Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Выражение и очищение человека липидов чувствительных катионного канала TRPC3 структурные определения по одной частицы крио электронная микроскопия

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58754
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 1
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол описывает методы, используемые для определения структуры ионного канала крио электронная микроскопия, включая систему бакуловирусы используется эффективно выражать гены в клетках млекопитающих с минимальными усилиями и токсичности, экстракции белков, очистка, и проверка качества, сетка пробоподготовки и скрининга, а также сбор и обработка данных.

Abstract

Переходный рецепторный потенциал каналов (TRPCs) канонических подсемейство ГТО, неселективных катиона каналы, которые играют важную роль в гомеостаз кальция, кальция, особенно магазин работает запись, которая имеет решающее значение для поддержания надлежащего функционирования релиз синаптических пузырьков и внутриклеточных сигнальных путей. Соответственно Термизатор каналы были вовлечены в различных заболеваний человека, в том числе сердечно-сосудистых расстройств, таких как гипертрофии сердца, нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Паркинсона и неврологических расстройств, таких как Спиноцеребеллярная атаксия. Таким образом Термизатор каналы представляют потенциальной мишенью фармакологических в заболеваниях человека. Однако молекулярные механизмы стробирования в эти каналы по-прежнему неясны. Трудности в получении большого количества стабильной, однородной и очищенный белок был ограничивающим фактором в исследованиях определение структуры, особенно для млекопитающих мембранных белков например Термизатор ионных каналов. Здесь мы представляем собой протокол для крупномасштабных выражение млекопитающих ионного канала мембранных белков с помощью очистки этих белков и системы передачи гена модифицированных бакуловирусы сродства и размер-гель-проникающей хроматографии. Далее мы представляем протокол для сбора сингл частица крио электронная микроскопия изображения от очищенный протеин и использовать эти изображения для определения структуры белков. Для определения структуры это мощный метод для понимания механизмов, стробирование и функции в ионных каналов.

Introduction

Кальций участвует в самых клеточных процессах, включая сигнальные каскады, транскрипция управления, нейромедиатора релиз и гормон молекулы синтез1,2,3. Гомеостатических поддержание цитозольной свободного кальция имеет решающее значение для здоровья и функции клеток. Одним из основных механизмов гомеостаза внутриклеточного кальция является запись работает магазин кальция (SOCE), процесс, в котором истощения кальция хранится в эндоплазматический ретикулум (ER) триггеры открытие ионных каналов на плазматической мембраны для облегчения пополнение ER кальция, который затем может использоваться в дальнейшей сигнализации4,5,6. Переходный рецепторный потенциал каналов (TRPCs), которые кальция проницаемые каналы, принадлежащие ГТО надсемейства, были определены как одним из основных участников в SOCE7,8,9 .

Среди семи членов в семье Термизатор TRPC3, TRPC6 и TRPC7 образуют подгруппу гомолог, и они являются уникальными в способности быть активированы липидов вторичных посланник диацилглицерол (ГПДР), продуктом разложения сигналов липидов фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат (PIP2)10,11. Высоко TRPC3 выражается в гладких мышц и регионах мозга и мозжечка головного мозга, где он играет существенную роль в сигнализации кальция, которые влияют синапсах и нейрогенез12,13. Дисфункция TRPC3 были связаны с центральной нервной системы, сердечно-сосудистых заболеваний и некоторых видов рака, таких как аденокарцинома яичников14,,1516. Таким образом TRPC3 обещает как фармацевтического назначения для лечения этих заболеваний. Разработка целенаправленных препараты, действующие на TRPC3 было ограничено отсутствием понимания его молекулярной активации механизмов, включая липидов привязки сайтов17,18. Мы сообщили первой атомной резолюции структуры человеческого TRPC3 канал (hTRPC3) и ее две липидов привязки сайтов в закрытом состоянии, предоставляя важные выводы этих механизмов19.

Ключевым фактором для определения структуры мембранный белок с высоким разрешением, чтобы получить белка высокого качества. Соответствующие скрининг очистки и выражение условия, необходимые для получения высококачественного белка может быть длительным и дорогостоящим стремиться. Здесь мы представляем протокол, подробно описывающий, как мы определить оптимальные условия для выражения и очистки hTRPC3, который вел себя плохо в наших первоначальных скрининг. Мы представляем несколько ключевых моментов, о том, как оптимизировать поведение белка, который заложить прочную основу для нашей крио электронная микроскопия (крио ЭМ) исследования и устранения неполадок. Мы используем модифицированных baculoviral генерации вектор (ПЭГ), разработанный Gouaux и коллеги, который оптимизирован для скрининговых анализов и эффективного поколения бакуловирусы в mammalian клетках20. Это выражение метод подходит для быстрого и экономически гиперэкспрессия белков в млекопитающих клеточной мембраны. Мы совмещаем использование данного вектора с флуоресцентным обнаружением размер исключение на основе хроматографии (FSEC), подавшим метод21. Этот метод использует тег Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), сливается с конструкцией интерес и улучшает визуализацию целевого белка в небольших, поклеточного растворимых образцов. Это позволяет для проверки стабильности белка в присутствии различных моющих средств и добавок, с thermostabilizing мутации и позволяет использовать небольшое количество клеток от небольших переходных transfection. Таким образом множество условий может проверяться быстро до переезда в крупномасштабных белка очистки. После выражения, скрининг и очистки мы представляем собой протокол для получения и обработки изображений с крио EM для создания de novo определение структурного белка. Мы считаем, что подходы, описанные здесь будет служить обобщаемым протокол для структурных исследований ГТО канал рецепторов и других мембранных белков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Преобразование компетентных клеток DH10α для производства Bacmid ДНК

