستعمرة بيضاء على اتصال مع مستعمرة أزرق (الأسهم الحمراء). الأسفار (ج) التجارة والنقل من باكولوفيروس P2 في Sf9 الخلايا تحت 20 X التكبير. ينبغي أن تكون الأسفار مشرق وموجودة على غشاء الخلية و/أو المناطق الداخلية من معظم الخلايا لفيروس قوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: فحص الاستقرار hTRPC3 من فسك- المنظفات (A) فحص hTRPC3. HTRPC3 كامل الخلية solubilized في مجموعة متنوعة من المنظفات بتركيز مذيل حرجة من 0.01-20 مم وتم تشغيلها في المخزن المؤقت DDM/CHS-تتضمن. على الرغم من أن DDM/CHS يبين قابلية الذوبان أعلى من hTRPC3، الذروة يظهر في الموقف الخاطئ، كبير جداً بحيث أن hTRPC3 تيتراميريك (الأزرق التتبع). (ب) مراقبة TRPM4، مع وزن الجزيئي تيتراميريك من قرابة 540 كاتشين، DDM سولوبيليزيد والتشغيل في/CHS، كان بحجم شطف حوالي 12.9 مل، بينما TRPC3، مع تيتراميريك وزن الجزيئي لحوالي 400 كاتشين، solubilized وتشغيل في DDM/CHS، كان حجم شطف حوالي 11.9 مل. مع وزن الجزيئي أصغر، يتوقع hTRPC3 أن يكون حجم شطف أكبر قليلاً من TRPM4، لا أصغر قليلاً، مما يوحي بأن DDM/CHS قد لا يكون منظفات مثالية سولوبيليزيشن hTRPC3 وتنقية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: فحص المخزن المؤقت المنظفات hTRPC3 من فسك- (أ) القابلية للذوبان والاستقرار اختبار hTRPC3 باستخدام ديجيتونين. تم اختبار ديجيتونين سولوبيليزيشن، وفي تشغيل المخزن المؤقت. ملاحظة موقف الذروة من البروتين hTRPC3 سولوبيليزيد في ديجيتونين تحولت نحو حجم شطف أكبر بالمقارنة مع البروتين solubilized في DDM/CHS (تتبع الأصفر مقابل زرقاء وحمراء آثار). إلا أن الجمع بين استخدام ديجيتونين في المخازن المؤقتة سولوبيليزيشن وتشغيل يظهر الحجم الصحيح من hTRPC3 من فسك (تتبع الأصفر، العلامة النجمية). (ب) على غرار نتائج فسك hTRPC3 سولوبيليزيد كامل الخلية، موقف ذروة hTRPC3 البروتين تقارب تنقية في ديجيتونين (تتبع أحمر، مل 14) تحولت نحو حجم شطف أكبر بالمقارنة مع تقارب البروتين المنقي في DDM/CHS (أزرق تتبع، 12 مل) مقاسا بتجزئة ثانية. (ج) السلبية-وصمة عار م استخدمت للتحقق من جودة البروتين المنقي قبل جمع البيانات cryo-م. وصمة عار مثالي ينبغي أن يقدم الجسيمات (دوائر حمراء) سلبا على الملون (ظهور الأبيض) ومحاط بعصابة منظفات (التي تظهر سوداء). ويرد الممثل، صورة مجهرية مثالية هذه الجسيمات بوفرة، مونوديسبيرسيد، وحاليا في اتجاهات متعددة. (د) نوعية بيانات من وصمة سلبية أم ينبغي توفير دروس 2D مع بنية عامة واضحة ومتسقة وينبغي أن تشمل التوجهات متعددة من البروتين، مع المعدلات الواردة وتركزت داخل القناع (دائرة سوداء). فئات 2D من وصمة سلبية م ميكروجرافس hTRPC3 سولوبيليزيد في DDM/CHS الجزيئات الحالية التي يبدو أنها ثنائي وجها لوجه من مونومرات hTRPC3. على النقيض من ذلك، بنية تيتراميريك الخام (ولكن واضحة ومتسقة) مثل البلوط عموما الظاهر في 2D فئات من وصمة سلبية م ميكروجرافس من hTRPC3 سولوبيليزيد في ديجيتونين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تنقية hTRPC3. اختبار الاستقرار (A) من hTRPC3 حضور يدتا. وكان سولوبيليزيد hTRPC3 في ديجيتونين في وجود (تتبع الأحمر) أو غياب (تتبع الأزرق) من 10 مم يدتا. السابق أظهر ذروة واحدة وأضيق الموضع تيترامير البروتين (تتبع أحمر، النجمة)، مما يشير إلى أن استقرت يدتا hTRPC3 في أن تكيف تيتراميريك. إشارة فسك على hTRPC3 سولوبيليزيد في ديجيتونين الفلورية (ب) التجارة والنقل وتشغيلها في المخزن المؤقت ديجيتونين. ويلاحظ ذروة تيترامير في مادة سولوبيليزيد قبل تنقية المعادن-تقارب العمود (تتبع الأزرق، العلامة النجمية). نظراً لغياب هذه الذروة في جزء صغير من خلال تدفق تشير إلى ربط كاملة للبروتين hTRPC3 في عمود النسب (تتبع أحمر). بعد شطف قبل ايميدازول، تم فحص الكسور في ذروة شطف من فسك (تتبع الخضراء). وجمعت جميع الكسور عرض ذروة تيترامير سليمة لمزيد من التنقية. (ج) اختبار الانقسام بروتينات فلورية خضراء من hTRPC3 باستخدام ثرومبين. وقت الهضم تم اختباره باستخدام كمية صغيرة من البروتين عند 4 درجة مئوية، وتم التحقق من اكتمال الهضم قبل فسك. في كل التتبع، يتوافق مع ذروة على اليسار إلى ذروة تيترامير hTRPC3 (العلامة النجمية) وذروة الحق هو ذروة التجارة والنقل مجاناً. كما ازداد طول الهضم، انخفضت نسبة البروتين تيتراميريك لتحرير التجارة والنقل، مشيراً إلى أنه كان يجري المشقوق بروتينات فلورية خضراء من البروتين. هضم ح 2 يظهر انقسام كامل للتجارة والنقل. وأضاف يدتا الشخصية (د) ثانية من hTRPC3 قبل أو بعد الهضم ثرومبين في ديجيتونين التي تحتوي على تشغيل المخزن المؤقت مع 10 ملم. كما هو متوقع، تحول موقف الذروة تجاه حجم شطف أصغر بعد الهضم ثرومبين (تتبع الأحمر). يمثل ذروة الرئيسية (العلامة النجمية) hTRPC3 تيتراميريك. وقد جمعت الكسور بين الخطوط الحمراء لتجارب cryo-م. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: التخطيطي للبرد-م جمع البيانات وتجهيزها ل hTRPC3. تم جمع أكوام فيلم 3,660 من hTRPC3 المنقي تستخدم مجهر الإلكتروني مع جهاز كشف إلكترون مباشرة. تطبيق تصحيح الحركة والتحديد اليدوي أدى إلى ميكروجرافس 3,580. جسيمات أوتوبيكيد وتعرض لتصنيف 2D. تم صقل 2D فئات حسب تصنيف ثلاثي الأبعاد. فقط واحدة من أصل خمس فئات 3D عرض ميزات عالية الدقة. تم اختيار هذه الفئة لصقل 3D وصقل فريليجن المحلي، أسفر عن إنشاء هيكل ل hTRPC3 في 3.3 القرار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التصميم الهيكلي للبروتينات بالبرد-م قد أحدث ثورة في مجال البيولوجيا الهيكلي في السنوات القليلة الماضية، بفضل تطوير خوارزميات والكاميرات الجديدة أن يسرع إلى حد كبير على تصميم بنية البروتينات التي لا سهولة تتبلور، لا سيما غشاء بروتينات. على الرغم من كل أوجه التقدم الأخيرة في تقنية م البرد، يظل إعداد تنقية البروتينات الكافية في نوعية وكمية لتيسير عالية الجودة التصوير غالباً ما تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة وصعبة. القدرة على التعبير عن سرعة وشاشة متعددة الجينات بنيات تحت مجموعة متنوعة من الظروف تنقية، كما هو موضح في البروتوكول أعلاه، يحسن كفاءة هذه العملية بالسماح لإنتاج عالية الجودة سريعة وفعالة من حيث التكلفة تنقية البروتين لاستخدامها في الدراسات م البرد.

بينما الأسلوب الموصوفة هنا يوفر طريقة لتنقية كميات كبيرة من البروتينات الغشاء الثدييات أقل تكلفة من جانب تعداء مباشرة و بسرعة أكبر مما كانت عليه قبل جيل خط الخلية transfected ثابت، العديد من الخطوات، كل منها يجب أن يكون الأمثل توفر عائد بروتين عالي الجودة. ضمن التقنيات الحيوية المستخدمة في إنتاج وتنقية hTRPC3، هناك عدد من الخطوات الحاسمة ونقاط التفتيش. نقطة المراقبة الحرجة الأولى هو إنتاج باكميد الحمض النووي. اختيار مستعمرة مثالية كما هو موضح في النتائج، هو الخطوة الأولى في توليد الفيروس نوعية للتعبير البروتين. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان تركيز الحمض النووي باكميد تنقيته من مستعمرة المحدد أقل من 1 ميكروغرام/ميكروليتر، الفيروس الناتجة لن تكون كافية للتعبير البروتين قوية. نقطة المراقبة الحرجة الثانية هو إنتاج باكولوفيروس P1 و P2. عيار الفيروس يمكن أن تقدر بالأسفار التجارة والنقل، كما هو مبين في الشكل 1 ، أو يمكن أن يقاس كما وصفها كولمان et al. 35-بالإضافة إلى عيار الفيروسية، ينبغي الاضطلاع بدوره وقت من وقت الإصابة لكل بناء جديد لتحديد الوقت الأمثل للإصابة للتعبير البروتين القصوى. نقطة حرجة ثلاثة هي القابلية للذوبان والاستقرار الفحص هو مبين في الشكل 2. المنظفات مع اللجنة العسكرية المركزية عالية، مثل DDM، قد توفر قابلية الذوبان عالية، لكنها ليست مثالية للتصوير م البرد لأنها يمكن أن تؤدي إلى وفرة من تلويث المذيلات. مطهر أكثر اعتدالا، مثل ديجيتونين، يمكن أن توفر قابلية الذوبان كافية مع الحفاظ على استقرار البروتين. فحص المواد المضافة، مثل يدتا في حالة hTRPC3، من المهم لاكتشاف حالة تنقية أن ينتج البروتين سليمة ومتجانسة، ربما عن طريق إزالة الكالسيوم من hTRPC3، ويسهل اختراقها للكالسيوم. نقطة حرجة أربعة هو تحقق التقاط البروتين محددة وفعالة أثناء تطهير عمود النسب، ومراقبة ذروة البروتين المثالي خلال ثانية-تجزئة (الشكل 4). تجنب إدراج تلويث جزيئات البروتين مع الإبقاء على كل من البروتين الهدف أمر حاسم للحصول على عائد عالية بما يكفي من البروتين لتصوير م البرد. تغيير الوقت دفعة ملزمة ونسبة الراتنج للبروتين سولوبيليزيد يمكن أن تساعد في تحسين الاحتفاظ بالبروتين حسب عمود الراتنج. هي الجودة الشاملة لذروة ثانية-تجزئة في تجربتنا أفضل مؤشر، قبل التصوير، ونوعية جزيئات البروتين المنقي. منخفض أو ذروة واسعة أثناء وجود ثانية يشير إلى المشاكل المحتملة لعدد قليل جداً من جزيئات البروتين كل صورة أو وجود تلويث المنتجات التجميع/تدهور البروتين، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، أثبتت التغييرات إلى علامة تقارب داخل بنية نفسه ضروريا في بعض الحالات لضمان كاف علامة تقارب ملزم. نقطة التفتيش النهائي قبل جمع مجموعات البيانات م البرد هو تحقق نوعية الجسيمات البروتين بالسلبية-وصمة عار م. في حين لم يكن ضروريا، فإننا نجد أن هذا يتيح فرصة ممتازة لقضايا نوعية البروتين الموضعية والصحيح قبل الاستثمار في عملية كثيفة الوقت وتكلفة جمع البيانات بالبرد-م.

هو أسلوب بديل واحد لإنتاج البروتين للدراسات الهيكلية cryo-م تنقية البروتين من مصدر الأنسجة الأصلية مباشرة. في حين غالباً ما يصادف هذا الأسلوب المسائل مع البروتين الغلة، هو بديل ممتاز للبروتينات ذات وفرة عالية في الخلايا، أو موجودة كجزء من مجمع كبير البروتين المتعددة، التي يمكن أن يكون من الصعب على إنتاج استخدام overexpression المؤتلف 36من النظام. غير أن للبروتينات وحيدة المعرب عنها في كميات معتدلة أو منخفضة في ظل الظروف الفسيولوجية، نظام التعبير وتنقية المقدمة هنا فعال، تنقية طريقة منخفضة التكلفة والعائد المرتفع نسبيا لإنتاج بروتين غشائي الثدييات دراسات الهيكلية م البرد. إحدى الطرق التي يمكن أن تكمل بشدة التي قدمت هنا هو إعادة تشكيل البروتين المنقي إلى نانوديسكس الدهن قبل جمع البيانات cryo-م37. وفي إطار هذا الأسلوب هي imbedded البروتينات إلى قرص صغير من بلير الدهن، ربما لتقديم المكروية أصلية الشبيهة بالمقارنة المذيلات المنظفات، على الرغم من أن هناك أي دليل حتى الآن على أن الهياكل التي حلت في المنظفات ونانوديسك مختلفة38،،من3940. وثمة نهج آخر هو استخراج البروتين مباشرة باستخدام البوليمرات amphipathic مثل الستيرين هيدرازيد الخل (SMA)، التي استخدمت بنجاح للبت في غشاء بروتين هياكل41،42.

أثبتت هذه النهج الموصوفة في هذه المخطوطة قابلة للتكيف مع سهولة في لدينا مختبر لمجموعة متنوعة من البروتينات الغشاء الثدييات الأخرى خارج قنوات أيون. ولذلك، نعتقد أن هذا البروتوكول سيكون أداة قيمة في التحاليل الهيكلية والوظيفية التي تكمن وراء تصميم المخدرات تستهدف خصوصية عالية. وهذا سيكون مفيداً بشكل خاص في أمراض الأعصاب وأمراض القلب والأوعية الدموية والسرطان، في أيون التي قنوات أهداف المخدرات صعبة ولكنها ذات الإمكانات العالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر تشاو زاي وعاشرا منغ للدعم بجمع البيانات على ديفيد فإن اندل متقدمة Cryo-إلكترون "مجهرية جناح". ونحن نقدر أيضا فريق "فاري الحوسبة" عالية الأداء لدعم الحسابية. ونحن نقدم امتناننا كليمنتي، "مستحقات دال"، أ. ج. فلورامو، هوانغ Y. ويوسف كيم، جيم مولر، روث باء وروان Z. للتعليقات التي تحسنت كثيرا هذه المخطوطة. ونشكر "نادزيجكا د" لدعم التحرير لهذه المخطوطة. هذا العمل كان يدعمها فاري الداخلية التمويل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent - to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Tags

الكيمياء الحيوية، 143 قضية، قناة أيون، بروتين غشائي، تنقية البروتين، وتصميم هيكل، الميكروسكوب الإلكتروني البرد، البرد-م، باكولوفيروس
التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun,… More

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter