Summary
Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.
Abstract
Voorbijgaande receptor mogelijke kanalen (TRPCs) van de canonieke TRP onderfamilie zijn opvangfaciliteiten catie kanalen die een essentiële rol bij de calcium-homeostase, met name op de winkel bediende calcium ingang, die is van cruciaal belang spelen voor het behoud van de goede werking van Synaptic vesikel release en intracellulaire signaalroutes. Dienovereenkomstig, TRPC kanalen zijn betrokken in een verscheidenheid van ziekten bij de mens met inbegrip van cardiovasculaire aandoeningen zoals hypertrofie van het hart, neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson en neurologische aandoeningen zoals spinocerebellar ataxie. Daarom, TRPC kanalen vertegenwoordigen een potentieel farmacologische doelwit in ziekten bij de mens. De moleculaire mechanismen van het gating in deze kanalen zijn echter nog onduidelijk. De moeilijkheid in het verkrijgen van grote hoeveelheden van stabiele, homogene en gezuiverde proteïne is een beperkende factor in structuur vastberadenheid studies, met name voor zoogdieren membraaneiwitten zoals de ionenkanalen TRPC geweest. Hier presenteren we een protocol voor de grootschalige uitdrukking van zoogdieren ion kanaal membraaneiwitten met behulp van een gemodificeerde baculovirus systeem voor de overdracht van de genen en de zuivering van deze proteïnen door affiniteit en grootte-uitsluiting chromatografie. Verder presenteren we een protocol voor het verzamelen van single-deeltje cryo-Elektron microscopie beelden van gezuiverde eiwit en deze om beelden te gebruiken om te bepalen van de eiwitstructuur. Structuurbepaling is een krachtige methode voor het begrijpen van de mechanismen van gating en functie in ionenkanalen.
Introduction
Calcium is betrokken bij de meest cellulaire processen, waaronder signalering cascades, transcriptie controle, neurotransmitter release en hormoon molecuul synthese1,2,3. De homeostatische onderhoud van cytosolische vrij calcium is essentieel voor de gezondheid en functie van cellen. Een van de belangrijkste mechanismen van intracellulair calcium-homeostase is calcium winkel bediende ingang (SOCE), een proces waarin uitputting van calcium in het endoplasmatisch reticulum (ER) triggers de opening van de ionenkanalen op het plasma-membraan opgeslagen te vergemakkelijken de aanvulling ER calcium, die vervolgens kunnen worden gebruikt in de verdere signalering4,5,6. Voorbijgaande receptor mogelijke kanalen (TRPCs), die calcium-permeabele kanalen die behoren tot de superfamilie TRP, hebben geïdentificeerd als een belangrijke deelnemer in SOCE7,8,9 .
Onder de zeven leden in de familie van de TRPC, TRPC3, TRPC6 en TRPC7 vormen een deelgroep van de homologe en ze zijn uniek in de mogelijkheid om te worden geactiveerd door de lipide secundaire messenger diacylglycerol (DAG), een afbraakproduct van de Lipide signalering phosphatidylinositol 4,5-difosfaat (PIP2)10,11. TRPC3 is sterk uitgedrukt in gladde spieren en in de cerebrale en cerebellaire gebieden van de hersenen, waar het essentiële rol in het calcium signalering die van invloed zijn transmissie en neurogenese12,13speelt. Dysfunctie van TRPC3 is gekoppeld aan het centrale zenuwstelsel-stoornissen, cardiovasculaire aandoeningen en bepaalde kankers zoals ovariële adenocarcinoom14,15,16. Daarom, TRPC3 houdt belofte als farmaceutische doel voor de behandeling van deze ziekten. De ontwikkeling van gerichte geneesmiddelen op TRPC3 heeft is beperkt door een gebrek aan begrip van de activering van de moleculaire mechanismen, met inbegrip van lipide bindende sites17,18. Biedt belangrijke inzichten in deze mechanismen19, hebben we de eerste atomaire resolutie structuur van het menselijke TRPC3 kanaal (hTRPC3) en haar twee lipide bandplaatsen in een gesloten toestand, gemeld.
De belangrijkste factor voor het bepalen van de structuur van een membraan eiwit op hoge resolutie is voor eiwitten van hoge kwaliteit. De overeenkomstige screening van expressie en zuivering voorwaarden tot het verkrijgen van hoge kwaliteit proteïne kan een tijdrovende en dure inspanning. Hier presenteren we een protocol beschrijft in detail hoe wij de optimale omstandigheden voor de expressie en de zuivering van hTRPC3, die zich slecht in onze eerste screening gedragen te identificeren. Wij presenteren verschillende belangrijke punten over het oplossen en optimaliseren van het gedrag van de eiwitten, die een solide basis voor onze cryo-Elektron microscopie (cryo-EM) studies leggen. We gebruiken een gemodificeerde baculoviral vector (pEG), ontwikkeld door Gouaux en collega's, dat is geoptimaliseerd voor screening tests en efficiënte generatie baculovirus in zoogdiercellen20genereren. Deze expressie-methode is geschikt voor snelle en kostenefficiënte overexpressie van eiwitten in de celmembraan van zoogdieren. Wij combineren het gebruik van deze vector met een fluorescentie-detectie grootte-uitsluiting chromatografie-gebaseerde (FSEC) methode21prescreening. Deze methode maakt gebruik van een tag van de groen fluorescente proteïne (GFP) gefuseerd tot de constructie van belang en verbetert de visualisatie van de doel-proteïne in kleine, hele-cel ontbindend monsters. Dit zorgt voor screening van eiwitstabiliteit in aanwezigheid van verschillende detergentia en additieven, met thermostabilizing mutaties, en maakt het gebruik van een klein aantal cellen uit kleinschalige voorbijgaande transfectie. Op deze manier kan een veelheid van voorwaarden snel worden gescreend alvorens tot een grootschalige eiwitreiniging. Naar aanleiding van meningsuiting, screening en zuivering presenteren we een protocol voor het verkrijgen en verwerken van beelden uit cryo-EM voor het genereren van een DOVO structurele bepaling van het eiwit. Wij zijn van mening dat de hier beschreven aanpak als een gegeneraliseerd protocol voor structurele studies van TRP kanaal receptoren en andere membraaneiwitten dienen zal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de transformatie van de bevoegde cellen van de DH10α voor de productie van Bacmid DNA
- Synthetiseren van het gen van belang en subclone het in een gewijzigde versie van de pEG vector met een twin strep-tag, een His8-tag en GFP met een trombine breukzijde op de N-terminus (pFastBacI)20.
- Bevoegde cellen transformeren door toevoeging van 5 ng van plasmide met een gewenste gen in pFastBacI tot 50 μl van DH10α cellen in een 1,5 mL tube en incubeer gedurende 10 min op ijs. Warmte schok de cellen voor 45 s bij 42 ° C. Voeg 200 μL van super optimale bouillon met katabole onderdrukker (SOC) medium op de buis en incubeer gedurende 4-8 uur bij 37 ° C in een roteerschudapparaat bij 225 t/min.
- Plaat 5 μL van cellen op een bacmid LB agarplaat (50 μg/mL kanamycine, 7 μg/mL gentamicine, tetracycline, 100 μg/mL Bluo-gal en 40 μg/mL isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], agar van 10 μg/mL).
- Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 ° C.
Opmerking: De Bluo-gal indicator vlekken koloniën, die nog steeds uiten lacZ (vector invoeging mislukte), waardoor voor selectie van witte (met succes getransformeerd) koloniën. - Selecteer zorgvuldig een geïsoleerde witte kolonie, het vermijden van eventuele witte koloniën die in contact met blauwe kolonies, en groeien van cellen overnachting in 6 mL bacmid LB voedingsbodem (50 μg/mL kanamycine, 7 μg/mL gentamicine, 10 μg/mL tetracycline) bij 37 ° C in een roteerschudapparaat bij 225 t/min.
2. bacteriële voorbereiding voor isolatie van Bacmid DNA
- Isoleren bacmid DNA, spin down Escherichia coli cellen gedurende 10 minuten bij 2880 x g.
- Gooi het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL van cel resuspensie oplossing van de miniprep (Zie Tabel van materialen) door pipetteren Kit. Zorg ervoor dat de pellet is volledig en homogeen opgeschort. Pipetteer vervolgens de celsuspensie in 1,5 mL tubes.
- Voeg 200 µL van de oplossing van de lysis van de cel uit de miniprep kit en meng door het omkeren van de buis een paar keer. Incubeer gedurende maximaal 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) Lyse de cellen. 200 µL van neutralisatie oplossing toevoegen vanuit de miniprep kit en meng door het omkeren van de buis een paar keer om te stoppen met de lysis van de reactie.
- Spin down voor 10 min op 21,130 x g in een centrifuge tafelblad. Verzamelen van 600 μL van de bovendrijvende substantie in een tube van 2 mL. Toevoegen van 600 μL fenol: chloroform: isoamyl alcohol oplossing (Zie Tabel van materialen) en meng grondig om het DNA uit de rest van de producten van de lysis van de cel.
Let op: Fenol: chloroform: isoamyl alcohol oplossing is vergiftig bij inademing, aanraking met de huid en opname door de mond. Het chemische brandwonden kan veroorzaken en is mogelijk kankerverwekkend. Draag handschoenen en een dichtgeknoopt laboratoriumjas. Werken in een zuurkast. Verwijdering van deze gevaarlijke afvalstoffen op de juiste manier. - Draai de buis gedurende 10 minuten bij 21130 x g in een centrifuge tafelblad. Twee verschillende vloeibare fasen zullen zichtbaar zijn. Zorgvuldig overbrengen 300 μL van de bovenste waterfase een nieuwe buis. Voeg 600 l 100% ethanol te wassen van het DNA. Voorzichtig omkeren de buis te mengen.
Opmerking: Doe niet vortex, zoals dit bacmid DNA kunt schuintrekken. - Cool buizen door ze te plaatsen in een vriezer van-20 ° C gedurende 10 minuten Spin down voor 10 min op 21,130 x g in een centrifuge tafelblad. Verwijder het supernatant en behouden van de DNA-pellet.
- Voeg vervolgens 1 mL van 70% ethanol te wassen de pellet. Voorzichtig omkeren de buis te mengen. Spin voor 10 min op 21,130 x g in een centrifuge tafelblad. Verwijder het supernatant en laat de pellet in de lucht droog gedurende ongeveer 5 minuten of totdat er geen vloeistof is zichtbaar in de buis en de DNA-pellet wordt doorzichtig.
- Resuspendeer de pellet droog in 50 µL van steriele, DNase-vrije, gedeïoniseerd water. Het meten van de concentratie van DNA.
Opmerking: Bacmid DNA niet invriezen. Bewaren bij 4 ° C voor maximaal enkele dagen.
3. de transfectie van Sf9 Insect cellen met Bacmid voor de productie van P1 Baculovirus
- Zaad 0.9 x 106 Sf9 cellen per putje in 2 mL zuiver geschikte voedingsbodem (Zie Tabel van materialen) in elk putje van de plaat van een 6-well weefselkweek. Incubeer de cellen bij 27 ° C gedurende 20 min ter bevordering van de gehechtheid aan de plaat.
Let op: Celculturen zijn een potentiële biohazard. Werken in een erkende laminaire flow kap met behulp van aseptische technieken en controleren van institutionele en gouvernementele richtsnoeren voor aanbevolen beschermende kleding en correcte afvoer van de afvalstoffen voorafgaand aan het uitvoeren van experimenten. - Na bijlage, voeg 8 µL van transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) naar 100 µL van media voor elk putje van de 6 goed plaat wordt transfected in een steriele buis. 6 μg van bacmid DNA aan 100 µL van medium in een aparte steriele buis toevoegen. Incubeer 5 min op RT. combineren de twee oplossingen en incubeer gedurende 45 min op RT.
- Het medium in de 6 putten vervangen door 2 mL verse voedingsbodem. Voeg het mengsel uit de vorige stap aan elk goed ontkleuring (200 µL per putje). Zachtjes rock de plaat zodat vermenging van de transfectie oplossing in het medium.
Opmerking: Niet swirl of schudden van de plaat omdat dit zal leiden tot cellen om los te maken. - Incubeer de cellen voor 5 d (120 h) in een 27 ° C bevochtigde incubator. Controleren van GFP fluorescentie vóór de oogst om te controleren dat virus wordt geproduceerd in een groot aantal cellen; Als het percentage laag is, breiden de incubatietijd als dit nodig is (Zie Figuur 1 c).
- Verzamelen het supernatant met P1 virus (ongeveer 2 mL van elk putje). Filteren van het medium met P1 virus in 2 mL buizen met behulp van een spuit met 3 mL en kleine 0,2 µm filter. Steriele foetale runderserum (FBS) toevoegen om een eindconcentratie van 1%.
Opmerking: Deze voorraad van P1 virus bij 4 ° C moet worden bewaard en worden beschermd tegen licht.
4. infectie van Sf9 Insect cellen met P1 Baculovirus tot P2 Baculovirus
- Bereiden van 200 mL (of gewenste volume) van Sf9 cellen bij een concentratie van 0.8 - 0.9 x 106 cellen/mL in geschikte voedingsbodem (Zie Tabel van materialen) in een erlenmeyer cultuur van platte bodem van voldoende grootte.
Opmerking: Voor schorsing cultuur, het volume dat wordt gebruikt mag niet meer dan 40% van de totale capaciteit van de kolf. - 1:2500 verhouding (v/v) van P1 virus voorraad uit 3.5 toevoegen aan de cultuur van de opschorting van de cel van Sf9. Incubeer gedurende de tijd van optimale virus expressie (meestal 48-120 h afhankelijk van de structuur van de proteïne) bij 27 ° C in een roteerschudapparaat bij 115 t/min.
Opmerking: De relatieve virus expressie kan worden bepaald door het bekijken van het GFP-fluorescentie van het virus in een monster van de cultuur. - De celsuspensie voor 40 min bij 11,520 x g centrifugeren en verzamel het supernatant met P2-virus. De bovendrijvende vloeistof met behulp van wegwerp 0,2 µm filters filteren. FBS toevoegen om een eindconcentratie van 0,5%.
Opmerking: Deze voorraad van P2 virus bij 4 ° C moet worden bewaard en worden beschermd tegen licht. - Het verkrijgen van een titer voor de P2-virus met behulp van Sf9easy cellen of een virus-teller.
5. infectie van zoogdiercellen van het HEK293 met P2 Baculovirus voor grootschalige eiwit expressie
- Bereiden van een gewenst volume van HEK293 zoogdieren schorsing celkweek (4-6 L is aanbevolen voor de bereiding van bevroren rasters) met een concentratie van 3.5-3.8 x 106 cellen/mL in het medium van expressie (Zie Tabel van materialen) aangevuld met 1% (v / v) steriele FBS in verbijsterd-onderkant kolf cultuur maatkolven van voldoende grootte.
Opmerking: Voor schorsing cultuur, het volume dat wordt gebruikt mag niet meer dan 40% van het totale volume van de kolf. - 8% (v/v) van P2 virus stockoplossing uit stap 4.3 toevoegen aan de cultuur van de opschorting van de cel van HEK293. Incubeer bij 37 ° C in een roteerschudapparaat bij 135 t/min.
- Voeg 10 mM natrium butyraat 12-18 h na infectie. Incubeer gedurende de tijd van optimale eiwit expressie (meestal 36-72 h) bij 30 ° C.
- Oogsten van cellen door gedurende 20 minuten bij 2,880 x gcentrifugeren. Wassen cellen door resuspending in ongeveer 100 mL tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) per liter cellen geoogst. Centrifugeer nogmaals gedurende 20 min op 2,880 x g en het verzamelen van de cel-pellet.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Cel pellets kunnen worden module-ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij-80 ° C tot zuivering.
Let op: Vloeibare stikstof kan cryogene brandwonden of letsel veroorzaken. Bevriezing kan veroorzaken. Het kan verdringen van zuurstof en snelle verstikking veroorzaken. Draag cold isolerende handschoenen en gelaatsscherm. - Verzamelen van kleine 1 mL oogsten op wisselende tijdstippen en solubilize gedurende 2 uur bij 4 ° C met schommelen of roeren in aanwezigheid van verschillende detergentia en/of additieven. Deze kleine geheel-ontbindend celsteekproeven kunnen worden verduidelijkt door ultracentrifugatie bij 235.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en uitvoeren als een monster 30 μL op een grootte-uitsluiting chromatography (SEC) kolom (Zie Tabel van materialen) om te bepalen van de beste tijd voor expressie en de beste voorwaarden voor solubilisatie.
Opmerking: In het geval van hTRPC3, deze voorstelling opgenomen verschillende buffers met pH-waarden van 4.0-9.5 en zout concentraties van 50-500 mM; verschillende Ionische composities (zoals MgCl2 of NaCl); verschillende detergentia conform zijn aan de kritische micel (CMC) concentraties van 0,1 - 20 mM; vermindering van de additieven, zoals dithiothreitol, tris(2-carboxyethyl) Fosfine en β-mercaptoethanol; en de calcium-chelaat additieve ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA).
6. de zuivering van hTRPC3 eiwit uit de cel bevroren Pellet
- Ontdooi de pellet in buffer met 20 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0,8 μM aprotinin, 2 μg/mL leupeptin, 2 mM pepstatin A, en 1% digitonin, met behulp van 100 mL buffer per liter cellen geoogst. Eenmaal ontdooid, zorgen voor homogeniteit van de oplossing door pipetteren of roeren. Laat gedurende 2 uur bij 4 ° C in een bekerglas van ondergedompeld in ijs met een roer bar roterende solubilize.
- Verwijderen van puin van de cel door ultracentrifugatie bij 235.000 × g gedurende 1 uur bij 4 ° C. Controleren van de hoeveelheid eiwit door eenmonstervan 30 μL op een SEC-kolom (Zie Tabel van materialen) door hoge prestatie vloeibare chromatografie (HPLC) en visualiseren van de doel-eiwit door het GFP-signaaluitgang.
- Incubeer de ontbindend proteïne (bezinken) met kobalt affiniteit hars gedurende 1-2 uur bij 4 ° C. Controleer of binding aan eiwitten om de hars door een 30 μL monster uit te voeren op een kolom SEC.
Opmerking: Als binding aan eiwitten heeft plaatsgevonden, het GFP tagged eiwit doel zal worden bewaard op de kolom niet gevonden in de doorstroming. Daarom geen GFP-signaal zullen aanwezig zijn op de positie die overeenkomt met de doelgrootte eiwit wanneer de doorstroming op HPLC wordt uitgevoerd. - Wassen van de hars met 10 kolom hoeveelheid in de buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 15 mM imidazool en 0,1% digitonin). Selectievakje voor eiwit verlies door een 30 μL monster uit te voeren op een kolom SEC.
Opmerking: Als eiwit verlies uit de kolom heeft voorgedaan, het GFP tagged eiwit doel zal worden gevonden in de wash-buffer via de kolom heeft doorgegeven. Daarom GFP signaal zullen aanwezig zijn op de positie die overeenkomt met de doelgrootte eiwit wanneer de buffer wassen op HPLC wordt uitgevoerd. Als eiwit verlies zich heeft voorgedaan, kan de imidazool-concentratie van de buffer wassen moet worden verlaagd om te voorkomen dat zijn label binding aan de kolom affiniteit verstoren. - Elueer de hars-gebonden hTRPC3 met buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 250 mM imidazool en 0,1% digitonin). Trombine toevoegen om een 1:20 molaire verhouding (tot het klieven van het GFP-tag) en voeg van 10 mM EDTA (een hTRPC3 stabilisator) aan het eluted monster en incubeer gedurende 3 uur bij 4 ° C. Controleer dat eiwit heeft zijn geëlueerd door 90 μL van een monster verdunde 1:100 waarop een SEC-kolom en controleren van de aanwezigheid van een GFP-signaal op de positie die overeenkomt met het doelformaat voor eiwit.
Opmerking: op dit punt, het tryptofaan signaal van totale proteïne in de elutie kan ook worden bekeken. Alleen het doel affiniteit-gezuiverd eiwit de elutie het GFP blijft en tryptofaan signalen zullen nabij identiek in profiel. Als het doel-eiwit niet in grote hoeveelheid in de elutie gezien wordt maar niet in de doorstroom of wassen verloren was, het eiwit gebleven waarschijnlijk gebonden aan de kolom en gebruik van hogere concentraties van imidazool in de buffer kan worden geëlueerd. - Het concentreren van het eluaat tot 500 μL of minder in een 15 mL 100K centrifugaal filter tube (Zie Tabel van materialen) door spinnen bij 2,880 x g bij 4 ° C in stappen van 5 min. Resuspendeer de proteïne door pipetteren de oplossing op en neer tussen de draaiingen om te voorkomen dat overconcentrating.
Opmerking: Centrifuge tijd kan worden verkort als het volume het gewenste eindvolume benadert. - Het laden van het concentraat op een kolom van de SEC in de buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA en 0,1% digitonin). Run.
- Combineer piek breuken met de intacte TRPC3 tetrameer, als gevisualiseerde door UV extinctie signaal, en me weer concentreren om een eindconcentratie van ten minste 5 mg/mL.
7. screening van proteïne door negatieve-vlek-elektronenmicroscopie
- Inschakelen van de machine gloed-kwijting. Stel het programma voor het nakomen van een koolstof-gecoat rooster met behulp van argon en zuurstof voor 30 s. Run het programma om de koolstof-coating op koperen 400-mesh rasters hydrofiele vóór toevoeging van de eiwit-oplossing.
- Vijf 40 μl druppels steriel water en twee 40 μl druppels 1% uranyl formate oplossing instellen (op lab film, vetvrij papier of een soortgelijk oppervlak, Zie Tabel van materialen). Nemen van het raster uit stap 7.1 en 2.5 μL van eiwit sample 5 mg/mL (50-200 μM) toevoegen aan de donkere kant en laat het zitten voor 1 min.
- Droog na 1 minuut, het raster met filtreerpapier. Raak niet het koffiefilter rechtstreeks naar het raster oppervlak; in plaats daarvan, breng het papier tot aan de rand van de vloeibare druppel en capillaire toelaten te trekken van de vloeistof uit het raster in het koffiefilter.
- Dompel het raster in eerste druppel water. Drogen met filtreerpapier en herhaal met de overige druppels water en de eerste daling van uranyl formate. Laat de tweede daling van uranyl formate zitten voor 1 min en vervolgens drogen met filtreerpapier. Het toestaan van het raster aan volledig lucht droog (ongeveer 1 minuut) alvorens op te slaan.
Opmerking: Dit kleuring protocol wellicht niet ideaal voor alle combinaties van de eiwit-wasmiddel. Verschillende concentraties van uranyl formate vlek en verschillende lengtes van tijd voor vlek blootstelling moeten worden getest als de bovenstaande stappen niet een vlek met goed contrast bieden. - Afbeelding van de rasters op een elektronenmicroscoop (Zie Tabel van materialen) om de kwaliteit van het eiwit deeltjes te controleren. Te controleren of de microfoto talrijke deeltjes die in algemene verschijning en distributie homogeen, weer goed contrast en overeenkomen met de voorspelde grootte van de proteïne doel.
- Voorlopige genereren, met een lage resolutie, tweedimensionale (2D) classificaties gebruik van 50-100 microfoto (Zie gegevensverwerking – stap 10) om te controleren dat de deeltjes vertegenwoordigen verschillende weergaven van een enkele consistente structuur.
Opmerking: Microfoto en voorlopige 2D klassen van voldoende kwaliteit, als hierboven, zijn een sterke indicator dat het protocol voldoende is geoptimaliseerd voor eiwitreiniging. Voorbereiding en screening van cryo-EM rasters gerechtvaardigd is op dit punt.
8. EM monstervoorbereiding
- Gloed-kwijting een gouden een koolstof-raster (Zie Tabel van materialen) zoals beschreven in stap 7.1.
- Toepassing van 2.5 μL van de eiwitSteekproef (5 mg/mL) van geconcentreerde hTRPC3 op het raster. Wissen van het raster voor 1.5 s met een vlek van kracht van 1 en een wachttijd van 5 s bij 100% vochtigheid en 4 ° C, duik dan het raster in vloeibaar ethaan gekoeld door vloeibare stikstof met behulp van een machine verglazing.
Opmerking: De vochtigheid, temperatuur, vlek-force, vlek tijd en wachttijd hier vermeld werden gebruikt voor de auteurs hTRPC3 studie19. Ze wellicht worden gewijzigd om te produceren optimale glasvocht ijs voor andere eiwitten en detergenten. - Scherm bevroren rasters voor optimale ijsgang met behulp van een Microscoop cryo-EM (Zie Tabel van materialen) en handmatig weergave regio's van dik ijs (vakjes fragmenten kleiner en donkerder), dun ijs (vakjes die groter en helderder verschijnen), en medium ice .
Opmerking: Dikker ijs houdt vaak meer deeltjes, terwijl dunnere ijs vaak betere contrastverhouding en resolutie levert. Gebruik handmatige screening van beelden om te bepalen welke ijs voorwaarden resultaten in een groot aantal monodispersed deeltjes met een goed contrast en resolutie. Als goede omstandigheden zijn geverifieerd, verplaats naar foto collectie op een 300 kV cryo-EM Microscoop.
9. EM gegevensverzameling
- Afbeeldingsstapels met behulp van een geautomatiseerde acquisitie programma, opnemen in Super tellen resolutiemodus met een weggegooid pixelgrootte van 1.074 Å op elektronenmicroscoop geëxploiteerd op 300 kV met een nominale vergroting van 130.000 X directe elektron detector.
- Dosis-fractionate elk beeld naar 40 frames met een blootstellingstijd van de totale van 8 s, met 0,2 s per frame en een dosering van 6,76 e− Å−2 s−1 (nominale defocus waarden varieerde van 1.0 tot 2,5 μm in de auteurs experiment).
10. EM gegevensverwerking
- Uitvoering van de motie correctie van vatte film stapels22 en schatten defocus waarden23 met behulp van de software van de gegevensverwerking (Zie Tabel van materialen)24.
- Kies deeltjes uit de microfoto. Gebruik deze deeltjes geplukt voor de bouw van een eerste referentie-gratis 2D classificatie op basis van de software-24. Selecteer ideale 2D klasse gemiddelden te gebruiken als sjablonen voor geautomatiseerde deeltje picken voor de hele gegevensset.
- Handmatig controleren van de kwaliteit van de auto-geplukt deeltjes en slechte deeltjes te verwijderen. Gebruik meerdere rondes van 2D classificatie op te schonen geplukt deeltjes.
- Het genereren van een eerste model25. Onderwerp 2D geplukt deeltjes driedimensionale (3D) indeling (ongeveer 5 klassen) met behulp van C1 symmetrie en een eerste wederopbouw-laagdoorlaatfilter van 60 Å als een referentiemodel. Bepalen welke klassen high-resolution kenmerken vertonen en combineren van deeltjes binnen dergelijke een klasse.
- Verder verfijnen deeltjes met behulp van de lokale verfijning met symmetrie van de C4 (in het geval van hTRPC3) toegepast en een hoge resolutie limiet voor deeltje uitlijning instellen naar 4.5 Å26.
11. model gebouw
- Bouwen van een model (Zie Tabel van materialen voor de software die wordt gebruikt). Voor hTRPC3, gebruik de transmembrane domein (TMD) van de voorbijgaande receptor potentiële melastatin 4 (TRPM4) structuur protein data bank (PDB) 5wp6 als een gids-27. Gebruik omvangrijk residuen en secundaire structuur voorspelling bij DOVO gebouw.
- Het eerste model onverminderd de reële ruimte verfijning met secundaire structuur beperkingen28. Handmatig onderzoekt de verfijnde model en remodify zo nodig (Zie Tabel van materialen voor de software die wordt gebruikt).
- Fourier shell correlatie (FSC) bochten voor de berekening van het verschil tussen het uiteindelijke model en de EM-kaart voor de validatie van de verfijnde structuur van toepassing. Evalueren van de geometrie van de atomaire modellen (Zie Tabel van materialen voor de software die wordt gebruikt)29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematisch overzicht van het protocol voor expressie en reiniging van hTRPC3 wordt getoond in figuur 1A. Een afbeelding van de hTRPC3 bacmid plaat met ideale witte kolonies, vergelijkbaar met degene geselecteerd voor de zuivering van de DNA van de bacmid, wordt getoond in figuur 1B. We vonden dat 48u is ideaal voor duidelijke Bluo-gal kleuring met behoud van de aanwezigheid van geïsoleerde kolonies. Piek productie van P2 virus voor hTRPC3, als gevisualiseerde door GFP fluorescentie, werd gezien na 4 d van infectie in insect cellen van de Sf9 (Figuur 1 c).
P2 baulovirus werd geoogst uit de media, aangevuld met 1% FBS, en gebruikt voor het infecteren van een opschorting van HEK293 zoogdiercellen. Natrium butyraat is toegevoegd aan de geïnfecteerde cellen 12-18 h na het virus te stimuleren eiwit expressie20. Cellen werden vervolgens geïncubeerd voor een extra 36 h bij 30 ° C. De cellen werden geoogst en onderworpen aan de oplosbaarheid en stabiliteit screening door FSEC (figuur 2A)21. De cellen waren ontbindend zeven verschillende detergentia met CMC waarden van 0.01 - 20 mM met een wasmiddel concentratie ongeveer 10 maal de waarde van de CMC. Na geheel-cel solubilisatie, het puin van de lysis van de cel door ultracentrifugatie werd verwijderd en het supernatant die ontbindend eiwitten bevatten was geladen op een kolom SEC en uitgevoerd door HPLC in n-dodecyl-β-D-maltopyranoside/cholesteryl hemisuccinate (DDM/CHS) wasmiddel-bevattende buffer om absolute oplosbaarheid en standpunt van het volume van de piek van hTRPC3 onder verschillende omstandigheden ten opzichte van de controle van een TRPM4 (figuur 2B) te vergelijken. We kozen te DDM/CHS gebruiken als de eerste lopende buffer voor de monsters ontbindend in verschillende detergentia omdat DDM/CHS de meest gebruikte is wasmiddel gebruikt bij het oplossen van de structuren van membraaneiwitten. Al de verschillende wasmiddel-ontbindend TRPC3 monsters bleek piek posities op ongeveer 11,9 mL, wat waarschijnlijk te groot, omdat het tetramere vorm van hTRPC3 een kleinere moleculair gewicht dan de positieve heeft controle menselijke TRPM4 (figuur 2A en Figuur 2B).
Toch, want er was geen structuur van elke receptor kanaal TRPC onze resultaten te vergelijken, en omdat de grote moleculair gewicht kan worden veroorzaakt door de architectuur van TRPC3 of andere factoren, voerden we een kleinschalige zuivering van hTRPC3 met behulp van 25 mL cellen met behulp van DDM/CHS gedurende het gehele experiment als DDM/CHS gaf de beste oplosbaarheid van hTRPC3. Het profiel van de SEC van hTRPC3 toonde een piek van de monodispers, maar was nog steeds in een positie van de piek die een hoger moleculair gewicht dan TRPM4 (gegevens niet worden weergegeven). Wij gecontroleerd het eiwit in de Fractie van de piek van SEC profiel door negatieve-vlek EM, want het is een snelle methode voor het verifiëren van de kwaliteit van de eiwitten en een zeer kleine hoeveelheid eiwit vereist. In de opname, werden deeltjes waargenomen met twee transmembraan domeinen in de dezelfde deeltjes aanwezig. Bleek dat twee hTRPC3 deeltjes dimerized head-to-head wijze door de interactie tussen twee cytosolische domeinen (figuur 3D). Wij vervolgens opgenomen het reducerend reagens dithiothreitol (DTT) in de buffer van de zuivering voor de tweede kleinschalige zuivering, hoop te verstoren de dimerisatie van hTRPC3. Inderdaad, verscheen een tweede piek met lager moleculair gewicht door SEC fractionering. Echter, de deeltjes verscheen te klein om een intact tetrameer en toonde geen functies van membraaneiwitten zoals een transmembraan domein. Het bleek dat DDM/CHS niet een geschikt reinigingsmiddel was voor het zuiveren van hTRPC3, ondanks de beste oplosbaarheid geven voor hTRPC3.
Vervolgens we geprobeerd een mildere wasmiddel, digitonin, om hTRPC3, solubilize en vergeleken met het eiwit ontbindend in DDM/CHS. Hier hebben we gebruikt twee verschillende lopende buffers met DDM/CHS en digitonin, respectievelijk. Dit was belangrijk gezien het feit dat het wasmiddel in de lopende buffer draagt vaak bij aan eiwitstabiliteit en dat het membraan eiwit kan instabiel worden wanneer de detergentia veranderen van solubilisatie naar FSEC. Het eiwit in de buffer met digitonin toonde een veelbelovende piek verschuiving naar een lager moleculair gewicht wanneer ontbindend DDM/CHS of digitonin uitgevoerd. Het eiwit ontbindend door en in digitonin uitgevoerd leverde de hoogste piek in een redelijk positie ten opzichte van de positie van de positieve controle, menselijke TRPM4 (figuur 3A). En we voorwaarts verplaatst door het uitvoeren van een kleinschalige zuivering met behulp van 25 mL van de cellen. Hoewel meerdere en brede pieken werden waargenomen door SEC (figuur 3B), het eiwit toonde kenmerken van een enkele tetramere hTRPC3 kanaal in 2D classificatie door negatieve-vlek EM (Figuur 3 c en 3D figuur). We concluderen dat digitonin is een ideaal schoonmaakmiddel voor het zuiveren van hTRPC3.
Wij opgeschaald van de uitdrukking van hTRPC3 en een middelgrote zuivering met behulp van 400 mL cellen in digitonin uitgevoerd. Door dit te doen, hoopten we te verkrijgen van voldoende eiwit voor een paar bevroren rasters zonder verspillen medium en wasmiddel, voordat we de laatste voorwaarden bedacht voor het zuiveren van hTRPC3 op grote schaal. Het gebeurt vaak dat membraaneiwitten instabiliteit wanneer hooggeconcentreerde voor de bereiding van bevroren rasters tonen. Het gezuiverde en geconcentreerde eiwit niet alleen verschoven naar een hoger molecuulgewicht door FSEC, maar toonde ook aan luidruchtig achtergrond in cryo-EM rasters beeld met behulp van een elektronenmicroscoop uitgerust met een EMCCD camera. Ook al we kunnen constateren één waren, intact tetramere receptoren, hTRPC3 gezuiverd in digitonin was niet ideaal voor hoge resolutie cryo-EM studies.
Om de eiwitstabiliteit verder te verbeteren, gescreend we een groot aantal voorwaarden beschreven in Protocol stap 5. Wij hebben gekozen voor scherm additieven op basis van de fysiologische karakter van hTRPC3; bijv., EDTA werd geselecteerd omdat hTRPC3 luchtdoorlatend calcium is en het verwijderen van het calcium kan het stabiliseren van het eiwit. Van alle monsters getest door FSEC uitgevoerd in de digitonin-bevattende buffer, 10 mM EDTA toonde een opmerkelijk effect op het stabiliseren van de hTRPC3 in een intact tetramere piek positie (figuur 4A). Het ook aanzienlijk steeg het aantal deeltjes in de cryo-EM-opname en daalde het lawaai op de achtergrond, zoals afgebeeld in Figuur 5.
De ideale omstandigheden voor expressie en zuivering te hebben geïdentificeerd, wij uitgevoerd een grootschalige uitdrukking (2 L) van hTRPC3. De cellen met hTRPC3 werden geoogst en vervolgens ontbindend. Ultracentrifuge-verduidelijkt lysate werd onderworpen aan metaal-affiniteit kolom zuivering door batch-bindende met een kobalt-hars gevolgd door reiniging in een gravity-kolom. Retentie van ontbindend eiwit binnen de kolom en de elutie van affiniteit-gezuiverd eiwit uit de kolom werd gecontroleerd door de FPLC (figuur 4B). We vonden dat voor hTRPC3, een imidazool concentratie van 15 mM in de wash-buffer toereikend was om te verwijderen van contaminerende eiwitten met hars van de niet-specifieke binding, en 250 mM imidazol in de buffer elutie voldoende was om de meerderheid van de ontbindend hTRPC3 Elueer eiwit gebonden aan de hars. Alle monsters werden gecontroleerd door de FSEC en de eluted proteïne toonde een scherpe, monodispers piek bij de piek van de juiste positie. Als intrinsieke flexibiliteit tussen de GFP-tag en de hTRPC3 proteïne de uitlijning van eiwit deeltjes tijdens beeldverwerking uitdagender kan maken, en omdat een trombine breukzijde tussen GFP en hTRPC3 ligt, we een kleine hoeveelheid getest gezuiverd eiwit op verschillende decollete tijden met behulp van trombine protease. Gezien het feit dat de eluted proteïne met trombine bij een 1:20 molaire verhouding redelijke stabiliteit en volledige decolleté na 2 uur bij 4 ° C toonde geïncubeerd, we gekloofd uit het GFP van het gezuiverde eiwit met behulp van dezelfde voorwaarden en gecontroleerd door HPLC om te bevestigen dat GFP c is geweest ompletely verwijderd (figuur 4C). Het eiwit werd verder gezuiverd door S en de splitsing van GFP kan opnieuw worden gevisualiseerd door de piek positie verschuiving naar een kleinere molecuulgewicht (Figuur 4 d). Een kleine ongeconcentreerde steekproef uit de belangrijkste piek werd gebruikt om rasters voor negatieve-vlek EM. Alle breuken met het tetramere hTRPC3 werden vervolgens gecombineerd en reconcentrated tot een definitieve concentratie van 5 mg/mL, die werd gebruikt voor te bereiden op rasters cryo-EM imaging. Zoals we hebben gezien dat deel van het eiwit nog geleidelijk verschoven naar een groter moleculair gewicht, we verzameld alleen de breuken op het juiste gewicht van de moleculaire en bevroor de rasters onmiddellijk na eiwitreiniging. We meestal afgerond de opeenvolging van experimenten van de reiniging van eiwit aan voorbereiding van bevroren rasters binnen één dag.
Een steekproef van de 2.5 μL van gezuiverde hTRPC3 eiwit (concentratie 5 mg/mL) werd toegepast op een raster van een koolstof gloed-geloosd. Een verglazing-machine werd gebruikt om voor te bereiden op de grid, met behulp van een 1.5 s bevlekken tijd tot 100% vochtigheid gevolgd door een duik naar vloeibaar ethaan gekoeld door vloeibare stikstof. Deze stap bevriest het monster in het glasvocht ijs voor imaging. Beelden werden gevangen op 130.000 X nominale vergroting door een cryo electron microscope geëxploiteerd op 300 kV. Afbeeldingsstapels werden geregistreerd in super resolutie tellen modus met een weggegooid pixelgrootte van 1.074 Å en een nominale defocus waarde variërend van 1.0 tot 2,5 μm met behulp van een directe elektron detector en geautomatiseerde acquisitie software. Elk beeld werd dosis-gefractioneerde 40 frames met een blootstellingstijd van de totale van 8 s (0,2 s per frame) en een dosering van 6,76 e− Å−2 s−1. Een representatieve opname van deze gegevensset is afgebeeld in Figuur 5.
Correctie van de beweging en schatting van defocus waarden van de stapels opgeteld film werd uitgevoerd. Ongeveer 200 resulterende microfoto werden gebruikt als bron voor handmatige deeltje picking en eerste referentie-gratis 2D classificatie31. Negen representatieve 2D klasse gemiddelden uit deze eerste classificatie werden geselecteerd en gebruikt als sjablonen voor geautomatiseerde deeltje picken voor de hele gegevensset. Een handmatige controle van autopicked deeltjes werd uitgevoerd om te verwijderen uiteraard slecht deeltjes, dan drie rondes van 2D classificatie werden toegepast om te verfijnen van de selectie van autopicked deeltjes (Figuur 5). Deze geselecteerde deeltjes van 2D-klasse waren ingedeeld in de vijf 3D klassen met behulp van een low-pass-filter van 60 Å als een eerste referentiemodel. Van deze vijf klassen weergegeven enige met een hoge resolutie kenmerken (Figuur 5). Deeltjes uit deze klasse werden verder onderworpen aan lokale verfijning met een hoge resolutie limiet van 4.5 Å en C4 symmetrie toegepast (Figuur 5)32. De verfijnde model was handmatig onderzocht en remodified. De verfijnde structuur werd gevalideerd door berekening van FSC krommen te bepalen van het verschil tussen de uiteindelijke model en EM kaart en evaluatie van de geometrie van de atomaire modellen33.
Eerste modelbouw werd uitgevoerd met behulp van het TMD-domein van de TRPM4-structuur (VOB 5wp6) als een gids-34. DOVO gebouw van het model van hTRPC3 was voornamelijk gebaseerd op omvangrijk residuen en secundaire structuur voorspelling, met de vele α-helices in de structuur sterk vergemakkelijken register toewijzing. In de eerste DOVO-model gebouwd, de volgorde, de lengte en de positie van de secundaire structurele kenmerken en omvangrijk residuen zijn in nauwe overeenkomst met de voorspelling. Tijdens de verfijning, werd de resolutie gehouden tot een ondergrens dan de resolutie geschat voor de definitieve wederopbouw. Driedimensionale FSC werd gebruikt voor het meten van de genormaliseerde Kruis-correlatiecoëfficiënt tussen twee onafhankelijk gegenereerde 3D-kaarten (elk met de helft van de gegevensset) over overeenkomstige schelpen in Fourier ruimte (als een functie van ruimtelijke frequentie). We gebruikt een zachte masker van 4.3 Å van de wederopbouw en een extra 4.3 Å cosinus zachte rand samen met een low-pass filter van 10 Å, dan gebruikt de gouden standaard FSC 0.143 cutoff drempel. Dit werd gebruikt voor het melden van de slotresolutie.
Figuur 1: expressie en reiniging van hTRPC3 met behulp van het systeem BacMam. (A) Schematische procedure voor hTRPC3 expressie en zuivering. (B) Bacmid kolonie selectie op blauw-wit indicator plaat. Kies een geïsoleerde witte kolonie (zwarte pijl), niet een witte kolonie met een ingebed blauwe kolonie of een witte kolonie in contact met een blauwe kolonie (rode pijlen). (C) GFP fluorescentie van P2 baculovirus in Sf9 cellen onder 20 X vergroting. Fluorescentie moet helder en aanwezig is op de celmembraan en/of het interieur van de meerderheid van de cellen voor een krachtige virus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: screening van de stabiliteit van hTRPC3 door FSEC. (A) wasmiddel screening van hTRPC3. De hTRPC3 was geheel-cel ontbindend in een verscheidenheid van detergentia conform zijn aan een kritische micel concentratie van 0,01 - 20 mM en is uitgevoerd in DDM/CHS-houdende buffer. Hoewel DDM/CHS de hoogste oplosbaarheid van hTRPC3 toont, de piek verschijnt op de verkeerde positie, te groot om te worden van het tetramere hTRPC3 (wel blauwe trace). (B) TRPM4 control, met een tetramere moleculair gewicht van ongeveer 540 kDa, ontbindend en tekstgroep in DDM/CHS, had een elutievolume voor ongeveer 12.9 mL, terwijl TRPC3, met een tetramere moleculair gewicht van ongeveer 400 kDa, ontbindend en uitvoeren in DDM/CHS, had een elutievolume voor ongeveer 11,9 mL. Met een kleinere moleculair gewicht, hTRPC3 zou worden verwacht dat een iets groter dan TRPM4, elutievolume niet iets kleiner, suggereren dat DDM/CHS niet een ideaal schoonmaakmiddel voor hTRPC3 solubilisatie en zuivering wellicht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: wasmiddel buffer screening van hTRPC3 door FSEC. (A) oplosbaarheid en stabiliteit test van hTRPC3 met digitonin. Digitonin werd getest zowel voor solubilisatie als in het runnen van de buffer. Opmerking de positie van de piek van hTRPC3 eiwit ontbindend in digitonin verschoven naar een grotere elutievolume in vergelijking met het eiwit ontbindend in DDM/CHS (gele trace vs. blauwe en rode sporen). Alleen de combinatie met behulp van digitonin in zowel solubilisatie als lopende buffers toont de juiste omvang van hTRPC3 door de FSEC (gele trace, sterretje). (B) vergelijkbaar met de resultaten van de FSEC van geheel-cel ontbindend hTRPC3, de positie van de piek van hTRPC3 eiwit affiniteit gezuiverd in digitonin (rode trace, 14 mL) verschoven naar een grotere elutievolume in vergelijking met de eiwit-affiniteit gezuiverd in DDM/CHS (blauw traceren, 12 mL) zoals gemeten door de SEC-fractionering. (C) negatief-vlek EM werd gebruikt om te controleren of de kwaliteit van gezuiverde eiwit voorafgaand aan het verzamelen van de gegevens van de cryo-EM. Een ideale vlek dient deeltjes (rode cirkels) negatief gekleurd (verschijnen witte) en daaromheen een wasmiddel ring (verschijnen zwarte). Een vertegenwoordiger, ideale opname waarin deze deeltjes overvloedig zijn, monodispersed en heden in meerdere richtingen wordt weergegeven. (D) de gegevens van de kwaliteit van negatieve-vlek EM 2D klassen moeten voorzien van een duidelijke en consistente algemene architectuur en dienen te gelden voor meerdere oriëntaties van het eiwit, met gemiddelden bevatten en gecentreerd in het masker (zwarte cirkel). 2D klassen van negatieve-vlek EM microfoto van hTRPC3 ontbindend in DDM/CHS aanwezig deeltjes die lijken te zijn een head-to-head dimerisatie van monomeren van hTRPC3. Daarentegen is een ruwe (maar duidelijke en consistente) totale eikel-achtige tetramere structuur in 2D klassen blijkens negatieve-vlek EM microfoto van hTRPC3 ontbindend in digitonin. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: zuivering van hTRPC3. (A) stabiliteit test van hTRPC3 in aanwezigheid van EDTA. hTRPC3 was ontbindend in digitonin in de aanwezigheid (rode trace) of afwezigheid (blauwe trace) van 10 mM EDTA. De voormalige toonde een interne en smaller piek op de tetrameer eiwit positie (rode trace, sterretje), die aangeeft dat EDTA gestabiliseerd hTRPC3 in haar tetramere bevleesdheid. (B) GFP fluorescentie FSEC signaal voor hTRPC3 ontbindend in digitonin en in digitonin buffer uitgevoerd. De tetrameer piek wordt waargenomen in de ontbindend materiaal voor metaal-affiniteit kolom zuivering (blauwe trace, sterretje). Het ontbreken van deze piek in de Fractie doorstroomtest een volledige binding van hTRPC3 eiwitten in de kolom affiniteit (rode trace) aangeeft. Na de elutie van imidazool, werden de breuken in de elutie piek gecontroleerd door de FSEC (groene trace). Alle breuken tonen intact tetrameer piek werden verzameld voor verdere zuivering. (C) Test van de splitsing van de GFP van hTRPC3 met behulp van trombine. Spijsvertering tijd werd getest met behulp van een kleine hoeveelheid eiwit bij 4 ° C en de volledigheid van de spijsvertering werd gecontroleerd door de FSEC. In elk spoor, de piek aan de linkerzijde komt overeen met de hTRPC3 tetrameer piek (sterretje) en de piek aan de rechterkant is de gratis GFP-piek. Als de lengte van de spijsvertering verhoogd, de / tetramere eiwitten aan gratis GFP gedaald, die aangeeft dat GFP werd wordt gekloofd van het eiwit. De spijsvertering van 2 h toont een volledige decolleté van GFP. Profiel van de (D) SEC van hTRPC3 vóór of na trombine spijsvertering in digitonin bevattende buffer met 10 mM EDTA toegevoegd. Zoals verwacht, wordt de piek positie verplaatst naar het kleinere elutievolume na trombine spijsvertering (rode trace). De belangrijkste piek (sterretje) vertegenwoordigt het tetramere hTRPC3. De breuken tussen rode lijnen werden verzameld voor cryo-EM experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: schematische van cryo-EM gegevensverzameling en -verwerking voor hTRPC3. De collectie van 3660 film stapels van gezuiverde hTRPC3 werd gedaan met behulp van een elektronenmicroscoop met een directe elektron detector. Correctie van de beweging en handmatige selectie werden toegepast, resulterend in 3,580 microfoto. Deeltjes waren autopicked en onderworpen aan 2D classificatie. 2D klassen werden verder verfijnd worden door 3D-indeling. Slechts één van de vijf 3D klassen weergegeven met een hoge resolutie functies. Deze klasse werd geselecteerd voor 3D verfijning en Frealign lokale verfijning, wat resulteert in een structuur voor hTRPC3 op 3.3 Å resolutie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Structurele bepaling van eiwitten door cryo-EM heeft een revolutie teweeggebracht in het gebied van structurele biologie in de afgelopen jaren, dankzij de ontwikkeling van nieuwe camera's en algoritmen waarmee u aanzienlijk sneller kunt de structuurbepaling van proteïnen toe die niet gemakkelijk crystalize, met name membraaneiwitten. Ondanks al de recente vooruitgang in de cryo-EM-techniek blijft de voorbereiding van gezuiverde eiwitten voldoende kwaliteit en kwantiteit te vergemakkelijken van hoogwaardige imaging vaak uitdagend, tijdrovend en kostbaar. Het vermogen snel uitspreken en scherm meerdere gene onder een verscheidenheid van zuivering voorwaarden construeert, verbetert zoals beschreven in het bovenstaande protocol de efficiëntie van dit proces doordat de snelle en kostenefficiënte productie van kwalitatief hoogwaardige gezuiverde eiwit voor cryo-EM onderzoek.
Terwijl de hier beschreven methode een manier biedt om grote hoeveelheden van zoogdieren membraaneiwitten tegen minder kosten dan door directe transfectie zuiveren en sneller dan een stabiel transfected cellijn generatie, zij vele stappen heeft, elk waarvan moet worden geoptimaliseerd om te bieden een hoge kwaliteit eiwit opbrengst. Binnen de biochemische technieken gebruikt om te produceren en te zuiveren van hTRPC3, zijn er een aantal kritische stappen en controlepunten. Het eerste kritisch controlepunt is de productie van bacmid DNA. Zoals beschreven in de resultaten, is ideale kolonie selectie de eerste stap in de generatie van een kwaliteit-virus voor eiwit expressie. Bovendien, als de concentratie van bacmid DNA gezuiverd van de geselecteerde kolonie minder dan 1 μg/μl is, zullen de resulterende virus niet volstaan voor robuuste eiwit expressie. Het tweede kritisch controlepunt is de productie van P1 en P2 baculovirus. Virus titer kan worden geschat door GFP fluorescentie, zoals aangegeven in Figuur 1 c of kan worden gemeten zoals beschreven door Coleman et al. 35. naast de virale titer, een tijdsverloop van infectie tijd voor elke nieuwe construct te bepalen van de optimale tijd van infectie voor maximale eiwit expressie moet worden uitgevoerd. Kritisch controlepunt drie is de oplosbaarheid en stabiliteit screening afgebeeld in Figuur 2. Wasmiddelen met een hoge CMC, zoals DDM, hoge oplosbaarheid kunnen bieden, maar ze zijn niet ideaal voor cryo-EM imaging omdat ze leiden een overvloed tot kunnen aan besmetting van micellen. Een mildere wasmiddel, zoals digitonin, bieden voldoende oplosbaarheid met behoud van de eiwitstabiliteit. De screening van additieven, zoals in het geval van hTRPC3, EDTA is belangrijk voor het ontdekken van een zuivering aandoening die tot een intact en homogene eiwit, waarschijnlijk leidt door het verwijderen van het calcium uit hTRPC3, die is luchtdoorlatend calcium. Kritisch controlepunt vier is de verificatie van specifieke en efficiënte eiwit opname tijdens de zuivering van de kolom affiniteit en de observatie van een ideale eiwit piek tijdens SEC-fractionering (Figuur 4). Vermijden van de opneming van contaminerende eiwit deeltjes met volledig behoud van het target-eiwit is van cruciaal belang voor het verkrijgen van een hoog genoeg opbrengst van eiwitten voor cryo-EM imaging. Wijziging van de batch-bindende tijd en verhouding van hars op ontbindend proteïne kan helpen verbeteren eiwit retentie door de kolom hars. De algehele kwaliteit van de SEC-fractionering piek is in onze ervaring de beste indicator, voorafgaand aan de beeldvorming, van de kwaliteit van gezuiverde eiwit deeltjes. Een laag of een brede piek tijdens SEC-fractionering geeft mogelijke problemen van te weinig eiwit deeltjes per beeld of de aanwezigheid van contaminerende eiwit aggregatie/afbraakproducten, respectievelijk. Bovendien, wijzigingen in de tag affiniteit binnen de constructie zelf heeft bewezen noodzakelijk zijn in sommige gevallen om voldoende affiniteit-tag bindend. Het laatste controlepunt voor het verzamelen van gegevenssets cryo-EM is de verificatie van eiwit deeltjes kwaliteit door negatieve-vlek EM. Hoewel niet strikt noodzakelijk is, vinden we dat dit een uitstekende gelegenheid om ter plaatse en juiste eiwit kwaliteitskwesties biedt alvorens te investeren in de tijd en kosten-arbeidsintensieve proces van het verzamelen van gegevens door cryo-EM.
Een alternatieve methode voor de productie van eiwitten voor cryo-EM structurele studies is de directe zuivering van eiwitten uit de bron van het oorspronkelijke weefsel. Hoewel deze methode vaak problemen met eiwit opbrengst aantreft, is het een uitstekend alternatief voor eiwitten die zijn zeer talrijk in cellen, of die bestaan als deel van een groot multi eiwit complex, die kan moeilijk zijn om te produceren met behulp van een recombinant overexpressie systeem36. Voor enkele eiwitten uitgedrukt in gematigde of lage bedragen onder fysiologische omstandigheden, de expressie en zuivering systeem hier gepresenteerd is echter een efficiënte, relatief lage kosten en hoog rendement methode voor de productie van gezuiverd zoogdieren membraan eiwit voor cryo-EM structurele studies. Eén methode die sterk kan aanvullen die hier gepresenteerd is de reconstitutie van gezuiverde proteïne in lipide nanodiscs vóór cryo-EM gegevens collectie37. Onder deze methode, worden de eiwitten ingebed in een kleine schijf van lipide dubbelgelaagde, waarschijnlijk het verstrekken van een native-achtige communicatie in vergelijking met wasmiddel micellen, hoewel er tot nu toe geen aanwijzingen dat de structuren ontbonden in wasmiddel en nanodisc zijn verschillende38,39,40. Een andere benadering is om uit te pakken van de proteïne die rechtstreeks met behulp van amphipathic polymeren zoals styreen maleïnezuuranhydride (SMA), die met succes heeft ingezet voor de bepaling van membraan eiwit structuren41,42.
Deze benaderingen in dit manuscript beschreven hebben bewezen te zijn gemakkelijk aanpasbaar in ons lab aan een verscheidenheid van andere zoogdieren membraaneiwitten buiten ionenkanalen. Daarom vinden wij dat dit protocol zullen een waardevol hulpmiddel in de structurele en functionele analyses die ten grondslag liggen aan de hoge-specificiteit gerichte drug design. Dit is vooral nuttig bij neurodegeneratieve ziekte, hart-en vaatziekten en kanker, in welke ion kanalen moeilijk maar veelbelovende drug targets zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken G. Zhao en X. Meng voor de ondersteuning bij het verzamelen van de gegevens op de David Van Andel geavanceerde Cryo-Elektron microscopie Suite. Wij waarderen de VARI High-Performance Computing team voor computationele steun. Wij geven onze dankbaarheid aan N. Clemente, D. contributie, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth en Z. Ruan voor opmerkingen die sterk verbeterd dit manuscript. Wij danken D. Nadziejka voor redactionele ondersteuning voor dit manuscript. Dit werk werd gesteund door interne VARI financiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent - to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
- Sudhof, T. C.
- Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
- Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
- Prakriya, M., Lewis, R. S.
- Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
- Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
- Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
- Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
- Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
- Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
- Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
- Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
- Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
- Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
- Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
- Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
- Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
- Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
- Bayburt, T. H., Sligar, S. G.
- Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
- Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
- Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).