  1. Синтезировать гена интереса и subclone в модифицированную версию вектора колышек, содержащий тег стрептококк Твин, His8-тег и GFP с сайтом расщепления тромбина на вокзал (pFastBacI) N20.
  2. Превратить сведущие клетки, добавив 5 нг плазмида, содержащий требуемый гена в pFastBacI до 50 мкл DH10α клетки в 1,5 мл трубки и проинкубируйте втечение 10 мин на льду. Тепловой шок клетки для 45 s при 42 ° C. Добавить 200 мкл супер оптимального бульон с катаболических репрессор (SOC) средний в трубы и проинкубируйте 4-8 ч при 37 ° C в орбитальный шейкер на 225 об/мин.
  3. Пластина 5 мкл клеток на плите агар bacmid фунтов (50 мкг/мл канамицин, 7 мкг/мл гентамицин, тетрациклин, 100 мкг/мл Bluo Гал и 40 мкг/мл изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид [IPTG], агар 10 мкг/мл).
  4. Инкубировать пластину для 48 ч при 37 ° C.
    Примечание: Bluo Гал индикатор пятна колоний, которые по-прежнему выражают lacZ (вектор вставки неудачной), позволяя для отбора белых колоний (успешно преобразованных).
  5. Тщательно выберите изолированное белый колонии, избегая любой белый колоний, которые находятся в контакте с голубой колоний и расти клеток на ночь в 6 мл среды bacmid фунтов (50 мкг/мл канамицин, 7 мкг/мл гентамицин, тетрациклин 10 мкг/мл) при 37 ° C в орбитальный шейкер на 225 об/мин.

2. бактериальные подготовка для изоляции Bacmid ДНК

  1. Чтобы изолировать bacmid ДНК, спина вниз клетки Escherichia coli 10 мин на 2880 x g.
  2. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле в 200 мкл раствора ресуспендирования клеток от алкалический комплекта (см. Таблицу материалы), закупорить. Убедитесь, что гранулы приостанавливается полностью и содержанием однородно. Затем перевести суспензию клеток на 1.5 мл пробирок.
  3. Добавьте 200 мкл раствора лизис клеток от алкалический комплект и микс, инвертирование трубки в несколько раз. Инкубируйте до 5 мин при комнатной температуре (RT) чтобы лизировать клетки. Добавить 200 мкл раствора нейтрализации от алкалический комплект и микс, инвертирование трубки несколько раз остановить лизис реакции.
  4. Спин вниз за 10 минут на 21,130 x g в центрифуге столешницы. Собирайте 600 мкл супернатант в 2-мл пробирку. Добавить 600 мкл фенола: хлороформ: изоамилового спирта раствор (см. Таблицу материалы) и перемешать тщательно, чтобы извлечь ДНК из остальных продуктов лизис клеток.
    Предупреждение: Фенол: хлороформ: изоамилового спирта раствор токсичных при вдыхании, при контакте с кожей и при проглатывании. Это может вызвать химические ожоги и могут быть канцерогенами. Надевайте перчатки и застегнутой халате. Работа в зонта. Утилизация опасных отходов надлежащим образом.
  5. Спиновые трубки для 10 мин на 21130 x g в центрифуге столешницы. Две отдельные жидкой фазы будет видимым. Тщательно передачи 300 мкл верхней водной фазы к новой пробке. Добавьте 600 мкл, 100% этанола мыть ДНК. Аккуратно Переверните трубку смешивать.
    Примечание: Сделать не вихря, как это можно наклонять bacmid ДНК.
  6. Прохладный трубы, поместив их в морозильной камере-20 ° C на 10 мин спин вниз за 10 минут на 21,130 x g в центрифуге столешницы. Отменить супернатант и сохранения ДНК Пелле.
  7. Добавьте 1 мл 70% этанола, чтобы помыть лепешка. Аккуратно Переверните трубку смешивать. Спина за 10 минут на 21,130 x g в центрифуге столешницы. Отменить супернатант и позволяют Пелле воздух сухой, примерно 5 минут или до тех пор, пока жидкости не виден в трубе и Пелле ДНК становится прозрачным.
  8. Ресуспензируйте сухие гранулы в 50 мкл стерильные, DNase бесплатно, деионизированная вода. Измерение концентрации ДНК.
    Примечание: Не замораживать bacmid ДНК. Хранить при 4 ° C до нескольких дней.

3. transfection Sf9 насекомых клеток с Bacmid производить P1 бакуловирусы

  1. Семя 0,9 x 106 клеток/хорошо Sf9 в 2 мл соответствующей среды (см. Таблицу материалы) в каждой скважине пластины 6-ну тканевые культуры. Инкубируйте клетки на 27 ° C в течение 20 мин содействовать привязанность к пластине.
    Предупреждение: Клеточных культур являются потенциальной биологической опасности. Работа в утвержденных Ламинарный шкаф с использованием асептических методов и проверьте институциональные и правительственные руководящие принципы для рекомендованных защитную одежду и надлежащего удаления отходов до выполнения экспериментов.
  2. После вложения, мкл 8 трансфекции реагента (см. Таблицу материалы) до 100 мкл средств массовой информации для каждой скважины 6 хорошо пластины будучи transfected в стерильную пробирку. Добавьте 100 мкл среды в отдельной стерильную пробирку 6 мкг bacmid ДНК. Инкубировать 5 мин на RT. Combine двух решений и проинкубируйте 45 мин на RT.
  3. Замените средний в 6 скважин с 2 мл свежей среды. Добавить смесь из предыдущих шага для каждого хорошо каплям (200 мкл на хорошо). Осторожно покачайте пластину для обеспечения Смешивание раствора трансфекции в среду.
    Примечание: Не вихрем или встряхнуть пластину, потому что это вызовет клетки для отсоединения.
  4. Инкубируйте клетки для 5 d (120 ч) в 27 ° C увлажненные инкубатора. Проверьте GFP флуоресценции до сбора урожая, чтобы убедиться, что этот вирус производится в большой процент клеток; Если процент является низкой, продлить время инкубации при необходимости (см. рис. 1 c).
  5. Соберите супернатанта содержащий вирус P1 (около 2 мл от каждой скважины). Фильтр носитель, содержащий вирус P1 в 2-мл пробирок, используя шприц 3 мл и малые 0.2 мкм фильтром. Добавьте стерильные плода бычьим сывороточным (ФБС) в конечной концентрации 1%.
    Примечание: Этот запас P1 вируса следует хранить при 4 ° C и быть защищены от света.

4. инфекции Sf9 насекомых клеток с P1 бакуловирусы производить P2 бакуловирусы

  1. Подготовка 200 мл (или желаемый объем) Sf9 клеток в концентрации 0,8 - 0,9 х 106 клеток/мл в соответствующей среде (см. Таблицу материалы) в плоское дно колбу Эрленмейера культуры достаточного размера.
    Примечание: Для подвески культуры, объем использования не должен превышать 40% общей емкости колбы.
  2. Добавьте соотношение 1:2500 (v/v) акций P1 вирус от 3,5 подвеска культуры клеток Sf9. Инкубируйте время оптимального вирус выражения (обычно 48-120 ч в зависимости от конструкции белка) при 27 ° C в орбитальный шейкер на 115 об/мин.
    Примечание: Выражение относительного вирус может быть определен путем просмотра GFP флуоресценции вируса в образце культуры.
  3. Центрифуга суспензию клеток для 40 мин на 11,520 x g и собирать супернатанта содержащий вирус P2. Фильтр супернатанта, используя одноразовые фильтры 0,2 мкм. Добавь FBS в конечной концентрации 0,5%.
    Примечание: Этот запас P2 вируса следует хранить при 4 ° C и быть защищены от света.
  4. Получения титра вируса P2 с помощью Sf9easy клетки или счетчик вирус.

5. инфекции HEK293 Mammalian клеток с P2 бакуловирусы для крупномасштабных белков

  1. Подготовка тома желательно HEK293 культуры mammalian клетки подвеска (4-6 L рекомендуется для приготовления замороженных сеток) в концентрации 3,5-3,8 x 106 клеток/мл в средство выражения (см. Таблицу материалы) дополнены 1% (v / v) стерильные FBS в догадках дно Эрленмейер культуры колбы достаточного размера.
    Примечание: Для подвески культуры, объем использования не должен превышать 40% от общего объема колбы.
  2. Добавьте 8% (v/v) P2 вирус Стоковый раствор из шага 4.3 подвеска культуры клеток HEK293. Инкубируйте при 37 ° C в орбитальный шейкер на 135 об/мин.
  3. Добавьте 10 мм натрия бутират в 12-18 h послеоперационные инфекции. Инкубируйте время оптимального белков (обычно 36-72 ч) при 30 ° C.
  4. Урожай клетки центрифугированием на 20 мин в 2880 x g. Вымойте клетки, resuspending в приблизительно 100 мл трис буфер солевой раствор (TBS) на литр клеток собирают. Центрифуга снова на 20 мин в 2880 x g и собирать Пелле ячейки.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Окатыши клеток может оснастки замороженные в жидком азоте и хранятся при температуре-80 ° C до очистки.
    Предупреждение: Жидкий азот может вызвать криогенные ожоги или травмы. Это может вызвать обморожение. Он может вытеснять кислород и вызвать быстрое удушья. Надевайте холодной Изоляционные Перчатки и щит.
  5. Собирать урожай небольшой 1 мл в различные моменты времени и солюбилизировать последнего втечение 2 ч при 4 ° C с качания или перемешивания в присутствии различных моющих средств и добавок. Эти небольшие образцы растворимых поклеточного может быть уточюненным ultracentrifugation на 235 000 × g 10 мин при 4 ° C и запустить как 30 мкл пример на столбец Размер-гель-проникающей хроматографии (сек) (см. Таблицу материалы), чтобы определить лучшее время для выражение и лучшие условия солюбилизация.
    Примечание: В случае hTRPC3, это обследование включены различные буферы с pH от 4.0-9.5 и концентрация соли 50-500 мм; различных ионных композиций (например, MgCl2 или NaCl); различные моющие средства с критической мицеллы значения концентрации (CMC) 0,1 - 20 мм; снижение добавки, такие как Дитиотреитол, tris(2-carboxyethyl) фосфина и β-меркаптоэтанол; и кальций Хелатирующие добавка Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).

6. Очистка hTRPC3 белка из замороженных клеток Пелле

  1. Оттепель Пелле в буфер, содержащий 20 мм трис (рН 8,0), 500 мм NaCl, 1 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF), 0,8 мкм Апротинин, 2 мкг/мл leupeptin, 2 мм pepstatin A, и собрали digitonin 1%, с использованием 100 мл буфера на литр клеток. После размораживания, обеспечить однородность раствора, закупорить или перемешивания. Позволяют солюбилизировать последнего за 2 ч при 4 ° C в стакан, погруженный в лед с вращающейся бар stir.
  2. Удалить ячейки мусор, ultracentrifugation на 235 000 × г за 1 час при 4 ° C. Проверить количество белка, запустив 30 мкл пример на столбец SEC (см. Таблицу материалы), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и визуализировать целевого белка GFP выходного сигнала.
  3. Инкубировать растворимых белка (супернатант) с кобальтом сродство смолы для 1-2 ч и при 4 ° C. Проверка связывания белков в смолу, запустив 30 мкл пример на столбец сек.
    Примечание: Если произошло связывания белков, целевой меткой белка GFP будет храниться на столбце, не найден в поток через. Таким образом сигнал не GFP будет присутствовать в положении, соответствующем размер целевого белка при запуске потока через на ВЭЖХ.
  4. Вымойте смолы с 10 томов столбца буфера (20 мм трис, рН 8,0, 500 мм NaCl, 15 мм имидазола и 0,1% digitonin). Проверка потери белка путем запуска 30 мкл пример на столбец сек.
    Примечание: Если произошло потери белка из столбца, целевой меткой белка GFP будет находиться в буфере мыть, что прошел над столбцом. Таким образом GFP сигнал будет присутствовать в положении, соответствующем размер целевого белка при мытье буфер на ВЭЖХ. Если произошла потеря белков, концентрация имидазола мыть буфера может потребоваться быть снижен для предотвращения подрыва его тег привязки к столбцу сходства.
  5. Элюировать hTRPC3 смола граница с буфером (20 мм трис, рН 8,0, 500 мм NaCl, 250 мм имидазола и 0,1% digitonin). Добавить тромбина в 1:20 молярное соотношение (чтобы расщеплять тег GFP) и добавить 10 мм ЭДТА (hTRPC3 стабилизирующий агент) в образце eluted и Инкубируйте 3 ч при 4 ° C. Проверьте, что белок был этого eluted, запустив 90 мкл пример разбавленный масштаба 1: 100 на столбец SEC и проверяя наличие сигнала GFP в позиции, соответствующей размеру целевого белка.
    Примечание: на данный момент, триптофан сигнал от общего белка в элюции можно также рассматривать. Только сходство очищенный белок целевой останется в элюции и GFP и триптофан сигналы будут вблизи идентичны в профиле. Если целевого белка не видел в большом количестве в элюции, но не был потерян в проточных или мыть, белок вероятно остается привязанным к столбцу и может быть этого eluted используя более высокую концентрацию имидазола в буфере.
  6. Концентрат элюата до 500 мкл или меньше в 15 мл 100K центробежного фильтра трубки (см. Таблицу материалы), спиннинг на 2880 x g при 4 ° C с шагом в 5 минут. Ресуспензируйте белка, закупорить решение вверх и вниз между спинами, чтобы избежать overconcentrating.
    Примечание: Центрифуги время может быть сокращен как объем приближается к желаемый конечный объем.
  7. Загрузите концентрата на SEC столбца в буфере (20 мм трис, рН 8,0, 500 мм NaCl, 1 мм ЭДТА и 0,1% digitonin). Запуск.
  8. Объединить пик фракций, содержащих нетронутыми Тетрамер TRPC3, как визуализировать УФ поглощения сигнала и снова сосредоточиться в конечной концентрации по крайней мере 5 мг/мл.

7. Скрининг белка, отрицательные пятно электронной микроскопии

  1. Включите машину тлеющего разряда. Задайте программу для разгрузки углерода покрытием сетки с использованием аргона и кислорода для 30 s. запустить программу, чтобы сделать углерода покрытие на медь 400-сетки сетки гидрофильные перед добавлением раствора белка.
  2. Созданы пять 40 мкл капли стерильной воды и два 40 мкл капель раствора 1% уранила формате (на фильм лаборатории, вощеной бумагой или подобную мягкую поверхность, см. Таблицу материалы). Возьмите решетку из шага 7.1 и добавить 2,5 мкл белка образца 5 мг/мл (50-200 мкм) на темную сторону и дайте ему сидеть за 1 мин.
  3. После 1 мин сухие сетку, используя фильтр-бумаги. Не прикасайтесь к фильтровальной бумаги непосредственно на поверхность сетки; Вместо этого довести этот документ до края жидкие капли и позволяют капиллярность тянуть жидкости из сетки в фильтровальную бумагу.
  4. Окуните сетки в первые капли воды. Сухие с фильтровальной бумаги и повторите с оставшиеся капли воды и первая капля уранила формате. Разрешить Второе падение уранила Формиат сидеть за 1 мин и затем высушить фильтровальную бумагу. Разрешить сетке полностью воздух сухой (около 1 мин) перед сохранением.
    Примечание: Это окрашивание протокол не может быть идеально подходит для всех комбинаций белка-моющего средства. Различные концентрации уранила Формиат пятно и разной длины времени пятно воздействия должны быть проверены, если перечисленные выше шаги не предоставляют пятно с хорошим контрастом.
  5. Изображение сетки по электронным микроскопом (см. Таблицу материалы) для проверки качества белковых частиц. Убедитесь, что микроскопии показывают многочисленные частицы, которые являются однородными в общий вид и распределение, отображения хороший контраст и матч прогнозируемого размера целевого белка.
  6. Создать предварительный, с низким разрешением, двухмерный (2D) классификаций, с помощью микроскопии 50-100 (см. обработка данных-шаг 10) чтобы проверить, что частицы представляют разные виды единой последовательной структуры.
    Примечание: Микроскопии и предварительных 2D классы достаточно высокого качества, как описано выше, являются сильным показателем, что протокол был достаточно оптимизирован для очистки белков. Подготовка и показ крио ет сетки является оправданным в этот момент.

8. EM пробоподготовки

  1. Тлеющего разряда Золотой Холи углерода сетки (см. Таблицу материалы), как описано в пункте 7.1.
  2. Примените 2,5 мкл концентрированного hTRPC3 образец протеина (5 мг/мл) на сетке. Блот сетки для 1,5 s с помощью пятно силу 1 и время ожидания 5 s при 100% влажности и 4 ° C, затем окунуться в сетке жидкий Этан, охлаждаемый жидким азотом, с помощью витрификации машины.
    Примечание: Влажность, температура, блот сила, блот время и время ожидания, перечисленные здесь были использованы для авторов hTRPC3 исследовании19. Им может потребоваться изменить для получения оптимального стекловидного тела ice для других белков и моющих средств.
  3. Экран замороженных сетки для оптимального ледовых условий с помощью микроскопа крио Эм (см. Таблицу материалы) и вручную мнение регионов толщиной льда (сетка квадратов, которые появляются небольшие и темнее), тонкого льда (сетка квадратов, которые появляются больше и ярче) и среднего льда .
    Примечание: Толще льда часто проводит больше частиц, в то время как тоньше льда часто дает лучше, контрастность и разрешение. Использование ручной отбора изображений для определения, которое льда условия результаты в большое количество частиц монодисперсными с хороший контраст и разрешение. После того, как хорошие условия проверяются, переход к коллекции изображений на микроскопом крио EM 300 кв.

9. сбор данных EM

  1. С помощью программы автоматического приобретения, запись стеки изображений в супер-резолюции подсчитывая режиме с сегментированием пикселя размером 1,074 Å на электронным микроскопом на 300 кв с номинальным увеличением 130,000 X прямой детектор электронов.
  2. Доза фракционировать каждое изображение до 40 кадров с общей выдержка из 8 сек, с 0,2 s каждого кадра и дозы 6.76 e− Å−2 s−1 (номинальный defocus значения варьировались от 1,0 до 2,5 мкм в эксперименте авторов).

10. обработка данных EM

  1. Осуществлять движение, коррекция подвел фильм стеки22 и оценить defocus значения23 с помощью программного обеспечения для обработки данных (см. Таблицу материалы)24.
  2. Выберите частиц от микроскопии. Используйте эти выбрали частиц для создания начальной ссылки бесплатный 2D классификации с использованием программного обеспечения24. Выберите идеальный 2D класса средние значения для использования в качестве шаблонов для комплектации автоматизированных частиц для всего набора данных.
  3. Вручную проверить качество авто выбрали частиц и удалить плохие частицы. Используйте несколько раундов 2D классификации для очистки взял частиц.
  4. Создание начальной модели25. Тема 2D выбрал частиц для трехмерных (3D) классификации (около 5 классы) с использованием C1 симметрии и первоначальной реконструкции НЧ-фильтр 60 Å как a эталонной модели. Определите, какие классы имеют черты высокого разрешения и объединить частиц в рамках такого класса.
  5. Дальнейшего уточнения частиц с помощью местных уточнения с C4 симметрия (в случае hTRPC3) применяется и с высоким разрешением для выравнивания частиц лимит до 4.5 Å26.

11. модель здания

  1. Построить модель (см. Таблицу материалов для используемого программного обеспечения). Для hTRPC3, используйте трансмембранных доменов (ПРО ТВД) в переходный рецепторный потенциал melastatin 4 (TRPM4) структура белка 5wp6 банка данных (PDB) как руководство27. Используйте громоздкие остатков и предсказание вторичной структуры для руководства de novo здания.
  2. Тема первоначальной модели для уточнения реального пространства с вторичной структуры ограничений28. Вручную изучить изысканные модели и remodify при необходимости (см. Таблицу материалов для используемого программного обеспечения).
  3. Применение кривых корреляции (FSC) оболочки Фурье для вычисления разницы между окончательной модели и карта EM для проверки структуры изысканный. Оценка геометрии атомной модели (см. Таблицу материалов для используемого программного обеспечения)29,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схематический обзор протокола для выражения и очистки hTRPC3 показано на рисунке 1A. Изображение hTRPC3 bacmid плиты с идеальной белых колоний, аналогичный тому, который выбран для очистки bacmid ДНК, показан на рисунке 1B. Мы обнаружили, что 48 h идеально подходит для четкого Bluo Гал окрашивания по при сохранении наличие изолированных колоний. Пик производства вируса P2 для hTRPC3, как визуализировать, GFP флуоресценции, был замечен после 4 d инфекции в Sf9 насекомых клеток (рис. 1 c).

P2 baulovirus было собрано из СМИ, дополнен с 1% FBS и используется для заразить подвеска HEK293 mammalian клеток. Натрия бутират был добавлен к инфицированных клеток 12-18 ч после вируса, чтобы увеличить белка выражение20. Клетки были затем инкубированы для дополнительных 36 h при 30 ° C. Клетки были собраны и подвергли растворимость и стабильности скрининга FSEC (рисунок 2A)21. Клетки были солюбилизирован с помощью семь различных моющих средств с CMC значения 0,01 - 20 мм на стиральный порошок концентрации примерно 10 раз значение CMC. После поклеточного солюбилизация мусора лизис клеток был снят ultracentrifugation и супернатанта, содержащие растворимых белок был загружен на столбец SEC и работать на ВЭЖХ в н додецил β-D-maltopyranoside/cholesteryl hemisuccinate (DDM/CHS) моющих средств содержащих буфер для сравнения абсолютных растворимость и пик объем позиции hTRPC3 в различных условиях по отношению к TRPM4 управления (рис. 2B). Мы решили использовать DDM/CHS как первоначальный идущий буфер для образцов, солюбилизирован в различных моющих средств, потому что DDM/CHS является наиболее часто используемых моющих средств при решении структуры мембранных белков. Все различных моющих средств солюбилизирован TRPC3 образцы показали пик позиции на около 11.9 мл, который вероятно слишком велик, потому что tetrameric форма hTRPC3 имеет меньший молекулярный вес, чем положительный контроль человеческого TRPM4 (рис. 2A и Рисунок 2B).

Тем не менее поскольку там был никакой структуры канала рецептора любой Термизатор сравнить наши результаты и большой молекулярный вес может быть вызвано архитектуры TRPC3 или других факторов, мы провели мелких очищение hTRPC3 с помощью 25 мл клетки с помощью DDM/CHS на протяжении всего эксперимента как DDM/CHS дал Лучшая растворимость hTRPC3. SEC профиль hTRPC3 показал монодисперсных пик, но был еще в состоянии пик, представляющих высокий молекулярный вес, чем TRPM4 (данные не показаны). Мы проверили белка в пик часть профиля SEC, отрицательные пятно EM, потому что это быстрый метод проверки качества белка и требует очень небольшое количество белка. В Микрофотография частицы были замечены с двумя трансмембранных доменов в той же частицей. Оказалось, что два hTRPC3 частицы димерной соперничество путем взаимодействия между двумя цитозольной доменами (Рисунок 3D). Затем мы включили сокращение реагент Дитиотреитол (DTT) в очистки буфера для второй мелких очистки, надежде сорвать Димеризация hTRPC3. Действительно второй пик с ниже, молекулярным весом появился фракционирование сек. Однако частицы появилось слишком малы, чтобы быть нетронутыми Тетрамер и показал без особенностей мембранных белков, например трансмембранных доменов. Оказалось, что DDM/CHS не было подходящего моющего средства для очистки hTRPC3, несмотря на предоставление лучших растворимости для hTRPC3.

Далее мы пытались мягкий стиральный порошок, digitonin, чтобы солюбилизировать последнего hTRPC3 и сравнил его с белками, солюбилизирован в DDM/CHS. Здесь мы использовали два различных запущенных буферов, содержащих DDM/CHS и digitonin, соответственно. Это важно, учитывая, что моющее средство в буфере работает часто способствует стабильности белка и мембранный белок может стать нестабильной при изменении моющих средств от солюбилизация FSEC. Белка запустить в буфер, содержащий digitonin показали многообещающие пик сдвиг в сторону нижней молекулярный вес при солюбилизирован в DDM/CHS или digitonin. Белок солюбилизирован и запустить в digitonin дали самый высокий пик в разумную позицию относительно позиции положительный контроль, человеческие TRPM4 (рис. 3A). Затем мы пошли вперед, выполняя мелких очистки с использованием 25 мл клеток. Хотя несколько и широкий пики были замечены на сек (рис. 3B), белок показан функции одного tetrameric hTRPC3 канала в 2D классификации по отрицательной пятно EM (рис. 3 c и 3D рисунок). Мы заключаем, что digitonin это идеальное средство для очистки hTRPC3.

Мы масштабируется вверх выражение hTRPC3 и выполняется очистка среднего масштаба, с 400 мл клеток в digitonin. Поступая таким образом, мы надеялись получить достаточно белка для нескольких замороженных сеток без тратить среднего и моющих средств, прежде чем мы выяснили, окончательные условия для очистки hTRPC3 в больших масштабах. Это часто случается, что мембранных белков Показать нестабильности, когда высококонцентрированный для приготовления замороженных сетки. Очищенный и концентрированные белки не только смещается в сторону более высокой молекулярной массой FSEC, но также показан шумных фон в крио ет сетки, отображаемого с помощью микроскопа, оснащенный камерой EMCCD. Несмотря на то, что мы имели возможность наблюдать за один, нетронутыми tetrameric рецепторов, hTRPC3, очищенный в digitonin был не идеально подходит для исследования с высоким разрешением крио EM.

Для дальнейшего повышения стабильности белка, мы экранированный большое количество условий, описанных в шаге 5 протокола . Мы решили экрана добавки на основе физиологических характер hTRPC3; например., ЭДТА был выбран потому, что hTRPC3 является проницаемой для кальция и удаления кальция может стабилизировать белка. Из всех образцов, FSEC, работает в digitonin содержащих буфера ЭДТА 10 мм показал замечательный эффект на стабилизации hTRPC3 в положении нетронутыми tetrameric пик (рис. 4A). Он также значительно увеличилось количество частиц в крио EM Микрофотография и снизился уровень шума в фоновом режиме, как показано на рисунке 5.

Определив идеальные условия для выражения и очистки, мы провели крупномасштабные выражение (2 Л) hTRPC3. Ячейки, содержащие hTRPC3 были собраны и затем солюбилизирован. Уточнить ультрацентрифуга lysate был подвергнут метал близость столбец очистки привязав пакетного кобальта смолой, после очистки в столбце гравитации. Удержание растворимых белка в столбце и элюции сродство очищенный белок из столбца была подтверждена ПСОК (рис. 4В). Мы обнаружили, что для hTRPC3, имидазола концентрация 15 мм в буфере мыть было достаточно, чтобы удалить загрязняясь протеины с привязкой неспецифических смолы, и 250 мм имидазола в Элюирующий буфер был достаточно элюировать большинства растворимых hTRPC3 белок связывается со смолой. Все образцы были проверены FSEC, и eluted белка показал резкое, монодисперсных пик на правильный пиковой позиции. Как внутренняя гибкость между тегом GFP и hTRPC3 белков может сделать выравнивание белковых частиц во время обработки более сложных изображений, и потому, что сайт расщепления тромбина расположен между GFP и hTRPC3, мы протестировали небольшое количество очищенной белка в различных расщепления раз используя тромбина протеазы. Учитывая, что eluted белка инкубировали с тромбина в 1:20 молярное соотношение показали разумной стабильности и полного расщепления после 2 ч при температуре 4 ° C, мы расщепляется с GFP от всех очищенный протеин, используя те же условия и проверены ВЭЖХ для подтверждения, что GFP c ompletely удалена (рис. 4 c). Белок был неразделимая S, и расщепление GFP снова могут быть визуализированы на пик позиции сдвиг в сторону меньших молекулярной массой (рис. 4 d). Небольшой пример неконцентрированной от основной пик фракции был использован чтобы сетки для отрицательных пятно EM. Затем всех фракций, содержащих tetrameric hTRPC3 были объединены и reconcentrated в конечной концентрации 5 мг/мл, который был использован для подготовки сетки крио EM изображений. Как мы заметили что часть белка по-прежнему постепенно смещается в сторону большего молекулярный вес, мы собрали только фракций на правильный молекулярный вес и заморозил сетки сразу после очистки белков. Мы обычно завершает последовательность экспериментов от очистки белков для приготовления замороженных сеток в течение одного дня.

2.5 мкл пример очищенный hTRPC3 белка (концентрация 5 мг/мл) был применен на сетку свечения выписан Холи углерода. Витрификация машина был использован для подготовки сетки, используя 1.5 s промокательной время под 100% влажность следуют окунуться в жидкий Этан охлажденный жидким азотом. Этот шаг замерзает образца в стекловидном лед для воображения. Изображения были захвачены на 130 000 X номинальное увеличение крио микроскопа, действовали на 300 кв. Стеки изображений были записаны в супер-резолюции подсчитывая режиме с сегментированием пикселя размером 1,074 Å и значение номинального defocus, от 1,0 до 2,5 мкм с использованием прямого электронного детектора и автоматизированное приобретение программного обеспечения. Каждое изображение было, фракционированный дозы 40 кадров с общей выдержка из 8 s (0,2 s в кадре) и дозы 6.76 e− Å−2 s−1. Представитель Микрофотография из этого набора данных показано на рисунке 5.

Была проведена коррекция движения и оценки defocus значения суммируются фильм стеков. Примерно 200 результате микроскопии были использованы в качестве источника для комплектации ручной частиц и начальной ссылки бесплатный 2D классификации31. Девять представительского класса 2D средние от этой первоначальной классификации были отобраны и использовать в качестве шаблонов для комплектации автоматизированных частиц для всего набора данных. Ручная проверка авто частиц была выполнена для удаления частиц очевидно плохо, то три раунда 2D классификации были применены для уточнения выбора Авто частиц (рис. 5). Эти отдельные частицы 2D-класса были разделены на пять 3D классов, с помощью низкой pass фильтр 60 Å как исходной модели. Из этих пяти классов отображается только одно окно с высоким разрешением функций (рис. 5). Частицы от этого класса также были подвергнуты местных уточнения с высоким разрешением предел 4.5 Å и C4 симметрии (рис. 5)32. Изысканная модель вручную изучены и изменен. Изысканный структура была проверена путем расчета кривых FSC определить разницу между окончательной модели и карта EM и оценки геометрий атомной модели33.

Первоначальная модель строительство проводилось с использованием домена TMD TRPM4 структуры (PDB 5wp6) как руководство34. De novo здание модели hTRPC3 руководствовался преимущественно громоздких остатков и предсказание вторичной структуры, с многих α-спиралей в структуре значительно облегчить регистр назначения. В первоначальный de novo-построена модель, порядок, длину и положение вторичного структурные особенности и громоздкие остатков, тесно согласуются с предсказание. Во время уточнения резолюция была проведена до нижнего предела, чем резолюция, по оценкам, для окончательного восстановления. Трехмерные FSC был использован для измерения нормализованных коэффициент кросс корреляции между двумя самостоятельно созданный 3D-карты, (каждый с помощью половина набора данных) соответствующего снаряды в пространстве Фурье (как функция пространственной частоте). Мы использовали маску мягкой 4.3 Å от реконструкции и дополнительные 4.3 Å косинус мягкие края вместе с НЧ-фильтр 10 Е, то используется золотого стандарта FSC шагом 0.143 отсечки порог. Это было использовано для окончательного решения отчетности.

Figure 1
Рисунок 1: выражение и очистки hTRPC3 с использованием системы BacMam. (A) схема процедура для очистки и hTRPC3 выражения. (B) Bacmid колонии выбор на табличке сине белый индикатор. Выберите изолированное белый колонии (черная стрелка), не белый колонии с встроенным синий колонии или белый колонии при контакте с голубой колонии (красные стрелки). (C) GFP флуоресценции бакуловирусы P2 в Sf9 клетки до 20 кратным увеличением. Флуоресценции должен быть ярким и присутствует на клеточные мембраны и/или интерьер большинства клеток для мощный вирус. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: стабильность скрининга hTRPC3, FSEC. (A) моющего средства проверки hTRPC3. HTRPC3 был всего клеточной солюбилизирован в различных моющих средств с критической мицеллы концентрации 0,01 - 20 мм и был запущен в DDM/CHS-содержащих буфера. Хотя DDM/CHS показывает высокая растворимость hTRPC3, пик отображается в неправильном положении, слишком большой, чтобы быть tetrameric hTRPC3 (синий след). (B) управления TRPM4, с tetrameric молекулярной массой около 540 кДа, растворимых и бежать в DDM/CHS, имел элюции объем около 12,9 мл, при TRPC3, с tetrameric молекулярной массой около 400 кДа, солюбилизирован и запустить в DDM/CHS имел элюции объем приблизительно 11,9 мл. С меньший молекулярный вес hTRPC3 будут иметь элюции объем немного больше, чем TRPM4, чуть не меньше, предполагая, что DDM/CHS не может быть идеальной моющее средство для очистки и hTRPC3 солюбилизация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: скрининг буфера моющего средства hTRPC3, FSEC. (A) растворимость и стабильности тест hTRPC3 с помощью digitonin. Digitonin был испытан как для солюбилизация, так и в управлении буфера. Отметить положение пик hTRPC3 белка солюбилизирован в digitonin, смещается в сторону большего объема элюции по сравнению с белка, солюбилизирован в DDM/CHS (желтые трассировки против синие и красные следы). Только комбинации, используя digitonin в буферы солюбилизация и работает показывает правильный размер hTRPC3, FSEC (желтый след, звездочка). (B) аналогично FSEC результаты поклеточного растворимых hTRPC3, пик позиции сродство белков hTRPC3 очищенный в digitonin (красный след, 14 мл) смещается в сторону большего объема элюции по сравнению с сродство белков, очищенный в DDM/CHS (синий проследить, 12 мл) как измеряется SEC-фракционирования. (C) отрицательный пятно EM был использован для проверки качества очищенный протеин до сбора данных крио EM. Идеальный пятно следует представить частиц (красные круги) негативное витражные (появляется белый) и окруженный кольцом стиральный порошок (появляется черный). Показано представитель, идеально Микрофотография, в котором эти частицы обильные, монодисперсными и присутствует в нескольких направлениях. (D) качество данных из отрицательной пятно ет должен обеспечить 2D классов с четкой и последовательной общей архитектуры и должен охватывать несколько ориентаций белка, с средними содержится и по центру в пределах маски (черный круг). 2D классы от отрицательной пятно EM микроскопии hTRPC3 солюбилизирован DDM/CHS настоящей частиц, которые могут оказаться соперничество Димеризация hTRPC3 мономеров. В отличие от грубой (но четкие и последовательные) в целом желудь как tetrameric структура проявляется в 2D классы от отрицательной пятно EM микроскопии hTRPC3 солюбилизирован в digitonin. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: очищение hTRPC3. (A) стабильность испытание hTRPC3 присутствии ЭДТА. hTRPC3 был солюбилизирован в digitonin в присутствии (красный след) или отсутствие (синий след) 10 мм ЭДТА. Первый показал единый и узкий пик позиции Тетрамер белка (красный след, звездочка), указав, что ЭДТА стабилизированный hTRPC3 в своем tetrameric конформации. (B) GFP флуоресценции сигнал FSEC для hTRPC3 солюбилизирован в digitonin и запустить в буфер digitonin. Тетрамер пик наблюдается в растворимых материалов до очистки металла соответствие столбца (синий след, звездочка). Отсутствие этого пика в поток через дробь указывает полного связывания белка hTRPC3 в столбце сродство (красный след). После элюции по имидазола фракций в пик элюции были проверены FSEC (зеленый след). Все фракции, показаны нетронутыми Тетрамер пик были собраны для дальнейшей очистки. (C) испытания GFP расщепление hTRPC3 с помощью тромбина. Пищеварение время был испытан с использованием небольшое количество белка на 4 ° C, и полноты пищеварения была проверена FSEC. В каждой трассировке пик слева соответствует Тетрамер пик hTRPC3 (звездочка) и пик справа является бесплатный пик GFP. С увеличением длины пищеварение, отношение tetrameric белка GFP освободить уменьшилось, указав, что GFP было время расщепляется с белками. 2 h пищеварение показывает полный раскол GFP. (D) SEC профиль hTRPC3 до или после переваривания тромбина в digitonin содержащих работает буфер с 10 мм ЭДТА добавил. Как и ожидалось, Пиковая позиция смещается в сторону меньшего объема элюции после переваривания тромбина (красный след). Основной пик (звездочка) представляет tetrameric hTRPC3. Крио EM экспериментов были собраны фракций между красными линиями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: схема крио EM сбора и обработки данных для hTRPC3. Коллекции 3,660 фильм стеков очищенный hTRPC3 было сделано с помощью микроскопа с детектор прямого электронов. Коррекция движения и ручной выбор применялись в результате 3580 микроскопии. Частицы были авто и подвергается 2D классификации. 2D классы были уточнены 3D классификации. Только один из пяти 3D классов отображается с высоким разрешением функций. Этот класс был выбран для 3D изысканности и Frealign местных уточнения, что привело в структуре для hTRPC3 на 3.3 Е резолюции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Структурные определения белков, крио EM произвела революцию в области структурной биологии в последние несколько лет, благодаря разработке алгоритмов и новых камер, что значительно ускоряет определение структуры белков, которые не легко crystalize, особенно мембранных белков. Несмотря на все последние достижения в технике крио EM подготовки очищенного белков в качество и количество достаточно для облегчения высокого качества изображений часто остается длительным, дорогостоящим и сложным. Способность быстро выражать и экран, несколько генов конструкции под разнообразные условия очистки, как описано в протоколе выше, улучшает эффективность этого процесса, позволяя быстрое и экономичное производство высокого качества очищенный протеин для использования в исследованиях крио EM.

В то время как метод, описанный здесь предоставляет способ для очистки больших количествах млекопитающих мембранных белков при меньших затратах, чем путем прямого transfection и более быстро чем поколения стабильно transfected клеток линии, он имеет много шагов, каждый из которых должны быть оптимизированы для обеспечить высокое качество белка урожая. В пределах биохимических методов, используемых для производства и очистки hTRPC3 существует ряд важных шагов и контрольно-пропускных пунктов. Первый критический контрольно-пропускной пункт является производство bacmid ДНК. Как описано в результатах, Выбор идеального колонии является первым шагом в поколении качества вируса для выражения протеина. Кроме того если концентрация bacmid ДНК, очищенного от выбранного колонии составляет менее 1 мкг/мкл, результате вирус не будет достаточно для надежной белков. Второй критический контрольно-пропускной пункт является производство бакуловирусы P1 и P2. Титр вируса может быть оценена путем GFP флуоресценции, как показано на рисунке 1 c или может быть измерена как описано Колман et al. 35. Помимо вирусный титр, время курс время инфекции должна осуществляться для каждой новой конструкции определить оптимальное время инфекции для максимальной белков. Критические контрольно-пропускного пункта 3 является растворимость и стабильности скрининга, показан на рисунке 2. Моющие средства с высокой CMC, например DDM, может обеспечить высокую растворимость, но они не являются идеальными для крио EM изображений потому, что они могут привести к обилие загрязнять мицеллы. Мягким моющим средством, таких как digitonin, может обеспечить достаточно растворимость при сохранении стабильности белка. Скрининг добавки, такие как ЭДТА в случае hTRPC3, имеет важное значение для обнаружения очистки условие, которое приводит к нетронутым и однородной белка, возможно путем удаления кальция из hTRPC3, который является проницаемой для кальция. Критические контрольно-пропускной пункт 4 является проверка конкретных и эффективных белка захвата во время очищения сродства столбец и наблюдения идеальный белок пика во время SEC-фракционирование (рис. 4). Недопущение включения загрязняющих частиц белка сохраняя при этом все из целевого белка имеет решающее значение для получения достаточно высокодоходных белка для визуализации крио EM. Изменения времени пакета привязки и соотношение смолы для растворимых белка может помочь улучшить удержание белка в столбце смолы. В целом качество SEC-фракционирование пик в наш опыт является лучшим показателем, до изображений, качества очищенный протеин частиц. Низкий или широкий пик в SEC-фракционирование указывает возможные проблемы слишком мало белка частиц на изображение или присутствие загрязняющих продуктов агрегации/разложения белка, соответственно. Кроме того изменения в близости тег в конструкции самого оказалось необходимым в некоторых случаях для обеспечения достаточного сродства тега привязки. Окончательный контрольно-пропускного пункта до коллекции наборов данных крио EM — это проверка качества частиц протеина, отрицательные пятно EM. Хотя это не является строго необходимым, мы находим, что это обеспечивает прекрасную возможность для спот и правильный протеин вопросы качества прежде чем инвестировать в требует больших затрат времени и стоимости процесса сбора данных, крио EM.

Один альтернативный метод производства белка для структурных исследований крио EM-это прямой очистки белков из родной ткани источника. Хотя этот метод часто встречаются проблемы с белка урожай, он является отличной альтернативой для белков в клетках, которые очень обильные или что существуют как часть большой комплекс мульти белок, который может быть трудно производить с помощью рекомбинантной гиперэкспрессия система36. Однако, для одной белки, выраженные в средней или низкой суммы в физиологических условиях, выражение и очистки системы, представленные здесь эффективный относительно недорогостоящих и высокодоходный метод производства очищенного млекопитающих мембранные белки крио EM структурных исследований. Один метод, который сильно могут дополнить, что представленные здесь является воссоздание очищенный протеин в nanodiscs липидов до сбора данных крио EM37. При этом методе белки вложенных в небольшой диск липидный бислой, возможно предоставление микроокружения родной как по сравнению с моющим мицеллы, хотя нет никаких доказательств пока что структур распущено моющего средства и nanodisc различные38,,3940. Другой подход заключается в том, чтобы извлечь белка, непосредственно с помощью амфифильными полимеров как малеинового ангидрида стирола (SMA), который успешно использовался для определения мембранных белков структур41,42.

Эти подходы, описанные в этой рукописи оказались легко адаптируется в нашей лаборатории в различных других млекопитающих мембранных белков за пределами ионных каналов. Поэтому мы считаем, что этот протокол будет ценным инструментом в структурных и функциональных анализов, которые лежат в основе высоких специфика целевых наркотиков дизайн. Это будет особенно полезно в нейродегенеративные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания и рак, в которых ион каналы являются трудной, но высоким потенциалом лекарственных препаратов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим G. Чжао и X. Meng за поддержку в сборе данных в Дэвид Ван Андел Advanced крио-электронная микроскопия Suite. Мы высоко ценим VARI высокопроизводительных вычислений команды для компьютерной поддержки. Мы даем нашу благодарность N. Клементе, D. взносы, J. Floramo, ю. Хуан, ю. Ким, C. Mueller, B. рот и Z. Ruan для комментариев, которые значительно улучшили эту рукопись. Мы благодарим д Nadziejka за редакционную поддержку для этой рукописи. Эта работа была поддержана внутренней VARI финансирования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent - to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Tags

Биохимия выпуск 143 ионного канала мембранные белки очищение протеина определения структуры крио электронная микроскопия крио EM бакуловирусы
Выражение и очищение человека липидов чувствительных катионного канала TRPC3 структурные определения по одной частицы крио электронная микроскопия
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun,… More

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter